Informații generale

Fungii sunt organisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care conțin
chitina in peretele celular.
Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut si acceptat in micologia
medicala.
Acesta permite impartirea fungilor in trei tipuri principale:
• filamentosi: mircoorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filamente tubulare ce pot fi
septate, denumite hife;
•levuriformi: microorganisme unicelulare, de forma rotunda sau alungita ce se multiplica in
principal prin burjeonare;
•dimorfici: o categorie aparte de microorganisme, care pot aparea sub 2 forme, in functie de
a) conditiile de mediu: forma de levuri se gaseste in tesuturile organismelor parazitate sau la
37°C
b) in vitro, iar forma filamentoasa apare cand sunt cultivate la temperatura camerei sau la
30°C, pe medii uzuale.
Levurile pot fi izolate din produsele patologice primite in laboratorul clinic in urmatoarele
situatii:
•contaminarea probei prin manevre defectuoae in cursul prelevarii;
•colonizarea cu levuri a unor suprafete (tegument, mucoase) sau cavitati;
•infectia cu aceste microorganisme.
In cazul prelevatelor din situsuri normal sterile, prezenta levurilor indica infectie, daca s-au
luat toate masurile de prevenire a contaminarii in timpul recoltarii. In cazul probelor
provenite din situsuri nesterile, cu microbiota proprie, coroborarea datelor clinice,
epidemiologice si de laborator este absolut necesara pentru interpretarea semnificatiei
clinice a levurilor.

Principalele indicatii ale testarii

•Infectii fungice cu levuri.
•Suspiciunea unei dermatite cu Malassezia spp.

Prelucrarea necesara dupa recoltare

Se pastreaza exclusiv la temperatura camerei. Nu se refrigereaza.
Desi probele prelevate pe mediu de transport au o stabilitate extinsa, se
recomanda a se trimite catre laborator in maximum 2 ore de la prelevare pentru o
mai sigura recuperare a microorganismelor urmarite.
Atentie: pe cererea de analize care acompaniaza proba trebuie mentionata orice
informatie clinica sau observatie care poate indruma medicul de laborator in
selectarea metodei potrivite de procesare a
specimenului (alegerea mediului de cultura corespunzator, conditiilor de incubare
etc), orice tratament antifungic administrat pacientului.
Antifungigrama este o analiză ce determină existența unor infecții fungice. Testul
este util în identificarea culturilor fungice, tipul acestora, dar și medicamentelor la
care acestea sunt sensibile, astfel încât să poată fi urmat un plan corect de
tratament.

In functie de situsul de izolare, fungii cei mai frecvent intalniti sunt:

•Lichid cefalorahidian: Cryptococcus neoformans, Candida albicans,

Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides immitis,
Histoplasma capsulatum;

•Sange: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis,

Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida lusitanie,
Candida krusei, Trichosporon spp., Coccidioides immitis, Malassezia
furfur;
•Tract genitourinar: Candida albicans, Candida glabrata, Candida
tropicalis, Candida parapsilosis, Penicillium spp., Candida krusei,
Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Cladosporium
spp., Aspergillus spp., Trochosporon spp., Alternaria spp.;

•Tract respirator: Candida spp., Aspergillus spp., Alternaria spp.,

Geotrichum candidum, Fusarium spp., Acremonium spp.,
Scopulariopsis spp., Trichosporon spp., Histoplasma capsulatum,
Coccidioides imitis;

•Piele si fanere: Candida albicans, Acremonium spp., Alternaria

spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis spp., Geotrichum spp.,
Cladosporium spp., Trichophyton spp., Epidermophyton flocossum,
Microsporum spp., Criptococcus neoformans1
Recoltarea si transportul probelor – joaca un rol important in
acuratetea diagnosticului, orice intarziere in procesarea probelor
poate duce la scaderea sanselor de a izola agentul etiologic.

Viabilitatea levurilor poate fi afectata de caldura excesiva sau de

frig, fiind recomandat ca transportul probelor sa se faca la
temperatura ambianta, iar procesarea lor in cel mai scurt timp
(aproximativ 2 ore).

Desi aproape orice tesut sau fluid poate fi supus izolarii si

identificarii fungice, cele mai importante specimene sunt
reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secretie
genitala, exudat faringian, sputa, aspirat transtraheal si lichid pleural,
tesuturi din plagi, lichid cefalorahidian, sange, urina si materii fecale.
ANTIFUNGIGRAMA

Testarea sensibilităţii la antifungice este în

prezent standardizată numai pentru metodele cu
macro şi microdiluţie şi respectiv E-test. De aceea
în
laboratoarele clinice obişnuite se practică fie
antifungigrama pe galerii automate de tipul celor
MiniAPI, ce au ca principiu metoda
microdilutiilor, fie E-testul.
 Metoda calitativa de screening a activitatii antifungice

1) Se prepara suspensii sporale de fungi filamentosi din culture de 5-7 zile,

dezvoltate pe mediu solid PDA repartizat in tub inclinat;
2) Pentru obtinerea suspensiilor sporale se utilizeaza: 10mL SF+1 pic. Tween 20
(10µL);
3) Amestecul se adauga peste cultura fungica si se agita pentru despriderea
sporilor
3) Densitatea suspensiilor aporale se ajusteaza spectrophotometric pana la
DO=620nm (cuprinsa intre 0,09 si 0,11 corespunzatoare standardului de turbiditate
McFarland 0,5);
4) Activitatea antifungica se testeaza prin metoda difuzimetrica, ce presupune
insamantarea in “panza“ pe suprafata mediului Sabouraud agarizat si plasarea in
spot a unei cantitati de 10µL din fiecare solutie/suspensie/substanta testata;
5) Placile sunt incubate 5-7 zile la 20-22°C
 Interpretarea rezultatelor

- evaluarea calitativa a activitatii antifungice se realizeaza la diferite intervale de

timp de incubare: 24h, 48h, 72h si 5 zile, atat prin observare macroscopica cat si
prin observare microscopica;
- analizand suprafata mediului solid insamantat in panza cu solutia de spori se
poate observa aparitia unei zone de inhibitie a cresterii miceliului primar al
speciilor fungice testate.

Metoda cantitativa de testare a activitatii antifungice prin stabilirea

valorilor concentratiei minime inhibitorii (CMI)

Se relizeaza dilutii binare ale compusilor/suspeniilor/solutiilor de testat in

mediu RPMI 1640
Fiecare godeu este inoculat ulterior cu suspensie fungica la densitate
standard
Probele sunt incubate timp de 5-7 zile la 20-22°C
In parallel, urmarind aceleasi etape si aceleasi conditii de reactie se lucreaza
2 probe martor: martor de crestere microbiana (MC=godeuri care contin
exclusiv mediu de cultura inoculat cu suspensie microbiana) si martor de
sterilitate a mediului (MS=godeuri care contin exclusiv mediu de cultura).
Interpretarea rezultatelor
CMI se stabileste ca fiind ultima concentratie la care nu s-a observant crestere
fungica, respectiv aparitia turbiditatii mediului.
 Determinarea spectrului de sensibilitate la substante antifungice a
tulpinilor de drojdii

A.Metoda calitativa
- se utilizeaza kitul FUNGITEST-presupune testarea a 6 compusi cu actiune
antifungica, unii ditre cei mai frecventi utilizati in clinica:5-fluorocitozina,
amfotericina B, miconazol, ketoconazol, intraconazol, fluconazole;
- compusii se gasesc in 2 concentratii diferite care permit determinarea celor
3 fenotipuri: sensibile, sensibile dependente de doza si rezistente.
Protocol de lucru:
- tulpinile de drojdii sunt crescute pe mediu YPG timp de 24h la 37°C
- se realizeaza un inocul in apa distilata sterile cu o DO de 3x104UFC/mL,
din care se transfera un volum de 20µL in mediul de suspensie present in kit
- din aceasta suspensie cate 100µL sunt insamantati in godeurile cu diferite
concentratii de substante antifungice dupa care se incubeaza 48h la 37°C
- dupa finalul incubarii sunt citite rezultatele; dezvoltarea tulpinii presupune
virarea culorii de la albastru la rosu.
- tulpinile care se dezvolta la concentratia 1 sunt considerate susceptibile
dependente de doza,
- cele care se dezvolta la ambele concentratii (1 si 2) sunt considerate
rezistente,
- tulpinile care nu se dezvolta la niciuna din concentratii sunt considerate
sensibile.
B. Metoda cantitativa
- se utilizeaza sistemul E-test care cuantifica direct susceptibilitatea la antifungice
- consta intr-un strip subtire, din plastic, impregnate cu un agent antifungic
- atunci cand stripul este aplicat pe o placa inoculate agentul antifungic are o
eliberare imediata pe suprafata mediului, inhiband cresterea fungilor, in functie de
gradientul de concentratie create in mediu si de sensibilitatea la antifungice a
tulpinilor testate
- suspensia celulara cu densitate standard 0,5 McFarland (1,5x108 UFC/mL) este
insamantata in “pinza“ cu ajutorul unui tampon pe mediu Sabouraund.
- peste suspensie se distribuie, cu o pensa sterile, stripurile E-test cu partea ce
conține scala de citire a CMI orientate în sus, iar plăcile sunt incubate la 37°C, 24 h.
- se notează rezultatele, luând în considerare punctul în care elipsa zonei de
inhibiție a intersectat stripul E-test.
E-test
 Antifungiframa
voriconazol, fluconazol

Antifungiframa
Antifungiframa
E-test pentru fluconazol
E-test pentru flucitozină