Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
p. ; cm.
ISBN 973-96090-3-8
I. Vassu-Dimov, Tatiana
II. Ssrman, Elena
579.8
2
P A RT E A A T R E I A . B I O LO G I A I TA XO N O M I A
D R O J D I I LO R
CAPITOLUL X
Drojdiile sunt un grup de fungi cu o diversitate filogenetic deosebit, ale cror forme
teleomorfe sau stri sexuate sunt prezente la nivelul a dou clase taxonomice majore,
Ascomycotina i Basidiomycotina.
Speciile anamorfe, care prezint numai nmulire asexuat, au fost iniial grupate n
fungii imperfeci.
De asemenea, termenul de drojdie este considerat, n prezent, unul de convenien,
aceste organisme, a cror diviziune mitotic (pe cale vegetativ) se realizeaz prin nmugurire
sau prin fisiune binar, fiind formele unicelulare ale fungilor filamentoi.
Taxonomia sau sistematica unui organism cuprinde trei pri importante i anume:
clasificarea aranjarea organismelor n grupe taxonomice pe baz de similaritate;
identificarea compararea caracterelor organismelor neidentificate cu indivizi deja
caracterizai i clasificai i
nomenclatura atribuirea unor nume taxonilor identificai, parametrii valabili i n
cazul drojdiilor n definirea unui taxon.
Microbiologii au studiat taxonomia drojdiilor de mai bine de un secol, dar nc mai
sunt destule de realizat pentru a stabili un sistem de clasificare complet.
O identificare corect este absolut necesar pentru tratamentul eficient al infeciilor,
pentru nelegerea interaciunii dintre specii n natur i pentru selectarea celor mai potrivite
tulpini pentru industria fermentativ i alimentar.
Un sistem de clasificare acurat presupune stabilirea interrelaiilor filogenetice, ce se
bazeaz pe similariti biochimice i genetice, incluznd diferite ci metabolice i
mecanismele de control ale acestor ci.
Un astfel de sistem filogenetic de clasificare prezint un interes particular pentru
biotehnologi, care trebuie s combine diferite proprieti metabolice i, dac aceste proprieti
aparin unor specii strns nrudite, ansa de a se exprima ntr-un singur organism este mai
mare.
De exemplu, n cazul fuziunii de protoplati, produii de fuziune au o mai mare
stabilitate dac parentalii aparin unor specii strns nrudite. n cazul aplicrii tehnologiei
ADN recombinant pentru introducerea anumitor caracteristici metabolice, ADN-ul heterolog
inserat se exprim mult mai bine ntr-o gazd strns nrudit cu specia donor.
Scopul acestui capitol este de a prezenta principalele metode de clasificare,
identificare i nomenclatur a drojdiilor, inclusiv a tehnicilor de taxonomie molecular, care
permit o ncadrare taxonomic mai corect a diferitelor genuri i specii.
Tabelele 10.1, 10.2 i 10.3 prezint caracteristicile claselor n care se ncadreaz
drojdiile.
3
Tabelul 10.1. Genurile clasei Ascomycotina i caracteristicile lor
Ambrosiozyma Sferic sau oval 1-4/asc cu form de plrie nmugurire multipl, pseudohife, Fermenteaz slab zaharurile;
hife adevrate cu septe adevrate izolate de pe insecte
Arthroascus Provine din celule Sferici sau aproape nmugurire multipolar, pseudo- Nu fermenteaz zaharurile; izolate
hifale dilatate sferici ; 1-4/asc hife; hife adevrate cu septe, din sol; materiale vegetale
avnd un singur micropor
Arxiozymma Sferic sau oval; Sferici sau ovali; 1-2/asc nmugurire multipolar; pseu- Fermenteaz zaharurile; izolate
provine din celule dohife; nu formeaz hife iniial de la psri de curte
vegetative adevrate
Citeromyces Sferic Sferici; 1-2/asc nmugurie multipolar; nu Fermenteaz intens unele
formeaz hife sau pseudohife zaharuri; izolate din concentrate
de fructe
Clavispora Sferic sau alungit Clavai; 1-2/asc nmugurire multipolar; Fermenteaz zaharurile; izolat
pseudohife; nu au hife adevrate iniial din surse umane i animale
Coccidiascus Alungit cu form Au form de fus; peste 8 per asc nmugurire multipolar; nu Izolate de la Drosophila
de banan formeaz hife sau pseudohife
Cyniclomyces Alungit Alungii, 1-4/asc nmugurire multipolar; Fermentaia slab a zaharurilor;
pseudohife, dar nu hife izolate din stomacul i fecalele de
adevrate iepure
Debaryomyces Sferic sau n general sferic cu suprafaa nmugurire multipolar,
elipsoida ondulat, 1-4/asc ocazional pseudohife, fr hife
adevrate
Dekkera Sferic sau alungit Cu form de plrie sau sferic, 1- nmugurire multipolar, Fermenteaz zaharurile, proces
4/ asc pseudohife, fr hife adevrate care este stimulat de oxigenare;
izolate din bere i vin ca specii
4
contaminante.
Guilliermondella Alungit Sferici, ovali sau reniformi 1-4/ nmugurire predominant lng Fermenteaz glucoza; izolate din
asc polii celulei; formeaz reziduri taninice.
pseudohife i hife adevrate
Hanseniaspora Oval sau alungit Cu form de plrie, 1-4 per asc Celule nmgurite au form de Fermenteaz zaharurile; izolate
lmie; formeaz pseudohife dar din sol, fructe i alte materiale
nu hife adevrate vegetale i din surse clinice
Issatcheria Oval sau alungit Sferici i uor ondulai pe nmugurire multipolar, Fermenteaz zaharurile; izolate
margine, 1-4 per asc pseudohife, fr hife adevrate din sol, fructe, vin, Drosophila,
ap marin i surse clinice
Kluyveromyces Sferic sau alungit Sferici sau reniformi, 1-c.1oo/asc nmugurire multipolar, pot Fermenteaz zaharurile; izolate
forma pseudohife, dar nu i hife din sol, ap, fructe i alte
adevrate materiale vegetale, Drosophila,
surse clinice
Lipomyces Elipsoidal sau Sferici sau alungii, de culoare nmugurire multipolar, pot Nu fermenteaz zaharurile; izolate
alungit brun, 1-c.3o/asc forma pseudohife, dar nu i hife din sol, formeaz colonii mucoide
adevrate
Lodderomyces Sferic sau alungit Oblongi cu capete netede, 1-2per nmugurire multipolar, Fermenteaz zaharurile; izolate
asc formeaz pseudohife dar nu i din sol i suc de portocale; utilili-
hife adevrate zeaz n-alkani
Metschnicowia Sferic sau Alungii, 1-2 per asc nmugurire multipolar; Fermenteaz zaharurile; izolate
elipsoidal pseudohife; nu formeaz hife din ap marin, ape curgtoare, de
pe flori, nevertrebate i
Drosophila
Nadsonia Alungit Sferici; 1-2 per asc nmugurire bipolar; nu Fermenteaz zaharurile; izolate
formeaz nici pseudohife nici din sol i materiale vegetale
hife adevrate
Nematospora Alungit Alungii cu form de fus, cu un Inmugurire multipolar; Fermenteaz zaharurile;
apendice terminal asemntor fsormeaz pseudohife i hife determin boli la alunele de
unui bici adevrate pmnt, capsulele de bumbac,
5
fasole
Pachysolen Hemisferc Hemisferici; 1-4 per asc nmugurire multipolar; pseudo- Fermenteaz zaharurile, inclusiv
hife; nu formeaz hife adevrate xiloza; izolate din reziduri
taninice
Pachytichospoa Elipsoidal Sferici sau elipsoidali nmugurire multipolar; pseudo- Fermenteaz zaharurile; izolate
hife rudimentare; nu formeaz din sol i din cecumul animal
hife
Pichia Sferic sau Sferici sau cu form de plrie, 1- nmugurire multipolar; unele Unele specii fermenteaz
elipsoidal 4 per asc specii formeaz pseudohife sau zaharurile; izolate din sol, fructe,
hife adevrate, cu un singur alte materiale vegetale insecte,
micropor septal surse clinice
Saccharomyces Sferic sau Sferici sau elipsoidali, 1-4 per nmugurire multipo-lar, Fermenteaz viguros zaharurile;
elipsoidal asc pseudohife, nu formeaz hife izolate din sol, fructe, alimente,
adevrate bere, vin foarte rar din surse
clinice
Saccharomycodes Elipsoidal sau Sferici, 1-4 per asc nmugurire bipolar, formeaz Fermenteaz zaharurile; izolate
alungit pseudohife, dar nu hife din produse vegetale
adevrate
Saccharomycopsis Sferic sau Sferici, elipsoidali sau n form de nmugurire multipolar, Fermenteaz slab zaharurile;
elipsoidal plrie, 1-4 /asc formeaz pseudohife i hife izolate de pe fructe, polen,
adevrate cu septe avnd material lemnos, insecte, alimente
plasmodese bogate n amidon
Schizosaccharomyces Alungit Sferici sau elipsoidali; 4-8 per Diviziune celular prin fisiune Fermenteaz viguros glucidele
asc binar; se pot forma hife izolate din sucuri, fructe, vin,
adevrate substraturi bogate n zaharuri
Schwanniomyces Sferic sau Sferici cu un inel ecuatorial nmugurire multipolar ; Fermenteaz zaharurile; izolate
elipsoidal distinct; 1-2/asc formeaz ocazinal pseudohife, din sol
nu hife adevrate
Sporopachydermia Sferic sau alungit Sferici sau elipsoidali, 1-4/asc nmugurire multipolar, Nu fermenteaz zaharurile,
formeaz ocazional pseudohife produc mirosuri puternice; izolate
dar nu hife adevrate din ape marine, curgtoare,
6
reziduale, surse clinice
Stephanoascus Sferic Iniial cu form de plrie,iar la nmugurire multipolar, Nu fermenteaz zaharurile; izolate
maturitate devin hemisferici, formeaz pseudohife i hife din sol, surse animale i umane
1-4/asc adevrate
Torulaspora Sferic sau Sferici, 1-4/asc nmugurire multipolar; Nu fermenteaz zaharurile; izolate
elipsoidal pseudohife, nu formeaz hife din sol, fructe, sucuri de fructe,
adevrate buturi alcoolice, alimente bogate
n zaharuri sau sare, surse clinice
sau animale
Waltomyces Elipsoidal sau Sferici sau alungii; pigmentai n nmugurire multipolar; nu Nu fermenteaz zaharurile;
alungit brun;1-20/asc formeaz pseudohife sau hife formeaz colonii mucoide; izolate
adevrate din sol
Wickerhamiella Sferic Oblongi, n general 1/asc nmugurire multipolar, nu Nu fermenteaz zaharurile; izolat
formeaz pseudohife i hife din vin i melas
adevrate
Williopsis Sferic sau Sferici sau elipsoidali, cu un inel nmugurire multipolar, Fermenteaz zaharurile; izolate
elipsoidal ecuatorial; 1-4/asc pseudohife, nu formeaz hife din sol, ape, material vegetal
adevrate
Wingea Sferic Au form lenticular; de culoare nmugurire multipolar; nu Nu fermenteaz zaharurile; izolate
brun deschis, 1-4/asc formeaz hife i pseudohife din sol i materiale vegetale
Yarrowia Sferic sau Sferici sau n form de plrie; nmugurire multipolar; Nu fermenteaz zaharurile; izolate
elipsoidal 1-4/asc formeaz pseudohife i hife din sol, ape reziduale, materiale
adevrate cu un singur por bogate n lipide i proteine, surse
central clinice i animale
Zygoascus Sferic sau Hemisferici sau cu form de nmugurire multipolar; Fermenteaz zaharurile; izolate
elipsoidal plrie; 1-4/asc formeaz pseudohife sau hife din must, reziduri industriale
adevrate, cu un singur micropor organice
septal
7
Zygosaccharomices Format prin Sferici sau elipsoidali, 1-4/asc nmugurire multipolar, Fermenteaz zaharurile; izolate
conjugarea a dou pseudohife, nu formeaz hife din vin, alimente, fructe, material
celule, fiecare adevrate vegetal, Drosophila
cuprinznd 1 sau
mai muli
ascospori
Aspectul
Genul starea sexual celulele vegetative Alte trsturi
Chionosphaera Conjugarea celulelor nmugurite de Celule nmugurite i ocazional Cu excepia prezenei corpului de fructificaie
tip opus de mperechere uninucleate pseudohife; hife adevrate se formeaz acest gen pare s aib un ciclu de via similar
determin formarea unor hife numai ca parte a ciclului sexuat cu Filobasidiella; nu formeaz teleospori i
dicariotice care formeaz un mic pigmeni; izolate de pe suprafaa frunzelor
corp de fructificaie; basidia de pe moarte
corpul de fructificaie poart
basidiospori care se reproduc prin
nmugurire
Filobasidiella Celulele nmugurite de tip opus de Celule nmugurite; nu se formeaz Starea teleomorf a lui Cryptococcus
mperechere se unesc pentru a pseudohife neoformans; nu formeaz teleospori i
forma hife dicariotice; din hife se pigmeni; izolate din sol i excremente de
formeaz basidii neseptate, care porumbel
produc basidiospori aranjai n
lanuri de cte patru; au fost
identificate i tulpini homotalice cu
autofertilizare
8
Filobasidium Celulele nmugurite de tip opus de Celule nmugurite, pseudohife i hife Unele specii fermenteaz zaharurile; nu
mperechere fuzioneaz pentru a adevrate formeaz pigmeni i teleospori; izolate din
forma hife dicariotice din care se buturi alcoolice, alimente fermentate i surse
formeaz basidii cu basidiospori clinice
terminali; sunt prezente i tulpini
homotalice
Leucosporidium Celulele nmugurite de tip opus de Celule nmugurite; unele tulpini formeaz Majoritatea speciilor fermenteaz zaharurile;
mperechere conjug pentru a hife i pseudohife nainte de conjugare izolate din ape marine i solul Antarcticii
forma hife dicariotice care dau
natere la teleospori; teleosporii
germineaz pentru a forma basdii
septate i neseptate care formeaz
basidiospori; prezint i tulpini
homotalice
Rodosporidium Similar cu Leucosporidium Celule nmugurite, pseudohife i hife Nu fermenteaz zaharurile; culturile sunt de
adevrate formate de unele specii nainte culoare galben stins, portocaliu sau roie
de conjugare datorit prezenei pigmenilor carotenoizi;
izolate din ape marine i curgtoare, sol,
plante i surse clinice
Sporidiobolus Ciclul de sexuat este n mare Celule nmugurite, pseudohife i hife Nu fermenteaz zaharurile; culturile sunt de
msur similar cu cel de la adevrate formate de unele specii nainte culoare roz sau roie; izolate din sol, ape, aer,
Leucosporidium de conjugare; formeaz ca i anamorful surse clinice i de pe frunze
su Sporobolomyces, ballistospori
Sterigmatosporidium Se formeaz hife dicariotice care Mugurii se formeaz la nivelul unor Nu fermenteaz zaharurile; izolate de pe pasta
poart teleospori,care germineaz extensii celulare denumite sterigme; se de celuloz
pentru a forma basidii neseptate, ce formeaz i pseudohife i hife adevrate
dau natere la basidiospori; prezint
i tulpini homotalice
9
Tabelul 10.3. Drojdiile imperfecte (anamorfe ) i caracteristicile lor
Aspectul
Genul celulele vegetative teleomorfii asociai Alte trsturi
Aciculoconidium Celule ovale sau elipsoidale Ascomicete pe baza testului DBB Fermenteaz slab zaharurile; izolate de la
nmugurite i conidii aciculare; se (diazonim blue B) negativ Drosophila
formeaz hife adevrate
Brettanomyces nmugurire multipolar, celule Genul Dekkera Vezi genul Dekkera din tabelul 10.1
frecvent ogivale la un capt, se
formeaz pseudohife dar nu hife
adevrate
Bullera Celule nmugurite, pseudohife i Bazidimicete pe baza testului DBB Nu fermenteaz zaharurile; nu au pigmeni
hife adevrate; formeaz pozitiv i prezena balistosporilor carotenoizi; izolate din aer, debriuri vegetale
balistospori
Candida nmugurire multipolar, pseudohife Multe genuri de ascomicete i cteva Caracteristicile sunt cele ale partenerilor
i hife adevrate genuri de bazidiomicete teleomorfi
Cryptococcus Celule nmugurite i ocazional Testul DBB pozitiv indic specii de Nu fermenteaz zaharurile; inozitolul
pseudohife bazidiomicete reprezint sursa de carbon; izolate din aer,
ap, alimente, materiale vegetale, insecte,
animale, om
Feniella mugurire bipolar i ocazional Testul DBB negativ indic un teleomorf Fermenteaz zaharurile; izolate din bere;
pseudohife rudimentare ascomicet acest gen este neobinuit, deoarece prezint
nmugurire bipolar, dar n acelai timp o
serie de caracteristici ale genului
Brettanomyces, incluznd producerea de acid
acetic i un timp scurt de via n cultur
10
Fellomyces nmuguririre din vrful sterigmelor Creterea vegetativ este similar cu cea Nu fermenteaz zaharurile; izolate din aer,
cu un punct de septare adiacent de la Strigmatosporidim, gen ce ap marin, brnzeturi, insecte, animale, om
mugurelui; celulele mam au n reprezint starea teleomorf
general cteva sterigme; formeaz
pseudohife i hife adevrate
Kloeckera Celule n form de lmie, cu Partenerul teleomorf este Hanseniaspora Vezi genul Hanseniaspora n tabelul 10.1
nmugurire bipolar; pot s formeze
psudohife, dar nu hife adevrate
Malassezia Celule cu nmugurire unipolar; Pe baza testului DBB bazidiomicete Izolate de pe piele, de la om i animale
forneaz hife adevrate
Oosporidium nmugurire multipolar; se pot Pe baza testului DBB ascomicete Nu fermenteaz zaharurile; sunt prezeni
forma pseudohife pigmeni non-carotenoizi roz sau orange;
izolate din materiale vegetale
Phaffa Celule nmugurite; clamidospori; Testul DBB pozitiv indic specii de Fermentaia slab a zaharurilor; culturile sunt
pseudohife rudimentare bazidiomicete de culoare roie darorit acumulrii
pigmenilor carotenoizi
Rhodotorula nmugurire multipolar; formeaz Starea sexual este reprezentat de Nu fermenteaz zaharurile; culturi de culoare
pseudohife i hife adevrate Rhodosporidium roie, oranj sau galben; izolate din aer, ap,
sol, materiale vegelale, insecte, animale, om
Sarcinosporon Celulele nmugurite care se separ Testul DBB pozitiv indic specii de Nu fermenteaz zaharurile; izolate din leziuni
sau rmn legate n agregate de bazidiomicete ale pielii
tipul celor formate de Sarcina
Schizoblastosporium nmugurire bipolar; pseudohifele Testul DBB negativ indic specii de Nu fermenteaz zaharurile; izolate din sol i
sunt rudimentare sau absente, nu ascomicete coninut stomacal
formeaz hife adevrate
Sporobolomyces Celule nmugurite; unele tulpini Partenerul teleomorf este Sporodiobolus Nu fermenteaz zaharurile; culturile sunt roz
formeaz pseudohife sau hife sau roii, datorit pigmenilor carotenoizi;
adevrate; formeaz balistospori izolate din sol, ap, aer, frunze, surse clinice
11
Sterigmatomyces nmugurire din vrful sterigmelor; Testul DBB pozitiv indic specii de Nu fernenteaz zaharurile; izolate din aer, ap
nu formeaz pseudohife sau hife basidiomicete de mare, surse clinice
adevrate
Sympodiomyces Celule nmugurite; unele celule Testul DBB negativ indic asocirea cu Nu fermenteaz zaharurile; izolate din ap
formeaz conidiofori care produc ascomicetele marin
conidii terminale; eliberarea
succesiv a conidiilor determin
formarea unui patern de cicatrici de
tip simpodial; se formeaz i hife
adevrate
Trichosporon Celule nmugurite i artrospori care Asocierea unor specii de basidiomicete Pot s realizeze sau nu fermentarea
se formeaz printr-un proces de i a altora cu ascomicete zaharurilor; izolate din ap, aer, sol, alimente,
fuziune; sunt prezente pseudohife i material vegetal, de la om i animale
hife adevrate; se pot forma i
endospori asexuai
Trigonopsis nmugurire multipolar cu celule Testul DBB negativ indic asocierea cu Nu fermenteaz zaharurile; din bere i must
elipsoidale sau triunghiulare; nu se ascomicetele
formeaz pseudohife sau hife
adevrate
12
X.1. Metode convenionale de identificare a drojdiilor
1. Teste morfologice
13
Bazidiosporii produi de bazidiomicete sunt, n general, celule neornamentate,
elipsoidale sau alungite, dar evenimentele ce duc la formarea lor pe suprafaa bazidiilor sunt
extrem de complexe. Depinznd de gen, bazidiile pot s apar din teleospori cu peretele
ngroat sau apar direct din hife. Speciile pot s fie homo- sau heterotalice, iar mperecherea
poate fi controlat de o pereche sau dou perechi de alele, spre deosebire de ascomicete, unde
o singur pereche de alele controleaz conjugarea.
2. Teste fiziologice
Dup cum am mai discutat, separarea drojdiilor n genuri s-a realizat iniial pe baza
observaiilor microscopice. Recunoaterea pn la nivel de specie pune, ns, problema
realizrii unor teste de asimilaie i fermentaie.
Testele de fermentaie
Testele de asimilaie
Alte teste de cretere includ rspunsul la compui cu azot, absena vitaminelor din
mediu variaia presiunii osmotice, prezena n mediu a cicloheximidei i variaia temperaturii.
14
O problem major care se pune este, n cazul drojdiilor anamorfe, identificarea
partenerilor teleomorfi, care pot s aparin ascomicetelor sau bazidiomicetelor. Van der Walt
i Hopsu-Havu (1976) au pus la punct un test simplu de culoare, care distinge cele dou clase.
Colorarea se realizeaz cu albastru de diazonium B (DBB-Diazonium Blue B) care
reacioneaz cu celulele ce aparin culturilor de bazidiomicete, peretele celular colorndu-se
n rou aprins. Ascomicetele nu rspund la reacia cu DBB.
CLASA COMPUII
Identificarea definitiv
15
Tabelul 10.5. Teste utilizate n sistemul COMPASS de identificare a drojdiilor
16
devenit Candida utilis. Ca urmare, numele de Torula utilis i Torulopsis utilis au devenit
sinonime cu Candida utilis. n prezent, Candida utilis este cunoscut i ca anamorful speciei
Pichia jadinii.
Un alt sinonim al drojdiei C. utilis este C. guillermondii. Acest termen a rezultat din
denumirea incorect a unei tulpini de C. utilis identificat ca o specie nou.
Alte exemple includ speciile Saccharomyces diastaticus i S. italicus care n urma
analizelor ADN s-au dovedit identice cu S. cerevisiae i deci au devenit sinonime.
Cunoaterea sinonimelor prezint o importan deosebit i pentru biotehnologi, care
pot s evite confuziile care apar n urma unei clasificri eronate.
De exemplu, descoperirea c o anumit reacie poate fi mediat de S. cerevisiae, S.
beticus, S. chevalieri, S. gaditensis, S. hispalensis i Zygosaccharomyces paradoxus a sugerat
iniial o funcie metabolic comun; ulterior s-a stabilit c sunt conspecifice cu S. cerevisiae i
sunt sinonime.
Metodele genotipice sunt cele care aduc datele cele mai rapide i acurate privind
ncadrarea taxonomic a unei anumite specii. Aceste tehnici moleculare vizeaz la drojdii
analiza ntregului ADN cromozomal:
determinarea compoziiei n baze azotate, respectiv a procentului molar de guanin/
citozin - % mol GC;
determinarea gradului de omologie prin reasocieri ADN/ADN;
analiza profilului de lungime a fragmentelor de restricie - RFLP (Restriction
Fragments Length Polimorfism);
studii de omologie a ARNr i a genelor corespunztoare;
compararea profilurilor cromozomale obinute prin tehnici electroforetice speciale
(electrocariotipare).
n ultimii ani au fost puse la punct o serie de tehnici de analiz a ADN cromozomal, ce
ofer informaii cu valoare taxonomic despre microorganisme. Una dintre cele mai folosite
analize este reprezentat de determinarea compoziiei ADN genomic n baze azotate.
Complementaritatea bazelor azotate i structura dublucatenar a ADN asigur existena n
molecul a unor cantiti echivalente de guanin - citozin i adenin timin.
17
Este important de subliniat faptul c similaritatea n compoziia n baze azotate nu
nseamn n mod necesar c dou microorganisme sunt nrudite, pentru c pot avea acelai %
mol GC, dar secven diferit de nucleotide. Reciproca nu este ns valabil, pentru c dou
tulpini cu valori foarte diferite ale mol % GC, au i secven diferit de nucleotide. Ca urmare,
compoziia n baze azotate exprimat n % mol GC reprezint un criteriu taxonomic de
excludere i nu de includere (criteriu negativ de ncadrare a taxonilor).
Estimarea procentului G+C al moleculelor ADN se poate realiza prin trei principale
metode:
determinarea cromatografic a bazelor azotate obinute n urma hidrolizei ADN
cromozomal, utilizndu-se tehnica HPLC (High Performance Liquid Chromatography-
cromatografie n faz lichid, Nakaseetal, 1989);
Aceast metod este extrem de acurat, dar este laborioas i costisitoare, iar la
eucariote prezint i dezavantajul existenei i a ADNmt n fracie.
ultracentrifugarea probei de ADN cromozomal n gradient de densitate de CsCl
urmat de calcularea densitii de plutire a macromoleculelor de ADN din prob cu
ajutorul densitii de plutire a unei probe standard de ADN;
Procentul molar G+C se calculeaz pe baza relaiei:
util cnd ADN este dizolvat n 0,1X SSC (NaCl 15 mM, citrat trisodic 1,5 mM), rezultnd o
concentraie mai mare a ionilor de sodiu.
util cnd ADN este dizolvat n tampon TE pH= 8,0 (Tris 10 mM EDTA 1mM), deci la o
concentraie mai mic a ionilor de sodiu.
Pentru drojdii este valabil o alt formul, i anume:
18
Astfel, procentul G+C al drojdiilor ascomicete este cuprins ntre 30 i 50 %, n timp ce
la basidiomicete variaz ntre 50 i 70% (Nakase i Komagata, 1968; Kurtzman, Phaff i
Meyer, 1983). i genurile clasei de drojdii imperfecte, cu excepia celor cu valori apropiate,
cuprinse ntre 48 i 52 %, pot fi determinate pe baza coninutului n baze azotate.
n general, variaia % mol GC pentru diferitele specii ale unui gen nu este mai mare de
10%, fapt confirmat pentru majoritatea genurilor de drojdii. Exist, ns i excepii, cum ar fi
n cazul speciilor genului Pichia la care diferena ajunge pn la 22%, sau la Rhodotorula,
pn la 14%. Ca urmare, s-a sugerat necesitatea diferenierii unor asemenea taxoni n mai
multe genuri de drojdii.
Hibridizarea n soluie
19
ADN radioactiv s fie n cantitate foarte mic (reasocierea este improbabil);
ADN neradioactiv s fie n cantitate de 1500 de ori mai mare.
Hibridizarea n NaCl 0,42 M, sau n tampon fosfat 0,28 M, la temperatur optimal (de
la Tm 25 la Tm 30o C ): prin aplicarea acestei metode se impune n final separarea ADN
hibrid (bicatenar) de ADN rmas monocatenar, fie prin cromatografie pe hidroxiapatit, fie
prin tratament cu nucleaz S1, care hidrolizeaz specific ADN monocatenar (Vandamme et
al., 1996).
Rezultatele obinute prin aplicarea metodelor de reasociere ADN se exprim n
procente de omologie, dar exist anumite semne de ntrebare n deciderea punctului n care
dou tulpini sunt considerate specii diferite. Unii cercettori au sugerat faptul c un procent de
reasociere mai mare de70 80 % demonstreaz conspecificitate (Price et al., 1978).
Kurtzman i colab. (1980) au analizat aceast problem la tulpinile de drojdii
heterotalice i au constatat c o complementaritate crescut a moleculelor de ADN este
corelat cu fertilitatea. Astfel, au constatat c speciile Pichia amylophila i P. missippiensis
care prezint capacitate de mperechere, dar sporii nu sunt viabili, au un procent sczut de
omologie ADN, n jur de 25%. Ca urmare, se poate face o corelaie ntre fertilitatea sczut i
un grad mic de complementaritate ADN.
n acelai timp, ns, relaia dintre alte tulpini, cum ar fi Issatchenikia scutulata var.
scutulata i I. scutulata var. exigua este oarecum diferit. Aceti doi taxoni prezint o
omologie ADN de numai 25%, dar ncrucirile genetice dau o viabilitate a ascosporilor de 3-
6 %. Mai mult, ncruciarea descendeilor din F1 a dat o viabilitate de 17% n generaia F 2.
Aceste rezultate sugereaz faptul c toi descendenii au n general cromozomi omologi i nu
apar nici amfiploizi, nici aneuploizi.
Este clar c limita minim a valorii procentului de reasociere ADN-ADN, care
sugereaz delimitarea speciilor, nu este bine definit, iar diferena n secvena de nucleotide,
estimat din compararea ntregului genom, poate fi chiar de 75% fr ca s apar modificri
genetice.
Tabelul 10.6 cuprinde principalele date referitoare la corelaiile dintre procesul de
mperechere i complementaritatea ADN.
n aceste studii se demostreaz c descreterea procentului de reasociere este asociat
cu scderea competenei de mperechere i a fertilitii.
Existena unor excepii n ceea ce privete omologia ADN genomic i fertilitatea
descendenilor pune problema c procentul de reasociere reprezint un indicator puternic, dar
nu infailibil al nrudirii speciilor. Aceste excepii se datoresc unor mutaii genetice de tipul
inversiilor, translocaiilor, autoploidiei i aloploidiei, care afecteaz fertilitatea. Majoritatea
acestor modificri nu pot fi detectate n urma comparrii ADN genomic total. Doar
amfiploidia poate fi decelat, n cazul n care apar variaii n mrimea genomului la specii
foarte nrudite.
De exemplu, S. carlsbergensis este nalt nrudit i cu S. cerevisiae i cu S. bayanus,
dei aceste dou ultime specii sunt foarte puin nrudite ntre ele. Compararea mrimii
genomurilor sugereaz c S. carlsbergensis este un amfiploid parial care apare ca un hibrid
natural ntre S .cerevisie i S. bayanus. (Vaughn Martin i Kurtzman, 1985). n acest caz, s-a
presupus c S. carlsbergensis este infertil cu parentalii, n ciuda omologiei mari a ADN.
Studiile de reasociere ADN au avut un impact extraordinar n definirea speciilor i
genurilor de drojdii (Tabelul 10.7).
Astfel, speciile genurilor Candida i Torulopsis au fost iniial ncadrate n taxoni
diferii pe baza faptului c primele produc pseudohife. n prezent, aceti taxoni sunt
considerai sinonimi, pe baza studiilor de reasociere ADN, i denumirea de Candida a avut
prioritate, fiind prima descris.
Este i cazul speciilor Pichia lindneri i Hansenula minuta (Kurtzman, 1984), care au
fost iniial ncadrate ca taxoni diferii pe baza capacitii diferite de asimilare a azotului, iar n
prezent sunt considerate ca aceeai specie, prezentnd un procent de omologie ADN de 75%.
20
Tabelul 10.6. Corelaia dintre reacia de mperechere i complementaritatea ADN ntre
ascomicete heterotalice strns nrudite i bazidiomicete
21
2. Studii de omologie pe ADN mitocondrial
22
acurate prin secvenierea ADNr, utiliznd primeri oligonucleotidici i reacia PCR
(Kaltenboecker i colab., 1992).
n sistematica drojdiilor, primele studii de reasociere ARNr-ADNr au fost realizate n
1970, de Bicknell i Douglas.
Prin estimarea gradul de reasociere dintre probe de ARNr 25S marcate radioactiv i
ADN nuclear au stabilit nrudirea strns dintre genurile Saccharomyces, Kluyveromyces,
Zygosaccharomyces, Torulopsis i Arxiozyma i o divergen crescut ntre aceti taxoni i alte
drojdii, cum ar fi Pichia jadinii (specia anamorf, Candida utilis). O metodologie similar a
fost utilizat i de Segal i Zylan (1974) n compararea speciilor de Candida, inclusiv
Candida albicans.
i la bazidiomicete studiile de reasociere ARNr-ADN au reevaluat relaiile dintre
diferite specii, stabilind, de exemplu, c speciile cu pigmentaie roie, Rhodosporidium
toruloides i Sporidiobolus salmoniocolor sunt mult mai puin nrudite ntre ele dect R.
toruloides i specia Leucosporidium scotti, care nu produce pigmeni carotenoizi.
Dei hibridizrile ARNr/ADNr dau informaii generale privind relaiile dintre taxoni,
prezint unele impedimente n aplicarea lor extensiv n studiile de taxonomie, deoarece sunt
laborioase, iar n cazul n care cresc distanele filogenetice se ajunge la un punct n care
secvenele de nucleotide sunt att de diferite, nct nu permit hibridizri moleculare. De altfel,
s-a sugerat c similaritatea de secven trebuie s fie n jur de 80%, pentru a se realiza
reasocierile moleculare.
Secvenierea ARNr 5S
23
Secvenierea ARNr 18S i 25S
Compararea secvenelor ARNr 18S i 25S (Guttel i Fox, 1988 ) a demonstrat faptul
c la capetele 5 aceste molecule prezint un grad ridicat de variabilitate, ceea ce permite
decelarea speciilor nalt nrudite. Astfel, Peterson i Kurtzman (1991) au artat c regiunea
desemnat 25S-635 (domeniul D2, Guadet i colab., 1989) prezint o variabilitate destul de
mare, care permite separarea speciilor stns interrelate (Tabelul 10.8).
Exist i excepii, cum ar fi perechea Saccharomyces bayanus/ S. pastorianus, cu o
variabilitate de 0% n regiunea D2. Se presupune c S. pastorianus este un amfidiploid parial
rezultat din hibridizrile S. cerevisiae x S. bayanus, care a reinut ADNr de la S. bayanus
(Peterson i Kurtzman, 1991).
Specii homotalice
24
agaroz. O soluie ar fi utilizarea unei agaroze de concentraie mai mic de 0,5% ceea ce
ridic ns dificulti de manipulare a gelului.
Aceste tehnici fac posibil evidenierea celor 16 cromosomi de la S. cerevisiae a cror
dimensiune medie (determinat prin tehnicile clasice de cartare genetic) variaz ntre 500 -
1000 kpb.
n prezent se utilizeaz diferite tehnici de electrocariotipare care difer att prin
numrul i dispunerea electrozilor ct i prin tipul de cmp electric generat, fapt care
determin grade diferite de rezoluie a benzilor electroforetice:
25
Tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis)
n tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis) Olson i Carle (1984) - este
schimbat cu 180o polaritatea cmpului electric la fiecare ciclu cu un timp mai mare (aproape
dublu) pentru direcia spre anod. Relaia ntre viteza de migrare i dimensiunea moleculelor de
ADN este complex i, de regul, impune creterea timpului de schimbare a direciei de migrare,
proces numit ramping. La unele drojdii care prezint cromosomi de dimensiuni mari, cum este
cazul celor din genul Saccharomyces, s-a reuit separarea cromozomilor fr ramping.
Pentru cei 16 cromosomi de la Saccharomyces cerevisiae, s-au evideniat 13 benzi
electroforetice datorit co-migrrii unor cromozomi cu dimensiuni apropiate (XIII i XVI, VII i
XV, V i VIII) (Fig. 4. 18). Mrimea cromosomului XII variaz de la o tulpin la alta (2 Mb
3Mb) n funcie de numrul de copii (100 200) ale genelor ADNr prezente la nivelul acestui
cromosom. Acest aspect s-a dovedit a fi de mare importan n taxonomia drojdiilor.
CROMOZOM DIMENSIUNE
(KPB)
IV 1625
XII 1095+ADNr
VII + XV 1120+1170
XIII + XVI 965+1015
II 840
XIV 825
X 760
XI 680
V + VIII 585+595
IX 440
III 350
VI 270
I 245
Descris de Chu (1989), Meese i Meltzer (1990), aceast tehnic folosete o arie
hexagonal n care sunt plasai muli electrozi mici conectai n serie astfel nct cmpurile
electrice se ntretaie n unghiuri de 120 o. Benzile rezultate sunt mai clare i pe acelasi gel poate
fi ncarcat un numr mare de probe (Fig. 4. 17). O variant a acestei tehnici este RGE (rotating
gel) n care se utilizeaz cmpuri electrice ntretiate omogene rezultate prin rotirea gelului cu
90o la fiecare ciclu.
26
Tehnicile electroforetice speciale permit: (I) separarea i caracterizarea cromosomilor
(molecule de ADN intacte) n scopul determinrii polimorfismului cromosomal a diferitelor
tulpini de drojdii; (II) identificarea poziiei genelor pe cromosomi; (III) prepararea i
screening-ul bibliotecilor YAC (Yeast Artificial Chromosomes).
27