Universitatea „Dunărea de Jos” din Galați

D.F.C.T.T Conversie Chimie – an II

Semestrul I, an 2023-2024
Laborator Chimie Organică. Compuși heterociclici nr. 1

A. REACŢII DE IDENTIFICARE PENTRU AMINOACIZI

Pentru identificarea aminoacizilor se folosesc proprietăţile de amfioni, capacitatea

de tamponare, punctul izoelectric, reacţiile de culoare şi cromatografia.
1. Reacţii de complexare a amfionilor. La o soluţie 0,1 % de aminoacid (glicină,
prolină etc.) se adaugă câteva picături dintr-o soluţie saturată de CuSO4. La adăugarea a
5-6 picături de NaOH 10%, apare culoarea albastră specifică chelaţilor cuprici ai
aminoacizilor. Pentru comparaţie se poate înlocui Cu2+ cu Co2+.
2. Reacţii comune tuturor -aminoacizilor
a. Reacţia cu ninhidrina. Reacţia este foarte sensibilă şi permite identificarea
tuturor amino-acizilor, inclusiv a prolinei care formează un produs cu structură deosebită.
Probă: într-o eprubetă se introduc 1-2 mL soluţie 0,05% a oricărui aminoacid în
soluţie neutră peste care se adaugă şi se omogenizează 1 mL soluţie de ninhidrină (0,1%
ninhidrină în alcool 60%). Amestecul se aduce la fierbere, când se constată apariţia unei
coloraţii albastre-violet.
Reacţia este pozitivă pentru toţi aminoacizii cu grupă -amino liberă, chiar dacă,
aminoacidul apare în capătul unei catene proteice. De aceea, reacţia este pozitivă şi
pentru peptide, proteine, -aminoaldehide şi derivaţi de uree. Majoritatea -, - şi -
aminoacizilor nu dau această reacţie.
3. Reacţii pentru aminoacizi aromatici
Inelul aromatic din aminoacizi este activat de grupele ce-l substituie şi de aceea
reacţionează mai uşor decât benzenul ca atare. Câteva exemple vor fi edificatoare în acest
sens.
a. Reacţia xantoproteică. Aminoacizii cu inel aromatic (fenilalanina, tirozina, cel
mai uşor, şi mai greu triptofanul) suferă reacţia de nitrare cu HNO3 conc., când se
transformă în nitroderivaţi de culoare galbenă, care în prezenţă de alcalii îşi intensifică
mult culoarea:
CH2 CH COOH CH2 CH COOH CH2 CH COOH
NH2 + HNO3 NH2 + NaOH NH2 + H O
2
- H2O NO2 + HCl N O
OH OH O
O Na+
Tirozina Nitroderivat galben Acinitroderivat (portocaliu)
Probă: la câteva picături soluţie apoasă de aminoacid se adaugă 0,5 mL HNO3
conc (se diluează în amestec cu proba de cca 4 ori) şi se încălzeşte uşor. După câteva
secunde apare o coloraţie galbenă. Proba se răceşte şi se alcalinizează cu NaOH 20%,
când soluţia devine portocalie datorită formării acinitroderivatului.
b. Reacţia cu azotat mercuros (reacţia Millon).
Reactivul Millon: 10 g Hg se dizolvă în 14,3 mL HNO3 conc ( = 1,4 g/cm3).
După dizolvare completă (sub nişă!), se încălzeşte pe baie de apă 10 minute şi apoi se
adaugă 2 volume de apă distilată şi şi 1-3 mL NaNO2 1%. Se păstrează în sticle brune,
perfect etanşe.

1
 Probă: într-o eprubetă se introduce 1 mL probă de tirozină şi 5 picături de reactiv
Millon proaspăt preparat. După uşoară încălzire la 50C apare culoarea roz-roşie sau se
depune un precipitat cărămiziu.
Reacţia pare a fi o nitrozare în poziţia 3 care trece în tautomerul chinonoximei
(roză) căreia îi corespunde sarea mercuroasă cărămizie.
c. Reacţia Pauli. Tirozina şi histidina dau reacţie de cuplare cu acid diazobenzen-
sulfonic în mediu slab alcalin, la temperatura mediului.
Reactivi: carbonat de sodiu 10%; aid sulfanilic 1% preparat prin dizolvare în HCl
2%; azotit de sodiu 5%.
Prepararea acidului diazobenzensulfonic: într-un pahar Berzelius mic se introduc
1-2 mL soluţie de acid sulfanilic. Se răceşte pe gheaţă la 0C. Sub agitare, se adaugă 1-2
mL azotit de sodiu răcit, pentru diazotare:
(a) NaNO2 + HCl = HNO2 + NaCl
Diazotare
(b) HO3S NH2 + HNO2 HO3S N N ] + Cl
-H2O
Acid sulfanilic Clorura acidului p-diazobenzensulfonic
Proba cu tirozină sau histidină: într-o eprubetă curată şi uscată se adaugă 2 mL
soluţie de tirozină, 2-4 picături de soluţie Na2CO3 10% şi 2 mL din soluţia de acid
diazobenzensulfonic. După uşoară agitare amestecul din eprubetă se colorează în roşu sau
oranj datorită reacţiei de mai jos:
CH2 CH COOH CH2 CH COOH
+
2 HO3S N N+ NH2 NH2
HO3S N N N N SO3H
Acid diazobenzen- OH OH
sulfonic Tirozină Produs de cuplare roz-roşu
Reacţia Pauli este sensibilă pentru decelarea a 1 ppm aminoacid şi se adaptează
pentru dozarea colorimetrică a histidinei, care cuplează astfel:
COOH COOH
CH2 CH CH2 CH
+ N NH2 N NH2
2 HO3S N N+
NH HO3S N N NH N N SO3H
Acid diazobenzen-
sulfonic Histidină Produs de cuplare roz-roşu
d. Reacţia cu acid glioxilic (reacţia Cole-Hopkins). Acidul glioxilic (O=CH-
COOH), conţinut ca impuritate în acidul acetic glacial, condensează cantitativ cu
triptofanul, în prezenţă de acid sulfuric conc, conducând la un colorant violet conform
reacţiei:
COOH HOOC COOH
CH2 CH CH2 CH
NH2 H2N CH CH2 NH2
H SO
2 + OCH COOH 2 4 CH
NH Acid - H2O NH NH
Triptofan glioxilic Colorant COOH
Probă: într-o eprubetă se introduc 2 mL soluţie de triptofan sau hidrolizat proteic
şi 2 mL acid acetic glacial, după care se încălzeşte uşor. În amestec se adaugă pe peretele
eprubetei, 1 mL H2SO4 conc. La limita de separare a straturilor se observă inelul violet al
produsului de condensare.
4. Reacţii pentru aminoacizi cu sulf
a. Precipitarea ca sulfură de plumb. Aminoacizii cu sulf (cisteina, cistina,
homocisteina şi metionina) dau precipitat de PbS la tratarea acestora cu acetat de plumb

2
în mediu bazic.
COOH COOH
NaOH 20%
2 R CH CH 2 R CH CH
NH2 - 2NaSH NH2
SH OH
Tioaminoacid Pb(CH3COO)2 Hidroxiacid
PbS + 2CH3COONa
Probă: la 1 mL soluţie de acetat de plumb se adaugă NaOH 20% până la
dispariţia precipitatului alb format iniţial. Peste această soluţie se adaugă câteva picături
de tioaminoacid şi se încălzeşte încet. În scurt timp se formează un precipitat negru-brun
de sulfură de plumb.

B. SEPARAREA CROMATOGRAFICĂ A AMINOACIZILOR

Separarea cromatografică a aminoacizilor din hidrolizate proteice se face pe hârtie sau în

strat subţire.

Cromatografia plană
Cromatografia plană se caracterizează prin forma geometrică plană a suportului
fazei staţionare. Această tehnică cromatografică include: cromatografia pe hârtie (CH) şi
cromatografia pe strat subţire (CSS). Separarea se bazează pe distribuţia componentelor
între două faze, una mobilă lichidă şi una staţionară. În cromatografia pe hârtie (CH),
fază staţionară este fibra celulozică cu anumite caracteristici structurale şi dimensionale.
În cromatografia în strat subţire (CSS), faza staţionară este silicagelul, alumina,
poliamide ca nylon-6 şi nylon-6,6, celuloză aminoetilată, amidonul etc., toate având în
masă un liant pentru formarea stratului subţire pe un suport inert (plăcuţe de sticlă sau
folii de aluminiu). Faza mobilă este un amestec de solvenţi bine aleşi.
Aceste metode prezintă avantaje ca: universalitatea, simplitatea, accesibilitatea şi
rapiditatea metodei, posibilitatea analizei simultane a mai multor probe, eficienţa mare de
separarea a substanţelor, posibilitatea utilizării pentru identificare a reactivilor corozivi
sau a developanţilor acizi.
Cromatografierea pe hârtie sau strat subţire presupune developarea într-un spaţiu
închis – cameră de developare (bac cromatografic) – cu atmosferă saturată de solvenţi.
Developarea poate fi ascendentă sau descendentă, orizontală, circulară sau radială.
Camerele de developare utilizate pot fi cilindrice sau paralelipipedice. În practică se
utilizează cuve rectangulare, de tip sandwich sau de alte forme, în care se introduce faza
mobilă (un solvent sau un amestec de solvenţi).
Hârtia cromatografică are o structură poroasă specială. Aceasta se decupează la
dimensiunile cerute de bacul cromatografic şi de numărul de spoturi care urmează a fi
depuse. Dacă n este numărul de spoturi, atunci lăţimea hârtiei va fi (n+2)2 cm, iar
lungimea egală cu înălţimea bacului. Plăcile pentru strat subţire sunt pregătite în
prealabil şi activate. Ele au dimensiuni standard, iar adsorbantul se alege după natura
componenţilor şi amestecul de solvenţi pentru eluţie. Amestecul de solvenţi se introduce
în camera sau bacul de cromatografie şi se ataşează capacul pentru a se ajunge la saturaţie
cu vapori.
Proba de analizat, dizolvată în general într-un solvent, se aplică la baza plăcii sau
hârtiei cromatografice, la 10-20 mm de margine, cu ajutorul unei capilare calibrate sau cu
o seringă specială. Probele aplicate pe plăci trebuie să conţină minim 0,01% concentraţie

3
în componentele de separat, însă nu trebuie să fir prea concentrate, deoarece la
concentraţii mari separarea este difuză (spoturile nu sunt distincte) obţinându-se
numeroase suprapuneri sau asimetrii. După aplicarea probelor, locurile de depunere aflate
pe linia de start, trebuie uscate foarte bine, deoarece solvenţii de extracţie remanenţi pot
influenţa negativ separarea substanţelor de analizat. Solvenţii volatili se pot îndepărta cu
uşurinţă, prin simpla agitare în aer a cromatogramelor, în timp de solvenţii cu puncte
înalte de fierbere se îndepărtează prin încălzirea plăcilor cromatografice la temperaturi
controlate, care să nu afecteze structura plăcilor şi componenţii din probă. După
evaporarea solventului de extracţie, cromatoplaca se introduce în camera de developare
care conţine faza mobilă (fig.1.).

5
Front
4 Direcţia
3 de migrare H
2 Spoturi
Start x3
1 2 cm
E A1 A2
d = 2 cm
(a) (b) (c)
Fig. 1. Detalii privind aplicarea cromatografiei plane:
(a) bac cromatografic (1) cu: nacelă pentru amestec de solvenţi (2), placa sau
hârtia suport (3), baghetă de sprijin(4), capac etanş (5); (b) placa sau hârtia
cromatografică; (c) cromatogramă developată şi distanţe folosite în calculul Rf – ului.
După ce developantul a atins distanţa de deplasare prevăzută (marcată prin frontul
developantului) placa sau hârtia cromatografică se scoate, se usucă şi se trece la detecţia
componenţilor. Revelarea este operaţia de punere în evidenţă a zonelor separate,
corespunzătoare diferiţilor componenţi separaţi. Procedeele de vizualizare pot fi: fizice –
expunerea cromatogramelor la lumină UV; chimice – reacţii de culoare efectuate prin
stropirea plăcii cu reactivi chimici; fizico-chimice – stropirea cu reactivi chimici urmată
de expunere la lumină UV; biochimice – bioautografia, reacţii enzimatice. Spotul poate fi
analizat cantitativ prin decupare sau răzuire urmată de extracţia componentului într-un
volum determinat dintr-un solvent potrivit sau direct prin densitometrie optică.
Modul general de evaluare a rezultatelor separării este dat de valoarea Rf, care
reprezintă raportul dintre distanţa xi de la linia de start până la centrul componentului
separat şi distanţa H de la linia de start la frontul fazei mobile:
Rf = xi / H
Pentru condiţii identice de cromatografiere pe hârtie şi strat subţire (condiţii
standard), Rf-ul devine o constantă de identificare a fiecărui component separabil.
Metoda se aplică curent în analiza aminoacizilor din hidrolizate proteice, a
zaharurilor şi glicozidelor din produse naturale, în chimia heterociclurilor, sterolilor,
carotinoidelor şi multe altele.
Când separarea componentelor nu a fost totală sau convenabilă, se apelează la
cromatografia bidimensională. Aceasta constă în reeluarea cromatogramei pe direcţie
perpendiculară pe prima. Practic, în bacul cromatografic cu dimensiuni adecvate, se
introduce cromatograma uscată şi nedevelopată, în aceiaşi solvenţi sau într-un alt
amestec.

4
 Modul de lucru:
Se cântăresc cca. 4 g (1 mg) produs proteic direct în balonul de hidroliză; se
adaugă 30 mL HCl 6 N şi câteva bucăţele de porţelan. Amestecul se fierbe 8 h sub reflux.
Hidrolizatul se tece cantitativ cu apă distilată în cotat de 100 mL, se adaugă 5 mL eter de
petrol, se completează cu apă la semn, se omogenizează şi se lasă în repaus câteva
minute. Stratul de eter de petrol, care conţine grăsimea dizolvată, se îndepărtează cu o
pâlnie de separare, iar faza apoasă se filtrează şi se utilizează în analize.
Separarea cromatografică a aminoacizilor din hidrolizatul proteic de mai sus se
face pe hârtie sau în strat subţire. Developant este amestecul n-butanol:acid acetic:apă =
6:1:2 şi revelatorul, soluţia alcoolică 0,2% de ninhidrină. Placa se activează în etuvă la
100C.

Bibliografie

 Furdui B., Dinică R., Georgescu M., Chimie organică. Noţiuni teoretice şi practice,
Editura Galaţi University Press, 2010;
 Dinică R., Georgescu M., Chimie Organică, Ed. Fundaţiei Universitare „Dunărea de
Jos”, Galaţi, 2004;
 Florea T., Furdui B., Dinică R., Creţu R., Chimie organică. Sinteza şi analiza
funcţională, Galaţi, 2009