Lucrarea de laborator nr.2.

Reacţii de culoare asupra proteinelor şi aminoacizilor

Experienţa 1. Reacţia biuretului asupra legăturilor peptidice

Aceasta este o reacţie, pe care o dau cu sărurile cuprului în mediu puternic alcalin biuretul
( ), polipeptidele, proteinele şi alţi compuşi.

Reacţia este condiţionată de prezenţa în molecule a grupărilor O H

peptidice. Compuşii coloraţi formaţi prin reacţia biuretică reprezintă R C C R
complexe care pot avea câteva structuri. Prezentăm una din
HC N N
posibilele: O
Complexele biuretice de cupru pentru fiecare compus se C Cu
caracterizează printr-o anumită culoare (roşu, violaceu, albastru) cu C 2Me+
O
maximul de absorbţie în intervalul de 440 - 470 nm. N N CH
Reacţia biuret este pozitivă numai pentru peptidele ce conţin
R C C R
cel puţin trei resturi de aminoacizi.
H O
Material de cercetare: soluție de proteină și de carnozină.
Reactivi: soluţii de: NaOH 10%, CuSO4 1%.
Modul de lucru: În 2 eprubete cu câte 10 picături soluţie de: I – proteină și II – carnozină se
adaugă câte 5 picături soluţie de NaOH 10% şi câte o picătură soluţie de CuSO4 1%. Se agită.
Concluzie: Soluția de proteină se coloreayă în ____________, iar soluția de carnozină nu
se colorează, deoarece ____________________________________________.

Experienţa 2. Reacţia ninhidrinică (ninhidrină) asupra aminogrupărilor

Soluţia de proteină cu o soluţie diluată de ninhidrină în mediu alcalin se colorează prin
încălzire în albastru-violet. La proteine interacţionează numai grupările –NH2 libere.
Cel mai probabil mecanism al reacţiei este acel care admite că la interacţiunea cu ninhidrină
aminoacizii se oxidează şi se scindează cu eliberare de amoniac, aldehidă şi acid carbonic.
Ninhidrina se reduce şi se condensează cu o altă particulă de ninhidrină şi cu amoniacul,
formând un compus complex de structură murexidă (purpurat de amoniu), colorat în albastru.
Majoritatea aminoacizilor formează culoare azurie sau liliachie, asparagina – portocaliu-
cafenie, prolina şi hidroxiprolina – galbenă. Reacţia ninhidrinică este deseori utilizată pentru
determinarea cantitativă (dozarea) a aminoacizilor, inclusiv şi la analizorul automat.
R O serie de
O
HOOC CH NH2 + produse
OH
intermediare
α-Aminoacid OH
O
Ninhidrină
O O
N

O- O
Produsul de reacţie cu structură murexidă

Material de cercetare: soluție de proteină, hidrolizat de proteină, soluție de prolină.

Reactivi: soluţie de ninhidrină 1% în acetonă.
Modul de lucru: În 3 eprubete la câte 10 picături soluție de proteină, hidrolizat de proteină și
soluție de prolină se adaugă câte 2 picături de ninhidrină 1% în acetonă și se duce la fierbere.
Concluzie: Soluția de proteină și de hidrolizat de proteină se colorează în
_______________________. Colorația este mai intensă în
 ________________________, deoarece _____________________. Pro se
colorează în _________________.

Experienţa 3. Reacţia xantoproteică asupra aminoacizilor aromatici

La încălzirea soluţiilor majorităţii proteinelor cu acid azotic concentrat, lichidul se
colorează în galben de lămâie, care prin alcalinizare trece în portocaliu.
Reacţia este condiţionată de prezenţa aminoacizilor aromatici – fenilalanina, tirozina şi
triptofanul, care la interacţiunea cu acidul azotic concentrat formează nitroderivaţi de culoare
galbenă (reacţie de nitrare).
Aceştea din urmă se transformă prin alcalinizare în săruri cu structură chinonică, colorate
în portocaliu.
Reacţia de nitrare a fenilalaninei decurge mai anevoios. Proteinele în care aminoacizii
aromatici lipsesc, nu dau reacţia xantoproteică. Din acest grup de proteine fac parte: gelatina,
protaminele spermei de peşte – clupeina, salmina ş. a.

OH OH
O2N NO2
+ 2HNO3 t˚
- 2H2O
CH2 CH NH2 C H2 CH NH2
COOH COOH
Tirozină
Dinitrotirozină
O
OH O
O2N N ONa
O O2N N
+ NaOH O

CH2 CH NH2 - H2O CH2 CH NH2

COOH COOH
Dinitrotirozină Sarea dinitrotirozinei cu
forma chinonică structură chinonică

Reacţia xantoproteică poate fi observată pe piele, unghii, lână etc. când pe ele nimereşte
acidul azotic concentrat (coloraţie galbenă).

Material de cercetare: soluție de albuș de ou, proteină vegetală, gelatină.

Reactivi: HNO3 concentrat, NH4OH concentrat sau NaOH 30%.
Modul de lucru: În 3 eprubete la câte 10 picături soluție de albuș de ou, proteină vegetală, gelatină
se adaugă câte 2-3 picături HNO3 concentrat. Se observă formarea precipitatului. Se încălzeşte.
Lichidul se colorează __________________. După răcire în fiecare eprubetă se adaugă câte 10
picături soluţie concentrată de NH4OH sau soluţie de NaOH 30%. Coloraţia lichidului trece în
____________.
Concluzie: Colorația este mai intensă în eprubeta cu ______________________ ceea ce
denotă că ________________________________________________, iar în
eprubeta cu gelatină ___________________________ ceea ce denotă că în
gelatină aminoacizi aromtici ______________________.

Experienţa 4. Reacţia Adamkiewiez-Hopkins asupra triptofanului

Dacă la soluţia de proteină se adaugă acid glioxalic (care se conţine în cantitate de urme în
acidul acetic concentrat), după care pe peretele eprubetei se substratează atent (se scurge prelins
din pipetă) acid sulfuric concentrat, atunci la hotarul COOH
dintre cele două lichide se formează un inel
COOH
roşu-violet. Reacţia a fost descoperită de Adamkiewiez, la sfârşitul secolului XIX. Chimismul
H2N CH H2N CH
H C 2
O
2 Triptofan + CH2 CH2
COOH - H 2O
H
Acid glioxalic C
N N
H COOH H
reacţiei a fost studiat de Hopkins. Ulterior, s-a constatat, că reacţia are loc şi în prezenţa altor
aldehide (formaldehida, furfuralul etc.). Chimismul reacţiei, după Hopkins este următorul:
COOH COOH
H2N CH H2N CH
H C O
2 Triptofan + CH2 CH2
COOH - H2O
H
Acid glioxalic C
N N
H COOH H
În unele cazuri triptofanul se scindează hidrolitic:
OH
NH2

Triptofan + HOH + CH3 CH COOH

N
H
Indol Alanină
Indolul format interacţionează cu aldehida, formând un compus colorat:
OH O

+ O C H
CH R + H2O
N R N
H H
Indol Aldehidă Derivat colorat al indolului

Prin aceasta se explică faptul că reacţia cu acidul glioxalic e pozitivă la fel şi cu alte
substanţe, care posedă inelul indolic, de exemplu, cu acidul indolilacetic (fitohormonul
heteroauxina).
Intensitatea coloraţiei obţinute depinde de cantitatea de triptofan. Conţinutul de triptofan în
proteina albuşului de ou şi cea de soia e de două ori mai înalt decât în făina de grâu.

Material de cercetare: soluție de albuș de ou, proteină vegetală, gelatină.

Reactivi: CH3COOH concentrat sau soluţie de HCHO 2,5%; H2SO4 concentrat.
Modul de lucru: În 3 eprubete se iau câte 10 picături soluție de albuș de ou, proteină vegetală,
gelatină. Se adaugă câte 5 picături CH3COOH concentrat, care conține urme de aldehida numită
acid glioxalic, sau soluție de HCOH 2.5%. Atent se substratează câte 15 picături de H2SO4.
Concluzie: La hotarul dintre cele 2 straturi de lichid apare un inel
___________________, care treptat se răspândește în tot lichidul. Colorația
este mai intensă în soluția de _______________________, ceea ce denotă că
____________________________________________.

Experienţa 6. Reacţia Fol asupra aminoacizilor ce conţin sulf

Prin încălzirea soluţiilor proteice în mediu puternic alcalin cu plumbit, lichidul se
colorează în brun sau negru.
Reacţia este condiţionată de prezenţa în proteină a aminoacizilor ce conţin sulf (cisteina şi
cistina), care sub influenţa alcaliilor se distrug cu formare de sulfură de sodiu:
Cisteină + 2NaOH → Na2S + Serină + H2O
Plumbitul de sodiu se formează la interacţiunea acetatului de plumb cu baza alcalină:
Pb(CH3COO)2 + 2NaOH → Pb(ONa)2 + 2CH3COOH
Plumbit de sodiu

Sulfura de sodiu reacţionează cu plumbitul, formând sulfura de plumb de culoare brună sau
neagră:
3
 Na2S + Pb(ONa)2 + 2H2O → PbS↓ + 4NaOH
Intensitatea coloraţiei depinde de cantitatea de aminoacizi ce conţin sulf în proteină şi de
concentraţia de proteină în soluţie.
Aminoacidul ce conţine sulf, metionina e mai stabil şi nu se distruge prin hidroliza
alcalină.

Material de cercetare: soluție de albuș de ou, proteină vegetală, gelatină.

Reactivi: Soluţii de: NaOH 10%, Pb(CH3COO)2 0,5%.
Modul de lucru: În 3 eprubete se iau câte 10 picături soluție: de albuș de ou, proteină vegetală,
gelatină. Și se adaugă câte 5 picături soluție de NaOH 10% și câte o picătură de Pb(CH 3COO)2
0,5%. Print-o încălzire îndelungată lichidul devine ____________ și se depune un precipitat
___________ de PbS.
Concluzie: Colorația intensă a soluției de __________________ atestă că această
proteină este bogată / săracă în aminoacizii ______________ și __________,
iar cea slabă denotă, că în soluția de _______________ acești aminoaciyi sunt
în cantitate mare / mică.

Rezultatele lucrării se înscriu în tabel. În rubrica “Prin ce este condiţionată reacţia?” este
necesar de adus formulele de structură a grupărilor chimice şi a acelor aminoacizi, prezenţa
cărora în proteine condiţionează reacţia respectivă.
Reacţii de culoare asupra proteinelor şi aminoacizilor

Nr. Prin ce este condiţionată Coloraţia

Denumirea reacţiei Reactivii utilizaţi
d/o reacţia? observată