Metode de separare

Cromatografia
Cromatografia este o metoda de separare bazata pe distribuirea componentelor probei intre doua faze: o faza sationara solida sau lichida si o faza mobila, lichida sau gazoasa, care migreaza de-a lungul fazei stationare. Scurt istoric Botanistul rus Mihail Tswett ( Mihail Semenovich Tswett , 1872-1919 ), a folosit pentru prima dat n 1906, termenul de " cromatografie " ( de la sensul grecesc i respectiv chroma " culoare " i graphein " a scrie " ) . La nceputul anului 1903 , Mihail Tsweet a folosit coloane de absorbie de lichide pentru a separa pigmeni vegetali (de exemplu , clorofila ) . Soluiile au fost fcute trecere printr-o coloan de sticl umplut cu carbonat de calciu , fin divizat ca un material poros , care interacioneaz n mod diferit cu constituenii amestecului , astfel nct acestea sunt separate n diferite benzi colorate mpreun cu coloana . Primele echipamente de cromatografie de gaze au apartut pe piata la mijlocul sec al XX-lea.

Cromatografia de gaze (GC) este o metoda instrumentala de separare cromatografica in care faza mobila este un gaz iar faza stationara un solid, un lichid impregnat pe un support solid inert, sau un lichid repartizat unifom pe peretii unei coloane capilare. In principiu, cromatografia in faza gazoasa este procesul prin care o proba adusa in faza de vapori este transportata de faza mobila (gazul purtator) de-a lungul unei coloane continand faza stationara, unde se realizeza separarea componentelor; la parasirea coloanei atat gazul purtator cat si componentele separate trec printr-un detector (spirometru de masa, detector cu ionozare in flacara, detector de conductibilitate termica, detector de ionizare cu radiatii etc.) al carui semnal proportional cu concentratia este inregistrat. Coloana cromatografica prezinta anumite caracteristici ( lungime, diametru, natura fazei stationare etc) functie de care se va face alegerea pentru separare unei clase de compusi de amestec.

Cromatografia de gaze

Page 1

Metode de separare
Pentru analiza, se vor stabili si ceilalti parametrii de lucru: debitul gazului purtator, volumul de proba injectata, regimul de temperatura si sistemul de detectie etc. Cromatografia de gaze este foarte potrivita pentru analiza probelor complexe. Un exemplu este detectia si determinarea cantitativa a unor substante care nu ar trebui sa fie prezente in lichidele biologice, de exemplu in urina. In tabelul urmator sunt prezentate cateva exemple de medicamente comune si narcotice ce pot fi analizate prin GC.

Barbiturice Amobarbital( Dexamil) Barbital Butabarbital Fenobarbital Pentobarbital(Nembutal) Secobarbital( Seconal) Metiprilon( Noludar) Difenilhidantoina( Dilantin) Glutetimida( Dorien)

Amfetamine Metamfetamina HCl( Dexoin) Amfetamina sulfat (Benzedrina) Dextroamfetamina sulfat ( Dexedrina)

Alcaloizi Metadona Cocaina Morfina Chinina Codeine Procaine Heroina Fenacetina(Empirina)

Halucinogene Marijuana Dietil aminaacidului lysergic (LCD) Mescalina

Pregatirea probei in vederea analizei prin gaz cromatografie include si separarea analitilor din mediul complex prin extractive cu solvent.

Cromatografia de gaze

Page 2

Metode de separare
Schema de principiu a unui cromatograf de gaze (1-sursa de gaz purtator, 2-dispozitul de reglare si masurare a debitului de gaz purtator, 3-dispozitivul pentru introducerea probei, 4-termostatul, 5-coloana cromatografica, 6-detectorul, 7-inregistratorul)

Izolarea medicamentelor utilizand extractia cu solventi

Din toate procedeele de izolare ce pot fi utilizare in vederea analizei prin cromatografie de gaze, extractia cu solvent este cea mai folosita. In timpul extractiei, clase diferite de substante sunt extrase dintr-o solutie apoasa, la valori diferite ale pH-ului, intr-un solvent cum ar fi clorura de metilen sau altii. Extractul in eter nu poate fi injectat direct in cromatograful de gaze daca este necesara o analiza cantitativa, deoarece, din cauza volatilitatii crescute a eterului se obtin rezultate imprecise. Extractul trebuie evaporat si pastrat in clorura de metilen sau metanol, in vederea analizei prin cromatografie de gaze. Substantele extractibile pot exista in una din urmatoarece grupuri, functie de aciditatea lor: baze organice, acizi organici si substante neutre. Primele doua grupuri pot exista in forma de saruri sau in stare libera, acestea din urma fiind mai solubile in solvent organici, in timp ce sarurile sunt mai solubile in apa. Substantele cu caracter acid vor fi extrase din solutii acide, in timp ce substantele cu caracter basic vor fi extrase din solutii alkaline (in aceste condintii, nu vor fi neutralizate ca saruri). Substantele cu caracter neutru pot fi extrase, in general, la orice pH. Substantele acide includ barbituricele si salicilatii, iar substantele bazice includ aminele si alcaloizii. Exemplu, extractia alcaloizilor se va face la pH = 9, amfetaminele si fenotiazinele la pH = 10. In timpul extractiei cu solvent, la o anumita valoare a pH-ului, se pot extrage componente din mai multe grupuri de substante; pentru acoperirea cantitativa a fiecarui grup, este necesar sa se izoleze

Cromatografia de gaze

Page 3

Metode de separare
extractele pentru fiecare valoare a pH-ului, tinand cont ca fiecare extract poate contine una sa mai multe clase de substante. Marijuana poate fi extrasa cu , LSD-ul poate fi extras cu un tampon carbonat, iar mescalina poate fi extrasa cu etanol. dupa solubilizare cu

Medicamentele din pudre sau tablete sunt in general dizolvate in solutii apoase de KOH sau HCl, apoi extrase la valoarea corespunzatoare a pH-ului. Pentru a determina medicamentele din lichidele biologice, poate fi necesara pre-concentrarea si/sau pre-tratamentul extractului sau al probei. Morfina, de exemplu, poate fi extrasa direct din urina la pH = 8,6 in - izopropanol. Totodata, numai aproximativ 15% din morfina se gaseste in stare libera, restul de 85% se poate gasi sub forma de sare. Daca se presupune ca morfina se gaseste intr-o concentratie ridicata (ppm), extractul trebuie concentrat prin evaporare. Dar daca se gaseste in urme, urina trebuie hidrolizata prin acidificare cu si incalzire la 90C timp de 15 minute pentru a elibera morfina legata inainte de extractie. Hidroliza elibereaza si alti compusi naturali ce vor fi de asemenea extrasi din urina. In acest caz, extractul trebuie purificat prin reextractia morfinei in HCl diluat, apoi solutia se va aduce la pH = 8,6 iar morfia va fi din nou extrasa cu - isopropanol. Pentru separarea medicamentelor din lichide biologice au fost descrise numeroase sisteme de extractie. Alcaloizii, antihistaminele, barbituricele si tranchilizantele au fost extrase intr-un amestec eter si acetona. Serul( urina) este ajustat(a) la un pH = 4 7,5 pentru a extrage multe din aceste medicamente. O extragere suplimentara la pH = 3 si 9 adauga compusii acizi sau bazici. Acest procedeu nu este utiizat pentru amfetamina. Pentru anliza barbituricelor din probe cu concentratii de domeniul micro sau de domeniul urmelor, acestea vor fi metilate cu dimetil sulfat inainte de extractie in hexan. Timpul de derivatizare este numai 4-5 minute, si astfel, prin gaz cromatografie, pot fi detectate 0,01-0,05 g de substanta. Pot fi folosite volume de 100 L de sange sau urina. Medicamentele din tesuturi sunt in general legate de proteine, ceea ce face extractia simpla foarte ineficienta. Tratamentul tesutului omogenizat cu o solutie de HCl fierbinte va elibera multe dintre aceste substante. Pentru a determina urmele de medicamente trebuie sa se utilizeze un procedeu de purificare. Unul dintre acestea consta in precipitarea proteinelor inainte de extractie. Acest lucru este insotit de macerarea tesutului si tratarea acestuia cu volframat de sodiu, hidroliza cu acid fierbinte (se formeaza acidul volframic, care este un agent de precipitare al proteinelor) In cazul unui continut ridicat in lipide al tesutului vor fi necesare operatii suplimentare de purificare. De exemplu, pentru a determina alcaloizii, acestia sunt extrasi la pH=10, extractul eteric este spalat cu NaOH 2,5%, apoi cu apa. Subsatntele din fiecare faza sunt reextrase cu 0,05M si in final extrase din solutia alcalina cu eter.

Separarea subsatantelor medicamentoase prin GC

Cromatografia de gaze Page 4

Metode de separare
Cel mai comun detector gaz cromatografic utilizat in analiza medicamentelor este detectorul cu ionzare in flacara. Acesta este usor de folosit, are o mare sensibilitate si este universal. Unele aplicatii specifice pot necesita detectoare mai selective si/sau sensibile; de exemplu detectorul cu captura de electron. Acestea sunt mai greu de folosit decat detectorul cu ionizarea in flacara. Selectarea coloanei pentru analiza gaz cromatografica a medicamentelor este foarte importanta. Cele mai utilizate coloane sunt cele acoperite cu un strat subtire de rasina siliconica (Se30 sau OV-1 nepolare). Aceste coloane nepolare sunt folosite pentru multe clase de compusi. Pentru unii compusi polari in concentratii scazute, totusi, se pot obtine pierderi in substanta sau in picuri mici. Coloana mediu-polara cu faza lichida OV-17 (lichid fenilmetil siliconiu) este superioara coloanei OV-1 atat in ceea ce priveste eficienta separarii cat si in ceea ce priveste forma picului, deoarece este mult mai selectiva fata de mult compusi polari si actioneaza ma bine ca o sita activa pe suportul solid la nivele de incarcare joasa. Alte coloane folosite in gaz cromatografie sunt PPE-20 (mediu polar) si Carbowax 20M (polaritate mare). In determinarea gaz cromatogarfica a morfinei, trebuie folosite o coloana de sticla si o poarta de injectare de sticla deoarece la o coloana de metal pot aparea pierderi mari. Aceasta problema poate fi prevenita prin transformarea morfinei in diacetil morfina (heroina), extinzand analiza cu inca o opertie. In general, pentru analiza medicamentelor, este bine sa se utilizeze o coloana de sticla cu injectare directa sau cu injector de sticla. Proba de urina a fost prelucrata prin extractie cu solvent si supusa analizei gaz cromatografice. In proba sunt identificate cateva substante. Gaz cromatografia este deci, o metoda simpla si rapida de separare si analizare calitativa si cantitativa pentru multe substante. Picurile sunt identificate pe baza timpului de retentie obtinut in urma analizei standardelor, in aceleasi conditii ca si proba necunoscuta. Pentru a analiza cele trei clase diferite de substante, se realizeaza frecvent 3 cromatograme separate la temperaturi diferite. Timpul de lucru poate fi de 45 minute sau mai mult. Este posibil sa se analizeze extracte diferite intr-o singura etapa, folosind un program de temperatura, reducand astfel timpul de lucru la 10 15 minute. Acest lucru se aplica in general pentru analiza rapida a medicamentelor din tablete si pulberi, pentru un amestec de subsatante cum ar fi: amphetamine (bazice), alcaloizi (bazici), si barbiturice (acide). O tehnica utilizata utilizata frecvent pentru analiza medicamentelor este analiza head space, in care proba este continuta intr-un recipient inchis etans iar coponentilor volatili le este permis sa se elibereze cu atmosfera de deasupra solutiei. O portiune din aceasta atmosfera este luata cu o seringa si injectata in gaz cromatograf.

Determinarea hidrocarburilor clorurate din amestec prin GC

Cromatografia de gaze Page 5

Metode de separare
Prin acest experiment se face o comparatie a metodelor de analiza cu standard extern fata de cele cu standard intern. Utilizarea unei curbe de etalonare bazata pe folosirea unui standard extern nu da intotdeauna rezultate satisfacatoare in gaz cromatografie, pe de o parte datorita unor mici variatii a conditiilor de operare cum ar fi temperatura si debitul fazei mobile, pe de alta parte datorita erorilor care pot interveni la masurarea unor volume mici de proba. Volumele de proba folosite in cromatografia de gaze nu depasesc cativa L. Masurarea unor astfel de volume se poate face cu reproductibilitate buna, dar acuratetea masurarii este destul de mica. Tehnica standardului intern, in care inaltimea picului din analit este comparat cu ce a a unui standard introdus alaturi de proba, elimina mult din erorile care pot proveni din astfel de surse. Rezultatul practic consta in faptul ca orice variatie care apare va afecta atat inaltimea picurilor din analit cat si cea a standardului cu aceeasi cantitate relativa iar raporturile dintre inaltimile celor doua picuri va ramane constant, functie de concentratia lor relativa. Pentru ca o substanta sa poata fi folosita cu rol de standard intern trebuie sa fie indeplinite urmatoarele conditii: Pentru standardul intern trebuie sa se obtina un pic complet separat de orice alt pic din proba; Picul standardului intern trebuie sa aiba un timp de retentie diferit de al oricarui alt pic; Raportul dintre inaltimile picurilor corespunzatoare standardului intern si respectiv probei trebuie sa fie cat mai apropiat de 1. Este de dorit, dar nu intotdeauna posibil, sa se utilizeze un standar intern a carui structura sa fie similara cu ce a analitului.

Calculul suprafetei picurilor cromatografice

Cromatografia de gaze

Page 6

Metode de separare
Principiul metodei: se realizeaza separarea si determinarea a trei hidrocarburi clorurate prin gaz lichid cromatografie, folosind ca standard intern aceton, gaz purtator de heliu, detector cu ionizare in flacara sau de conductibilitate termica. Reactivi si aparatura: 1. Cromatograful de gaze cu detector cu ionizare in flacara sau detector de conductibilitate termica; 2. Coloana cromatografica umpluta cu o faza stationara nepolara cum ar fi dinoniftalat in Celite 545; 3. ; ; ; 4. Standard intern: . Modul de lucru:
Realizarea curbei de calibrare

1. Se porneste aparatul si se fixeaza parametrii de lucru, cum ar fi temperatura in comporatmentul coloanei, sensibilitarea detectorului, debitul fazei mobile etc. parametrii particulari depind de tipul de aparat si de coloana folosita. 2. Pregatirea solutiilor standard prin amestecarea intr-o eprubeta curata a unor volume de reactivi puri dupa cum urmeaza: mL mL mL 0.5 1.5 2.5 1 2 1.5 1.5 2.5 0.5 2 0.5 2 2.5 1 1 Se omogenizeaza bine si se inchide gura epribetei cu un dop. mL 2 2 2 2 2

3. Se fixeaza acul inregistratorului pe linia de baza , in punctul de unde va incepe iregistrarea. Se injecteaza o cantitate de 1 L din primul amestec simultan cu pornirea inregistrarii. Se continua inregistrarea pana cand toti cei patru componenti sunt eluati. Se repeta aceste operatii pentru toate celelalte solutii preparate. 4. Se masoara inaltimea pentru fiecare component in fiecare cromatograma si se reprezinta grafic inaltimea picului pentru fiecare component functie de procentul de volum din amestec.
Analiza probei necunoscute

1. Se masoara o cantitate de proba (4 ml) si se aduga 2 mL de acetona ca standard intern. Se inghite gura eprubetei cu un dop si se agita.

Cromatografia de gaze

Page 7

Metode de separare
2. Se fixeaza acul inregistratorului pe linia de baza, in punctul din care va incepe inregistrarea. Se injecteaza un volum de 1 L din proba de analizat si se porneste simultan inregistrarea, care se continua pana dupa eluarea tuturor componentilor din proba. 3. Se repeta inregistrarea pentru inca un volum de 1 L din proba. 4. Se identifica componentul (componentii) din proba pe baza timpului de retentie si se determina procentul de volum pentru cele doua analize cu ajutorul curbei de calibrare.

Bibliografie : Vasile Dorneanu si Maria Stan Metode de separare in chimia analitica, Ed. Gr.T.Popa, UMF Iasi 2003 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Cromatografa

Realizator proiect: ova

Elena, an I, grupa 3, BIM

Cromatografia de gaze

Page 8