Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

C A P. 4. G E N E T I C A D R O J D I I L O R

Introducere
Drojdiile reprezint un grup de microorganisme eucariote, a cror denumire definete grupul
din punct de vedere morfologic, structural i genetic. Studiile recente de filogenie molecular au
demonstrat ns c drojdiile nu reprezint un grup separat, fiind formele unicelulare ale unor fungi
filamentoi.
n prezent, se pstreaz nc gruparea drojdiilor n funcie de prezena/absena i
mecanismele procesului de sexualitate, n : ascomicete, basidiomicete i deuteromicete (fungi
imperfeci). Cu toate acestea, analizele moleculare indic faptul c ascomicetele de tipul
Saccharomyces i Pichia reprezint formele teleomorfe (forme ce prezint meioz i sporulare i,
implicit, sexualitate) ale fungilor imperfeci de tipul Candida, considerai ca forme anamorfe (forme
care se divid vegetativ prin mitoz i nu prezint sexualitate). Dintre ascomicete, drojdia care a
reprezentat modelul experimental pentru majoritatea studiilor biologice este Sacchromyces cerevisiae,
microorganism care constituie i obiectul principal al problemelor teoretice i tehnicilor descrise n
acest manual.
Organizarea unicelular care presupune cretere i multiplicare rapid, propagarea clonal,
posibilitatea de marcare selectiv i analiz genetic, precum i structura eucariot, a permis
descifrarea unor aspecte legate de ciclul celular, structura i replicarea ADN la eucariote, structura
genei eucariote, precum i descifrarea mecanismelor de reglaj genetic, de splicing, de mutaie i
recombinare genetic. Astfel, o serie de aspecte legate de genetica i biochimia celulei eucariote,
explicate iniial pornind de la sisteme procariote, au putut fi nelese mai acurat prin studiile realizate
pe S. cerevisiae.

Cap. 4. 1. Ciclul de via la Saccharomyces cerevisiae

Ciclul de via la S. cerevisiae reprezint, pe de o parte, un proces de proliferare celular prin
care o celul de un anumit tip de mperechere (a sau prin diviziune mitotic d natere la dou
celule n esen identice, iar pe de alt parte, procesul prin care se modific gradul de ploidie, existnd
att forme diploide ct i haploide stabile. Haploizii se mperecheaz pentru a forma diploizi ce se pot
divide meiotic n cursul procesului de sporulare, formnd haploizi de tip de mperechere a i Aceste
procese de mperechere i meioz sunt procese biologice fundamentale care apar i la organismele
pluricelulare. Totui, ciclul de via la S. cerevisiae prezint un aspect particular n sensul c, celulele
haploide, pe lng proliferare, mperechere i meioz, pot suferi rearanjamente cromozomiale ce stau
la baza interconversiei tipului celular de mperechere.
Tulpinile de S. cerevisiae aparin la dou tipuri de fertilizare: tulpini homotalice care prezinta
un proces de autofertilizare formnd diploizi pornind de la o cultura monosporal i tulpini heterotalice
care prezint fertilizare incruciat i formeaza diploizi prin mperecherea celulelor a i de tip opus
de mperechere (Fig.4.1.).
n cazul tulpinilor heterotalice pornind de la o celul diploid heterozigot (a/) pentru locusul
tipului de mperechere (MAT = mating type) n urma procesului de meioz i sporulare (pe medii
specifice de sporulare srace n nutrieni) se formeaz o asc cu 4 ascospori (2a/2). Fiecare celul
haploid a sau cultivat separat pe medii vegetative (YPG) formeaz n urma diviziunii mitotice prin
nmugurire clone haploide stabile a i . Dac aceste celule sunt cultivate mpreun pe mediu
vegetativ, n urma recunoaterii celulare pe baza feromonilor a i , fuzioneaz realizndu-se un
proces de citogamie i kariogamie, rezultnd celule diploide ce pot forma de asemenea, prin diviziune
mitotic, clone diploide stabile.
La tulpinile homotalice, pornind de la un singur ascospor haploid a sau , n urma diviziunii
mitotice rezult datorit interconversiei tipului de mperechere, o cultur mixt a i , care genereaz,
n final, numai diploizi stabili.
nelegerea interconversiei tipului de mperechere prespune nelegerea structurii genetice a
locusului MAT i a celor 2 casete silenioase plasate la stnga (HML = homotalic left) i la dreapta
(HMR = homotalic right) fa de acesta i care poart informaie suplimentar a i . Cei 3 loci sunt
dispui pe cromozomul III iar n mod obinuit nu se exprim dect locusul MAT, casetele fiind
represate prin cuplarea unor proteine specifice codificate de genele SIR (silent information regulator).
Structura locusului MAT i a celor 2 casete este, n esen, identic, n cazul segmentelor W, X, Z,
fiind variabil numai segmentul Y de aproximativ 600 pb care codific fie pentru factorul a (alela a), fie
pentru factorul (alela ). (Fig. 4. 2.).
O alt gen important n procesul de interconversie este gena HO care codific pentru
endonucleza Ho (Y/Z) care recunote o secven specific de baze prezent la jonciunea
segmentelor Y/Z producnd incizii dublucatenare numai la nivelul locusului MAT, casetele fiind
protejate de proteinele Sir prin condensare. Gena HO (dominant) este prezent la tulpinile

1
 Cap. 4 Genetica drojdiilor

homotalice, n timp ce la tulpinile heterotalice este prezent alela recesiv ho, fapt care nu permite
interconversia tipului de mperechere la aceste tulpini.
Interconversia tipului de mperechere se realizeaz n mai multe etape care presupun:
- realizarea unei incizii dublucatenare la jonciunea Y/Z;
- degradarea segmentului Y din locusul MAT;
- formarea unor capete libere 3 care reprezint primeri pentru o polimeraz reparatorie care copiaz
informaia de pe segementul Y aparinnd casetei cu informaie corespunztoare tipului opus de
mperechere;
- sinteza reparatorie determin, n final, nlocuirea unui segment Y, de exemplu Ya, cu segmentul
complementar Y. Fiecare diviziune mitotic presupune parcurgerea procesului de interconversie,
fapt care determin formarea culturii mixte de haploizi caracteristic tulpinilor homotalice.

Fig.4.1. Ciclul de via la Saccharomyces cerevisiae

2
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

W X Z
H M L

M A Ta
W X Y a In c iz ie d u b lu - c a t e n a ra
In v a z ia re g iu n ii (e n d o n u c le a z a H O Y / Z )
z o m o lo a g e
Z
W X

W
Y a (D e g ra d a t )
D e g ra d a re a Y a
s i in v a z ia re g iu n ii
X o m o lo a g e
X Z
W
5 3
3
5

E x tin d e re a c a p e t e lo r 3
(s in te z e re p a ra t o rii)
Z
W X

S t ru c tu ri e c h iv a le n t e

W X Z

R e f a c e re a c ro m o s o m u lu i
lin ia r c u s e c v e n ta Y in lo c u s u l
W Z M A Ta
X

W X Z
M A T

IN T E R C O N V E R S IA T IP U L U I D E IM P E R E C H E R E L A D R O J D II
Fig.4. 2. Interconversia tipului de mperechere la Saccharomyces cerevisiae

Definirea complexitaii ciclului celular la drojdii a pus problema identificarii genelor implicate n
controlul diferitelor ciclicuri. Aceste gene au putut fi caracterizate prin analiza unor mutante specifice
aa numitele mutante cdc (cell division cycle). Acestea sunt mutante condiionale care la temperaturi
permisive exprim fenotipul de tip slbatic. Studiul mutantelor cdc a permis stabilirea faptului c
celulele haploide pot intra n mitoz sau meioz n funcie de genele cdc activate. Astfel, n cazul n
care naintea punctului START, sub aciunea factorilor de mperechere a sau , sunt activate genele
cdc36 i cdc39, celulele haploide sunt blocate n G1, se mperecheaz (a x ) formndu-se diploizi
care intr ntr-un proces de sporulare i meioz (Fig. 4. 3.).

3
 Cap. 4 Genetica drojdiilor

Factor a/

cdc 36, cdc 39

blocare

Cln 1, 2, 3/ cdc 28 START G1 S G2 MITOZA

cdc 7 cdc 17, 2, 21 Clb 1, 2/
cdc 8, 9 cdc 28

blocare in G1

kariogamie
meioza
sporulare

Fig. 4. 3. Rolul genelor cdc n controlul ciclului celular la Saccharomyces cerevisiae

Gena crucial care determin trecerea peste punctul START i desfurarea mitozei, este
gena cdc28, al crui produs este o proteinkinaz, fosforilarea proteinelor fiind esenial n
desfurarea diviziunii celulare. Funciile cdc28 sunt activate de acumularea ciclinelor (Cln 1, 2, 3) la
sfritul fazei G1, fiind facilitat trecerea n faza S. Trecerea din S n G2/M este controlat tot de gena
cdc28, activarea fiind realizat ns, de ciclinele de tip B Clb 1, 2. (Fig 4. 4.).
Alte gene cdc care se exprim n etapa de trecere de la G1 la S sunt: cdc7 (proteina codificat
este o proteinkinaz implicat n fosforilarea proteinelor ce particip n replicare), cdc17 (produsul ei
este polimeraza ), cdc2 (polimeraza ), cdc21 (codific o timidilatsintetaz), cdc8 (timidinkinaz) i
cdc9 (ADN ligaz) (Fig. 4. 4.).

4
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

M it o z a
n e c e s it a a c t iv a re a
C D C 2 8 -C LB 1 -4

S TA R T
n e c e s it a p re z e n t a P
u n u ia d in t re c e le 3
c o m p le x e Ty r Th r
C D C 2 8 -C LN 1 -3
C DC 28

Ty r Th r
C DC 28

P Ty r Th r
C DC 28

Ty r Th r
P

Ty r Th r
C DC 28

Ty r Th r
C DC 28

Ty r Th r
C DC 28

Ty r Th r
C DC 28

Fig. 4. 4. Activarea Cdc28 de ctre diferite cicline determin trecerea de START sau intrarea n
mitoz la Saccharomyces cerevisiae

Cap. 4. 2. Organizarea materialului genetic la Saccharomyces cerevisiae

4. 2. 1. Structura genomului nuclear la Saccharomyces cerevisiae
Genomul nuclear la drojdii are o structur cromatinic specific eucariotelor cu o compoziie
histonic normal n miezul nucleosomal, cu o dimensiune per genom haploid de 1.3 x 10 7 (14 X 103
kpb). Genomul este structurat n 16 cromosomi cu dimensiuni cuprinse ntre 245 kpb (cromozomul I) i
aproximativ 2500 kpb (cromozomul XII), cuprinznd 6500 de gene.

5
 Cap. 4 Genetica drojdiilor

n afara genelor structurale ce codific pentru proteine, genomul drojdiilor conine 140 gene
pentru ARNribozomal (ARNr) prezente ntr-un numar variabil de copii (100 - 200) pe cromozomul XII,
circa 40 de gene repartizate pe diferii cromosomi care codific small nuclear ARN i circa 400 de
gene pentru ARNtransfer (ARNt). Dintre toate aceste gene numai 4% prezinta introni, acestea fiind,
gena pentru actin (care conine 1 intron), gena MAT1 i 40 gene pentru ARNt.
Principalele substructuri cromosomale evideniate i studiate la drojdii sunt secvenele ARS
(autonomously replicating sequence) echivalente cu originile de relicare (ORI), secvenele CEN
(centromerice) i TEL (telomerice).

Secvenele ARS
Replicarea ADN ncepe de la nivelul originilor de replicare ARS, prima secven identificat
fiind ARS 1 (Bel i Stillman ,1979). La nivelul genomului drojdiilor exist aproximativ 400 ARS, care se
succed la circa 35 kpb, replicarea ADN ncepnd la momente diferite la nivelul unor clustere formate
din 20 80 secvente ARS care formeaza uniti replicative. Secvena ARS1, cu o dimensiune de 50
pb, este structurat n mai multe uniti: A i B, cea din urma fiind structurat, la rndul ei, n 3
subuniti: B11, B21 i B31. Secvena esenial este ACS (ARS consensus sequence) de 11 pb, la
nivelul creia se leag complexul proteic ORC (origin recognation complex) cu rolul de iniiere a
replicrii. Cele 3 subuniti B sunt secvene adiionale ale ACS, parial identice: B1 1 este secvena
suplimentar de legare a ORC, B21 are rol structural i B31 este o secven de legare pentru factorul
de transcriere OBF/ABF (origin/ARS binding factor) care stimuleaz replicarea prin domeniul activator
transcripional (Fig. 4. 5.).

B3 1 B2 1 B1 1 AC S
Fig. 4. 5. Structura secvenei ARS1 de la Saccharomyces cerevisiae

Secvenele CEN
Prima secvena centromeric descris a fost CEN3 de la nivelul cromosomului III (Clarke i
Carbon, 1980). La S. cerevisiae centromerii sunt formai din 3 secvene: CDE I (9 pb) - secven de
baze nalt conservat, plasat n partea stng, CDE II (78 89 pb) - cu un coninut de peste 90% AT,
prezent la toi centromerii, cu o constituie asemntoare cu ADN satelit de la eucariotele superioare
i CDE III (11pb) - secven nalt conservat (TGATTTCGGAA), secvena consens de legare a
factorului CBF (centromer binding protein). Factorul CBF este un complex proteic de aproximativ 6
proteine eseniale n structurarea kinetocorului.
Actualmente, cel mai bine caracterizate sunt secvenele CEN3, CEN4 i CEN11 (Fig. 4. 6.)

CDE I CDE II CDE III

CEN3 ATAAGTGACATGAT 88 pb (93% AT) TGATTTCCGAA
CEN4 ATAAGTGACATGAT 89 pb (94% AT) TGATTTCCGAA
CEN11 ATAAGTGACATGAT 82 pb (83% AT) TGATTTCCGAA
Fig. 4. 6. Structura secvenelor CEN la cromosomi diferii la S. cerevisiae

Secvenele TEL
Secvenele TEL i la drojdii sunt secvene scurte repetate n tandem, plasate la captul
cromosomilor, cu o structura non-cromatidic, denumit telosom. Fiecare secven TEL este
structurat n:
- unitate repetitiv - are secvena C1-3A/TG1-3;
- adiional acestor repetri la capetele extreme ale cromosomilor, telomerele prezint i ADN
mediu repetitiv reprezentat de elemente ADN asociate (telomere associated - TA): Y i X. Y este un
element nalt conservat care poate avea 2 dimensiuni diferite 6.7 kpb i 5,2 kpb i poate exista ntr-
un numar variabil de copii (0 4 copii/telomer). X cuprinde mai multe secvene repetitive mici de 35
560 pb, dimensiunea elementului X variind ntre 0.3 kpb i 3.75 kpb;
- ntre cele 2 elemente X i Y exist un numr mic de secvene repetitive TG 1 3 (Fig. 4. 7.).

c a t re (TG 1 - 3 ) m ( TG 1 - 3 ) n - (TG 1 -3 )- 3
c e n tro m e r X Y (0 - 4 c o p ii) (A C 1 - 3 ) n
(0 - n c o p ii)
(A C 1 - 3 ) m -5
Fig. 4. 7. Structura regiunii TEL la Saccharomyces cerevisiae

6
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

4. 3. Plasmida 2 m
Denumit astfel dup lungimea conturului, determinat prin studii de microscopie electronic,
plasmida 2 m este format dintr-o molecul de ADN dublu catenar circular covalent nchis, avnd o
dimensiune de 6.3 Kpb (4.2 MD). Aceast plasmid este prezent la majoritatea tulpinilor de S.
cerevisiae n 60 - 100 copii / celul.
n studiile iniiale, plasmida 2 m a fost considerat un element genetic citoplasmatic, dar,
analizele ulterioare au demonstrat, pe de o parte, localizarea sa nuclear, iar pe de alt parte,
structura sa nucleozomal.
Trstura cea mai important a plasmidei 2 m este reprezentat de 2 secvene invers
repetate (IR) de 599 pb fiecare, care separ molecula n dou regiuni cu secven unic, de 2774 pb,
i respectiv, 2346 pb (Fig. 4. 8). Cele 2 regiunile repetate invers permit recombinri intramoleculare i,
ca o consecin, plasmida se poate gsi n dou forme echivalente, A i B, care difer prin orientarea
relativ a celor 2 secvene unice.
n urma recombinrilor intermoleculare la nivelul regiunilor repetate invers pot s apar
multimeri de 4 m i 6m. Trecerea de la o form molecular la alta (proces denumit flipping) nu
se realizeaz printr-un proces care s implice i o transpoziie a plasmidei pe ADN cromosomial,
deoarece nu s-au identificat secvene corespunztoare plasmidei 2 m n ADN cromosomial.
Plasmida 2 m prezint 4 gene:
gena FLP (flipping) - codific o protein ce catalizeaz recombinarea situs-specific la
nivelul secvenelor repetate invers;
genele REP 1 i REP 2 (replication) - codific proteine ce controleaz, pe de o parte,
stabilitatea i segregarea plasmidei 2 m, iar pe de alt parte, exprimarea genelor plasmidiale (4);
gena RAF 1 - codific o protein implicat tot n reglarea exprimrii genice.
n structura plasmidei 2 m au mai fost identificate urmatoarele secvene funcionale:
- secvena ARS (autonomously replicating sequence) reprezint originea replicrii plasmidei i
este plasat la nivelul jonciunii dintre regiunea unic mic i una din regiunile repetate invers, astfel
nct cuprinde o parte din regiunea IR i 100 bp din regiunea unic mic ; regiunea FRT (FLP
recognition target - int de recunoatere pentru FLP) la nivelul creia acioneaz recombinaza FLP;
regiunea FRT este situat n interiorul uneia din cele 2 IR ; secvena STB (stability) necesar
segregrii stabile a plasmidei n mitoz, situs de aciune pentru produii genelor REP 1 i REP 2.

Fig. 4. 8. Structura i formele moleculare ale plasmidei 2 m

4. 4. Materialul genetic extranuclear

4. 4. 1. Genomul mitocondrial la Saccharomyces cerevisiae
Mitocondria este un organit complex, specializat n respiraia celular i fosforilarea oxidativ,
care prezint un sistem genetic propriu i, implicit, mecanisme specifice de sintez proteic. Spre
deosebire de celelalte organisme eucariote la care procesele de fosforilare oxidativ sunt catalizate de
5 complexe enzimatice, la drojdii nu exist dect 4 complexe enzimatice, dintre care 3 complexe
respiratorii i un complex ATP-azic (ATP-sintetaza), lipsind complexul reprezentat de NADH-CoQ-
reductaza :
I - succinat-CoQ-reductaza: oxideaz succinatul, reducndu-l la fumarat i reduce CoQ

7
 Cap. 4 Genetica drojdiilor

II - CoQH2-citocrom c-reductaza: oxideaz CoQ i reduce citocromul c

III - citocrom-oxidaza: transfer electronul la oxigen reducnd citocromul c i rezultatul este formarea
apei
IV - ATP-aza mitocondriala, care intervine n etapele fianle ale fosforilarii oxidative (n stare cuplat
funcioneaz ca o ATP-sintetaz sau kinaz).
Biogeneza mitocondriei reprezint un proces complex, care necesit interaciunea a dou
genomuri - nuclear i mitocondrial.
La drojdii ADN-ul mitocondrial (ADNmt) este reprezentat de o molecul de ADN dublu catenar
circular nchis, asemntor cromosomului bacterian, avnd o dimensiune de aproximativ 25 kbp (50
Md). Principalele caracteristici ale ADN-ului mitocondrial de drojdii sunt urmtoarele : (1) este
necomplexat cu histone, ci cu proteine histone-like; (2) are un procent mare de AT (80%); (3) are
multe gene mozaicate, spre deosebire de genele nucleare de la drojdii care sunt, n general,
nemozaicate (excepii: gena pentru actin, ADNr); (4) exist unele diferene ntre codul genetic nuclear
i cel mitocondrial (Tab. 4.1).

Tab. 4. 1. Diferene ntre codul genetic universal i cel mitocondrial

Mesaj n codul universal Mesaj n codul mitocondrial
CODON
mamifere Drosophila drojdii plante
UGA Stop Trp Trp Trp Stop
AUA Ile Met Met Met Ile
CUA Leu Leu Leu Thr Leu
AGA, AGG Arg Stop Ser Arg Arg

ADNmt la drojdii cuprinde urmatoarele gene (Fig. 4. 9.): circa 24 specii moleculare de ARN
(aceste gene sunt grupate ntr-un cluster); 2 specii moleculare de ARNr: 15S n subunitatea de 30S,
21S n subunitatea de 50S (ARNr de 5S este absent); gena pentru ARN 9S (ARN-9S va complexa o
protein, formnd o ribozim denumit RNaza P care particip la maturarea ARNt, avnd ca situs de
aciune capetele 5); gene pentru subuniti ale citocrom-oxidazei: CO I, II i III; gena pentru
apoproteina citocromului b (partea complexului b-c1, complexul III); genele pentru 3 subuniti ale
complexului de sintez ATP (subunitile 6, 8 i 9 ale ATPazei mitocondriale); proteine ce
interacioneaz cu acizii nucleici. Aceste gene sunt separate (ADN spacer) prin regiuni bogate n A+T.

8
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Fig. 4. 9. Harta genomului mitocondrial la Saccharomyces cerevisiae

Tab. 4. 2. Proteine mitocondriale codificate nuclear i sintetizate n citoplasm

Componenta structural mitocondrial Polipeptide
MATRIX carbamil-fosfat-sintetaza
superoxid-dismutaza
ADN polimeraza
ARN polimeraza
proteine ribozomale
ornitin-trans-carbamilaza
enzimele ciclului acidului citric
MEMBRANA INTERN~ citocromul c
subunitatea V a complexului citocromului b
subunit ale Fi-ATPazei
proteolipidul din Fo-ATPaza
subunit IV, V, VI, VII ale citocrom-oxidazei
SPATIUL INTERMEMBRANAR citocromul c
citocrom-peroxidaza c
citocromul b2
MEMBRANA EXTERN~ porina

9
 Cap. 4 Genetica drojdiilor

Mutantele petite apar la Saccharomyces cerevisiae corelat cu modificri ale ADN-ului

mitocondrial, determinnd o serie de deficiene respiratorii; la multiplicare n anaerobioz, mutantele
petite formeaz colonii mici (petite).

Fig. 4. 10. Aspectul coloniilor petite

Mutantele petite au fost obinute att cu mutageni fizici (de exemplu, radiaiile ultraviolete), ct
i cu mutageni chimici (nitrosoguanidina). Genomul mitocondrial a fost notat factor i, ca urmare,
tulpinile de tip salbatic sunt + .
Agenii mutageni specifici pentru ADN prokariot (de exemplu, acriflavina, bromura de etidium)
au aciune primar asupra mitocondriilor, determinnd 2 tipuri de mutaii: o - petite neutre ; - - petite
supresive; o - apar n urma deleiei complete a ADN mitocondrial.
Mutantele petite supresive apar n urma unor deleii partiale ce sunt urmate de duplicaii.

Fig. 4. 11. Structura genomului mitocondrial + i -

10
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Fig. 4. 12. Schema segregrii nemendeliene a genelor mitocondriale

n cazul diploizilor i

4. 4. 2. Sistemul killer la Saccharomyces cerevisiae

Majoritatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae au n citoplasm una sau mai multe specii
moleculare de virusuri ARN dublu catenar (ARN d.c.). Primele asemnea specii moleculare de ARN d.c.
viral descrise sunt cele responsabile de fenotipul killer la drojdii. Aceste molecule prezint foarte multe
similariti cu virusurile ARN d.c. de la organismele eucariote superioare. Ca urmare, virusurile de la
Saccharomyces reprezint un model pentru descifrarea mecanismelor centrale de replicare viral, de
transcriere ARN-dependent, de mpachetare, de frame-shift ribosomal, precum i relaiile dintre
funciile virale i cele ale gazdei parazitate.
Virusurile ARN d.c. de la drojdii includ 3 familii de genomuri ARN d.c.: L-A, L-BC i M. L-BC se
ntlnete mai rar, are aceeai dimensiune ca i L-A, dar are secven diferit de nucleotide.
Moleculele L-BC sunt localizate n particule virale intracelulare cu proteine capsidale diferite de cele
ale capsidelor L-A.
Din aceste motive se consider c citoplasma tulpinilor killer de la S.cerevisiae cuprinde 2
tipuri de particule: L i M. Particulele M sunt notate VSc-M i codific toxina i factorul de imunitate, iar
particulele L sunt notate VSc-L, codific capsidele M i L, precum i polimeraze necesare replicrii
ambelor genomuri, i au rol de helper n procesul de infecie.
Particulele killer de la S.cerevisiae reprezint molecule de ARN d.c. ncapsidate n particule
virus-like (cu un diametru de 40 nm) i sunt responsabile de sinteza toxinei killer, substan letal
pentru tulpinile de drojdii non-killer.
Sistemul killer a fost descoperit pentru prima oar la Saccharomyces n 1963, ulterior fiind
descris i la alte genuri i specii de drojdii. n prezent se cunosc 11 tipuri de toxine killer biochimic
diferite, produse de diverse genuri de drojdii.
Proteina de fuziune gag-pol are 3 domenii funcionale (Fig. 4. 13):

11
 Cap. 4 Genetica drojdiilor

1. domeniu capsidal (intr n structura capsidei, alturi de proteina majora a capsidei)

2. domeniu de ataare a ARN m.c. (+)
3. domeniu cu funcie de ARN-polimeraza

Fig. 4. 13. Structura genelor gag-pol din genomul L

Particulele M
Dac particulele L pot conine fie o molecul ARN d.c.-L, fie una m.c.-L (+), particulele M pot
conine una sau dou molecule ARN d.c.; n ambele cazuri, particulele M au aceeai dimensiune i
compoziie proteic, care este cvasi-identic cu particulele L.

Transcrierea genomurilor M
ARN d.c. al particulelor M codific pentru toxin i pentru imunitate la aceasta.
Activitatea killer a tulpinilor de S.cerevisiae aparine la 3 tipuri - K1, K2 i K3 - codificate de
genomurile M1, M2 i, respectiv, M3: K1 - tulpinile de laborator; K 2 i K3 - tulpinile de vin i de bere.
Tulpinile K1 i K2 sunt sensibile la toxina fiecruia, n timp ce K 2 i K3 sunt cros-imune. Lipsa total a
particulelor killer a fost notat drept K0. Rezistena este notat cu R.
Genomul M1 are un singur ORF ce se extinde de la codonul AUG (aflat n poziia 14) p na la
codonul UAG (aflat la pozitia 963).
L M
(100 copii/cel) (10-12 copii/cel)
K1 2.44 x 106 Da 1.28 x 106 Da
6
K2 2.54 x 10 Da 1.00 x 106 Da

Att particulele M, ct i cele L, nu au caracter infecios i nu prezint ciclu litic. Ele sunt
virusuri latente (cu o serie de caractere de plasmide) i pot fi transmise prin mperechere sexual sau
prin fuziune de protoplati.
ARN d.c.-M cuprinde un fragment de 1kb separat prin 200 bp (regiune bogata n AU) de un
fragment de 0.6 kbp. Fragmentul de 1 kbp poart informaia genetic pentru precursorul toxinei de
34000 Da.

Producerea toxinei killer

Precursorul toxinei este format din 3 subuniti, i (din care i vor forma toxina,
iar va forma factorul de imunitate). Secvena hidrofil leading, cu afinitate mare pentru reticulul
endoplasmic, permite penetrarea precursorului n aceast structur citoplasmatic unde au loc
modificri post-translaionale de tip glicozilare. n urma maturrii precursorului, toxina va avea o
greutate molecular de 43000 Da (Fig. 4. 13). n timpul transportului intracitoplasmatic, precursorul
este fragmentat de proteinaze specifice care separ secvena leader i subunitatea . Proteina killer
activ este, deci, format din subunitile i unite prin legturi disulfidice.

12
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Datorit fuziunii veziculelor de transport cu membrana plasmatic, proteina killer i factorul

proteic de imunitate sunt eliberate n afara celulei. Factorul proteic de imunitate ram ne legat de
suprafaa celular, probabil la nivelul unui receptor specific.
Modul de aciune al proteinei killer
Dupa o perioad de lag, proteina killer se leag de un receptor din peretele celular - 1,6--D-
glucanul - fr consum de energie. Al doilea receptor este plasat probabil n interior, pe membrana
plasmatic. Spre interiorul celulei sensibile este transferat doar subunitatea , procesul realizndu-
se cu consum de energie.
Efectul letal al toxinei pare s se datoreze formrii unor pori n membrana plasmatic. Ca
urmare a creterii permeabilitii membranei, are loc o eliberare a ionilor de K + i a moleculelor de ATP
n mediul extracelular. Aceste procese sunt urmate de o descretere a pH-ului intracelular i de
inhibarea proceselor metabolice, ducnd n final la moartea celular.
Sistemului killer este de o deosebit importan n procesele biotehnologice, fiind implicat n :
(1) protecia procesului de fermentaie la tulpini de drojdii de vin ; (2) procesul de selecie a
transformanilor rezultai prin fuziunea de protoplati ; (3) biotiparea unor tulpini de drojdii i de
bacterii.

Fig. 4. 14. Structura i maturarea preprotoxinei killer

13