Coloratii compuse

Metodele compuse de colorare a microbilor se bazeaza pe unele caractere chimice

ale celulei bacteriene.
Cele mai uzuale coloratii compuse sunt:

Coloratia Gram prin care microbii sunt clasificati in Gram-pozitivi si Gramnegativi

Coloratia Ziehl-Neelsem prin care germenii se impart in acido-alcoolorezistenti si neacido-alcoolo-rezistenti

Tehnica coloratiei Gram

Unele bacterii colorate cu derivati bazici de pararozanilina si mordensate cu iod
rezista la decolorarea cu alcool-acetona, in timp ce altele nu rezista.
De aici necesitatea recoltarii frotiului cu fucsina care recoloreaza bacteriile care nu
au retinut prima colorare. Bacteriile care rezista la decolorarea cu alcool-acetona
sunt numite Gram pozitive (G+) si apar colorate in violet ; restul bacteriilor se
decoloreaza sub actiunea alcool-acetonei si se recoloreaza cu fucsina decolorata,
aparand colorate in rosu si sunt numite Gram negative (G-)
Principiul acestei metode consta in formarea unui complex intre celula microbiana,
cu un colorant din grupul trifenil metanului ( violetul de gentiana sau violetul de
metil) si iodul, complex care este insolubil in alcool-acetona.
Tehnica coloratiei Gram :
1. Colorarea : se acopera frotiul uscat si fixat cu solutia de violet de gentiana
sau violet de metil ; se tine 1-2 minute, se varsa colorantul si se spala frotiul
cu apa de la robinet
2. Mordansarea : se acopera frotiul cu solutie Lugol, se tine cateva secunde si
se varsa, dupa care se acopera din nou cu solutie Lugol care se tine 4-5
minute, dupa care se indeparteaza solutia din nou.
3. Decolorarea : fara a spala frotiul, se acopera cu alcool-acetona , inclinanduse lama pentru a usura actiunea decolorantului. Se decoloreaza pana ce
culoarea nu mai trece in solutie si frotiul devine alb , timp de 15-20 secunde.
Se spala cu apa de la robinet pentru a opri actiune decolorantului.
4. Recoltarea : se acopera frotiul cu fucsina fenicata si se mentie 1-2 minute,
dupa care se spala cu apa, se usuca si se examineaza la microscop cu
obiectivul cu imersie.
Coloratii speciale
Acestea se realizeaza pentru punerea in evidenta a capsulei, a sporilor, a cililor, a
nucleului.

Coloratia sporilor bacterieni

La unele bacteria forma vegetative adica de crestere si de multiplicare, se poate
transforma intr-un spor bacteriile respective fiind sporogene.Sporul bacerian poate fi
pus in evident fie prin metode obisnuite (coloratia Gram) sau prin metode speciale.
In cazul coloratiei Gram corpul baceriei apare colorat, iar sporul , ca o formative
refringenta inconjurata de o membrane groasa.
Coloratia cu verde malachite
Frotiurile fixate prin caldura se acopera cu o solutie apoasa de verde malachit. Se
incalzeste frotiul pana se emit vapori se lasa sa se raceasca si apoi se indeparteaza
colorantul. Operatia se repeta de 3 ori, dupa care lama se lasa sa se raceasca se
spala cu apa de robinet si se coloreaza cu fucsina diluata. La examenul microscopic
corpul bacteriilor apare colorat in rosu, iar sporii in verde.
Coloratia capsule
Punerea in evident a capsule se poate face prin reactia Gram, cand corpul bacteriei
apare colorat in timp ce capsula se prezinta ca o forma necolorata, luminoasa in
jurul capsului bacteriene.
Se acopera frotiul cu o solute de albastru de metilen Loffer, si se lasa timp de 2-3
minute. Se varsa apoi colorantul, se spala cu apa de robinet , se usuca si se observa
cu obiectivul cu imersie. Capsula se va colora metacromatic in roz, in timp ce corpul
bacterian se va colora in albastru.
Coloratiile cililor
Cilii constituie organite de locomotie, filamentoase, flexibile care au afinitate
scazuta pentru colorantii obisnuiti.
Metoda Leiferson : se acopera frotiul cu solutie coloranta si se lasa 15 minute la
temperatura camerei, dupa care se spala , se usuca si se examineaza la obiectivul
cu imersie. Cilii se vad colorati in roz sau rosu iar corpul bacteriei apare necolorat
sau colorat in roz pal.