Determinări cantitative (dozări) ale proteinelor

Controlul calităţii în industria alimentară

În regnul animal, proteinele reprezintă aproximativ 65-70% din materia uscată a organismului
viu. În plante, conţinutul lor variază de la 2% la 35%, cantitatea majoră se acumulează în seminţe. În
microorganisme, conţinutul proteinelor poate atinge 80-90%.
Cantitatea de proteine depinde de particularităţile individuale, starea fiziologică şi
biochimică a organismului şi poate suferi modificări semnificative sub influenţa diferitor factori
ai mediului ambiant şi a proceselor tehnologice.
Determinarea proteinelor în lichidele şi ţesuturile corpului uman şi animal prezintă o mare
valoare pentru stabilirea diagnosticului diferitelor stări patologice şi urmărirea influenţei unor
factori (de exemplu, al medicamentelor) asupra metabolismului proteinic în aceste organisme.
Cunoaşterea conţinutului de proteine totale şi a fracţiunilor proteice principale în seminţele şi
organele vegetative ale diverselor culturi, este absolut necesară în procesul de ameliorare a
plantelor. Deoarece influenţa factorilor mediului asupra organismelor vii se realizează prin
modificarea structurii şi funcţiilor unor proteine, cunoaşterea metodelor de cercetare a acestor
biomolecule are un rol important în soluţionarea problemelor ecologice, precum şi în crearea
unor biotehnologii avansate.
Determinarea cantitativă este deosebit de importantă în cazul când apare necesitatea izolării
din marea mulţime a unor proteine individuale, procedură necesară în lucrările ştiinţifice de
biologie moleculară, chimia proteinelor şi altor cercetări la nivel molecular.
Pentru determinarea cantitativă (dozarea) a diferitelor substanţe, inclusiv a proteinelor,
biochimia analitică utilizează anumite metode experimentale: gravimetrice (prin cântărire),
volumetrice (titrimetrice), dintre care metoda Kjeldahl este considerată ca metodă etalon pentru
dozarea proteinelor, și fizicochimice, care sunt cele mai moderne metode analitice. Dintre acestea o
largă răspândire o au metodele electrofotocolorimetrice.

Lucrarea de laborator nr. 5

Dozarea proteinei cu reactivul biuret

Reguli de măsurări electrofotometrice

Metoda e bazată pe reacţia grupărilor peptidice cu reactivul biuret, care formează o coloraţie
violet-albastră sau violet-roşu, în dependenţă de preponderenţa în molecula proteică a unor sau
altor resturi de aminoacizi.
Intensitatea coloraţiei ce se formează este direct proporţională cu concentraţia proteinei în
soluţie şi poate fi determinată fotometric
Modul de lucru:
Etapa I. Construirea curbei etalon pentru determinarea cantitativă a proteinei cu
reactivul biuret.
1. Prepararea soluției etalon, ce conţine 10 mg proteină într-un ml. Se recomandă de a
utiliza preparate înalt purificate de firmă ca de exemplu, albumina serică bovină sau
albumine vegetale purificate şi liofilizate în laborator sau ovalbumine, în care, se
dozează în prealabil conţinutul de proteină după metoda Kjeldahl.
2. Prepararea resctivului biuret: în 250 ml apă bidistilată se dizolvă 1,5 g CuSO 4 și 3 g
sare Siegnette (tartrat dublu de sodiu și potasiu) apoi agitând minuțios se adaugă 150
ml soluție NaOH 10% decarbonată și 1 g de KI. Volumul se duce la 1 l cu apă distilată.
Reactivul se păstrează în vas de polietilenă.

Într-o serie de eprubete se introduc soluţii în volumele indicate în tabel, de fiecare dată
agitând energic conţinutul. După 30 minute de aflare la temperatura camerei se determină
extincţia la λ = 590 nm (filtrul optic nr. 6).
 Concentraţia
Cantitatea Apă Reactivul
Nr. obţinută a D
soluţiei etalon distilată Biuret
eprubetei proteinei λ = 590 nm
de proteină (ml) (ml) (ml)
(mg/ml)
1 0,1 0,9 1 4
2 0,2 0,8 2 4
3 0,3 0,7 3 4
4 0,4 0,6 4 4
5 0,5 0,5 5 4
6 0,6 0,4 6 4
7 0,7 0,3 7 4
8 0,8 0,2 8 4
9 0,9 0,1 9 4
10 1,0 0,0 10 4
11 0,0 (control) 1,0 0 4
Etapa II. Dozarea conţinutului de proteine după curba etalon.
Preparatul soluţiei de proteină cercetat (vegetală, animală sau microbiană). se diluează cu
soluţie de NaCl 5%, astfel încât conţinutul proteinei să fie în intervalul de 1 - 10 mg/ml.
La 1 ml soluţie proteică diluată se adaugă 4 ml reactiv Biuret, se agită şi după 30 minute de
aflare la temperatura camerei se determină extincţia. Folosind curba etalon (etapa I.), se determină
concentraţia în probă, apoi conţinutul de proteină în materialul cercetat se calculează în %,
ţinând cont de diluări.

Nr. problemei D, λ = 570 nm C, mg/ml după curbă

1
2
3