Generalităţi

Definirea mediilor de cultură într-o manieră completă şi complex ă, în

contextul varietăţii covârşitoare a entităţilor taxonomice microbiene
şi a exigenţelor nutritive extrem de diverse pe care acestea le reclam ă
în dezvoltarea lor, este o încercare destul de dificil ă pentru
microbiologul practician.

Mediile de cultură =complex de substanţe chimice pure sau

dimpotrivă, de substraturi organice şi minerale cu un grad mai redus
de puritate, care să ofere microorganismelor posibilitatea dezvolt ării
şi multiplicării, imitând pe cât posibil condiţiile trofico-habituale
din organismele gazdă sau din biotopurile naturale specifice.
Compoziţia mediilor de cultură
•Particularităţile metabolice şi numărul apreciabil al fungilor incumb ă folosirea unor
substraturi nutritive variate, făcând practic imposibil ă ob ţinerea unui mediu standard pentru
toate speciile de interes medical. Unele formule (Sabouraud, Czapek, PDA) permit totu şi
dezvoltarea unui număr mare de entităţi taxonomice apar ţinând mai multor genuri.

• În general, principalele componente ale mediilor de cultur ă sunt reprezentate de

substanţele nutritive, agenţii revelatori, factorii inhibitori, apa şi agen ţii de solidificare
(în cazul mediilor solide).
• Substanţele nutritive sau nutrienţii sunt reprezentate de o grupare pletoric ă de substanţe
chimice care sunt incluse în medii pentru a oferi fungilor: o surs ă de carbon, o surs ă de
azot şi promotori de creştere (substanţe minerale, vitamine, acizi gra şi etc.).
• Din punct de vedere al structurii chimice, nutrien ţii pot fi:
 în cazul surselor de carbon:
1. monozaharide (glucoza sau dextroza, fructoza, manoza, galactoza, xiloza,
ramnoza, arabinoza)
2. di- şi oligozaharide (zaharoza sau sucroza, lactoza, maltoza, celobioza,
trehaloza, rafinoza)
3. polizaharide (amidon, glicogen, celuloz ă, chitin ă etc.)
4. acizi organici (tartric, citric, oxalic, malonic etc.)
5. lipide
  în cazul surselor de azot:
1. substanţe anorganice azotate (nitra ţi, nitri ţi, s ăruri de amoniu)
2. peptide şi proteine (peptonă, hidrolizat de cazein ă, gelatin ă, cazein ă,
keratină, ovalbumină)
3. aminoacizi (glicină, triptofan, glutamin ă, histidin ă ş.a.)
4. Uree
 în cazul promotorilor de creştere:
1. substanţe minerale (sub formă de săruri care s ă con ţin ă Na, K, Mg, Ca, Fe, Cu, Zn,
Co, P, S ş.a.)
2. vitamine (tiamină, acid nicotinic, inozitol etc.)
3. acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (C12-C24), necesari pentru
dezvoltarea levurilor lipodependente ale genului Malassezia.
Pentru anihilarea dezvoltării bacteriilor, se recomand ă înglobarea în mediile de cultur ă
destinate izolării fungilor, a unor substan ţe din grupa antibioticelor (penicilin ă,
streptomicină, cloramfenicol, gentamicin ă, ciprofloxacin, tobramicin ă) sau a coloran ţilor
(cristal violet, Rose Bengal).

Izolarea fungilor patogeni este favorizat ă de îns ămân ţarea prelevatelor pe medii solide ce
conţin cicloheximidă, substanţă capabilă să inhibe par ţial sau total dezvoltarea fungilor
contaminanţi.
Prepararea şi sterilizarea mediilor
Prepararea mediilor este o etapă extrem de important ă, care condi ţioneaz ă hot ărâtor
dezvoltarea, replicarea şi exprimarea fenotipic ă plenar ă a tuturor caracterelor culturale ale
fungilor. Calitatea ingredientelor, modul de solubilizare a acestora, succesiunea ad ăug ării lor,
ajustarea pH-ului şi repartizarea mediilor în vederea steriliz ării pot reprezenta tot atâ ţia factori
limitativi ai demersului diagnostic, dac ă nu li se acord ă importan ţa cuvenit ă.

În general, mediile deshidratate sunt reconstituite prin solubilizarea unor cantităţi precise de
pulbere în apă distilată sau apă de robinet, de preferat înc ălzit ă la 70º-80ºC, urmat ă apoi de
fierberea amestecului până la dizolvarea complet ă a tuturor ingredientelor. În cazul mediilor
ce conţin ingrediente care nu suportă înc ălzire la temperaturi crescute, se va renun ţa la etapa
de fierbere.

După preparare, mediile repartizate în flacoane sau tuburi se vor steriliza prin autoclavare,
timp de 15-20 minute la 121ºC (sau respectând parametrii recomanda ţi deproduc ător).
Componentele ce nu pot fi autoclavate datorit ă termolabilit ăţii lor, se vor prepara separat şi se
vor adăuga la mediul de bază după sterilizarea acestuia. În vederea autoclav ării eficiente se
recomandă repartizarea mediilor în flacoane cu o capacitate care s ă nu dep ăşeasc ă 400-500
ml. Cele mai indicate sunt cele confec ţionate din sticl ă Pirex, gradate, cu capac filetabil.
Controlul de calitate şi păstrarea mediilor
Fiecare nou lot de medii de cultură, indiferent de provenien ţa sa (medii gata de folosire,
repartizate în plăci sau tuburi “single-use” livrate de diverse firme sau medii preparate în
laborator) va fi supus unui control de rutin ă care vizeaz ă analiza unor însu şiri esen ţiale cum ar
fi aspectul, pH-ul, sterilitatea şi performan ţele mediului.
Aspectul (culoare, transparenţă, consistenţă) şi pH-ul trebuie s ă corespund ă parametrilor
standard specifici pentru respectivul mediu de cultivare. Starea de sterilitate a mediilor se
verifică prin incubarea câtorva recipiente la temperaturile de 30ºC, respectiv 37ºC, timp de
24-48 ore. Absenţa dezvoltării unor colonii bacteriene sau fungice indic ă o corect ă sterilizare
a mediului. Performanţele de creştere se verific ă utilizând tulpini tip din colec ţia
laboratorului, alese în funcţie de tipul de mediu şi de recomand ările privind aplicabilitatea
acestuia în diagnostic:
- Mediile de izolare neselective se verific ă prin evaluarea capacit ăţii lor de a asigura
dezvoltarea optimă a tulpinilor însămânţate;
- Mediile selective se verifică prin însămân ţarea unor tulpini tip rezistente şi a unora sensibile
la agenţii inhibitori existenţi în mediu;
- Calitatea mediilor diferenţiale se evalueaz ă prin modul de reac ţie al acestora în urma
însămânţării cu tulpini producătoare de reac ţii pozitive şi negative.
Conservarea mediilor de cultură preparate în laborator şi a celor reconstituite prin
rehidratare se face de preferinţă la temperaturi de refrigerare (2º-8ºC), pl ăcile Petri plasându-
se în pungi de polietilenă sau cutii închise ermetic, iar tuburile vor fi etanşeizate cu dopuri
confecţionate din material neporos pentru a preveni desicarea. În aceste condiţii, mediile
condiţionate în plăci Petri se pot păstra pân ă la 3 luni, iar cele în tuburi cu dop etan ş pân ă la 6
luni.
 Denumire mediu Caracteristici Aspect
Sabouraud dextrose agar Conţine peptonă şi
dextroză
Potato dextrose agar Contine dextroza si
(PDA) extract de cartof
Brain heart infusion – tub Mediu imbogăţit cu
inclinat extract de carne şi
cazeină, conţine dextroză
ADCL – Agar dezoxicolat Conţine lactoză şi roşu
Citrat Lactoză neutru ca indicator de pH
Conţine dezoxicolat ca
inhibitor al dezvoltării
bacteriilor G+ şi a unor
enterobacterii
Geloză sânge Mediu imbogăţit
Recomandare
Mediu uzual de cultivare a
levurilor (în special) şi fungilor
filamentoşi
Mediu de cultivare a fungilor
filamentoşi (în special) şi a
levurilor
Izolarea levurilor aparţinând
speciei Histoplasma capsulatum
Evidenţiereea fermetării
lactozei prin schimbarea culorii
mediului
Evidenţierea caracterului
hemolitic
 Denumire mediu Caracteristici
Sabouraud cu cloramfenicol Conţine cloramfenicol,
antibiotic de spectru larg care
inhibă dezvoltarea majorităţii
speciilor bacteriene Gram
pozitive şi Gram negative
Potato dextrose agar Contine dextroza si extract de
(PDA) cartof
Czapek Dox Contine nitrat de sodiu ca
unica sursa de azot
Mycosel agar - Conţine cloramfenicol care
inhibă creşterea bacteriană
inclusiv a actinomicetelor, şi
cicloheximide pentru
inhibarea fungilor filamentoşi
saprofitici , a speciilor
oportuniste de Aspergillus şi
Scopulariopsis şi a unor levuri
(inclusiv Candida
neoformans).
CANDICHROM Mediu cromogen
Aspect Recomandare
Mediu selectiv de cultivare a speciilor
comensale şi patogene de levuri şi
fungi filamentoşi
Mediu selectiv pentru levuri si fungi
Izolarea unor specii de
Penicillium, Aspergillus, Paecilomyces
Mediu selectiv al speciilor strict
patogene de fungi filamentoşi şi
levuri;
Perimte diferenţiereea speciilor de
levuri şi fungi filamentoşi pe baza
aspectului macroscopic şi al culorii
coloniilor izolate dezvoltate la
suprafaţa mediului.
 Denumire mediu Caracteristici
Caffeic Acid Agar - Conţine acid cafeic şi
citrat feric; acidul cafeic
este oxidat de către
fenoloxidază, cu
producerea unui pigment
negru (melanină)
Bird seed Agar - Conţine cloramfenicol
KT Medium & Kelley Agar
Mediu Levine (EMB) modificat
Aspect Recomandare
Mediu de diferenţiere a speciei
Cryptococcus neoformans (de C.
albicans) prin colorarea
coloniilor în negru datorită
producerii de melanină în urma
metobolizării acidului cafeic
(difenol)
Mediu selectiv şi de diferenţiere
a speciei C. neoformans de alte
specii de Cryptococcus sau alte
levuri prin aspectul maroniu al
coloniilor izolate
Mediu utilizat pentru conversia speciei
dimorfe de Blastomyces dermatitidis din
forma miceliana in forma levurică
Mediu utilizat pentru producerea
sferulelor de către Coccidioides immitis.
 Tehnici de însămânţare şi transplantare
Tehnici uzuale
De regulă, însămânţarea prelevatelor se poate face prin mai multe tehnici uzuale:
- epuizare pe medii solide condiţionate fie în plăci Petri, fie în tuburi (în pant ă) – asigur ă
separarea fungilor cu semnificaţie clinic ă de cei contaminan ţi şi inhib ă prin diluare
eventualele substanţe antimicrobiene cu rol antifungic;
- etalare în puncte izolate – prin spotare: la unele prelevate paucibacilare sub formă de lichide
organice – LCR, pasaje din hemoculturi, sedimente, fragmente de ţesut şi prin înţepare: la fire
de păr, scuame, diverse raclate;
- înglobare în medii solide pretopite şi r ăcite la 45°C : la fire de păr, fragmente unghiale,
scuame.

În timpul însămânţărilor se va ţine seama de urm ătoarele reguli:

- Însămânţările se vor executa în boxe sau hote speciale, care se pot steriliza periodic şi nu
permit formarea de curenţi de aer în timpul lucrului. Însămânţarea prelevatelor provenite din
situsuri normal sterile se va face preferabil sub protec ţia unei hote microbiologice clas ă 2,
pentru a preveni eventuala lor contaminare cu spori fungici ambientali.
- Se evită conversaţia şi orice mişcare în jurul operatorului;
- Instrumentul utilizat la însămânţare (ansă microbiologic ă, ac de îns ămân ţare, pipet ă etc.) nu
se va atinge de obiecte nesterilizate (halat, mas ă de lucru );
- Însămânţările se vor executa într-un timp scurt, pentru a reduce la minim contactul
materialului de însămânţat cu atmosfera ambiant ă;
În timpul cât tuburile de cultură sunt deschise, vor fi ţinute într-o pozi ţie oblic ă, cât mai
aproape de orinzontalitate şi cu deschiderea în imediata apropiere a flăcării becului de gaz;
- Operatorul trebuie să poarte mască de protec ţie;
- Tuburile şi plăcile Petri însămânţate se noteaz ă cu markerul, f ăr ă a omite num ărul probei,
denumirea abreviată a mediului de cultivare şi data îns ămân ţării.
Însămânţarea se execută în faţa flăcării unui bec de gaz care asigur ă condi ţii de antisepsie
în timpul acţiunii. În micologia medical ă, produsele patologice se îns ămân ţeaz ă în mod
similar cu cel din bacteriologie. Acul de îns ămân ţare / ansa se flambeaz ă şi se r ăce şte în ser
fiziologic sterilizat, apoi se ia un fragment de produs patologic ce ader ă de ac şi se depune pe
suprafaţa mediului de cultură. Din aceea şi prob ă, se îns ămân ţeaz ă mai multe pl ăci sau tuburi,
în puncte separate, cîte 3 – 4 fragmente de cercetat.
Culturile se examinează zilnic, urmărindu-se aspectul macroscopic (suprafa ţa, relieful,
culoarea, prezenţa pigmentării, consisten ţa şi viteza cre şterii). În timpul dezvolt ării, coloniile
îşi schimbă aspectele macroscopice. Aspectele coloniilor se notează periodic, pentru a
surprinde toate caracterele culturale. Paralel se face şi examenul morfologic al fragmentelor
de colonii. Şansele de izolare a fungilor cu semnifica ţie clinic ă cresc direct proportional cu
numărul probelor însămânţate. Temperatura de incubare dup ă îns ămân ţare este de 36°-37°C
pentru prelevatele interne / profunde şi de 30°C pentru cele superficiale.
Pentru izolarea levurilor, însămânţarea prelevatelor se face pe Agar Sabouraud aditivat cu
cloramfenicol. Acest mediu permite o bun ă dezvoltare a levurilor şi supreseaz ă multiplicarea
eventualelor bacterii contaminante.
Pe mediile de izolare, levurile de interes medical se dezvolt ă în 24-72 ore de incubare. În
funcţie de provenienţa prelevatului se va face şi alegerea temperaturii de incubare. Pentru
prelevatele provenind din situsuri în care în mod normal temperatura este identic ă cu cea a
organismului, se va alege temperatura de 37°C pentru incubare. În cazul celor provenind de
la nivelul tegumentului sau unghiilor, incubarea se va face atât la 37°C, cât şi la 30°C,
deoarece unele levuri cultivabile la 30°C dar necultivabile la 37°C, pot avea semnificaţie
clinică fiind cauza unor micoze superficiale.

Tehnici speciale
Tehnica de cultivare în „picătură suspendată”
Inele de sticlă cu diametrul de 2 cm şi în ăl ţimea de 1 cm se imerseaz ă în parafină topită şi
imediat se aşează pe o lamă de sticlă sterilizat ă. În interiorul inelului de sticl ă se pune o
picătură de apă distilată sterilizată. Lamela de sticl ă se flambeaz ă şi în zona central ă se
depune o picătură de bulion Sabouraud, în care se îns ămân ţeaz ă materialul de cercetat.
Marginea superioară a inelului de sticlă se greseaz ă cu lanolin ă, se trece prin flac ăr ă pentru
sterilizare şi se aplică apoi lamela cu pic ătura îns ămân ţat ă în jos.
Lamela se examinează la microscop după câteva zile de incuba ţie.
Tehnica de cultivare pe bloc de geloză (cultivarea pe lamă)
Cultura pe bloc de geloză (pe lamă) este recomandată pentru studierea în dinamic ă a
morfologiei structurilor de fructificare (generatoare de conidii) la fungi filameno şi septa ţi (nu
însă la cei din genurile Aspergillus şi Penicillium). În acest scop, fungul de identificat se
însămânţează în două puncte opuse ale unui bloc de geloz ă (PDA) de 1 x 1 x 0,5 cm etalat pe o
lamă de sticlă. După însămânţare, acesta se acoperă cu o lamelă, iar lama se aşeaz ă pe o
baghetă de sticlă în formă de „U” plasat ă într-o camer ă umed ă (de fapt, o plac ă Petri ce
conţine un fragment de hârtie de filtru umectat cu cca. 5 ml ap ă distilat ă). Camera umed ă se
incubează la 25°-30°C, un timp variabil, până la apari ţia pe lam ă a structurilor de fructificare
cu morfologie caracteristică, fapt constatat în urma examin ării microscopice. În final, blocul
de geloză se îndepărtează, iar din lamă, respectiv lamel ă, se ob ţin prin ad ăugare de lactofenol
şi montare, două preparate extemporanee. Aceste dou ă preparate ob ţinute se pot păstra, dacă
vor fi lutate, timp de aproximativ cinci ani.
Tehnici de transplantare
Prin transplantări sau pasaje se urmăreşte izolarea în stare pur ă a fungilor de
interes medical din culturile mixte sau menţinerea lor în timp, în condiţii de
laborator (tulpini de colecţie) şi obţinerea de colonii monosporale.
Din culturile pe medii lichide, recoltarea materialului de transplantat se poate
face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de însămânţare. Cu pipeta Pasteur se recolteaz ă
o cantitate din cultura veche, din care se însămânţează câteva picături în mediul
lichid şi câteva picături pe suprafaţa mediului solid. În cazul transplant ării cu ansa,
se introduce ansa sterilizată în cultura veche, apoi se face însămân ţarea pe mediile
proaspete (întâi pe mediul lichid şi apoi în trei puncte pe mediul solid).
Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa sau cu o
microspatulă, luând o cantitate redusă de miceliu de la periferia coloniei vechi.
Acest material biologic se transferă pe bulion şi pe un mediu agarizat (Agar
Sabouraud, PDA, Agar Czapek – Dox, Agar cu extract de malţ etc.).
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h
Mediu Sabouroud (agar dextroza)

Colonii cu extensii caracteristice, filiforme si tuburi

germinative (2-3 h incubare in ser sau plasma)- suspiciune de
Candida albicans.
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h

• Candida krusei
(conform API)
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h

• LEVURI – CANDIDA ALBICANS

-DISPERSIE
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h

• Levuri tip CANDIDA

 Aspectul coloniilor de
Cryptococcus
neoformans

Apectul coloniilor
brune de C. neoformans
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h

• ZYGOMICETE LA 24 ORE
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h

• ZYGOMICETE LA 48
DE ORE
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h

Zygomicete si levuri
tip Candida la 4 zile
Mediu Sabouroud (agar dextroza)

• Fungi din familia

FUSARIUM (conform
frotiu”amprenta”)
Mediu Sabouroud (agar dextroza) la 48h

• Aspergillus flavus
EXS. NAZAL

• FUNGI FILAMENTOSI
(ALTERNARIA)
EXS. NAZAL

• FUNGI FILAMENTOSI PE
GELOZA LACTOZATA
EXS. FARINGIAN

• FUNGI FILAMENTOSI PE GELOZA SANGE

Bibliografie selectivă
1. Bazgan O (1999) - Diagnostic de laborator şi igiena alimentelor de origine
animală; Ed. Moldogrup; Iaşi.
2. Buiuc D, Neguţ M (1999) - Tratat de microbiologie clinică; Ed. Medicală;
Bucureşti.
3. Coman I, Mareş M (2000) - Micologie medicală aplicată; Ed. Junimea; Iaşi.
4. Mareș M (2007)-Tehnici de laborator în micologia medicală, Editura Pim, Iași.