Teste și determinări

Testul de culoare
Un test de culoare este o procedură chimică în care substanța de testat reacționează cu un reactiv care
produce o schimbare acestuia, producând astfel o culoare observabila sau schimbarea culorii. Testele
de culoare pot fi folosite pentru a determina prezenta anumitor compuși sau a unei clase generale de
compuși. Procedurile sunt, de obicei, rapide si ușor de realizat. Cel mai folositor dintre testele de
culoare în toxicologie este depistarea rapidă a probelor de urină, deoarece urina poate fi analizat în
mod direct, fără proceduri de extracție consumatoare de timp. Un exemplu de test de culoare este
"testul lui Trinder " pentru detectarea salicilaților în sânge sau urină. Un reactiv de azotat de fier si
clorura de mercur se amesteca cu 1 ml de sânge sau urina; în cazul în care sunt prezenți salicilații se
observă o culoare violet.

Cromatografia este o tehnică de separare. componente ale unui amestec de probă sunt distribuite
între două faze, dintre care una este staționară în timp ce a doua, faza mobilă, percolează printr-o
matrice sau pe suprafața fazei fixe. Componentele unui amestec prezintă diferite grade de afinitate
pentru fiecare fază, iar când acestea sunt transportate de faza mobilă, are loc o migrare diferențiată.
Unele componente sunt reținute pe faza staționară mai mult decât altele, producându-se o separare a
compusilor din acel amestec.
Unele medicamente ca antihipertensive, colinergice, insulina etc., sunt extrase din sânge și urină
direct prin cromatografia produsului acidulat cu ajutorul unei coloane cu rășini schimbătoare de ioni.
Dintre diferite forme de cromatografie - pe hârtie, pe coloană, în strat subțire, în fază gazoasă -
cromatografie pe stat subțire (CSS) este deosebit de utilă prin rapiditatea, sensibilitatea, capacitatea
de separare a componentelor dintr-un amestec. Se folosesc diferite suporturi. În functie de grupa de
substanțe de analizat se utilizează diferite amastecuri de solvenți pentru migrare, care asigura
obținerea unor Rf cât mai diferențiate. Pentru o mai bună separare a compușilor apropiați structural,
se recomandă uneori C.S.S. bidimensională.
Relevarea (identificarea componentelor izolate) se realizează prin examinarea plăcii în lumină U.V.
și/sau prin pulverizarea cu diferiti reactivi, indicați pentru fiecare substanță sau grupe de substanțe.
Gaz-cromatografia este o metodă aplicabilă în special pentru separarea amestecurilor și depistarea
ulterioara prin detectarea conductibilitații termice, detectarea ionizării (în flacără, captură de
electroni, ionizare de argon). Metoda are o mare sensibilitate și specificitate, însă necesită o aparatură
complexă.

Cromatografie în strat subtire

În TLC, faza staționara este un "strat subțire" a unui gel absorbant, de obicei silice (bioxid de siliciu),
care se întinde pe un suport solid, cum ar fi o placă de sticlă. Extractele concentrate din probele
prelevate, împreună cu mostrele (standardele) de droguri sunt aplicate sub formă de serie de puncte
de-a lungul părții de jos a plăcii cromatografice și lăsate să se usuce.
 Placa este apoi plasataă într-un vas cromatografic închis (de forma paralelipipedică), în care
stratul absorbant de silicagel sau oxid de aluminiu de pe sticlă intră în contact cu faza mobilă (soluția
de developare) sub punctele de substanțe aplicate.
Pentru identificarea unei substanțe se folosește un standard, adică substanța căutată, de
exemplu un drog (heroină, LSD, cocaină) sau un medicament, care se spotează pe linia de start (de
exemplu în poziția 4 din figura de mai jos). Proba de analizat (de pildă urină, extract din firul de păr,
etc) se spotează în celelalte poziții pe linia de start. După migrarea solventului, care poate fi o soluție
ce conține solvenți diferiți (apă: alcool butilic: acid acetic; apă: acetonă: amoniac, etc.) pe placă până
în apropierea marginii de sus a plăcii de silicagel depus pe aluminiu, se trasează cu creionul, ca și în
cazul liniei de start, locul unde a ajuns solventul (frontul solventului, Fs). Se usucș placa la aer sau
prin suflare cu aer cald de la un uscător de păr, se developeazș substanțele de pe placă cu un reactiv
potrivit, se usucă din nou pentru a obține pete stabile și se măsoară factorul de retenție, Rf. Se pot
vizualiza substanțele de pe placă prin iluminarea acesteia cu lumină ultravioletă, dacă placa are
adăugată o substanță fluorescentă. In acest caz se marchează substanțele cu un creion. Rf este de
regulă o caracteristică a unei substanțe într-un amestec de developare anumit. Totuși, este bine să se
introducă și un standard. Rf se calculează astfel: se împarte distanța parcursă de o anumită substanță
de la linia de start la distanța parcursă de frontul solventului de la linia de start.
De exemplu, în extractele de urină pentru depistarea drogurilor, toxicologul spray-iază cromatograma
cu ninhidrină care produce o culoare roșie sau roz cu amine primare, cum ar fi amfetamină sau
efedrină. Apoi, el poate aplica etanol în acid sulfuric, care produce o serie de pete viu colorate în roz,
portocaliu, albastru sau verzi dacă sunt prezente tranchilizante fenotiazinice si metaboliți ai
acestora. Placa poate fi în continuare pulverizată cu iodoplatinat, care reacționează cu toate baze
azotate.
Există numeroși reactivi pentru TLC, dar toxicologul trebuie să fie ghidat de natura chimică a
compușilor pe care dorește să-i identifice. În cazul în care un compus din extract migrează la aceeași
distanță și reacționează la spray-urile aplicate în același mod ca drogul de referință, toxicologul va
încerca identificarea compusului printr-un alt test chimic.
Au fost găsite următoarele valori pentru factorul de retenție, RF: Acid acetilsalicilic, 01;
Nicotinamină, 04; Paracetamol, 05; Fenobarbital, 05; Morfină, 07; Barbital 11; Acetilprocaină, 18;
Chinină, 20; Fenacetină, 22; Fenazonă, 31; Codeină, 33; Procaină, 35; Cafeină, 38; 6MAM, 39;
Stricnină, 44; Papaverină, 55; Heroină, 58; Acetilcodeină, 61; Aminofenazonă, 64; Noscapină, 70;
Lidocaină, 71; Metacualonă, 73; Cocaină, 80, în sistem toluen–dietilamină (85:15).

Drochioiu, G., Elemente de toxicologie Medico-Legală, Iasi, 2013, Pag 40-49

Topală, C.M., Lucrări practice de biochimie Medicală, Pitești, 2015, 23