UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

DIN CRAIOVA

FACULTATEA DE FARMACIE

MASTER “LABORATOR CLINIC ȘI DE ANALIZA

MEDICAMENTULUI”

DISCIPLINA “ANALIZA MEDICAMENTULUI”

REFERAT

"Analiza flavonoidelor din Ginkgo

biloba"

MASTERAND:
Radu Mihaela Camelia

1
2022

2
 Introducere

Se știe că flavonoidele au diverse beneficii pentru sănătate, cum ar fi activități

antioxidante, antimutagene, antibacteriene, antiangiogenice, antiinflamatorii, antialergice și
anticancerigene. Mai mult, s-a raportat anterior că unele flavonoide joacă un rol de reglare în
eliberarea neurotransmițătorilor din neuroni. Flavonoidele, inclusiv delfinidina, cianidina,
miricetina și quercetina (Q), opresc plierea proteinelor solubile ale receptorului proteinei de
atașare a factorului sensibil la N-ethylmaleimidă (SNARE). Eliberarea neurotransmițătorilor din
celulele neuronale poate fi reglată de flavonoide, deoarece formarea complexului SNARE este
esențială pentru fuziunea completă între membrana veziculară sinaptică și membrana plasmatică.
Studiile in vitro sugerează că diferitele etape ale fuziunii membranei, inclusiv andocarea,
hemifuzia și formarea porilor, sunt afectate de flavonoide din cauza interacțiunii directe atât cu
intermediarul complex SNARE, cât și cu membranele. Flavonolii, cum ar fi miricetina și Q, pot
imita activitatea neurotoxinelor botulinice (BoNT) prin inhibarea formării complexului SNARE,
deoarece BoNT blochează eliberarea de acetilcolină prin proteoliza proteinelor SNARE. Prin
urmare, BoNT sunt utilizate în intervenții terapeutice pentru boli precum hiperhidroza, ridurile,
durerile articulare și musculare și alte boli de hipersecreție.
Frunza de Ginkgo biloba (GBL) a fost folosită ca remedii pe bază de plante de secole în
Asia de Est. GBL este utilizat în mod obișnuit ca unul dintre suplimentele pe bază de plante din
întreaga lume și este utilizat în mod obișnuit pentru ameliorarea afecțiunilor, inclusiv tulburări de
circulație periferică/cerebrală, boala Alzheimer, pierderea memoriei pe termen scurt, depresie și
anxietate.
Flavonoidele sunt un grup de substanțe cu greutate moleculară mică care reprezintă
aproximativ 24% din extractul total de frunze de Ginkgo. În general, biodisponibilitatea
flavonoidelor este relativ scăzută datorită absorbției limitate și eliminării rapide.
Flavonoidele sub formă glicozidică sunt slab absorbite în intestin, numai sub formă de
aglicon pot fi absorbite direct. Flavonoidele neabsorbite care ajung în colon pot fi supuse
metabolismului de către enzimele bacteriene și apoi absorbite. Odată absorbite, flavonoidele
ajung în ficat, unde sunt metabolizate în derivați conjugați. S-a demonstrat că flavonoidele au
activitate antioxidantă, inclusiv activitate de captare a radicalilor liberi. Se știe că flavonoidele își
exercită efectele prin inhibarea enzimei ciclooxigenaza-2, care face parte din sinteza
prostaglandinelor, iar inhibarea acesteia reduce carcinogeneza de colon. Flavonoidele
(quercitina, kaempferol și izorhamnetina) sunt, de asemenea, cunoscute că îmbunătățesc fluxul
sanguin coronarian prin îmbunătățirea funcțiilor contractile care se datorează eliberării crescute
de catecolamine din rezervele endogene de țesut hepatic. Prin urmare, izolarea și cuantificarea
flavonoidelor din extractul de frunze de G.biloba sunt esențiale pentru a asigura activitatea
flavonoidelor.
Au fost folosite diverse tehnici analitice pentru a izola și cuantifica flavonoidele din
extractul de frunze de G.biloba. Analiza flavonoidelor din G.biloba cu un sistem de gradient
HPLC binar a fost revizuită de Pietta și colegii de muncă încă din 1991. Li și Fitzloff (2002) au
folosit HPLC cu detector cu matrice de fotodiode pentru a compara conținutul de flavonoli
gliconi din produsele farmaceutice. Recent, o nouă metodă de evaluare a extractului de frunze de
Ginkgo utilizând amprenta HPLC, a fost sugerată ca o metodă mai bună de monitorizare a
diferitelor flavonoide.
Scopul acestui studiu este de a dezvolta o metodă analitică robustă pentru determinarea
rapidă a flavonoidelor, cu un tratament minim al probei. S-a evaluat utilizarea HPLC–MS pentru
cuantificarea flavonoidelor, iar metoda a fost validată prin determinarea reproductibilității,
liniarității, limitei de detecție și a recuperării acesteia. În cele din urmă, această metodă a fost
aplicată extractului de frunze de G.biloba.

Materiale si metode
Din următoarele soluții s-a preparat o soluție stoc de 100 mg/L pentru cele cinci
flavonoide: rutină (95%), quercetină 3-D-galactozidă (97%), baicalin (95%), izorhamnetin (95%)
și ramnetina (99%).
Curbele de calibrare în cinci puncte (0,5, 1, 5, 10 și 50 mg/L) ale compușilor de
referință au fost preparate în apă deionizată Milli-Q.
 Metode de extracție
Două feluri de frunze de G.biloba au fost cumpărate în diferite farmacii. Au fost răzuite
și apoi trecute printr-o sită de 50 de ochiuri. Cinci grame din fiecare au fost cântărite și extrase
cu 50 ml de etanol 70% timp de 20 de minute la 60℃ folosind un sistem de extracție cu
ultrasunete. Extractele primare au fost filtrate pentru a îndepărta particulele în suspensie și apoi
au fost trecute prin coloane de extracție în fază solidă care conțineau silice poroasă legată de
octadecil pentru a extrage flavonoidul la un debit de 10 ml/min.
Pentru a pregăti probele pentru analiza HPLC-MS, extractul a fost filtrat prin filtre de
0,22 μm.
 Analiza HPLC-MS
Analizele HPLC-MS au fost efectuate pe un sistem HPLC-MS. Sistemul HPLC a fost
echipat cu un sistem de pompare cu gradient cuaternar, un degazator on-line, un detector cu
matrice de fotodiode (PDA) și un spectrometru de masă (MS).

4
 Separările cromatografice au fost efectuate cu o coloană Thermo ODS-2 HYPERSIL
C18 (100 mm × 4,6 mm, dimensiunea particulei de 3 μm, Thermo Electron Corporation Inc,
SUA). Solventul A a fost apă şi solventul B a fost acetonitril. Debitul a fost de 0,3 mL/min și
gradientul de solvent a fost de 20% B la 0 min; 30% B la 4 min; 43% B la 16 min; 45% B la 25
min; 60% B la 29 min; 70% B la 36 min; 50% B la 41 min; 20% B la 50 de minute. Coloana
analitică a fost echilibrată timp de 10 minute între probe pentru a obține o linie de bază stabilă
pentru analiza ulterioară.
Efluenții au fost monitorizați prin măsurarea absorbanței la 255 nm și dirijați în
spectrometrul de masă prin interfața de electrospray. Azotul a fost folosit ca gaz de nebulizare și
uscare. Pentru HPLC–MS, spectrele au fost înregistrate în intervalul de masă-încărcare (m/z) de
la 100 la 1.300 cu o masă țintă de 609 m/z, 445 m/z, 463 m/z, 315 m/z și o medie de aproximativ
5 spectre. Toate analizele au fost efectuate folosind un volum de injecție de 10 μL, s-au făcut
injecții în trei exemplare pentru fiecare punct de pe curbele de calibrare și s-au făcut injecții
duplicate pentru probe. Flavonoidele din aceste probe au fost cuantificate prin spectrometrie de
masă folosind curbe de calibrare preparate în același sistem cu standarde de referință de cel puțin
95% puritate.
Au fost realizate grafice ale zonelor de vârf HPLC-MS pentru ionul molecular deprotonat
la m/z 609, 445, 463 și 315. Determinarea prin HPLC-MS s-a bazat pe zonele de vârf ale celor
mai abundenți ioni de produs din fragmentarea moleculară ion cu m/z 609, 445, 463 și 315.

Rezultate si discutii
 Validarea metodei
Linearitatea
O analiză de regresie liniară a zonei vârfului vs. concentrația fiecărui flavonoid standard de
referință dizolvat în apă a fost calculată utilizând 3 probe la 5 concentrații diferite de analiză
HPLC-MS. Curbele de calibrare au fost construite la lungimea de undă relevantă de absorbție
maximă a fiecărui flavonoid de referință. Picurile HPLC au fost monitorizate la intervalul UV de
200-400 nm. Curba de calibrare a fost construită folosind aria de vârf a ionului molecular
deprotonat pe cromatograma MS detectată la timpul de retenție HPLC al fiecărui flavonoid de
referință, care a fost confirmată de vârfurile UV ale HPLC la 255 nm pentru rutina, quercetin 3-
D-galactozid, izoramnetină și ramnetină, și 275 nm pentru baicalin. Evaluarea purității de vârf a
arătat omogenitatea vârfului, excluzând posibilitatea prezenței componentelor interferente și
făcând metoda specifică. Ecuația liniară și coeficienții de corelație au fost reprezentați în Tabelul
1. Rezultatele obținute pentru toate analizele HPLC-MS au corespuns ecuațiilor liniare. Valorile

5
coeficientului de determinare ( în Tabelul 1) au fost mai mari de 0,99, ceea ce a indicat că
potrivirile au fost acceptabile.
Tabelul 1 . Ecuație liniară, coeficient de corelație al curbelor de calibrare.

Constituenți Ecuație liniară Regresie ( )

Rutină Y = 94 . 8 X + 6269 . 7 0.9983

Quercetină 3-D-galactozidă Y = 90 . 9 X + 2393 . 5 0.9976
Baicalin Y = 74 . 6 X– 2593 . 3 0.9979
Izoramnetin Y = 281 . 1 X + 263 . 4 0.9991
Ramnetina Y = 138 . 7 X – 14088 0.9982
Notă: Y: aria vârfului (μv.s) X: concentrație (μg/L)

Tabelul 2. RSD și limitele de detecție ale celor cinci flavonoide

Constituenți RSD% Limitele de detecție(μg/L)

Rutină 3.43 4.7

Quercetină 3-D-galactozidă 2.48 5.3
Baicalin 2.21 9.7
Izoramnetin 3.93 6.9
Ramnetina 3.89 12.9

Limita de detecție
Curba de calibrare obținută prin HPLC-MS a fost utilizată pentru cuantificare. Limita de detecție
a fost estimată prin concentrația de flavonoide dând un semnal egal cu semnalul martor plus 3
abateri standard ale martorului. Limitele de detecție au fost 4,7, 5,3, 9,7, 6,9 și 12,9 μg/L pentru
rutina, quercetin 3-D-galactozid, baicalin, izorhamnetin și respectiv ramnetină. Această limită de
detecție poate fi îmbunătățită cu ușurință prin creșterea debitului care a fost trecut la sursa de
electrospray (de la 20 la 300 L/min), dar debitele mai mari au dus și la formarea unui depozit pe
conul spectrometrului de masă care ar trebui să fie eliminate periodic pentru a evita deteriorarea
răspunsului.

Precizia și acuratețea
Reproductibilitatea testului a fost evaluată prin concentrații mari, medii și scăzute ale
standardului de referință. Fiecare concentrație a fost preparată în trei exemplare pentru a
determina precizia. Reproductibilitatea a fost estimată prin deviația relativă standard (RSD) a

6
zonelor de vârf pentru 9 analize consecutive ale standardului de referință. Valorile obținute
pentru acest parametru au fost prezentate în Tabelul 2 și au variat între 2,21 și 3,93%.
Recuperarea a fost estimată prin (cantitatea găsită în eșantionul adăugat – cantitatea găsită în
eșantion) × 100/cantitatea adăugată. Valorile medii au fost calculate din experimentele de
recuperare folosind 3 concentrații diferite a cinci standarde de referință (5 μg/g, 10 μg/g și 50
μg/g) adăugate la extractul de frunze de G.biloba, extractul martor a fost preparat pentru a
determinați concentrația inițială a standardului de referință și s-au efectuat adăugări în trei
exemplare ale fiecărui punct. Valorile de recuperare din Tabelul 3 au fost atinse la utilizarea
curbelor de calibrare.
Datele de recuperare obținute au variat de la 66% la 72% pentru analiza HPLC-MS. Prin urmare,
regresiile liniare pot fi utilizate pentru a calcula concentrația de flavonoide.

Tabelul 3 . Recuperările a cinci flavone crescute în frunzele de G.biloba (media ±RSD,

%, n = 3)

Constituenți Cantitate adăugată Cantitate adăugată Cantitate adăugată

(5 μg/g) (10 μg/g) (50 μg/g)

Rutină 68 . 74 ± 3 . 11 72 . 45 ± 2 . 18 71 . 54 ± 3 . 63

Quercetină 3-D- 69 . 65 ± 3 . 94 71 . 75 ± 1 . 81 70 . 32 ± 3 . 42
galactozidă
Baicalin 65 . 94 ± 2 . 01 67 . 94 ± 2 . 21 70 . 53 ± 3 . 14

Izoramnetin 69 . 350 ± 3 . 23 69 . 95 ± 2 . 97 72 . 11 ± 2 . 14

Ramnetina 71 . 32 ± 3 . 73 70 . 89 ± 5 . 17 71 . 34 ± 2 . 55

Analiza extractului de frunze de G.biloba

Extractul de frunze de G. biloba a fost selectat pentru a optimiza condițiile analitice pentru
determinarea flavonoidelor. Analiza HPLC a acestui extract a dus la un profil foarte complex
(Figura 1). Flavonoidele de interes, rutina, quercetina 3-D-galactozida, baicalin, izoramnetina si
ramnetina, au eluat impreuna cu alte fragmente. Cromatograma ionică totală a HPLC-MS a
acestei zone a relevat, de asemenea, un amestec complex de flavonoide (Figura 2).

7
Fig. 1. Cromatograma lichidă de înaltă performanță a extractului de frunze de G.biloba.
Vârfuri: 1=Rutina; 2=Quercetină 3-D-galactozidă; 3=Baicalin; 4=Izoramnetin; 5=Ramnetina.

Fig. 2. Cromatograma LC-MS cu curent ionic total a extractului de frunze de G.biloba.

Vârfuri: 1=Rutina; 2=Quercetină 3-D-galactozidă; 3=Baicalin; 4=Izoramnetin; 5=Ramnetina.

O specificitate semnificativ mai bună a fost obținută prin extracția ionului molecular cu
m/z 609, m/z 445, m/z 463 și m/z 315, unde s-au obținut niște vârfuri de intensitate mare cu
timpi de retenție diferiți. Cromatograma totală a fost separată în fracții marcate cu 1, 2, 3, 4 și 5,
care corespundeau rutinei, quercetinei 3-D galactozide, baicalinului, izorhamnetinei și, respectiv,
ramnetinei (Figura 1; Figura 2). Deși selectivitatea și intensitatea semnalului HPLC au fost
suficiente pentru a efectua o determinare cantitativă a flavonoidelor, au fost de asemenea
evaluate răspunsurile a cinci flavonoide standard obținute prin efectuarea HPLC-MS.
Cromatograma HPLC la λ=255 nm a 10 μL de standarde de referință la 5 mg/L, cu timpii de
retenție corespunzători a fost prezentată în Figura 3. Cromatograma LC-MS cu curent ionic total
a fost prezentată în Figura 4.
După cum se poate observa, s-a realizat o bună separare.

8
Fig. 3. Cromatograma lichidă de înaltă performanță de 10 μL din cinci standarde de flavonoide la 5 mg/L. Vârfuri:
1=Rutina; 2=Quercetină 3-D-galactozidă; 3=Baicalin; 4=Izoramnetin; 5=Ramnetina

Fig. 4. Cromatograma curentului ionic total LC-MS a 10 μL din cinci standarde de flavonoide la 5 mg/L
Vârfuri: 1=Rutina; 2=Quercetină 3-D-galactozidă; 3=Baicalin; 4=Izoramnetin; 5=Ramnetina

Analiza prin HPLC-MS

Analiza prin HPLC-MS a fost utilizată pentru a confirma rezultatele HPLC. Mai întâi, a fost
injectată o soluție standard de flavonoide în condițiile descrise în Materiale și Metode. Figura 5
prezintă spectrele de masă scanate complet ale celor 5 flavonoide selectate. Pentru toate

flavonoidele analizate, aria de vârf a ionului molecular deprotonat , pentru rutina la

m/z 609, pentru 3-D-galactozida la m/z 463, pentru baicalin la m/z 445, pt. izorhamnetina și
ramnetina la m/z 315, au fost utilizate pentru cuantificare. Proba a fost injectată prin HPLC-MS

9
și rezultatul a fost confirmat prin compararea timpului lor de retenție, a spectrelor UV și a
spectrelor de masă ale standardelor și eșantionului folosind aceleași condiții HPLC-MS.

Fig. 5. Spectre de masă în mod negativ de 10 μL din cele cinci flavonoide. Standarde la 1 mg/L.
A. Rutina; B. Quercetină 3-D-galactozidă; C. Baicalin; D. Izoramnetin; E.Ramnetin.

10
Concluzie

Metoda descrisă este un instrument analitic alternativ bun pentru determinarea de rutină a
acestor flavonoide în frunzele de G.biloba.
Utilizarea MS a produs cromatograme foarte curate pentru cinci flavonoide. Metoda a avut
variabilitate cu RSD mai mică de 4% și liniaritate bună în intervalul de la 0,5 la 50 mg/L
necesare pentru determinarea directă a acestor flavonoide în frunzele de G.biloba. Analiza a fost
efectuată fără nicio pretratare sau concentrare a probei. Analiza prin spectrometru de masă cu
ionizare cu electrospray HPLC este o metodă adecvată și utilă pentru identificarea celor cinci
flavonoide.

11