Laborator Imunobiologie Citometrie in flux

Introducere In cazul organsimelor superioare initierea si controlul raspunsului imun sunt rezulatatul interactiunilor complexe dintre populatiile de limfocite T si B, si subpopulatiilor lor. Investigarea functiilor fiecarei subpopulatii de limfocite, estimarea gravitatii dezechilibrelor imunologice in cazurile patologice au devenit posibile incepand cu anii '70, odata cu perfectionarea tehnicilor de laborator (citometrie de flux) ce permit decelarea unor markeri de membrana specifici, caracteristici acestor populatii si subpopulatii, care le diferentiaza intre ele. Acesti markeri sunt reprezentati prin receptorii de suprafata (dintre care cei mai specializati sunt receptoriii de antigen) si molecule care mediaza raspunsul acestor celule la mitogeni. Printre tehnicile de laborator care permit evidentierea tipurilor de limfocite se afla si citometria de flux.

Citometria de flux Citometria de flux reprezint o abordare tehnic nou, de mare complexitate care pemite determinarea simultan a mai multor parametri fizici i chimici ai unei singure celule aflate n micare ntr-un curent lichid. Parametrii msurai inculd mrimea relativ a celulei, granularitatea sau complexitatea intern i intensitatea flourescenei. Aceste caracteristici sunt determinate folosind un sistem optic-electronic care nregistreaz modul n care celula disperseaz lumina incident a laserului i emite flourescena. Un citometru de flux este compus din 3 sisteme principale: sistemul fluidic, sistemul optic i sistemul electronic. Sistemul fluidic (hidraulic) Rolul sistemului fluidic este de a transporta celulele n curentul lichid spre fasciculul laser. Pentru o iluminare optim curentul lichid care transport particulele trebuie poziionat n centrul razei laser. Doar o singur celul sau particul trebuie s se deplaseze prin raza laser.

n acest scop proba este injectata ntr-un curent al unui fluid de nveli (sheet fluid) in camera de flux. Designul camerei de flux face c proba s fie concentrat n centrul fluidului de nveli pentru c apoi fasciculul laser s interacioneze cu particulele ( James V.Watson., 2004). Proba reprezentata de celule pe baza principiilor referitoare la fluxul laminar rmne separat de fluidul de inveli. Fluidul de inveli asigura migrarea celulelor i le direcioneaz spre centrul curentului (fig. 1).

mprtierea luminii. mprtierea luminii se produce atunci cnd o particul (celula) determina dispersia (imprastierea) razei laser incident. Msura n care acest lucru se ntampl depinde de proprietile fizice ale particulei, n special de mrimea i de complexitatea intern a acesteia. Factorii care afecteaz mprtierea luminii sunt: membrana celular, nucleul, i orice material granular din interiorul celulei. Forma celulei i topografia suprafeei acesteia contribuie de asemenea la dispersia luminii. Lumina dispersat nainte (Forward scatter light - FSC) Lumina dispersat nainte este proporional cu suprafaa i mrimea celulei. FSC msoar lumina difractat i este detectat n cea mai mare parte pe axa incident a razei laser n direcia nainte de o fotodiod. FSC este declana semnalul de prelucrare. o metod potrivit de detectare a particulelor mai mari independent de flourescena lor i prin urmare este adesea folosit n imunofenotipare pentru a

Lumina dispersat lateral (Side-scatter light - SSC) Este proporional cu granularitatea celulei sau complexitatea intern. SSC reprezint n cea mai mare parte o msura a luminii reflectate i refractate ce apare la orice interfaa a celulei unde exist o schimbare n indexul de refractie. SSC este colectat la aproximativ 90 de grade fata de raza laser incidenta si redirecionata prin intermediul unui separator de fascicule spre un detector adecvat (fig.2 ).

Fig.2 . Modalitati de dispersie a a luminii

Corelarea msurtorilor realizate prin FSC i SSC permite diferenierea tipurilor celulare dintr-o populaie celular heterogen. Subpopulaii majore leucocitare pot fi difereniate folosind FSC i SSC ( fig.3 ).

Fig.3 Distributia in dot plot a subpopulatiilor bazate pe masuratorile FSC i SSC

Fluorescena Un compus flourescent absoarbe energia luminoas ntr-un spectru de lungimi de und caracteristic compusului respectiv. Absoria luminii determina o stare de excitatie energetica a compusului flourescent. Aceasta stare de incarcare energetica este instabila si ca urmare compusul respectiv revine rapid la starea anterioar emind excesul de energie (emisie de fotoni intr-o anumit spectru de unde). Tranziia energetic este denumit flourescen. Laserul cu argon este folosit n mod curent deoarece lumina pe care o emite (avnd o lungime de und de 488nm) exicit mai mult multi flourocromi. Unul dintre aceti flourocromi este izotiociantul de flourescin (FITC). n spectrul de absorbie al FITC lungimea de und 488 nm este aproape de maximul de absorbie al FITC. Excitaiile la aceast lungime de und vor determina o emisie inalt a FITC. Dac flourocromul ar fi fost excitat de o alt lungime de und din spectrului su de absorbitie, radiaiile emise nu ar avea aceeai intensitate. Pot fi folosii simultan mai muli flourocromi dac fiecare este excitat la o lungime de und de 488 nm i dac peak-urile lungimilor de unde emise nu sunt foarte de apropiate unele de altele (un ex este combinaia FITC cu ficoeritrina (PE)). Cu toate c maximul de absorbie al PE nu este la 488 nm, flourocromul este excitat suficient pentru a produce o emisie flourescent pentru detecie. Mai important peak-ul lungimii de und emise de FITC este 530 nm, i 570 nm pentru PE. Aceste valori sunt suficient de ndeprtate astfel nct fiecare semnal s poat fi detectat de detectoare separate. Cantitatea de semnal flourescent detectat este proporional cu numrul de molecule de flourocrom de pe fiecare particul. (fig 4,fig 5).

Fig.4 Spectrele de absorbtie ale unor flourocromi comuni( FITC, PE, PerCP, APC)

Fig.5 Spectrele de emisie ale flourocromilor FITC, PE, PerCP, APC

Dac un colorant flourescent este conjugat cu un anticorp monoclonal acesta poate fi folosit pentru a identifica un anumit tip celular bazat pe markerii antigenici de suprafa ai fiecrei celule. ( D. Porro. 1993 )

ntr-o populaie heterogen de celule, diferii flourocromi pot fi folosii pentru a distinge populaiile separate. Modelul de colorare al fiecrei populaii combinat cu datele obinute din analiza FSC i SSC pot fi folosite pentru a identifica celulele prezente n prob i pentru a le determina procentajul relativ. De asemenea celulele pot fi sortate.

Fig.6 Legare specifica flourocrom-anticorp pe suprafata antigenului

Sistemul optic Sistemul optic const n sistemul excitare (reprezentat de laser) i sisteme optice reprezentate de lentile care preiau lumina emis de interaciunea dintre particul i raza laser i oglinzi i filtre optice specifice pentru fiecare lungime de und a luminii colectate. Lentile au rolul de a forma i concentra raza laser.

Fig.7 Reprezentarea schematica a flowcitometrului

Sistemul electronic Semnalele luminoase sunt generate pe msur ce particula trece prin raza laser. Semnalele luminoase sunt convertite n semnale electronice de ctre fotodetector. Exist dou tipuri de fotodetectori BD n flowcitomeru: fotodiode i tuburi fotomultiplicatoare. Fotodioda este mai puin sensibil la semnalele luminoase dect PMT i prin urmare este folosit pentru a detecta semmalele puternice FSC. PMT sunt utilizate pentru a decta semnalele mai slabe generate de SSC i flourescenta. Un puseu de tensiune se creeaz cnd particula intra n raza de laser i ncepe s distribuie lumina i flourescenta. Odat ce semnalele luminoase sau fotonii se lovesc de o parte a PMT sau de fotodiod sunt convertite ntr-un numr proporional de electroni care sunt multiplicai creind un curent electric mai intens. Curentul electric trece prin amplificator i este convertit ntr-un puls de tensiune. Cel mai nalt punct al pulsului de tensiune are loc cnd particula este n centrul razei laser i valoarea maxim de dispersie i flourescena este atins. Pe msur ce particula prete fasciculul, tensiunea revine la normal (fig 8).

Fig.8. Generarea puseului de tensiune la trecerea celulei bacteriene prin faa razei laser

Dimensiunea puseului de tensiune depinde de numrul de fotoni detectai, voltajul PMT crete. Semnalele pot fi amplificate aplicnd o tensiune PMT creind un curent electric mai mare. Puseului de tensiune i se atribuie o valoare digital prin intermediul Convertorului Analog-to-Digital. ADC transform un puls cuprins ntre 0-1,000mV ntr-un numr digital

reprezentnd numrul canalelor cuprinse ntre 0-1,000mV. Semnalul luminos este apoi afiat n poziia corespunztoare pe histogram. Analiza datelor: colectarea i afiarea Odat ce datele au fost salvate, populaia celular poate fi afiata n cateva formate diferite. Un singur parametru cum este FSC sau FITC (FL 1) poate fi afiat sub forma unei histograme cu un singur parametru, unde axa orizontal reprezint semnalul parametrului i axa vertical reprezint numrul de evenimente. Fiecare eveniment este plasat n canalul corespunztor valorii semnalului. Semnalele cu aceeai intenstate se acumuleaz n acelai canal. Doi parametri pot fi afiati simultan n grafic. Un parametru este afiat pe axa X, i celalalt pe axa Y. Datele tridimensionale pot fi de asemenea vizualizate, astfel axele X i Y reprezint parametrii iar axa Z afiseaza numrul de evenimente pe canal (fig 9).

Fig.9 Reprezentare grafica a datelor

Un principiu important n flowcitometrie este capacitatea de a analiza selectiv celule de interes eliminand datele nedorite cum ar fi celule moarte sau resturile celulare. Aceast procedur se numete distribuie pe pori. n mod normal celulele au fost sortate n funcie de caracteristicile fiziologice. De exemplu resturile celulare pot fi difereniate de celule unice prin mrime (estimate prin intermediul parametrului forward scatter). n acelai timp celulele moarte

au un grad de dispersie a luminii n faa, mai mic i un grad de dispersie n lateral mai mare dect al celulelor vii. Pe histogram, fiecare punct reprezint o singur celul care a trecut prin raza laser. Punctele rosii/galbene reprezint un numr mare de evenimete dintr-o populaie celular. Culorile dau impresia unui aspect 3D. Histogramele de contur reprezint o alt modalitate pentru a demonstra acelai lucru. Graficul se aseamn n acest caz cu o harta geografic care, n principiu este foarte asemntoare cu histograma density plot. Uneori populatiile celulare discrete sunt mai uor de vizualizat prin intermediul histogramelor contur.( H. E. Steen. 1983)

Fig.10 Utilizarea gateing pentru a selecta populatiile celulare

Strategiile noi de gating utilizeaz parametrii flouresceni pe lng cei de dispersie a luminii. Sngele este folosit pentru a demonstra acest principiu. Mai jos n stnga este reprezentat o histogram FSC/SSC cu snge uman lizat. Limfocitele, monocitele, granulocitele au fost selectate n regiunile: regiunea 1 (R1), regiunea 2 (R2 ), respectiv regiunea 3 (R3) ( prin regiune se inelege aria desemnat pe histogram pentru a afia datele.) n partea dreapt aceeleai celule sunt analizate dar utiliznd parametrul SSC reprezentat

pe axa Y i markerul flourescent CD45 pe axa X. CD45 este un marker exprimat numai pe leucocie, lipsind pe celulele sangvine. n termeni relativi limfocitele au un nivel mic al SSC i mare nalt al parametrului CD45 (R4), granulocitele au un nivel nalt al parametrului SSC i scazut al parametrului CD45 (R6) n timp ce monocitele sunt situate undeva la mijloc ntre cei doi paramteri. Cea mai mare diferenta ntre limfocitele din R1 i cele din R4 este absena celulelor rosii facnd preparatul mult mai pur (fig 11).

Fig.11 Utilizarea gateing pentru a evidentia populatiile sangvine

Limfocitele din punct de vedere al functiilor indeplinite si al receptorilor de suprafata se clasifica in: Limfocite T (CD3+) limfocite T helper (CD4+) limfocite T citotoxic CD8+ limfocte B (CD 19+) celule natural killer (NK) (CD3-, CD16/56+)

Marcarea directa a celulelor Acesta metoda este aplicabila in cazul in care fluorocromul este direct legat de anticorpul primar adica conjugatelor PE, FITC and Alexa Fluor 1. Sangele periferic se recolteaza pe anticoagulant (EDTA sau heparina); 2. Un volum de 100 l se pipeteaza in tuburile de testat; 3. Se adauga anticorpii la dilutiile recomandate (specificatiile tehnice ale reactivilor respectivi) ; omogenizare si incubare la temperatura camerei timp de 30 de minute ; 4. Se spala celulele cu 2 ml PBS, se centrifugheaza la 400 g pentru 5 minute si se elimina supernatantul ; 5. Se adauga 2 ml tampon de liza proaspat preparat ; se incubeaza 10 minute la temperatura camerei ; se centrifugheaza la 400 g pentru 5 minute si se indeparteaza supernatantul; 6. Celulele se resuspenda in 0.2 ml de PBS 7. Se achizitioneaza datele la citometru de flux