Domeniul major de intervenie 1.

5 Programe doctorale si post -doctorale in sprijinul cercetarii Titlul proiectului: ORGANIZAREA SCOLII POSTDOCTORALE DE INTERES NATIONAL BIOTEHNOLOGII APLICATE CU IMPACT IN BIOECONOMIA ROMANEASCA No proiect: POSDRU/89/1.5/S/52432 PROGRAM DE INVATAMANT SI PREGATIRE INDIVIDUALA PROMOTIA II UPB

Proiect Final de Cercetare

Titlul proiectului de cercetare: BIOTEHNOLOGIE DE OBINERE A INOCULULUI BACTERIAN CU ROL DE PROTECTIE ANTIFUNGICA

Tutore, Prof. dr. Romulus DIMA

Student postdoctorand, Dr. Valeria GAGIU

Bucureti 2012

REZUMAT

Scopul proiectului de cercetare postdoctorala a fost obtinerea si optimizarea fermentatiei unui aluat acid de grau cu inocul Lactobacillus plantarum cu activitate inhibitoare fata de cresterea fungilor toxigeni.

Lb. plantarum a fost evaluat pentru cresterea in doua medii de cultura, iar activitatea antifungica a fost testata fata de fungi toxigeni si analizata comparativ cu cea a propionatului de calciu (conservant de referinta in industria panificatiei).
Procesul de optimizare a aluaturilor acide cu inocul Lb. plantarum a fost controlat prin urmatorii factori exogeni: consistenta (DY); temperatura si timp de fermentatie; adaos de carbohidrati (maltoza, sucroza, fructoza); adaos NaCl. Monitorizarea procesului de optimizare a aluaturilor acide a fost realizata prin determinarea urmatorilor parametri: bacterii acidolactice, pH, aciditate titrabila totala, acizi carboxilici (lactic, acetic, tartric si oxalic), activitate inhibitoare a cresterii fungilor toxigeni.

Au fost efectate testari tehnologice cu aluaturile acide de grau, tip 650 DY 220, care au prezentat cei mai buni parametri de fermentatie si activitate de inhibare totala a cresterii fungilor toxigeni. Aluaturile acide, aluaturile de paine si painile obtinute au fost analizate biochimic, fizico-chimic, microbiologic si a fost observata amprenta senzoriala.

OBIECTIVELE LUCRARII
Obiectivul general al acestui proiect de cercetare a fost dezvoltarea unei biotehnologii de obtinere a unui inocul bacterian cu efect de protectie antifungica.
Obiectivele specifice ale proiectului de cercetare au fost reprezentate de: - prezentarea caracteristicilor unui inocul Lb. plantarum (genetic, microbiologic, biochimic, tehnologic); - comparatie intre efectul inhibitor al inoculului Lb. plantarum si propionatului de calciu fata de fungi toxigeni; - dezvoltarea si optimizarea unei biotehnologii de obtinere a unor aluaturi acide de grau fermentate cu inocul Lb. plantarum cu efect antifungic; - caracterizarea microbiologica, fizico-chimica si senzoriala a painilor obtinute cu adaos de aluaturi acide de grau, fermentate cu inocul Lb. plantarum. Lb. plantarum, izolat din aluaturi acide de secara, a fost utilizat pentru dezvoltarea unor aluaturi acide de grau, in scopul prevenirii contaminarii painii cu fungi toxigeni si fungi totali, precum si pentru imbunatatirea indicatorilor de calitate fizico-chimica si senzoriala a painilor. Procesul de optimizare a aluaturilor acide de grau a fost controlat printr-un set de factori exogeni, iar rezultatele experimentarilor de laborator au fost continuate la nivel de statie pilot.

PARTEA EXPERIMENTALA

CRESTEREA INOCULULUI BACTERIAN IN MEDII DE CULTURA

- Lactobacillus plantarum (C71, C78, C81) (Facultatea de Biologie, Bucuresti); - Determinarea viabilitatii si morfologiei Lb. plantarum in bulion/agar MRS (Biokar Diagnostic) si bulion/agar SDB (Atlas, 1993); - Determinarea acizilor carboxilici (lactic, acetic, oxalic si tartric) metoda HPLC .

EFECTUL INHIBITOR AL INOCULULUI LACTOBACILLUS PLANTARUM SI AL PROPIONATULUI DE CALCIU FATA DE FUNGI TOXIGENI - Propionat de calciu (SC Baneasa Morarit - Panificatie SA); - Fusarium graminearum 96 (Fg 96), F. culmorum 46 (Fc 46), F. verticillioides (Fv)

(INCDA Fundulea) si Aspergillus flavus 1038L (Univ. Dunarea de Jos din Galati);
- Metoda de difuzie radiala in mediu Malt extract agar (MEA; Biokar Diagnostic).

DEZVOLTAREA SI OPTIMIZAREA UNOR ALUATURI ACIDE DE GRAU FERMENTATE CU INOCUL MIXT LACTOBACILLUS PLANTARUM CU ACTIVITATE INHIBITOARE FATA DE FUNGI TOXIGENI

- Materiale: Inocul mixt Lb. plantarum (3:1:2), in bulion SDB;

- Carbohidrati: Maltoza (Sigma Aldrich), Sucroza (Fluka), Fructoza (Fluka); - Clorura de sodiu (NaCl) (SC Silal Trading SRL); - Faina alba de grau, tip 650 (SC Pambac SA, Bacau).
5

DEZVOLTAREA SI OPTIMIZAREA UNOR ALUATURI ACIDE DE GRAU FERMENTATE CU INOCUL MIXT LACTOBACILLUS PLANTARUM CU ACTIVITATE INHIBITOARE FATA DE FUNGI TOXIGENI

Aluaturi acide de grau, tip 650 - DY 400 (lichide): faina grau 20 g; apa distilata 60 ml (Paramithiotis si altii, 2005). Controlul procesului de fermentatie a aluaturilor acide DY 400:

- Maltoza, Sucroza, Fructoza 0%, 2.5%, 5% (raportat la faina);

- Clorura de sodiu 0%, 0.7%, 1.4% (raportat la faina); - Inocul Lb. plantarum 2% (raportat la faina); - Ingredientele au fost adaugate in flacoane Erlenmayer (100 ml), omogenizate prin agitare si incubate la 320C10C/18...20 ore/180 rpm (incubator Heidolph cu agitare). >>> 27 aluaturi acide din faina de grau, tip 650 - DY 400.

Aluaturi acide de grau, tip 650 - DY 220 (semi - consistente): faina grau 187.5 g; apa distilata 221.5 ml (Minervini si altii, 2010). Controlul procesului de fermentatie a aluaturilor acide DY 220: - Maltoza, Sucroza, Fructoza 0%, 2.5%, 5% (raportat la faina); - Clorura de sodiu 0%, 0.7%, 1.4% (raportat la faina);

- Inocul Lb. plantarum 2% (raportat la faina);

- Ingredientele au fost adaugate in cuva unui mixer Krups de laborator, omogenizate la viteza mica 1 2 si apoi la viteza 5 6, timp de 5 minute; - Aluaturile in pungi de polipropilena, sigilate, au fost incubate la 320C10C/18...20 ore. >>> 27 aluaturi acide din faina de grau, tip 650 - DY 220.
6

PARAMETRII URMARITI IN DEZVOLTAREA SI OPTIMIZAREA ALUATURILOR ACIDE Aluaturi acide de grau, tip 650 - DY 400 - Populatia totala de bacterii lactice (LAB, ufc/g); - pH; - Aciditate titrabila totala (TTA, ml solutie 0.1N NaOH pana la pH 8.5 sub agitare). Aluaturi acide de grau, tip 650 - DY 220 - Populatia totala de bacterii lactice (LAB, ufc/g); - pH; - Aciditate titrabila totala (TTA, ml solutie 0.1N NaOH pana la pH 8.5); - Acizi carboxilici (acizii lactic, acetic, oxalic, tatric, g/g metoda HPLC); - Activitatea inhibitoare a aluaturilor acide DY 220 fata de cresterea fungilor toxigeni Fusarium graminearum 96 (Fg 96), Fusarium culmorum 46 (Fc 46), Fusarium verticillioides (Fv) si Aspergillus flavus 1038L (Af 1038L) (metoda de difuzie din discuri).

Echipamentele din laboratorul de microbiologie, utilizate in experimentari:

- Balanta electronica Sartorius GE512 OCE (cantarire probe si ingrediente aluaturi); - Omogenizator Stomacker circulator, Seward 400 (omogenizare aluaturi si paini); - Centrifuga Allegra 21R Beckman Coulter (5000 rpm, 40C; centrifugare aluaturi acide de grau, tip 650 - DY 220); - pH-metru de laborator, WTW Inolab pH 730; - Incubator TC 100 (320C; incubare bacterii lactice); - Incubator Sanyo MIR-153 (250C; incubare fungi); - Autoclav Systec MLV 3870 (preparare medii de cultura); - Autoclav Sanyo (decontaminare materiale); - Etuva Venticell (sterilizare materiale); - Hota cu flux laminar vertical, Faster VS 4 (inoculare probe pentru analiza LAB si fungi).

CARACTERIZAREA PAINILOR OBTINUTE CU ADAOS DE ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 DY 220
CARACTERIZARE TEHNOLOGICA - Faina de grau tip 650 (SC Vel Pitar SA); drojdie de panificatie Pakmaya; tavi aluminiu (180 mm 120 mm 60 mm); cuptor de coacere cu 2 vetre suprapuse (Mondial Forni, Italia); pungi de polietilena multistratificata (Film Top Tray 50 LAF), masina de ambalat in atmosfera modificata si in vid MultiVac C200. - Adaos 10% aluaturi acide de grau, tip 650 DY 220 (cu activitate de inhibare totala a cresterii fungilor toxigeni) Propionat de calciu (0.3%) metoda directa de preparare a painii.

CARACTERIZARE FIZICO - CHIMICA SI MICROBIOLOGICA - Metode clasice, standardizate si acreditate RENAR SR EN ISO/CEI 17025 Certificat 417/2010, rev. 2011) EVALUAREA AMPRENTEI SENZORIALE A PAINILOR - Sistem multisenzor -Prometheus 4000 (sistem de 18 senzori si un spectrometru de masa; soft AlphaSoft).
-

REZULTATE SI DISCUTII

10

PREZENTAREA CARACTERISTICILOR TULPINILOR DE BACTERII LACTICE UTILIZATE

- Lb. plantarum (C71, C78, C81)
- Sursa de izolare: aluaturi de secara simple, fermentate la 320C si propagate 7 zile. - Identificare moleculara (metoda Rep-PCR; dendrograma realizata cu soft Quantity One): analiza diferentelor intraspecifice a aratat apropierea filogenetica de tulpina de referinta Lb. plantarum ATCC 8014. - Acizi organici (lactic, acetic, oxalic, tartric).

11

CRESTEREA INOCULULUI BACTERIAN IN DOUA MEDII DE CULTURA

- MORFOLOGIA COLONIILOR LACTOBACILLUS PLANTARUM PE MEDIILE DE CULTURA
- Inoculul mixt Lb. plantarum (3:1:2) a prezentat rezultate foarte bune in mediul SDB (1.3 log ufc/ml; pH 3.53, TTA 4.2 ml solutie 0.1N NaOH) si a fost testat pentru activitatea inhibitoare fata de cresterea fungilor toxigeni F. graminearum 96, F. culmorum 46, A. flavus 1038L, cel mai eficient fiind fata de tulpinile Fg 96, Fc 46 si Af 1038L (8.0...8.7 mm). Morfologia coloniilor Lb. plantarum pe agarul MRS: - M1 colonii rotunde, plate, albicioase, 3 7 mm; - M2 colonii lenticulare, diametrul 1 2 mm; - M3 colonii stelate, diametrul 1 3 mm. Morfologia coloniilor Lb. plantarum pe agarul SDB: - M1 colonii rotunde, albe, diametrul 1 2 mm.

12

INFLUENTA MEDIILOR DE CULTURA ASUPRA PARAMETRILOR DE FERMENTATIE AI LACTOBACILLUS PLANTARUM

13

14

EFECTUL INHIBITOR AL INOCULULUI LACTOBACILLUS PLANTARUM SI PROPIONATULUI DE CALCIU FATA DE FUNGI TOXIGENI

- Lb. plantarum (3:1:2) a fost cel mai eficient fata de tulpinile Fg 96, Fc 46 si Af 1038L (8.0...8.7 mm).

- PCa nu a inhibat cresterea fungilor toxigeni nici la concentratia maxim legala de 0.3% (3000 ppm).

15

INFLUENTA PARAMETRILOR EXOGENI ASUPRA DEZVOLTARII SI OPTIMIZARII

UNOR ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 - DY 400

- Influenta asupra pH: Adaosul de maltoza, sucroza (2.5%, 5%) si NaCl (0.7%, 1.4%) a determinat o crestere a pH cu 0.01...0.1, cu exceptia fructozei (2.5%, 5%) care a determinat o scadere a pH cu 0.1. Efectul interactiv al carbohidratilor si clorurii de sodiu s-a manifestat printr-o usoara crestere a pH, in special in cazul fructozei. - Influenta asupra TTA (ml solutie 0.1N NaOH pana la pH 8.5): Adaosul de maltoza si sucroza nu a determinat modificari mari ale TTA. Adaosul de fructoza 2.5%, 5% a determinat o crestere a TTA cu 1.5 ml, iar adaosul de sare a determinat cresterea TTA cu aproximativ 2.5 ml. Valorile TTA inregistrate pentru aluaturile de grau, tip 650 - DY 400 sunt mult mai scazute decat pentru aluaturile de grau, tip 650 - DY 220. - Influenta asupra LAB: Aluaturile DY 400 au inregistrat 8.0 log ufc/g pentru toate concentratiile de maltoza si 8.4 - 8.5 log ufc/g in cazul adaosului de sucroza. - Pentru aluaturile cu adaos de fructoza, bacteriile lactice nu au crescut pe agarul MRS incubat la 320C pentru 3 zile. Aceasta situatie a aratat ca LAB sunt foarte stresate in aluaturile acide din cauza valorilor parametrilor de fermentatie (TTA, pH).

16

INFLUENTA PARAMETRILOR EXOGENI ASUPRA DEZVOLTARII SI OPTIMIZARII UNOR ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 - DY 220
- Influenta asupra pH: Adaosul de maltoza, sucroza (2.5%, 5%) si NaCl (0.7%, 1.4%) a determinat o usoara crestere a valorii pH (0.01...0.1), cu exceptia fructozei (2.5%, 5%) care a determinat o scadere a valorilor pH cu 0.7. - Efectul interactiv al carbohidratilor si clorurii de sodiu s-a manifestat, de asemenea, printro usoara crestere a valorii pH. Variantele in care s-a adaugat fructoza au scazut pH cu 0.7, insa la adaugarea NaCl, s-a inregistrat o crestere a pH cu 0.15. - Influenta asupra TTA (ml solutie 0.1N NaOH pana la pH 8.5): Maltoza singura nu a determinat modificari alte TTA, insa NaCl singura a determinat scaderea TTA cu 0.6 ml. - Cresterea sucrozei la 2.5%, 5% a determinat o scadere a TTA cu 0.2 ml. - Adaosul de fructoza 2.5% a determinat o crestere a TTA cu 0.9 ml, chiar adaosul simultan al NaCl mentinand o valoare crescuta a TTA; aceste variante cu fructoza au prezentat cele mai mari valori pentru TTA si cele mai scazute valori ale pH. - Influenta asupra LAB: Pentru toate aluaturile DY 220 nu au crescut LAB pe mediul MRS, dupa incubare la 320C, timp de 3 zile. Aceasta situatie a aratat ca bacteriile lactice sunt foarte stresate in aluaturile acide din cauza valorilor parametrilor de fermentatie (TTA, pH). - Influenta asupra aromei: Aluaturile acide DY 220, preparate cu faina de grau, tip faina 650 au prezentat o aroma intensa si placuta. Exceptie au facut aluaturile cu adaos de fructoza, la care s-a simtit un usor miros metalic, ca urmare a valorilor mari ale TTA si pH scazut.

17

ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 - DY 400 (Lichide) ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 - DY 220 (Semi - consistente)

18

TTA
12 11 10 9 8 7 6 5
2.9 2.7 2.5 2.3

pH
3.7 3.5 3.3 3.1

0 % Maltoza

0 % Maltoza 2.5 % Maltoza 5 % Maltoza 0 % Sucroza 2.5 % Sucroza 5 % Sucroza 0 % Fructoza 2.5 % Fructoza 5 % Fructoza 0 % Maltoza 2.5 % Maltoza 5 % Maltoza 0 % Sucroza
DY 400 DY 220

2.5 % Maltoza 5 % Maltoza

0 % Sucroza 2.5 % Sucroza

0 % NaCl DY 220

0 % NaCl

5 % Sucroza 0 % Fructoza 2.5 % Fructoza 5 % Fructoza 0 % Maltoza 2.5 % Maltoza 5 % Maltoza 0 % Sucroza 2.5 % Sucroza 5 % Sucroza
1.4 % NaCl 0.7 % NaCl
Aluaturi acide grau

0.7 % NaCl

Aluaturi de grau DY 400

1.4 % NaCl

2.5 % Sucroza 5 % Sucroza 0 % Fructoza 2.5 % Fructoza 5 % Fructoza

0 % Fructoza 2.5 % Fructoza 5 % Fructoza

LAB, log ufc/g

8.8 8.6 8.4 8.2 7.8 8

0 % Maltoza 2.5 % Maltoza 5 % Maltoza

0 % Sucroza 2.5 % Sucroza

0 % NaCl

DY 220 Aluaturi acide grau DY 400

5 % Sucroza 0 % Fructoza 2.5 % Fructoza 5 % Fructoza 0 % Maltoza 2.5 % Maltoza 5 % Maltoza

0.7 % NaCl

1.4 % NaCl

0 % Sucroza 2.5 % Sucroza 5 % Sucroza

0 % Fructoza 2.5 % Fructoza 5 % Fructoza

Evolutia parametrilor primari de fermentatie a aluaturilor acide de grau, tip 650 - DY 220 / DY 400

19

20

21

INFLUENTA PARAMETRILOR EXOGENI ASUPRA DEZVOLTARII SI OPTIMIZARII

UNOR ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 - DY 400

Influenta asupra pH: Adaosul de maltoza, sucroza (2.5%, 5%) si NaCl (0.7%, 1.4%) a determinat o crestere a pH cu 0.01...0.1, cu exceptia fructozei (2.5%, 5%) care a determinat o scadere a pH cu 0.1. Efectul interactiv al carbohidratilor si clorurii de sodiu s-a manifestat printr-o usoara crestere a pH, in special in cazul fructozei.

- Influenta asupra TTA (ml solutie 0.1N NaOH pana la pH 8.5): Adaosul de maltoza si sucroza nu a determinat modificari mari ale TTA. Adaosul de fructoza 2.5%, 5% a determinat o crestere a TTA cu 1.5 ml, iar adaosul de sare a determinat cresterea TTA cu aproximativ 2.5 ml. Valorile TTA inregistrate pentru aluaturile de grau, tip 650 - DY 400 sunt mult mai scazute decat pentru aluaturile de grau, tip 650 - DY 220.
- Influenta asupra LAB: Aluaturile DY 400 au inregistrat 8.0 log ufc/g pentru toate concentratiile de maltoza si 8.4 - 8.5 log ufc/g in cazul adaosului de sucroza. Aceasta situatie a aratat ca LAB sunt foarte stresate in aluaturile acide din cauza valorilor parametrilor de fermentatie (TTA, pH).

22

INFLUENTA PARAMETRILOR EXOGENI ASUPRA DEZVOLTARII SI OPTIMIZARII UNOR ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 - DY 220
- Influenta asupra pH: Adaosul de maltoza, sucroza (2.5%, 5%) si NaCl (0.7%, 1.4%) a determinat o usoara crestere a valorii pH (0.01...0.1), cu exceptia fructozei (2.5%, 5%) care a determinat o scadere a valorilor pH cu 0.7. - Efectul interactiv al carbohidratilor si clorurii de sodiu s-a manifestat, de asemenea, printro usoara crestere a valorii pH. Variantele in care s-a adaugat fructoza au scazut pH cu 0.7, insa la adaugarea NaCl, s-a inregistrat o crestere a pH cu 0.15. - Influenta asupra TTA (ml solutie 0.1N NaOH pana la pH 8.5): Maltoza singura nu a determinat modificari alte TTA, insa NaCl singura a determinat scaderea TTA cu 0.6 ml. - Cresterea sucrozei la 2.5%, 5% a determinat o scadere a TTA cu 0.2 ml. - Adaosul de fructoza 2.5% a determinat o crestere a TTA cu 0.9 ml, chiar adaosul simultan al NaCl mentinand o valoare crescuta a TTA; aceste variante cu fructoza au prezentat cele mai mari valori pentru TTA si cele mai scazute valori ale pH. - Influenta asupra LAB: Pentru toate aluaturile DY 220 nu au crescut LAB pe mediul MRS, dupa incubare la 320C, pentru 3 zile. Aceasta situatie a aratat ca bacteriile lactice sunt foarte stresate in aluaturile acide din cauza valorilor parametrilor de fermentatie (TTA, pH). - Influenta asupra aromei: Aluaturile acide DY 220, preparate cu faina de grau, tip faina 650 au prezentat o aroma intensa si placuta. Exceptie au facut aluaturile cu adaos de fructoza, la care s-a simtit un miros usor metalic, ca urmare a valorilor mari de aciditate totala si pH scazut.

23

INFLUENTA PARAMETRILOR EXOGENI ASUPRA SINTEZEI DE ACIZI ORGANICI IN ALUATURILE ACIDE DE GRAU, TIP 650 DY 220

Adaosul de fructoza (2.5%, 5%) si NaCl (0.7%, 1.4%) au determinat valorile cele mai mari de acizi lactic, tartric si oxalic. Cele mai mari cantitati de acid lactic si acid tartic, si in proportii aproape egale, au fost detectate in aluaturile acide cu adaos de fructoza. Se considera ca o prelungire a timpului de fermentatie a aluaturilor acide poate favoriza transformarea acidului tartric in acid lactic, ca urmare a actiunii LAB.

Deoarece acizii tartric si oxalic nu au fost detectati in culturile Lb. plantarum in bulion MRS sau bulion SDB, se considera ca sinteza lor in aluaturile acide de grau, tip 650 - DY 220 a fost determinata de parametrii exogeni de fermentatie. Acidul oxalic este unul dintre cei mai puternici acizi carboxilici si a fost detectat in toate aluaturile acide, la valori peste 3.5 g/g, cu exceptia aluaturilor cu adaos de sucroza / 0.7% NaCl si 0%, respectiv 2.5% Maltoza / 0% NaCl.
24

CARACTERIZAREA ALUATURILOR ACIDE DE GRAU, TIP 650 - DY 220

25

CARACTERIZAREA PAINILOR OBTINUTE CU ADAOS DE ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 DY 220
CARACTERIZARE TEHNOLOGICA, BIOCHIMICA, FIZICO-CHIMICA SI MICROBIOLOGICA

- PCa 0.3% a prelungit dospirea cu 5 10 min. (exceptie aluatul 0.7% NaCl/5% Maltoza).
- La sfarsitul dospirii, aluaturile de paine au inregistrat cresteri ale TTA cu 0.4...1.8 ml, painile corespunzatoare prezentand de asemenea TTA mai mari cu 0.3...0.9 ml. - Toate variantele de paini au fost corespunzatoare pentru indicatorii de calitate fizico - chimici, existand diferente mici intre ele ca urmare a tipului de aluat acid adaugat. - Toate variantele de paini au fost corespunzatoare (7 zile) pentru contaminarea microbiologica (fungi totali), dar au prezentat o modificare a sfaramiciozitatii miezului.

26

CARACTERIZAREA PAINILOR OBTINUTE CU ADAOS DE ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 DY 220
ANALIZA AMPRENTEI SENZORIALE - Painile AA 3.1. (0% NaCl / 0% Zahar, fara PCa) au avut o amprenta senzoriala mai puternica (miros acid puternic), desi valorile TTA pentru aluatul acid, aluatul de paine si paine au fost dintre cele mai scazute. Valorile de pH ale aluatului acid AA3 au fost cele mai mici (pH 3), si au fost corelate cu valori mai scazute pentru elasticitatea si textura miezului.

- Adaosul de PCa (0.3%) a avut un efect negativ asupra painilor AA 3.0, acestea prezentand cea mai scazuta amprenta senzoriala, corelata cu cele mai mici valori ale diametrului, inaltimii, TTA, pH si umiditate a miezului pentru paine. Explicatia acestor valori este un efect sinergic negativ al PCa 0.3% si aluatului acid de grau, tip 650 DY 220. - In urma evaluarii spectrului, s-a observat ca painile AA 5 (0 % NaCl / 2.5 % Sucroza / 0.3% PCa), AA 10 (0.7 % NaCl / 0 % Maltoza / 0.3% PCa) si AA 16 (0.7 % NaCl / 5 % Maltoza / 0.3% PCa) prezinta o amprenta senzoriala apropiata.

27

CONCLUZII

1. EFECTUL INHIBITOR AL INOCULULUI LACTOBACILLUS PLANTARUM SI PROPIONATULUI DE CALCIU FATA DE FUNGI TOXIGENI
1.1). Inoculul Lb. plantarum (3:1:2) a prezentat cei mai buni parametri de fermentatie (numar bacterii, pH, TTA, acizi organici) in mediile MRS si SDB si activitatea cea mai eficienta de inhibare a fungilor toxigeni Fusarium graminearum 96 (Fg 96) si Fusarium culmorum 46 (Fc 46). 1.2). Lb. plantarum (3:1:2) in bulionul SDB a prezentat parametri de fermentatie mai mici decat in bulionul MRS, insa a fost eficient in dezvoltarea si optimizarea unor aluaturi acide de grau, cu fermentatie controlata prin parametri exogeni. 1.3). Este necesar ca inoculul Lb. plantarum sa fie utilizat impreuna cu propionatul de calciu pentru asigurarea unui spectru antifungic mai larg.

2. DEZVOLTAREA SI OPTIMIZAREA UNOR ALUATURI ACIDE DE GRAU FERMENTATE CU INOCUL MIXT LACTOBACILLUS PLANTARUM CU ACTIVITATE INHIBITOARE FATA DE FUNGI TOXIGEN
2.1). Raportat la aluaturile acide de grau, tip 650 - DY 400 (lichide), aluaturile acide de grau, tip 650 - DY 220 (semi-consistente) au prezentat valori mai mari ale TTA si valori mai mici ale pH, explicate prin cantitatea mai mare de faina (substanta uscata) a aluaturilor acide DY 220. 2.2). Valorile parametrilor de fermentatie au fost determinate de parametrii exogeni de control (inocul bacterian, tip de faina utilizata, adaos de carbohidrati si sare, consistenta aluat, temperatura si timp de fermentatie). 2.3). Din cele 27 variante de aluaturi acide de grau, tip 650 - DY 220 (semi-consistente) doar 7 aluaturi acide au inhibat total cresterea fungilor toxigeni Fg 96 si Fc 46, anume: 1). 0% NaCl / 2.5 % Maltoza; 2) 0% NaCl / 2.5% Sucroza; 3) 0% NaCl / 0% Fructoza; 4) 0.7% NaCl / 0% Maltoza; 5) 0.7% NaCl / 5% Maltoza; 6) 0.7% NaCl / 2.5% Fructoza; 7) 1.4% NaCl / 2.5% Maltoza. 2.4). Aluaturile acide de grau, tip 650 - DY 220 (semi-consistente) preparate cu adaos de Maltoza NaCl au fost cele mai eficiente in inhibarea cresterii totale a fungilor toxigeni Fusarium graminearum 96 si Fusarium culmorum 46.
28

CONCLUZII

3). CARACTERIZAREA PAINILOR OBTINUTE CU ADAOS DE ALUATURI ACIDE DE GRAU, TIP 650 DY 220
Adaosul 10% de aluaturi acide de grau, tip 650 - DY 220 (semi-consistente) in aluaturile de paine ( propionat de calciu 0.3%) a determinat urmatoarele efecte: 3.1). usoara crestere a timpului de fermentatie a aluatului de paine (5...10 min); acest aspect poate fi corectat prin utilizarea unui ameliorator de panificatie; 3.2). cresterea aciditatii titrabile totale (aluat de paine: TTA 3...4.8; paini: TTA 1.3...3.6); 3.3). toate painile au fost corespunzatoare pentru indicatorii de calitate fizico-chimici, existand diferente mici intre ele ca urmare a tipului de aluat acid adaugat; 3.4). toate painile au fost corespunzatoare (7 zile) pentru contaminarea cu fungi totali, dar au prezentat o modificare a sfaramiciozitatii miezului; acest aspect va fi corectat prin utilizarea unui ameliorator de panificatie, disponibil comercial; 3.5). painile cu adaos de aluat acid control (inocul Lb. plantarum, fara adaos de carbohidrati/sare) si fara adaos de propionat de calciu au prezentat o amprenta senzoriala mai puternica (miros placut si intens de fermentatie acidolactica); 3.6). painile cu adaos de aluat acid control (inocul Lb. plantarum, fara adaos de carbohidrati/sare) si cu adaos de propionat de calciu au prezentat amprenta senzoriala cea mai mica, urmare a efectului negativ al propionatului asupra fermentatiei bacteriilor lactice si drojdiei de panificatie; 3.7). adaosul de aluaturi acide cu fermentatie optimizata (prin parametri exogeni) pentru inhibarea totala a cresterii fungilor toxigeni Fg 96 si Fc 46, a contracarat efectul negativ al propionatului de calciu asupra amprentei senzoriale a painilor. Utilizarea aluaturilor acide de grau, tip 650 - DY 220 (semi-consistente) [fermentate cu inocul Lb. plantarum cu activitate de inhibare a cresterii fungilor toxigeni Fusarium graminearum 96, Fusarium culmorum 46] ca adaos 10% in tehnologia directa de fabricare a painii, a dus la obtinerea unor paini usor acide, cu proprietati fizico-chimice, microbiologice si senzoriale imbunatatite.
29

CONTRIBUTII ORIGINALE

Inoculul Lb. plantarum - combinarea tulpinilor C71, C78 si C81 in raportul 3:1:2. Tulpinile pure au fost izolate din aluaturi acide de secara, fermentate natural (a 5-a etapa de reimprospatare), prezentand toleranta ridicata la aciditate si activitate inhibitoare fata de fungi toxigeni.
Stabilirea parametrilor exogeni: inocul mixt Lb. plantarum (2% raportat la faina), temperatura de fermentatie (320C), timp de fermentatie (18 ore); tip si procent de utilizare a carbohidratilor (maltoza, sucroza, fructoza 0%, 2.5%, 5%, raportat la faina), procent de utilizare a NaCl (0%, 0.7%, 1.4%, raportat la faina). Utilizarea fainii albe de grau tip 650 pentru prepararea unor aluaturi acide tip II, cu consistenta lichida (DY 400) si semi-consistenta (DY 220). Faina de grau 650 este utilizata cel mai frecvent in industria de panificatie, neexistand problema furnizarii, precum in cazul fainii de grau tip 1100 si fainii de secara. Modul de conducere a procesului biotehnologic de obtinere a aluaturilor acide de grau, tip 650 DY 220 pentru inhibarea totala a cresterii fungilor toxigeni (Fusarium graminearum 96, Fusarium culmorum 46) si imbunatatirea indicatorilor de calitate a painii (fizico-chimici, microbiologici si senzoriali).

Imbinarea metodelor si tehnicilor din domeniul biotehnologiei, microbiologiei, biochimiei, analizei senzoriale si tehnologiei panificatiei.

30

Anexa 1 - Lista cu lucrari Valeria Gagiu Biotehnologie de obinere a unui aluat acid de grau fermentat cu inocul Lb. plantarum, cu efect de protecie antifungic - Seminar Stiintific Promovarea contributiilor biotehnologiilor la aplicarea conceptului de dezvoltare durabila. Universitatea Politehnica Bucuresti, 19, 26 Octombrie 2012.

Valeria Gagiu, Nastasia Belc, Diana Pelinescu, Romulus Dima. Development and optimization on an wheat sourdough fermented by Lactobacillus plantarum with inhibitory activity on toxigenic fungi. Poster abstract. Biotoxin Knowledge Conference SAFEFOOD Conference. Biotoxin and Chemical Residue in Food, Biotoxins and Chemical Residues in Food, Belfast, Irlanda, 29 November 2012.
Anexa 2 - Lucrari publicate (indicatori de rezultat) Valeria GAGIU, Florentina Israel-Roming, Nastasia Belc, Romulus Dima. INHIBITORY ACTIVITY OF LACTOBACILLUS PLANTARUM AND CALCIUM PROPIONATE ON THE GROWTH OF TOXIGENIC FUNGI (Accept publicare nr. 20/12.12.2012, Romanian Biotechnological Letters Journal, Factor Impact = 0,359). Valeria GAGIU, Florentina Israel-Roming, Nastasia Belc, Romulus Dima. DEVELOPMENT OF AN WHEAT SOURDOUGH FERMENTED BY LACTOBACILLUS PLANTARUM WITH INHIBITORY ACTIVITY ON THE GROWTH OF TOXIGENIC FUNGI (Accept publicare nr. 21/12.12.2012, Romanian Biotechnological Letters Journal, Factor Impact = 0,359).

31

CADRUL DE DESFASURARE A PROIECTULUI DE CERCETARE POSTDOCTORALA

Proiectul de cercetare POSTDOCTORALA BIOTEHNOLOGIE DE OBINERE A INOCULULUI BACTERIAN CU ROL DE PROTECTIE ANTIFUNGICA a beneficiat de suport financiar prin proiectul POSDRU/89/1.5/S/52432 din 2010, ORGANIZAREA SCOLII POSTDOCTORALE DE INTERES NATIONAL BIOTEHNOLOGII APLICATE CU IMPACT IN BIOECONOMIA ROMANEASCA proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013. Partea experimentala a proiectului de cercetare postdoctorala a fost efectuata in cadrul INSTITUTULUI NATIONAL DE CERCETARE-DEZVOLTARE PENTRU BIORESURSE ALIMENTARE IBA BUCURESTI. Detectia acizilor organici a fost efectuata in cadrul CENTRULUI DE BIOCHIMIE APLICATA SI BIOTEHNOLOGIE BIOTEHNOL (Bucuresti). Ca tematica, proiectul de cercetare postdoctorala este complementar cu: Programul National Parteneriate in domenii prioritare - Domeniul 5 Agricultura, siguranta si securitate alimentara [5.1.8 Trasabilitatea pe lantul alimentar; 5.1.9 Reducerea reziduurilor si contaminantilor pe intregul lant alimentar; 5.1.10 Metodologii de inalta acuratete, sensibilitate si rapide pentru detectarea reziduurilor si contaminantilor]. Planul sectorial al MADR ASAS, Program ADER 2020 Imbunatatirea si dezvoltarea gamei de produse alimentare si a sigurantei acestora in concordanta cu cerintele nationale si internationale (INDAL) Evaluarea riscului privind contaminarea cu micotoxine a productiilor anuale de grau din Romania (ADER 8.1.1). Rezultatele stiintifice obtinute dezvolta cunostintele si expertiza personala si institutionala in domeniul biotehnologiilor dezvoltate in industria de panificatie, in scopul asigurarii sigurantei alimentare. Corelarea acestor domenii prezinta un impact important pentru dezvoltarea si implementarea strategiei nationale pentru siguranta alimentara.
32

Dr. biolog Valeria Gagiu E-mail: valeria_gagiu@yahoo.com

33