7.3.2.

Replicarea macromoleculei de ADN

Din punct de vedere fizic molecula de ADN se prezint ca o substan fibroas, de culoare alb
cristalin (fig. 7.16.), care se dizolv foarte greu n ap, iar dup dizolvare se
prezint sub forma unei soluii cu un grad ridicat de birefrigeren i
vscozitate.
Principalele caractere fizice ale macromoleculei de ADN sunt:
- molecula de ADN este cutat i rsucit pentru a ocupa un spaiu ct
mai redus,
- n urma cutrii se poate manifesta o anumit discontinuitate
structural care poate avea ca i consecin formarea unor secvene particulare,
- catenele care intr n structura ADN-ului se pot separa temporar n
anumite regiuni formnd structuri monocatenare.
7.3.2.1. Generaliti

Fig.7.16. Extract de
ADN

Replicarea1 reprezint proprietatea doar a macromoleculei de ADN de

a forma dou molecule bicatenare identice dintr-o molecul iniial care se
constituie ca o matri i care are rolul de a transmite informaia genetic n succesiunea generaiilor
celulare.
Replicarea presupune separarea progresiv a celor dou catene complementare, care devin matrie
pentru o catene sintetizate din nou. Acest tip de sintez n urma cruia dintr-o molecul mam rezult dou
molecule fiice sa numete model semiconservativ.
Replicarea este una dintre cele mi importante reacii caracteristice lumii vii care asigur
continuitatea vieii i variabilitatea acesteia, fiind, dup DARLINGTON o punte ntre trecut i viitor.
n urma cercetrii principalelor sisteme autoreplicative s-au stabilit urmtoarele principii:
a. secvena de baze azotate coninut de orice macromolecul de acid nucleic are rol de substan
ereditar, iar rolul primordial al modalitilor de replicare este reprezentat de duplicarea secvenei bazelor
moleculei parentale,
b. exactitatea autoreproducerii specific sistemelor biologice este reprezentat de specificitatea
urmtoarelor mperecheri dintre nucleobaze: A-T, G-C,
c. adugarea monomerilor acizilor nucleici se realizeaz de ctre urmtoarele enzime
polimerizatoare:
- ADN-polimeraza,
- ARN-replicaza,
- reverstranscriptaza, numai n cazul ribovirusurilor
- ARN-polimeraza.
d. n toate cazurile de sintez polinucleotidic se utilizeaz o caten-matri,
e. noua caten sintetizat prezint secvena de baze azotate complementar secvenei de baze
azotate a catenei parentale care a servit drept matri.
GAVRIL (2003) propune patru predicii care stau la baza replicrii macromoleculei de ADN:
1. Prima predicie conform creia catenele nou-sintetizate au o compoziie n nucleotide identic cu
molecula parental original, poate fi testat prin sinteza in vitro, n sisteme acelulare, cu ajutorul enzimei
ADN-polimeraza I.
2. A doua predicie presupune c molecula fiic de ADN va conine o caten parental i una
complementar nou-sintetizat. Variantele de replicare ale ADN-ului sunt:
- modelul Watson-Crick
- modelul conservativ
- modelul dispersiv
1

Replicare deriv din englez: to replicate a copia

Pentru a stabili care dintre aceste modele corespund replicrii ADN, MESELSON i STAHL (citai
de GAVRIL, 2003) efectueaz n anul 1958 urmtorul experiment, prezentat i n figura 7.17: celule de
Escherichia coli au fost
crescute pe un mediu care
conine izotopul greu al
azotului (15N), forma normal
a azotului fiind 14N. Izotopul
15
N intr n structura bazelor
azotate, iar dup mai multe
generaii ADN-ul bacterian
este marcat cu acesta (fig.
7.17-1). Aceste bacterii sunt
trecute pe un mediu care
conine forma normal a
azotului: 14N (fig. 7.17.-2) i
analizate dup prima i a doua
generaie. ADN-ul bacterian
se extrage (fig. 7.17-3) i se
ultracentrifugheaz
n
gradient de CsCl, care
prezint concentraia cea mai
mare de ioni de Cs+ i Cl- la
fundul eprubetei de centrifug
(fig. 7.17-4). Datorit forei
centrifuge moleculele de
ADN sunt mpinse spre
fundul eprubetei, dar datorit
faptului c ntlnesc o
concentraie din ce n ce mai
mare acestea sunt mpinse
Fig.7.16. Experimentul lui Matthew Meselson i Franklin Stahl
1- bacterii de E. coli crescute pe un mediu marcat cu 15N; 2 nmulirea
napoi deoarece ADN-ul are o
bacteriilor pe un mediu cu 14N; 3 extragerea ADN-ului bacterian; 4
densitate mai mic dect
ultracentrifugarea ADN-ului bacterian n gradient de CsCl; 5 bandarea
soluia de CsCl. n final ele se
macromoleculelor de ADN n funcie de densitate; 6 bandarea ADN-ului
stabilizeaz pe anumite nivele
dup prima i a doua generaie de nmulire a bacteriilor
n eprubet n zonele unde are
loc o echilibrare ntre densitatea ADN-ului i suma forelor determinate de densitatea gradientului soluiei
saline i fora centrifug. Datorit faptului c izotopul 15N este mai greu dect 14N ADN-ul care are
incorporat n bazele sale azotate izotopul 15N va avea o densitate mai mare dect cel care conine forma
normal de 14N. n urma analizrii moleculelor de ADN din eprubete s-a constatat c ADN-ul cu 15N
bandeaz la fundul eprubetei, iar cel cu 14N se afl spre gura eprubetei (fig. 7.17-5). Analiznd ADN-ul la
trecerea bacteriilor de pe mediu cu 15N pe cel cu 14N s-a obinut o band care avea densitate intermediar
ntre ADN cu 15N i ADN cu 14N. Dup a doua generaie de bacterii, pe mediul cu 14N se constat prezena a
dou benzi: una corespunztoare ADN cu 14N i cealalt fiind caracteristic ADN-ului intermediar 15N-14N
(fig. 7.17.-6).
Rezultatele acestui experiment sunt confirmarea indubitabil c replicarea ADN-ului se realizeaz
dup modelul semiconservativ, modelele conservativ i dispersiv fiind excluse.
3. A treia predicie presupune existena unei bifurcaii de replicare deoarece separarea catenelor de
ADN nu se realizeaz dintr-o dat, ci progresiv, iar adugarea nucleotidelor se realizeaz de asemenea
progresiv. Aceast prezumie a fost confirmat prin experienele efectuate de CAIRNS n 1963. Acesta a
marcat cromozomul la E. coli cu timidin tritiat dup care a realizat autoradiografia la microscopul
electronic a ADN-ului bacterian, observnd bifurcaii de replicare. n procesul de formare a acestora

intervin mai multe enzime: polimeraze, helicaze, topoizomeraze, mici segmente de ARN.
4. A patra predicie presupune c la punctul de start al replicrii, genele sunt n numr dublu de
exemplare fa de zonele nereplicate din ADN. Acest fapt a fost confirmat prin expunerea unor celule
eucariote pentru un interval scurt de timp la timidin tritiat
A
(expunere pulsatorie pulse exposure), dup care este
D
N
administrat timidin neradioactiv (pulse chase) i
autoradiografierea
ADN-ului.
n
urma
analizei
p
macromoleculei
de
ADN
s-a
constatat
c
replicarea
se
o
l
declaneaz n mai multe situsuri n cadrul aceluiai
i
cromozom. Acelai fenomen s-a observat i la unele
m
organisme procariote (GAVRIL, 2003).
e
r
a
z
a

7.3.2.2. Enzimele implicate n replicare ADN-ului

Complexul enzimatic care particip la procesul de

replicare a macromoleculei de ADN cuprinde urmtoarele
enzime:
Fig.7.17. ADN-polimeraza n procesul de
replicare
ADN-polimeraza este caracteristic att celulelor
procariote, ct i celor eucariote (fig. 7.17.). n urma
cercetrilor de biochimie i genetic molecular a fost identificat o familie de ADN-polimeraze, unele
implicate direct n replicare denumite replicaze, iar altele intervin n procesele reparatorii (tabelul 7.7.).
n cazul replicrii ADN-ului celulelor procariote ADN-replicaza are o alctuire foarte complex,
fiind format din mai multe subuniti. La Escherichia coli au fost identificate trei ADN-polimeraze dintre
care Pol III are rol n sinteza de novo a ADN-ului, iar dou au rol de reparare a erorilor de citire i de
sintez : Pol I i Pol II.
La eucariote Pol este responsabil de sinteza catenei directoare, iar Pol este implicat n sinteza
catenei ntrziate, iar Pol i Pol intervin n corectarea erorilor de citire, acestea din urm neavnd
activitate exonucleazic.
Tabelul 7.6.
Familii i tipuri de ADN-polimeraze
Famil
ia

B
C
D

X
Y
RT

Rol

Polimeraze specifice
procariotelor

Polimeraze specifice
eucariotelor
Denum
Rol
ire
Replicarea
Pol
catenei
ntrziate

Denumire

Rol

Pol I

Repararea ADN

Pol II

Implicate n
replicarea ADN,
avnd i rol de
exonucleaze

Pol

Pol III

Replicarea ADN
bacterian

Pol

Pol IV

Polimeraze
reparatorii

Pol

Pol V

Polimeraze
reparatorii

Pol

Repararea ADN
catena ntrziat

Polimeraze reparatorii

Pol ,
,

Polimeraze
reparatorii

Reverstranscriptaze
caracteristice eucariotelor i
retro-virusurilor

Pol

Polimeraze
reparatorii

Conine polimeraze cu rol

replicativ i reparator
Polimeraze replicative
caracteristice eucariotelor,
bacteriilor i bacteriofagilor
T4, Phi29 i RB69
Polimeraze replicative i
exonucleaze caracte-ristice
cromozomului bacterian
Polimeraze replicative
caracteristice genului
Euryarchaeota din Archea
Polimeraze cu rol reparator
caracteristice eucariotelor

Repararea ADN
catena
directoare
Replicarea
ADN
mitocondrial
Replicarea
catenei
directoare

Endonucleazele sunt enzime a cror rol principal este segmentarea lanurilor de ADN bicatenar,
monocatenar sau ARN n fragmente, ele fiind implicate n sinteza unui nou lan de ADN.
Un tip special sunt endonucleazele de restricie care au capacitatea de a recunoate secvene
specifice scurte de ADN pe care l cliveaz la ntmplare sau n puncte int. Acest tip de enzime sunt
utilizate n: ingineria genetic, tehnologia DNA recombinat, cartarea genelor, sinteza ADN-complementar,
reconstruirea ADN-ului.
Exonucleazele au rolul de cura materialul genetic, reziduurile fiind eliminate baz cu baz i de
nlturare a nucleotidelor terminale ale lanului polinucleotidic, genernd mononucleotide.
Topoizomerazele au rolul de a tia i cataliza reunirea moleculelor fosfat din macromolecula de
ADN, asigurnd i suprarsucirea negativ prin convertirea
unei dispuneri topologice a ADN-ului (fig.7.18). Aceste
enzime sunt de dou tipuri: topoizomeraza I care menine
apropiate extremitile ADN-ului tiat asigurndu-le o
rsucire pozitiv, sau dou rsuciri negative n cazul
enzimei topoizomeraza II (denumit giraz la procariote).
ADN-ligaza ndeplinete acelai rol la procariote
i eucariote concretizat n cuplarea terminaiilor 3-OH de la
un fragment cu 5-PO4 de la fragmentul adiacent prin
umplerea
breei
cu
o
Fig.7.18. Topoizomerazele
punte
fosfat
(fig.7.19).
ADN-helicaza are rolul de a separa ADNului
dublu catenar n dou molecule monocatenare a cror
stabilitate
este asigurat n urma cooperrii acestei enzime cu
proteinele
SSB (single-stranded binding protein), iar energia
necesar
procesului este generat de hidrolizarea ATP-ului.
Primaza are rol de sintetiza unui segment
de ARN
denumit primer, cu rol de catalizare a primelor reacii
de
sintetizare a ADN-ului fiind alctuit dintr-un singur
lan
polipeptidic.
Primosomii
sunt complexe proteice
localizate
la nivelul furcii de replicare cnd se mic mpreun
cu acesta,
sau dup furc, coordonnd primele procese de
replicare
(BUTNARU GALLIA i colab. 1999).
Fig.7.19. ADN-ligaza n procesul de
replicare

7.3.2.3. Mecanismul replicrii macromoleculei de ADN

Iniierea replicrii se realizeaz pe un anumit punct de pe molecula de ADN, denumit originea
reaplicrii, caracterizat printr-un coninut mai mare de perechi de baze A=T, care avnd doare dou puni de
hidrogen pot fi mai uor separate
dect perechile CG, care conin
trei legturi de H.
Punctul de origine al
replicrii la procariote este
denumit ori C, fiind caracterizat
printr-un
nalt
grad
de
Fig.7.19. Palindrom la E. coli
4

repetitivitate, iar acesta conine secvene cu bisimetrie rotatorie denumite palindroame (fig.7.20).
Din punctul de origine a replicrii se realizeaz bifurcaia de replicare ce se deplaseaz de-a lungul
macromoleculei de ADN. Replicarea poate fi:
- unidirecional n cazul n care o singur bifurcaie se deplaseaz din punctul de origine spre
punctul terminus,
- bidirecional cnd din punctul de origine al replicrii se formeaz dou bifurcaii care se
deplaseaz n direcii diametral opuse.
Indiferent tipul bifurcaiei de replicare, pe msura deplasrii acesteia de-a lungul macromoleculei
de ADN, se realizeaz desfurarea dublului helix-parental, pentru ca cele dou catene matri s fie expuse.
Datorit faptului c desfacerea dublului helix parental fr o rotaie determin formarea unor nfurri
superhelicale la punctul de separare cu acumularea unor tensiuni, este necesar s se asigure relaxarea
acestora.
Aceast sarcin i revine enzimei topoizomeraza I (fig. 7.20.) care acioneaz nainte de furca de
replicare, iar detensionarea se realizeaz prin
ruperea unei puni fosfodiesterice, crendu-se
o balama pe catena opus, n jurul creia se
poate roti liber catena crestat, dup care
aceeai enzim reface puntea diesteric.
Dup
aciunea
topoizimerazei,
intervine alt enzim denumit ADN-helicaza
care au rolul de a separa catenele prin ruperea
legturilor de hidrogen (fig.7.21). Pentru a-i
realiza funcia aceste enzime utilizeaz energia
rezultat n urma defosforilrii ATP-ului.
Fig.7.20. Modul de funcionare a topoizimerazei I
Ca urmare a interveniei helicazei
rezult dou extremiti dintre care una are
gruparea 3-OH, iar cealalt 5-P, iar energia liber de la nivelul acestei tieturi asigur desfacerea nc a 23 crestturi. n continuare are loc ataarea la nivelul monocatenelor a unor proteine neenzimatice denumite
SSB (single-stranded binding protein), care au rolul de a expune matriele n replicare i de a asigura
stabilitatea catenelor monocatenare.
n urma interveniei ADN-helicazei rezult dou catene pe care
inserarea nucleotidelor se realizeaz diferit n timp: pe catena
directoare denumit leading acest proces se realizeaz mai timpuriu,
iar pe catena ntrziat numit lagging inseria se produce cu o
anumit ntrziere.
Aciunea ADN-helicazei este urmat de intervenia enzimei
ADN-primaza a crui principal rol l reprezint sintetizarea unui
segment scurt de ARN, denumit primer care formeaz perechi de baze
pe catena matri ce se constituie ca o amors pentru includerea
nucleotidelor n catena nou-format.

Fig.7.21. ADN-helicaza
5

Rolul primerului este de a oferi urmtoarei enzime specific replicrii, denumit ADN-polimeraza
un capt 3-OH cu ajutorul cruia acesta atac 5-P al nucleotidului aliniat pe matri, avnd loc realizarea
celei dinti legturi fosfodiesterice i sinteza catenei replic. ADN-polimerazele nu au capacitatea de
sintetizare de novo a unei catene polinucleotidice, ci numai de elongaie a unei catene iniiale, de aceea au
nevoie de un capt 3-OH pus la dispoziie de ctre un primer ARN (fig.7.22.).
La eucariote, de iniierea replicrii este responsabil ADN-polimeraza fiind alctuit din patru

Fig.7.22. Replicarea moleculei de ADN

subuniti majore, avnd n acelai timp i o activitate exonucleazic 3-5. ADN-polimeraza este o
replicaz nuclear care este implicat alturi de ADN-polimeraza n procesul de replicare. n catena
directoare procesul replicativ este asigurat de ADN-polimeraza , iar n replicarea catenei ntrziate este
implicat ADN-polimeraza . ADN-polimeraza i au rol n repararea leziunilor, iar replicarea ADN-ului
mitocondrial este asigurat de ADN-polimeraza .
Catena leading este sintetizat continuu, pe cnd catena lagging este sintetizat discontinuu. ADN-

ul nou sintetizat se afl sub forma unor poriuni mici monocatenare de 1000-2000 nucleotide denumite
fragmente Okazaki (GAVRIL, 2003).
Fragmentele Okazaki sunt unite prin refacerea punilor fosfodiesterice ntre 5- fosfat i 3-OH de
ADN-ligaza.
Replicarea este un proces esenial pentru organisme care trebuie s se desfoare fr absolut nicio
eroare deoarece, n caz contrar ar putea determina apariia unor modificri biochimice cu efecte catastrofale
asupra celulei i a organismului.
n procesul replicrii ADN-polimeraza introduce eronat o nucleotid la 100.000, grad de precizie
care nu este suficient nici pentru bacterii. n medie o bacterie conine aproximativ 3 .106 nucleotide,
rezultnd c la replicare se introduc eronat 30 de nucleotide. ADN-ul din genomul uman conine 6 .109
nucleotide, iar numrul erorilor posibile fiind de 60.000/generaie celular, care ar avea ca rezultat
generarea unei informaii ereditare eronate (BUTNARU, GALLIA, 1985).
n decursul evoluiei integritatea macromoleculei de ADN a fost meninut datorit activitii
specifice de reparare a lanului enzimatic implicat n procesul de replicare, precum i a unor mecanisme
care au rolul de a proteja ADN-ul de aciunea modificatoare a unor factori mutageni.
Primul mecanism care asigur corecia replicrii i care presupune excizia unui nucleotid liber,
greit mperecheat cu matria revine ADN-polimerazei I care are proprietatea de corecie a citirii denumit
proofreading.
Un alt control al corectitudinii replicrii exist la nivel celular, care cuprinde urmtoarele puncte de
verificare:
- G1 checkpoint, n care se verific integritatea ADN nainte de faza S a ciclului celular,
- n timpul fazei S,
- G2 checkpoint

7.4. Denaturarea i renaturarea macromoleculei de ADN

La temperatura corpului animalelor, n afar de momentele replicrii i transcripiei,
macromolecula de ADN este stabil, i pstreaz structura dublu-catenar helicoidal conform
modelului Watson-Crick.
Ins, n anumite condiii experimentale cum sunt: tratrile termice sau tratamentele cu
acizi i baze sau n prezena unui pH foarte nalt sau foarte sczut, se poate obine trecerea de la
structura bicatenar la structura monocatenar prin desfacerea celor dou catene complementare.
Astfel, ntre 63C i 100C, n funcie de specie, adic de componena n baze azotate a
ADN, stabilitatea mai slab a punilor de hidrogen cedeaz, legturile de hidrogen se desfac i are
loc separarea din dublul helix a celor dou monocatene.
n mod obinuit se procedeaz la nclzirea timp de 10 minute la 95C a unei soluii n
care se gsete duplexul ADN. In aceast situaie, legturile de hidrogen se rup i cele dou catene
se despart. Acest proces poart numele de denaturare termic.
O ridicare n continuare a temperaturii peste 95C duce la degradarea macromoleculei de
ADN prin ruperea i a legturilor covalente fosfodiesterice, la nceput ntre bazele purinice i
scheletul glucido- fosforic i n cele din urm i dintre bazele pirimidinice i acelai schelet.
Procesul de denaturare a ADN a fost denumit i topirea" ADN pentru c el se comport
ca un cristal ntr-un proces de topire.
Mijlocul obinuit prin care se stabilete dac a avut loc denaturarea ADN-ului este
msurarea capacitii ADN n soluie de a absorbi lumina ultraviolet cu lungimea de und de 260
nm. ADN denaturat prezint o cretere marcat (cu 40% mai mare) a nivelului de absorbie a
razelor UV de 260 nm fa de moleculele de ADN dublu catenare n aceeai concentraie. Acest
fenomen cunoscut sub numele de efect hipercrom este o urmare a expunerii bazelor azotate la
exterior, realizat prin trecerea de la structura bicatenar n care bazele azotate se gsesc n

interiorul dublului helix la monocatene. In acest fel, bazele azotate vor oferi suprafee mult mai
mari pentru absorbia UV i se produce o diminuare a vscozitii soluiei.
Temperatura la care 50% din ADN este denaturat se numete temperatura medie de topire
notat cu Tm.
Temperatura medie de topire este dependent de compoziia n perechi de baze azotate a
ADN. Perechile GC ntre care exist trei legturi de hidrogen sunt mai rezistente la denaturare fa
de perechile A-T ntre care sunt doar dou legturi de hidrogen. Aceste observaii arat c
denaturarea ncepe totdeauna la nivelul regiunilor ADN bogate n perechi A-T.
Valoarea temperaturii medii de topire poate da indicaii asupra compoziiei n baze a
ADN, temperatura fiind mai mare pentru un ADN bogat n perechi G-C i mai mic pentru un
ADN bogat n perechi A-T. Ca urmare, fiecare specie avnd un raport A + T/G + C caracteristic, se
va distinge i printr-o anumit valoare a temperaturii medii de topire a ADN-ului su.
Dac o soluie de ADN este nclzit treptat i valoarea absorbiei UV este nregistrat la
spectrofotometru se obine o curb de topire a ADN ca n fig. 124. Denaturarea poate fi reversibil
(renaturare) i ireversibil.
Dac dup denaturarea termic la 95C are loc o rcire brusc a soluiei, atunci nu mai
poate avea loc reasocierea catenelor cu refacerea structurii dublu catenare. Se produce denaturarea
ireversibil sau permanent a ADN. Rcirea brusc a soluiei de ADN denaturat face s se reduc
mobilitatea monocatenelor, avnd loc plierea lor, cu mpiedicarea reasocierii complementare.

Fig. 7.24. Curba de topire a ADN-ului cu evidenierea temperaturii medii i a etapelor separrii catenelor (dup
Hartl i col. 1988, Jones and Bartlett Publishers, Inc.)

Dac soluia de ADN este rcit foarte lent, proces denumit clire", catenele se reasociaz
pe baza complementaritii i se reface structura bicatenar similar cu cea original. Acest
fenomen este cunoscut sub denumirea de renaturarea ADN i este nsoit de efectul hipocrom,
adic de o reducere a capacitii de absorbie a UV deoarece prin refacerea structurii dublucatenare, bazele azotate care sunt cromofile se ascund" din nou n interiorul macromoleculei.
Renaturarea este iniiat la nivelul sectoarelor de ADN mai bogate n perechi G-C, fiind
caracterizate de o mai mare stabilitate n refacerea structurii bicatenare.
Dup denaturare-renaturare, ADN reconstituit i pstreaz proprietile biologice iniiale.
Denaturarea i renaturarea ADN sunt procese fizice foarte importante pentru studiul
relaiilor filogenetice dintre diferite specii i n ingineria genetic pentru realizarea ADN

recombinat prin producerea de hibrizi moleculari ADN-ADN i ADN-ARN.

Fig.7.24. A- Denaturarea, renaturarea ADN. B - Hibridarea ADN-ARN

Lungimea

macromoleculelor de ADN i cantitatea de ADN

Unitatea de msur a lungimii ADN este perechea de baze azotate notat prescurtat pb.
Multiplii perechii de baze sunt: kilobaza (kb) i megabaza (Mb). O kilobaz este alctuit din 1000
perechi de baze, iar o megabaz are 1.000.000 pb.
La procariote, macromolecula de ADN este alctuit, de exemplu la Escherichia coli, din
4,6 x 106 perechi de baze sau 4,6 Mb, la nematodul Caenorhabditis elegans 97x106pb sau 97 Mb, la
om 3,1 x 109 pb = 3100 Mb. La virusurile cu ADN, lungimea macromoleculei de ADN are 47.000
pb (la bacteriofagul lambda) i 200.000 pb la fagii T2-T4.
n ceea ce privete cantitatea de ADN, ea se msoar n picograme (1 pg = 10-12 g).