UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE PROTECIA MEDIULUI

DOMENIUL: INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE
PROGRAMUL DE STUDIU: SIGURAN I SECURITATE AGROALIMENTAR

METODE OPTICE I CROMATOGRAFICE N

INDUSTRIA ALIMENTAR
DETERMINAREA OCHRATOXINEI A DIN CAFEA BOABE
PRIN METODA HPLC

COORDONATOR TIINIFIC
EF LUCR. DR. ING. CHI ADRIANA
MASTERAND:
DULU F. GEORGIANA-FLORINA
ORADEA
2014

INTRODUCERE
Cafeaua este o butur de culoare neagr ce conine cofein
care se obine din boabe de cafea prjite i mcinate coninnd vitamina
PP (acid nicotinic sau niacin). Genul Coffea cuprinde circa 60 specii
din care cea mai important din punct de vedere economic dar care este
crescut i ca plant de interior este Coffea arabica.
Arborele de cafea (Coffea arabica) este un arbore tropical cu
frunzi persistent originar din zona tropical a Africii, Madagascar i
insulele Oceanului Indian unde poate atinge nlimi de pn la 5 6 m,
ca plant de interior nlimea poate fi de 1,5 - 2,5 m. Frunzele au
form ascuit oval, sunt de culoare verde nchis i au marginea
ondulat.
Florile au form stelat i apar la baza frunzelor. Arborele de
cafea nflorete pe la mijlocul verii, florile sunt albe i intens
parfumate. Din aceste flori apar fructele, care sunt bace de mrimea
unor viine. Fructele ajung la maturitate n 7 - 9 luni culoarea lor fiind
rou stacojiu. Bacele conin de regul dou semine (boabe de cafea).
Concentraia n cofein este de 0,8 - 1,4%.
Calitatea cafelei e influenat i de locul de cultivare,
depozitare i prjire a boabelor de cafea.

Compoziia chimic a cafelei

ap 2-3 %

substane azotate 5 %

substane grase 8-15 %

zaharuri: zaharoz 6,5 %, glucoz 0,7 %,

fructoz 0,3 %

acid nicotinic 10-17 %

acid glutamic 17,6 %

cafein 0,9-2 %

acizi aminai

acizi organici
Tipuri de cafea

acizi clorogenici

compui sulfurici

sruri minerale: Ca 2,8 mg, Fe 1,8 mg, P 9 mg, Na 40 mg, K 10 mg, Mg 8 mg.

Cafeina Formul structural

Efecte pozitive

substanele antioxidante din cafea

protejeaz celulele renale

reduce incidena bolilor cronice de ficat

influeneaz secreia gastric i ritmul

respirator

rol important n stimularea arderii

grsimilor din organism

efect pozitiv i n boala Parkinson sau

Alzheimer.
Efecte negative

tahicardie, nelinite, tremor, nervozitate,

stri de panic, insomnie, convulsii, anemie, o
stare uoar de dependen, n lipsa cafelei
pot s apar dureri de cap.

Procesul tehnologic de obinere a cafelei

DETERMINAREA OCHRATOXINEI A DIN

CAFEA BOABE PRIN METODA HPLC
Ochratoxina A este un metabolit toxic
produs de specii din genul Aspergillus n
zonele tropicale i subtropicale i de specii
din genul Penicillium n zonele temperate.
Ochratoxina A a fost izolat pentru
prima dat din culturi de Aspergillus
ochraceus de Van der Merwe i colab. n
anul 1965 n timp ce testau capacitatea
toxigen a unor tulpini de micromicei
izolate din diferite boabe de cereale i
legume.

Figura nr. 1 Ochratoxina A structura chimic

Penicillium verrucosum este izolat frecvent din probe de cereale n timp ce

A. ochraceus contamineaz boabele verzi de cafea, condimentele, boabele de cacao, soia
i arahide.

Scop
Validarea metodei de determinare a ochratoxinei A prin cromatografie de lichide de nalt
performan (HPLC) i aplicarea acesteia pe probe de cafea boabe prjit.

Material i metod
Probele de cafea au fost supuse extraciei cu un amestec de metanol i bicarbonat de sodiu,
CH3OH: NaHCO3 (80:20). Extractele au fost purificate prin extracie n faz solid (C18) pentru
reinerea ochratoxinei A. Micotoxina a fost eluat cu cloroform; faza organic a fost evaporat la sec
i apoi, reziduul reluat cu 0,6 ml faz mobil. Un volum de 20 l a fost supus analizei HPLC. Analiza
s-a realizat pe un cromatograf de lichide tip HP 1090 Series II, echipat cu o coloan cromatografic
tip Stable Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m), folosind ca faz mobil un amestec de acetonitril:
ap : acid acetic (99 : 99 : 2). Detecia ochratoxinei A s-a realizat n fluorescen
(ex=228 nm i em=423 nm).
Discuii
Aceast lucrare contribuie la evaluarea prezenei ochratoxinei A n produsele alimentare
(cafea boabe) comercializate n Romnia i atrage atenia asupra riscului consumului de alimente
contaminate cu micotoxine.

Material i metod

balan;

baie de ultrasunete;

micro-sering Hamilton;

HP 1090 Series II lichid cromatograf echipat cu detector cu multidiode UV-VIS i

detector de fluorescen;

coloan cromatografic tip Stable Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m);

standard ochratoxin A (Sigma-Aldrich);

coloane SPE C18 (Lida, manufacturing corp.);

hrtie de filtru cantitativ (Schleicher & Schuell MicroScience);

acetonitril (puritate HPLC, gradient grade, Riedel de Han);

cloroform (puritate HPLC, Sigma Aldrich);

metanol ChromasolvR (puritate HPLC, Riedel de Han)

acid acetic glacial 99,99% (Sigma Aldrich);

sulfat de sodiu (A.C.S. reagent, Sigma Aldrich);

ap (puritate HPLC, Merck);

faz mobil: amestec acetonitril : ap : acid acetic (99: 99: 2).

Mod de lucru - Extracia ochratoxinei A i purificarea extractului

Probele de analizat (cafea boabe prjit-vrac) au fost supuse extraciei n vederea
separrii ochratoxinei A.

20 g prob mrunit se agit 20 minute cu un volum de 20 ml amestec

CH3OH : NaHCO3 3% (80 : 20);

se filtreaz prin hrtie de filtru cantitativ;

filtratul se trece prin coloana SPE (precondiionat prin splare succesiv cu 4 ml

metanol, respectiv cu 4 ml ap purificat);

ochratoxina A este eluat de pe coloan cu un volum de 3 ml cloroform;

faza organic se evapor la sec;

reziduul obinut se reia cu un volum de 0,6 ml faz mobil i se supune analizei HPLC
prin injectarea unui volum de 20 l n condiiile menionate.
Analiza HPLC s-a realizat astfel: un volum de 20 l prob a fost supus analizei pe un
cromatograf de lichide tip HP 1090 Series II, echipat cu o coloan cromatografic tip Stable
Bond SB C18, folosind ca faz mobil un amestec de acetonitril : ap : acid acetic
(99 : 99 : 2).
Detecia ochratoxinei A s-a realizat n fluorescen (ex = 228 nm i em = 423 nm).

Rezultate i discuii
Specificitatea
Pentru determinarea specificitii metodei au fost analizate probe coninnd
ochratoxina A i o prob coninnd faza mobil ca solvent al probelor injectate. La timpul
de retenie al ochratoxinei A nu s-a obinut nici un semnal n cromatograma
corespunztoare fazei mobile, rezult deci faptul c nu exist interfereni.
Identificarea picurilor
Identificarea picului corespunztor ochratoxinei A se realizeaz n funcie de timpul de
retenie. n condiiile menionate, timpul de retenie pentru ochratoxina A este de 9,5 min.
n figura nr 2 este prezentat cromatograma pentru soluia standard de ochratoxin A.

Figura nr. 2 Cromatograma pentru soluia standard de ochratoxin A

VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE A OCHRATOXINEI A PRIN

CROMATOGRAFIE DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN (HPLC)
Metoda de analiz prin HPLC prezentat a fost validat, urmrindu-se urmtorii
parametri: stabilitatea n timp a soluiei, linearitatea, limita de detecie i limita de
cuantificare, precizia sistemului, precizia metodei, exactitatea metodei.
Stabilitatea soluiei
Pentru a determina stabilitatea soluiei de ochratoxin A a fost analizat o prob cu o
concentraie de 19,5 ng/ml ochratoxin A dup ce a fost meninut la temperatura camerei 2,
3 i 10 zile. Rezultatele experimentale sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Stabilitatea soluiei

n concluzie, probele n faz mobil coninnd ochratoxin A pot fi stocate la

temperatura camerei cel puin 10 zile, fr a aprea degradarea acestui compus, avnd n
vedere faptul c aria picului corespunztor ochratoxinei A este aproximativ constant (n
acest caz, deviaia standard relativ avnd valoarea de 4,1230%).

Linearitate, limita de detecie i limita de cuantificare

Pentru studiul lineritii au fost analizate ase serii de soluii, pentru fiecare
cromatogram a fost calculat aria picului corespunztor ochratoxinei A, iar valoarea ariei
medie a fost reprezentat grafic funcie de concentraie. Prin analiz statistic au fost calculate
ecuaia dreptei de regresie, coeficientul de corelaie (r) i eroarea standard de regresie.
Folosind panta dreptei de regresie i eroarea standard a acestei drepte s-au calculat valorile
limitei de detecie i a limitei de cuantificare.
n tabelul nr. 2 sunt prezentate ariile picurilor corespunztoare ochratoxinei, iar n figura
nr. 3 este reprezentat dreapta de calibrare a ochratoxinei A.
Tabelul 2. Ariile picurilor ochratoxinei A obinute n studiul linearitii metodei

Deoarece cantitatea de ochratoxin A din probe este mic, ecuaia curbei de calibrare a
fost calculat pentru concentraii cuprinse ntre 9,765625 i 39,0625 ng/ml.

Figura nr. 3 Dreapta de calibrare a ochratoxinei A

Dup calculul statistic s-a obinut ecuaia curbei de calibrare:

Arie pic = 1,0750780952381 x concentraia + 7,325
Valoarea coeficientului de corelaie (r) este 0,9983 iar eroarea standard a curbei de
regresie (SE) este 1,3229431474665. Folosind aceste valori s-au calculat limita de detecie
(LD) i limita de cuantificare (LQ) cu formulele (1) i (2):

Precizia i exactitatea
Prima etap n determinarea preciziei o reprezint studiul preciziei sistemului. Astfel, o
soluie de concentraie de 20 ng/ml a fost analizat de cinci ori. Ariile picurilor
corespunztoare ochratoxinei A pentru cele cinci determinri sunt prezentate n tabelul nr. 3.
Tabelul 3. Ariile picurilor corespunztoare ochratoxinei A pentru cele cinci determinri

Pentru aceste valori, deviaia relativ standard (RSD %) a fost calculat ca fiind
8,6912%.
Pentru concentraii n prob de ordinul ng, valoarea este bun, deci sistemul este
precis.
Precizia i exactitatea metodei au fost determinate prin calcularea valorii medii a 3
determinri la trei concentraii diferite n jurul valorii de interes 39.0625 ng/ml, 19.53125
ng/ml i respectiv, 9.765625 ng/ml (concentraia urmrit 50%).

Utiliznd ecuaia curbei de calibrare i ariile picurilor au fost calculate concentraiile pentru
fiecare prob. A fost determinat regsirea ca procent din valoarea concentraiei teoretice,
regsirea medie i precizia metodei exprimat prin deviaia standard relativ din regsirea
calculat.
Pentru aceste dou grupuri de date (I i II), valorile obinute sunt prezentate n tabelul nr. 4.
Tabelul 4. Ariile picurilor ochratoxinei A pentru grupul de date I i II

Dup prelucarea statistic a ambelor seturi de determinri a rezultat o valoare de 16,9629 % a

deviaiei standard relative ceea ce demonstreaz precizia metodei; regsirea medie fiind de 99,2%
(pe intervalul 61,6 126,1%), ceea ce demonstreaz exactitatea metodei.

APLICAIE LA DETERMINAREA OCHRATOXINEI A

DIN PROBE DE CAFEA BOABE PRJT
Metoda de analiz validat a ochratoxinei A prin HPLC a fost aplicat la determinarea
ochratoxinei A din probe de cafea boabe.
Probele au fost procurate din uniti ce comercializeaz produse vrac. S-au analizat 40
de probe de cafea boabe prjit, de diferite sorturi (Columbia 10 probe, Jacobs 10 probe,
Indonezia 8 probe, Brazilia 4 probe, Robusta 2 probe, India 1 prob, cafea
decofeinizat 5 probe).
n urma analizei prin HPLC, cromatogramele obinute au fost prelucrate, stabilindu-se
aria picurilor corespunztoare ochratoxinei A i, folosind ecuaia dreptei de regresie, s-a
calculate coninutul n ochratoxin A pentru probele de cafea (valori prezentate n tabelul 5).
Tabelul 5. Coninutul n ochratoxin A

Figura nr.4 Dou dintre cromatogramele obinute la analiza probelor de cafea boabe
prin metoda HPLC

Din analiza datelor obinute n urma determinrii ochratoxinei A din cele 40

probe de cafea boabe prjit, s-a constatat c ntr-o singur prob (2,5% din numrul total
de probe) ochratoxina A este prezent ntr-o cantitate mai mare dect limita maxim
admis de legislaia n vigoare (5 g/kg cafea boabe prjit); n 5 probe (2,5% din numrul
total de probe) ochratoxina A se gsete n concentraii sub limita maxim admis, iar ntrun numr de 34 probe (85% din numrul total de probe) ochratoxina A nu a fost
identificat prin metoda aplicat.

CONCLUZII
Metoda corespunde parametrilor de validare i a fost aplicat cu bune rezultate la
determinarea ochratoxinei A din probele de cafea boabe prjit.
Aceast lucrare contribuie la evaluarea prezenei ochratoxinei A n produsele
alimentare (cafea boabe vrac) comercializate n Romnia.
Avnd n vedere consumul crescut de cafea n rndul populaiei adulte este necesar
adoptarea unor msuri n vederea protejrii sntii consumatorului, o msur important
fiind evitarea comercializrii produselor cu un nivel ridicat de contaminare cu ochratoxin
A.
n urma analizei HPLC s-au obinut urmtoarele rezultate:
Din cele 40 de probe analizate: n 5 probe (12,5% din numrul total de probe),
ochratoxina A a fost prezent sub limita maxim admis de legislaia n vigoare (5 g/kg
cafea boabe prjit), ntr-o singur prob concentraia ochratoxinei A a fost peste limita
maxim admis A iar n 34 de probe (85% din numrul total probe) ochratoxina A nu a
fost identificat prin metoda aplicat.

ARTICOLE TIINIFICE PRELUATE DIN REVISTE DE

SPECIALITATE CARE SE REFER LA APLICAREA METODEI
DETERMINAREA OCHRATOXINEI A (HPLC)

Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food chain

[CONTAM] related to ochratoxin A in food
Sursa: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/365.htm

Code of practice for the prevention and reduction of ochratoxin A contamination in coffee
CAC/RCP 69-2009
Sursa: http://www.codexalimentarius.org/search-results/?cx=018170620143701104933%3Aizresgmxec&cof=FORID%3A11&q=ochratoxin+a&siteurl=http%3A%2F%2Fwww.codexalimentarius.o
rg%2F&siteurl=www.codexalimentarius.org%2F&ref=www.google.ro%2Furl%3Fsa%3Dt%26rct%3Dj
%26q%3D%26esrc%3Ds%26source%3Dweb%26cd%3D1%26ved%3D0CDEQFjAA%26url%3Dhttp
%253A%252F%252Fwww.codexalimentarius.org%252F%26ei%3DBIDSUtiPL8va0QWgyIDQAg%26
usg%3DAFQjCNE0-M9lFhfnmehUF8gaKEYMh6R_g%26bvm%3Dbv.59026428%2Cd.Yms&ss=1993j443057j12&sa.x=0&sa.y=
0

Cafeaua este o butur apreciat de milioane de oameni din toat lumea . . .