Efectuarea frotiului Prin frotiu se nelege etalarea materialului microbian (produs patologic, cultura microbiana) in strat subire pe suprafaa

unei lame de microscop in vederea examenului microscopic. Efectuarea frotiului cuprinde trei timpi: etalarea, uscarea si fixarea. Materiale necesare - lame de sticla curate si degresate - ansa bacteriologica - ser fiziologic steril 1. Etalarea Cu o ansa se ntinde un strat cat mai subire si uniform din produsul patologic, pe o suprafaa de 1-2 2 cm in centrul lamei, fara a atinge marginile; similar, o seciune dintr-o colonie bacteriana de pe mediul solid, prelevata cu ansa, poate fi suspensionata intr-o pictura de ser fiziologic steril depusa in centrul lamei. In cursul etalrii trebuie evitata ruperea peliculei de lichid prin ridicarea brusca a ansei; aceasta previne formarea de aerosoli contaminani. 2. Uscarea frotiului se face la temperatura camerei. 3. Fixarea Este necesara pentru aderarea produsului patologic de lama, omorrea bacteriilor si pentru nlesnirea absorbiei colorantului pe suprafaa acestora. Frotiurile se fixeaz nainte de colorare cel mai ades la flacra, lama se trece de 3-4 ori prin flacra, nclzind-o pe fata opusa frotiului. Colorarea frotiului Asigura un contrast mai bun intre microbi si fondul preparatului dect cel realizat in preparatele native, detaliile morfologice devin mult mai vizibile. Frotiurile se pot colora simplu cu un singur colorant, elementele preparatului avnd toate aceeai culoare, eventual de intensitate diferita (coloraia cu albastru de metilen, coloraia GIEMSA) sau difereniat cu mai muli colorani, bacteriile colorndu-se diferit in funcie de caracterele morfotinctoriale (coloraia APT-DRAGAN, coloraia GRAM). Coloraia simpla cu ALBASTRU DE METILEN Materiale necesare - lame de sticla cu frotiuri etalate si fixate - soluie de albastru de metilen Mod de lucru - frotiul fixat la flacra se acoper cu soluia de albastru de metilen - se las sa acioneze 1-2 minute - se spal apoi cu apa - se usuc - se examineaz la microscop optic cu obiectiv cu imersie Interpretarea rezultatelor Fondul preparatului apare colorat in albastru deschis iar bacteriile in albastru nchis.

Coloraia GRAM Reprezint coloraia de baza in microbiologie si mparte bacteriile in doua grupe: bacterii gram pozitive colorate in violet si bacterii gram negative colorate in rou, diferena de culoare se datoreaz deosebirii de permeabilitate a peretelui celular. Principiul coloraiei Bacteriile se coloreaz cu un colorant acridinic (cristal violet) si sunt fixate cu soluie iodoiodurata de potasiu (soluie de lugol), se formeaz complexe insolubile cu acidul ribonucleic celular, de culoare violet; diferena dintre bacteriile gram pozitive si gram negative consta in diferena de permeabilitate a peretelui celular pentru aceste complexe. Dup decolorare cu alcool acetona sau alcool absolut, bacteriile gram pozitive pstreaz complexele violet pe cnd cele gram negative le pierd, devenind incolore, acestea se vor recolora in rou fie cu fuxina, fie cu safranina. Materiale necesare lame de sticla cu frotiuri etalate si fixate soluie cristal violet soluie de lugol soluie alcool-acetona soluie fuxina fenicata diluata 1/10 sau safranina

Mod de lucru - frotiul fixat la flacara se acopera cu soluie de cristal violet timp de un minut - se spal lama cu soluie lugol 2 minute (iodul servete ca fixator in coloraie) - se indeparteaza lugolul - se decoloreaz preparatul cu alcool-acetona cteva secunde sau cu alcool absolut 2 minute - se spal abundent cu apa - se acoper lama cu soluie de fuxina fenicata diluata 1/10 sau cu safranina - se spal lama cu apa - se usuc - se examineaz la microscop optic cu obiectiv cu imersie Interpretarea rezultatelor Frotiul colorat Gram din produsul biologic furnizeaz date care se refera la prezenta celulelor inflamatoare (polimorfonucleare neutrofile, macrofage), morfologia bacteriilor (coci, bacili, vibrioni, spirili), dispoziia lor (in ciorchine, grmezi, diplo, tetrade, lanuri, palisada, litere chinezeti sau majuscule), daca exista o singura specie sau mai multe specii bacteriene, relaia lor cu celulele existente in produsele patologice (intracelular sau extracelular).