2.

1 Electroforeza capilară în analiza materiilor prime și a excipienților farmaceutici

Electroforeza capilară (EC) este o tehnică care combină mecanismele de separare ale electroforezei cu
aparatura și automatizarea cromatografiei(1). EC este o procedură foarte utilă și adaptabilă pentru un
număr substanțial de aplicații. Popularitatea acestei tehnici este dată de puterea de înaltă rezoluție,
instrumentația complet automatizată, separarea rapidă, și prin urmare o gamă largă de substanțe
precum ioni, medicamente și biopolimeri pot fi analizați prin EC în funcție de proprietățile fizico-chimice
ale analitului. Tehnicile utilizate în scopul controlului calității trebuie să prezinte unele dintre
următoarele caracteristici: ușurința de operare, recunoașterea speciilor cromofore prin utilizarea
detectării UV indirecte sau prin absorbanța directă la lungimi de undă scăzute, cheltuieli de lucru reduse
și producerea de informații brute de înaltă calitate, recuperabile. EC devine tot mai utilizată în industria
farmaceutică pentru separări chirale și pentru a identifica substanțele active sau a impurităților
asociate(2).
2.1.1. Analiza alcoolilor
Alcoolii și solvenții organici precum acetonitrilul, metanolul, etanolul și acetona sunt cei mai folosiți în
procesarea substanțelor chimice. Confirmarea identității acestora se face de regulă prin gaz-
cromatografie înainte de utilizarea lor în formulare, dar poate fi realizată și prin EC prin metoda
cromatografiei electrocinetice micelare (MEKC). Prin urmare, identitatea probei de solvent poate fi
confirmată prin compararea acesteia cu timpul de migrare al probei standard(2).
2.1.2. Analiza carbohidraților
Analiza carbohidraților poate fi făcută cu ajutorul EC, iar performanța și metodele posibile în acest
domeniu au fost bine documentate în literatură. În această metodologie, pentru detectarea indirectă a
fost folosit un electrolit cu pH crescut care conține triptofan și EC a fost folosită pentru a elimina
carbohidrații folosind o derivatizare într-o singură etapă cu reactivi precum aminobenzoatul. Diferiți
carbohidrați sunt capabili să formeze un complex cu ioni borat care permite separarea lor ca anioni.
Formarea acestui complex are loc în general la o temperatură ridicată și în prezența unor concentrații
ridicate de ioni borat(2).
2.1.3. Analiza ciclodextrinelor
Hidroxilpropil- sau dimetil-b-ciclodetrina sunt formele derivatizate chimic ale ciclodextrinelor. Aceste
forme au solubilitatea în apă îmbunătățită față de formele nederivatizate. Separarea diferitelor forme de
ciclodextrine poate fi efectuată prin EC cu utilizarea unui electrolit cu ioni benzoat. Această metodă
ajută la separarea formelor α, β și γ. Formele derivatizate sunt cele mai utilizate în fabricarea produselor
farmaceutice lichide, pentru a spori solubilitatea medicamentelor greu solubile. Un grup de cercetători a
raportat o metodă de EC pentru a identifica formele derivatizate ale ciclodextrinelor cu ajutorul
detectării indirecte a fluorescenței. Pentru furnizarea semnalului de fond necesar detectării
fluorescenței indirecte a fost utilizat sulfonatul de anilină(2).
2.1.4. Analiza coloranților
Analiza coloranților se face de obicei prin cromatografie de strat subțire, dar poate fi efectuată și prin
EC. A fost raportat faptul că, coloranții cationici pot fi analizați prin utilizarea unui electrolit cu pH scăzut,
în timp ce pentru analiza coloranților insolubili în apă este mai potrivită utilizarea electroliților cu SDS (cu
posibila adăugare de solvenți organici). Pentru separarea coloranților acizi, se poate folosi tampon fosfat
sau borat cu pH ridicat(2).
2.1.5. Analiza acizilor grași
Aceștia sunt în general analizați prin gaz-cromatografie (GC) urmată de derivatizarea lor la esteri volatili.
Acizii grași cu lanț mai lung sunt în general insolubili în apă și nu activitate UV substanțială. În urma unui
studiu a fost raportată analiza acizilor grași liberi prin EC utilizând detectarea UV indirectă cu ajutorul
soluțiilor de surfactant cu un conținut crescut de solvenți organici, inclusiv acetonă sau acetonitril. Într-
un alt studiu au fost analizați acizii grași liberi cu o lungime a lanțului de la C4 la C18 cu ajutorul unei
soluții de electrolit constând din acetonitril 40% în 16 minute. Detectarea a fost făcută la o lungime de
undă de 254 nm și ca agent de fond UV a fost folosit acidul trinitrobenzen sulfonic. Această tehnică este
foarte utilă în analiza unei game largi de excipienți farmaceutici, inclusiv a stearatului de magneziu și a
altor acizi grași(2).
2.1.6. Analiza agenților de aromatizare
Un grup de cercetători a raportat că determinarea ionilor organici , cum ar fi bitrex, se poate face prin
intermediul EC. Separarea a fost realizată în 0.025 mol L -1 trifosfat la pH 7.0 iar detectarea a fost făcut
prin UV la 214nm. Ca standard intern a fost utilizată clorura de trietilbenzilamoniu(2).
Un alt agent de aromatizare, aspartam, a fost analizat prin MEKC folosind o coloană capilară de
silice cu un soluție tampon constând din deoxicolat de sodiu 0.05 M, ortofosfat dihidrogen de potasiu
0.01M, borat de sodiu 0.01 M la 20 kV unde aspartamul migrează sub formă de cation și poate fi
detectat la 200 nm pentru sensibilitate maximă. Pentru acest experiment a fost folosit acidul
dehidroacetic ca standard intern(2).
2.1.7. Testarea anionilor anorganici
Testarea anionilor precum clorura, sulfatul sau fosfatul se poate face prin titrare sau cromatografie cu
schimb de ioni. Cu toate acestea, EC reprezintă o opțiune bună deoarece este ușor de utilizat, este mai
puțin costisitoare și necesită mai puțin timp în comparație cu metodele convenționale. Un studiu în care
a fost analizat un amestec de 50 mL de clorură și nitrat, a dezvăluit că aceștia pot fi separați prin detecție
indirectă la 254 nm cu adăugarea de cromat la un electrolit de borat. Bromura de
tetradeciltrimetilamoniu a fost încorporată în electrolit pentru a acoperi energic pereții capilarei pentru
a regla selectivitatea dobândită. Nitratul a fost folosit ca standard intern pentru clorură. Cristalinitatea
unor excipienți, cum ar fi zaharoza, poate fi afectată semnificativ de nivelurile reduse ale diferiților
anioni inclusiv clorura și sulfatul. Prin urmare, este esențial să existe o metodă analitică adecvată pentru
a determina nivelurile acelor contaminanți. EC poate oferi sensibilitatea și selectivitatea
corespunzătoare(2).
Concluziile unui alt studiu au dezvăluit că EC poate fi folosită pentru a analiza prezența unor niveluri
foarte reduse (ppm) a unor diverși contaminanți, inclusiv clorură sau acetat(2).
2.1.8. Analiza ionilor metalici
Nivelul ionilor metalici în materiile prime farmaceutice sau în excipienți poate fi analizat prin EC prin
intermediul detectării UV indirecte. Un număr mare de medicamente acide care sub formă de săruri
metalice conțin sodiu și potasiu. Alți cationi de interes sunt amoniul, calciul și magneziul. Confirmarea
identității și a conținutului de cation poate fi făcută prin calcul procentual. A fost raportată separarea
sodiului, litiului, potasiului, magneziului și a cobaltului folosind o soluție de electrolit care conține 5 mM
imidazol în 99 mL acid acetic glacial la o tensiune de 10 kV și detecția indirectă la 214nm(2).
2.1.9. Analiza surfactanților
Surfactanții sunt compuși folosiți ca emulgatori și conservanți într-o varietate largă de produse
farmaceutice. Agenții tensioactivi precum dodecilbenzensulfonat de sodiu și clorura de benzalconiu pot
fi analizați prin EC utilizând electroliți cu pH 9 respectiv 2.5 cu detecție UV la 200nm(2).
EC este un instrument important utilizat pentru analiza compușilor cu absorbanță UV limitată cu ajutorul
detecției indirecte prin intermediul tehnicilor EC simple, fiabile și mai puțin costisitoare(2).
2.2. Cromatografia de gaz capilară
Aceasta este o tehnică eficientă utilizată pentru detectarea și cuantificarea impurităților organice
volatile din excipienții farmaceutici(2).
2.2.1. Analiza solvenților organici în excipienții farmaceutici
O echipă de cercetători a optimizat o metodă pentru detecția solvenților organici într-un interval mare
de concentrații. Metodologiile propuse au fost testate pentru selectivitate, precizie și reproductibilitate
și au fost implementate eficient pentru screening-ul rapid al solvenților organici în excipienții utilizați în
mod obișnuit(2).
Identificarea și caracterizarea peak-urilor a fost făcută prin compararea acestora cu valorile din
biblioteca spectrală NIST (National Institute of Standards and Technology) din SUA(2).
2.3. Cromatografia cu permeație pe gel-cromatografia de excludere și alte tehnici de cromatografie
lichidă
Calitatea, siguranța și eficacitatea formulărilor farmaceutice sunt influențate în principal de proprietățile
excipienților polimerici și, prin urmare, trebuie caracterizate ca atribute critice de control al calității.
Agilent este o tehnologie cu o împlicare extinsă în evaluarea excipienților prin cromatografie cu
permeație pe gel, cunoscută și sub denumirea de cromatografia de excludere prin dimensiune (CE).
Această tehnică este foarte importantă pentru determinarea distribuției greutății moleculare
excipienților polimerici, deoarece un număr mare de caracteristici fizice sunt afectate de greutatea
moleculară a acestora. Prin urmare, un polimer nu va funcționa conform cerințelor dacă distribuția sa
moleculară este mai mare sau mai mică decât este necesar(2).
2.3.1. Analiza polivinilpirolidonei (PVP)
PVP este cel mai utilizat excipient în produsele farmaceutice și este în general disponibil în trei forme:
povidona solubilă, crosprovidona reticulată insolubilă și copovidona. Povidona este solubilă în apă și în
solvenți organici polari. În acest exemplu, dimetilformamida a fost utilizată cu bromura de litiu pentru a
reduce orice efecte polielectrolitice. În scopul detectării a fost utilizat detectorul cu indice de refracție
(DIR). Analiza polivinilpirolidonei a fost realizată eficient prin utilizarea Agilent PLgel 10 µm MIXED-B
COLUMNS(2).
2.3.2. Analiza polietilenglicolului
Polietilenglicolul este un excipient folosit de obicei în produse farmaceutice și de îngrijire personală. În
cromatografia cu permeație pe gel, analiții sunt separați în funcție de dimensiunea lor. Analiții cu
dimensiuni reduse pot pătrunde cu ușurință în pori și, ca urmare, pot petrece timp suplimentar în acești
pori crescându-le timpul de retenție. Astfel, moleculele mai mici vor elua mai târziu. Pe de altă parte,
analiții cu molecule mari petrec foarte puțin timp în pori și prin urmare sunt eluați mai repede. Cu toate
acestea, în cromatografia interactivă, moleculele mari interacționează cu materialul de ambalare și sunt
reținute pentru o perioadă mai lungă de timp și, prin urmare, eluează după moleculele mici. În punctul
critic, condițiile de eluant sunt menținute în așa fel încât să susțină un echilibru între mecanismele
interactive și cromatografia bazată pe excluziune astfel încât molecula să elueze la un timp de retenție
similar, în ciuda greutății moleculare. Prin urmare, o modificare foarte mică la structura moleculară, de
exemplu la grupele funcționale, poate duce la o schimbare mare în comportamentul de eluție(2).
2.3.3. Analiza chitosanului
Greutatea moleculară medie și distribuția greutății moleculare a chitosanului au fost determinate
folosind CPG/CE. Au fost utilizate coloane Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 8 µm pentru a analiza trei
grade diferite de chitosan. Datorită naturii sale cationice, a fost utilizat un acid puternic pentru a prepara
proba de chitosan care a fost păstrată peste noapte pentru a facilita dizolvarea. Analiza probei a fost
realizată utilizând tampon de azotat de sodiu 0.5 M cu pH scăzut. Pentru calibrarea sistemului au fost
utilizate standarde de polizaharidă pullulan. În urma interpretării cromatogramelor, s-a ajuns la
concluzia că cele trei probe de chitosan diferă în ceea ce privește valoarea medie a masei moleculare(2).
2.3.4. Analiza metilcelulozei
Două probe de metilceluloză au fost analizate prin CE utilizând coloane PL aquagel-OH. Pentru calibrare
au fost utilizate standarde de polizaharide pullulan Agilent(2).
2.3.5. Analiza acetatului de celuloză
Esterificarea celulozei cu radicali acetil, butiril sau ftalat are ca rezultat formarea de ester mixt care este
folosit ca agent de acoperire cu eliberare lentă a capsulelor și tabletelor. Acetatul de celuloză este
solubil într-un număr limitat de solvenți. În acest experiment, dizolvarea acetatului de celuloză a fost
obținută în dimetilacetamidă după încălzirea ușoară și agitarea soluției(2).
2.3.6. Analiza ciclodextrinelor
Ciclodextrinele sunt greu de analizat prin HPLC deoarece nu au un cromofor UV și adesea este necesară
eluția prin gradient, ceea ce face ca detectarea prin DIR să nu fie fezabilă. Detectarea împrăștierii luminii
prin evaporare este o tehnică independentă de proprietățile optice ale compusului și prin urmare, este o
opțiune avantajoasă pentru determinarea ciclodextrinelor. Această tehnică are capacitatea de a distinge
toate componentele produsului farmaceutic într-o singură cromatogramă și poate fi operat la o
temperatură scăzută, de obicei necesară pentru produsele farmaceutice, deoarece temperatura sa de
funcționare nu este dependentă de faza mobilă. Compoziția reală a formulării farmaceutice se obține
prin operarea instrumentului la 30 °C. S-a observat însă că la o temperatură de 50 °C o cantitate mică de
ibuprofen semi-volatil s-a evaporat(2).
2.3.7. Analiza sorbitolului
Sorbitolul a fost analizat prin cromatografie lichidă utilizând un detector cu index de refracție cu o
temperatură de 50 °C și o coloană de 7.7mm x 10cm care conține L34. Temperatura coloanei a fost
menținută la 50 °C cu un debit de 0.7mL/min. A fost folosit ca standard intern o soluție de sorbitol și
manitol preparată în așa fel încât să se obțină 4.8 mg/mL din fiecare compus. Analiza a fost efectuată
folosind o coloană special concepută pentru acest experiment(2).
2.3.8. Analiza manitolului
Manitolul a fost analizat prin cromatografie lichidă cu un detector de refracție care a fost menținut la o
temperatură constantă și o coloană cu dimensiunile de 4 mm x 25 cm care conține L19. Temperatura
coloanei a fost menținută între 30 și 85 °C cu un debit de 0.5 mL/min. A fost folosit ca standard intern o
soluție de sorbitol și manitol preparată în așa fel încât să se obțină 4.8 mg/mL din fiecare compus(2).
1. Funduc I. NOTE DE CURS Electroforeza capilară Capillary electrophoresis. Rev Română Med Lab.
2006;2.
2. Kumar M, Bhatia R, Rawal RK. Applications of various analytical techniques in quality control of
pharmaceutical excipients. J Pharm Biomed Anal [Internet]. 2018;157:122–36. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.05.023