Proprietile fizico-chimice ale

ADN
Particularitile moleculelor de acizi nucleici, a
ADN n special, pot fi determinate prin
utilizarea unor tehnici variate: microscopie
electronic, ultracentrifugare, electroforez,
tehnici biochimice, spectrofotometrie etc,
aplicarea acestora depinznd de scopul
cercetrilor.
 Masa molecular i dimensiuni
Sub raportul masei moleculare sunt cele mai mari molecule din
sistemele vii, ajungnd la 107 4 x 109 daltoni. In cazul ADN viral
acesta poate conine cteva sute de perechi de baze, iar ADN al
bacteriei Escherichia coli are aproximativ 4 milioane de perechi de
baze. La om lungimea ADN per complement haploid (genom, n 23
cromosomi), corespunde la 3,3 x 109 perechi baze sau 3,3 x 106
Kbaze 1m lungime. Dac inem cont c n organismul uman exist
aproximativ 1013 celule diploide i se calculeaz lungimea total a
ADN coninut n aceste celule, se poate ajunge la o valoarea
astronomic, de ordinul diametrului sistemului solar.
Conformaia molecular a moleculelor poate fi determinat prin
utilizarea electroforezei n gel de agaroz i a microscopiei
electronice.
Datorit metodelor brutale de purificare a ADN, lungimea corect a
unei molecule se poate aprecia numai prin corelarea datelor
obinute prin dou trei metode, dintre care sunt de amintit:
microscopia electronic, autoradiografia, coeficientul de
sedimentare, densitatea de plutire.
 Compoziia n baze a ADN i semnificaia acesteia

Absorbia radiaiilor ultraviolete cu lungimea de und de 260 nm,

folosit pentru determinri cantitative de ADN din soluii, nu este
aceeai pentru formele monocatenare i bicatenare ale acestuia. S-
a constatat n mod experimental c absorbia UV este cu 3040 %
mai mare n cazul formelor monocatenare, fa de cele bicatenare la
care are loc o mascare a bazelor azotate (implicate n absorbie) ca
efect al structurii sale.
Analiza coninutului n baze azotate din ADN de diferite origini, a
artat o variaie relativ a cantitii acestora n funcie de sursa de
provenien a materialului genetic. Compoziia n baze se exprim
n general n procente de G+C din cantitatea total de ADN, sau sub
forma raportului A+T/G+C. Dei raportul este variabil de la o specie
la alta, la organismele pluricelulare acest raport este acelai
indiferent de natura celulelor sau esutului de origine.
Unele dintre proprietile ADN sunt puternic influenate de procentul
G+C. Astfel, densitatea unei soluii de ADN este cu att mai mare cu
ct cantitatea de G+C crete. Ca urmare, se poate determina acest
coninut G+C i indirect n funcie de densitatea de plutire.
 Denaturarea i renaturarea ADN
Moleculele de ADN dublu catenar pot suferi modificri ale proprietilor lor
fizice ca rezultat al aciunii unor factori fizici sau chimici. Experimental s-a
demonstrat c prin nclzirea la temperaturi cuprinse ntre 63C i 100C a
soluiilor ce conin ADN, n funcie de natura i proveniena moleculelor de
ADN acestea sufer o rupere a legturilor de hidrogen care leag n mod
normal bazele. In consecin, cele dou catene ale ADN se separ,
moleculele devenind monocatenare. Fenomenul se numete denaturare
termic, el fiind denumit i topire, deoarece este nsoit de o fluidizare a
soluiei, iar cldura furnizeaz energia necesar pentru ruperea legturilor
de hidrogen.
Fenomenul de denaturare se realizeaz n mai multe etape. Iniial, cele
dou catene se deruleaz parial dar rmn reunite prin anumite segmente
dublu catenare n care bazele continu s formeze perechi. Segmentul
derulat al fiecrei catene poate lua o conformaie ntmpltoare care se
schimb de la un moment la altul. Cnd temperatura a atins punctul de
topire are loc separarea complet a celor dou catene.
Temperatura de denaturare este influenat de mai muli factori dintre care
cel mai important este proporia de GC. Cele trei legturi de hidrogen dintre
bazele azotate, asigur n mai mare msur stabilitatea structurii dublu
catenare. Dovada o constituie faptul c topirea termic, derularea i
denaturarea ncep n regiuni bogate n legturi A-T i continu cu cele cu
coninut crescut n G-C. Temperatura de topire este cu att mai mare cu ct
procentul GC este mai ridicat.
 Efectul hipercromic nsoete procesul de denaturare termic i se
manifest printr-o cretere progresiv a capacitii de absorbie a
radiaiilor UV cu lungimea de und de 260 nm. Aceast cretere
este corelat cu coninutul n baze de tipul A-T i va fi n final cu
aproximativ 40% mai mare fa de absorbia moleculelor normale
bicatenare.
Dac soluia de ADN denaturat este rcit brusc, catenele
complementare rmn separate, ceea ce nseamn c procesul de
denaturare a devenit permanent. n schimb, dac rcirea este lent,
are loc procesul de refacere a legturilor de hidrogen dintre bazele
complementare ale catenelor i deci refacerea moleculelor dublu
catenare. Procesul a fost numit renaturare.
Eficiena acestui proces se poate msura prin metode biologice,
cum este reapariia procesului de transformare genetic (n cazul
microorganismelor) ca i prin scderea puterii de absorbie a
radiaiilor UV (efect hipocromic).
Procesul de renaturare se realizeaz cu destul rapiditate dup
formarea unor secvene iniiale bicatenare, scurte.
Centrifugarea izopicnic n gradient de clorur de cesiu
poate fi folosit att pentru separarea ADN de eventualii
contaminani ct i pentru izolarea diferitelor forme
moleculare ale ADN de interes. Astfel, proba de ADN este
amestecat cu clorura de cesiu, substan capabil de a
forma, n cursul centrifugrii la turaii mari, un gradient
omogen de concentraie. In aceste condiii, dup o
centrifugare la turaii mari (mai mari de 20.000xg) timp de
48 ore, moleculele de ADN vor sedimenta n tubul de
centrifugare doar la nivelul la care densitatea CsCl este
egal cu densitatea ADN respectiv, acesta concentrndu-
se sub forma unei benzi de unde poate fi extras i apoi
precipitat cu alcool etilic.
Includerea bromurii de etidiu n
amestecul de centrifugare asigur o
rapid identificare a benzilor de ADN
la nivelul tubului de centrifug
datorit diferenelor n capacitatea
de legare a colorantului de ctre
moleculele de ADN: moleculele
suprancolcite (aa cum sunt
plasmidele) sunt capabile s lege
doar cantiti reduse de EtBr (acesta
se intercaleaz ntre bazele azotate
din ADN dublu-catenar) n timp ce
moleculele de ADN crestate sau
lineare leag cantiti crescute de
colorant, ele dobndind o
conformaie nersucit n prezena
acestuia.
 Determinarea puritii i concentraiei de acizi nucleici
Utilizarea acizilor nucleici n diferite experimente este condiionat de un
anumit grad de puritate i o cantitate corespunztoare. Concentraia de
acizi nucleici din diferite probe se poate determina pe baza absorbiei
radiaiilor ultraviolete, tiut fiind faptul c absorbana radiaiilor UV cu
lungimea de und de 260 nm este direct proporional cu cantitatea de
ADN din soluie (dac ADN este pur). Determinrile efectuate asupra
unor probe cunoscute (n cuve cu grosimea de 1 cm) au stabilit c
valoarea 1,00 a absorbanei la 260 nm corespunde unei concentraii de
50 g/ml ADN dublu catenar, 33 g/ml ADN monocatenar sau 40g/ml
ARN, dac soluia de analizat conine doar ARN. Variaia absorbiei n
ultraviolet a soluiilor de ADN permite studiul denaturrii acestuia. Odat
cu trecerea de la forma dublu catenar la forma monocatenar,
absorbia soluiilor de ADN crete cu pn la 40% (fenomen numit efect
hipercromic), variaie care depinde de procentul bazelor G-C. Pe baza
acestui fenomen se poate stabili compoziia n baze azotate a ADN
provenit de la o anumit specie (mai ales n cazul bacteriilor). Astfel,
prin nclzirea treptat a unei soluii de ADN are loc ruperea legturilor
de hidrogen intercatenare i separarea celor dou catene, fenomen
nsoit de creterea absorbanei n lumin UV. Temperatura la care are
loc denaturarea a jumtate din moleculele de ADN din solu ia de
analizat se numete temperatur de topire (melting temperature =
Tm), valoarea sa depinznd de proporia de perechi GC i AT din ADN
Temperatura de topire a ADN genomic izolat de la un anumit organism poate fi calculat
astfel:
Tm = 16,5(log[Na+]) + 0,41(%GC) + 81,5oC
unde [Na+] reprezint concentraia ionilor de sodiu din soluia de ADN iar %GC
reprezint proporia de baze azotate de tip guanin i citozin din ADN de analizat.
De exemplu, pentru un ADN cu 40% GC (aa cum se ntlnete n cazul ADN de la
mamifere), aflat ntr-o soluie ce conine 50mM NaCl, temperatura de topire este
76,4oC. In cazul n care se dorete aflarea proporiei de GC din genomul unui
organism nou, se stabilete mai nti Tm (prin nclzirea treptat a soluiei de ADN i
citirea absorbanei la 26 nm) dup care se folosete formula lui Owen (1985):
%GC = Tm 2.08 106.4
In cazul tehnologiei ADN recombinant se utilizeaz deseori scurte fragmente de ADN,
lungi de 15-30 pb astfel c pentru acestea este necesar stabilirea Tm specifice pe
baza unei variante a ecuaiei de mai sus (Wallace i colab., 1979):
Tm = 2(AT) + 4(GC)
Astfel, fiecare pereche AT din duplex contribuie cu 2oC la stabilizarea dulului helix, n timp
ce fiecare pereche GC contribuie cu 4oC la stabilizare. Astfel, pentru o secven
oligonucleotidic monocatenar format din 20 nucleotide (cinci resturi de A, ase
resturi de T, trei resturi de C i ase resturi de G), temperatura de reasociere cu
catena complementar de ADN poate fi stabilit pe baza formulei de mai sus: 2 (11) +
4(9) = 58oC. Acest aspect este important n cazul aplicrii tehnologiei PCR i a
hidridizrii acizilor nucleici.
Pe baza proprietilor de absorbie a soluiilor de acizi nucleici, se poate evalua puritatea
acestora. Acizii nucleici au un spectru de absorbie ntre 250 320 nm. O extincie, la
320 nm, mai mare cu cteva procente dect cea corespunztoare lungimii de und
de 260 nm, indic prezena altor tipuri de molecule n soluie.
Metoda standard de separare i identificare a moleculelor de ADN izolate dintr-un anumit organism
este electroforeza n gel de agaroz. Principiul general al metodei const n faptul c, la pH
alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcin negativ i, prin urmare, dac sunt plasai ntr-un
cmp electric, ei vor migra spre anod (+)
Electroforeza n gel de agaroz, n condiii standard, asigur separarea eficient a moleculelor de ADN cu dimensiuni
cuprinse ntre 200 i 15.000 pb. Examinarea comparativ a modului de migrare a unor tipuri variate de ADN a
permis observaia c procesul de separare depinde de o serie de factori, ntre care mrimea ADN de separat i
conformaia molecular ocup un loc important. Astfel, ADN de dimensiuni mici migreaz mai rapid dect
fragmentele mai mari. Cu toate acestea, reprezentarea grafic a mrimii fragmentelor de ADN i a distan ei de
migrare a evideniat faptul c ntre cei doi parametri rela ia nu este linear.
In cazul moleculelor de ADN de dimensiuni mari, de peste 30 kb (inclusiv pentru cromosomii
eucariotelor inferioare), pentru migrarea lor electroforetic nu se poate aplica metoda standard
deoarece aceasta nu permite separarea corect moleculelor, ele rmnnd agregate ntr-o
singur band. De aceea, cercetrile efectuate n aceast direc ie au condus la elaborarea unor
metode specifice de migrare electroforetic ce au primit denumirea generic de electroforez n
cmp pulsatoriu, ele bazndu-se pe supunerea moleculelor de ADN la un cmp electric care se
modific periodic. In acest fel a devenit posibil separarea eficient a moleculelor de ADN ce
depesc 30-50kb, pn la 10 Mb (10.000 kb)
Dei exist numeroase tipuri de echipamente, ele pot fi grupate n dou categorii.
Cel mai simplu echipament este desemnat pentru electroforeza n cmp
inversat (FIGE = field inversion gel electrophoresis), tehnic ce presupune
inversarea polaritii electrozilor n cursul electroforezei.
Deoarece FIGE supune ADN la o reorientare de 180o, moleculele de ADN se
deplaseaz nainte-napoi separndu-se mai eficient la o tensiune mai mic
dar ntr-o perioad mai lung de timp. In cazul FIGE, metoda este foarte
eficient pentru separarea moleculelor cu dimensiuni cuprinse de obicei ntre
4-1000 kb dar asigur i evidenierea moleculelor de pn la 2000 kb. In
principiu, n cazul bacteriilor, prin electroforeza n cmp pulsatoriu se separ
fragmentele de ADN cromosomal obinute prin utilizarea unor enzime de
restricie specifice. Cele mai multe rezultate sunt legate de obicei de bacteriile
patogene, principalul scop fiind acela al identificrii tulpinilor virulente, a
genotiprii acestora i a stabilirii relaiilor cu nrudire cu diferite alte tulpini.
Cel de-al doilea grup de echipamente orienteaz moleculele de ADN sub un
anumit unghi oblic, n general cu o mrime de 96-120o. Aceasta determin ca
moleculele de ADN s se mite n zigzag iar comparativ cu FIGE, pentru
acelai tip de molecule, n condiii optime, separarea se realizeaz mai rapid i
permite evidenierea mai multor tipuri de molecule. In acest grup sunt incluse
mai multe categorii de metode dintre care sunt de menionat: CHEF (contour-
clamped homogenous electric field), TAFE (transverse alternating field
electrophoresis), RGE (rotating gel electrophoresis).
 Hibridarea molecular
Studiul acestor procese permite aprecieri indirecte privind compoziia n
baze a unor molecule de ADN. n general, ADN dublu helical bogat n baze
A-T este denaturat la temperaturi mai joase, comparativ cu cel bogat n G-
C. Determinarea proporiei de baze se face n general comparnd profilul de
topire al unei molecule de ADN necunoscut, cu cel al unui ADN de
referin, cu compoziia n baze determinat.
Prin procesele respective se poate realiza i localizarea regiunilor bogate n
A-T, mai puin stabile i se poate realiza o hart a acestor regiuni care se
separ n catene. Regiunile bogate n G+C care rmn dublu catenare,
evideniindu-se la microscopul electronic.
Una dintre cele mai importante aplicaii ale procesului de denaturare
renaturare este hibridarea molecular. Ea permite renaturarea prin
combinarea unor molecule de ADN monocatenare sau de ADN
monocatenar i ARN. Se formeaz molecule hibride de tip ADN ADN sau
ADN ARN, indiferent de proveniena lor, cu condiia existenei unui grad
de nrudire, respectiv de complementaritate n secvena bazelor.
Detectarea moleculelor hibride se poate face prin microscopie electronic
deoarece regiunile dublu catenare prezint un contur mai gros. Hibridarea
molecular poate fi utilizat pentru a aprecia gradul de similaritate n
secvena bazelor ntre ADN provenit de la dou organisme diferite.
 Deoarece ARN este complementar unei catene
a moleculei de ADN, de pe care a fost transcris
i identic celeilalte (cu excepia T nlocuit de U
n cazul ARN), tehnica hibridrii moleculare
permite s se stabileasc cu precizie regiunea
din cromosom de la care s-a fcut transcrierea.
Tehnica hibridrii ADN permite evidenierea cu
acuratee a deleiilor sau a substituiilor
provocate de mutaii i d informaii privind
gradul de extindere i poziie a acestora. Dup
denaturarea termic moleculele de ADN
provenite dintr-un genom de tip slbatic i din
genomul mutant puse n condiii favorabile
pentru renaturare formeaz un heteroduplex.
Reasocierea este perfect cu excepia regiunii
n care nu exist complementaritate.
Moleculele heteroduplex prezint n acest caz
o bucl de deleie.
Studiul hibrizilor ADN-ARN a permis elucidarea
unor aspecte legate de funciile acizilor
nucleici, de particularitile de structur ale
genelor (de exemplu structura discontinu a
genelor de la eucariote) sau de localizarea
unor gene la nivelul ADN (de exemplu a
genelor pentru ARNr 28S, 18S, 5S). Cercetrile
efectuate asupra acestor hibrizi a demonstrat
rolul de matri al ADN pentru sinteza ARNm.