Universitatea Valahia Târgoviște

Facultatea de Ingineria Mediului și Stiința Alimentelor

Specializarea: Controlul și Securitatea Produselor Alimentare

Anul: IV

Optimizarea hidrolizei enzimatice a cărnii de

pui,utilizând metodologia de răspuns la suprafață

Nume: Ciuciuc Evelyne Andrada

Prof. Coordonator: Nicolescu Cristina Mihaela

Târgoviște, 2022-2023
 1. Introducere
În timp ce America de Nord și Centrală și Europa au pierdut o parte din piață,
China și Brazilia au devenit noile centre pentru producția de pui în Asia și,
respectiv, America de Sud. În anii 2001 - 2005, producția braziliană de carne de
pui a crescut cu 38,3%, ajungând la aproape 9 milioane de tone în 2005 ( FAO
2006 ). Pieptul de pui are un conținut mai mare de proteine (22 g/100 g carne) și
un conținut mai mic de grăsimi (3 g/100 g carne) decât alte părți ale puiului, cum
ar fi butioarele (18 g proteine și 5 g grăsimi/100 g). g carne) și aripioare (18 g
proteine și 18 g grăsime/100 g carne). În plus, proteina animală prezintă un
echilibru perfect de aminoacizi esențiali (sau aminoacizi indispensabili). Un
aminoacid esențial este un aminoacid care nu poate fi sintetizat de organism și,
prin urmare, trebuie să fie furnizat de dietă.

Potrivit lui Barbut (2002) , în ultimii ani au fost introduse pe piață noi produse
procesate din carne de pasăre (de exemplu, hot-dogi de pasăre), din cauza
prețurilor scăzute ale materiilor prime. Pentru a fi competitivă, industria
păsărilor de curte trebuie să dezvolte noi produse care să satisfacă cerințele
emergente ale consumatorilor și să crească profitabilitatea. Astfel, hidroliza
proteică a cărnii de pui ar putea fi o soluție alternativă pentru obținerea de
produse cu valoare adăugată.

Hidroliza proteinelor poate fi realizată folosind enzime, acizi sau alcaline, dar
hidroliza enzimatică este puternic preferată față de metodele chimice pentru
producerea de hidrolizate pentru aplicații alimentare. Enzimele proteolitice sunt
folosite pentru a dizolva sau a descompune proteina musculară din carne,
rezultând 2 fracții distinse, fracțiunile solubile și insolubile. Fracția insolubilă
poate conține grăsimi și alte materiale nedorite și poate fi utilizată în hrana
animalelor. Fracția solubilă conține proteina hidrolizată cu profile peptidice bine
definite și un conținut scăzut de grăsimi. În timpul acestui proces, se eliberează
aminoacizi, sporind aroma cărnii. Hidrolizatele de proteine pot fi utilizate ca
potențiatori de aromă, ingrediente funcționale sau pur și simplu aditivi nutritivi
pentru alimente de calitate scăzută a proteinelor.

Hidrolizatele de proteine sunt aplicate în principal în managementul nutrițional

al persoanelor care nu pot digera proteinele întregi/integre. Hidrolizatele bogate
în peptide cu greutate moleculară mică, în special di- și tri-peptide cu cât mai
puțini aminoacizi liberi, s-au dovedit a avea mai multe utilizări dietetice datorită
valorilor lor nutriționale și terapeutice ridicate ( Bhaskar și alții 2007 ).
Proteinele hidrolizate extensiv prezintă, de asemenea, reactivități imunologice
reduse și pot fi utilizate în formule pentru sugari hiperalergici ( Mahmoud 1994).
În plus, peptidele, fiind ușor absorbite, pot fi o sursă optimă de azot în
alimentația sportivă, iar peptidele cu valoare biologică ridicată sunt atractive ca
supliment proteic general într-o varietate largă de diete (Sližytė și alții 2005 ).

Proteoliza enzimatică și dizolvarea proteinelor din diverse surse au fost

studiate pe larg, cum ar fi din somon roșu, deșeuri de procesare a creveților,
catla, masă viscerală de oaie, crap de iarbă și melc de noroi (Sathivel și alții
2005; Holanda și Netto 2006 ; Bhaskar și alții 2007, 2008 ; Wasswa și alții 2007
; Xia și alții 2007 ). Cu toate acestea, puține informații sunt disponibile cu privire
la hidroliza enzimatică a cărnii de pui.

Cele mai importante variabile în reacția enzimatică au fost raportate a fi

concentrația și specificitatea enzimei, temperatura de reacție și pH-ul și natura
substratului proteic (Adler-Nissen 1985 ) . Este important să știm care dintre
acești factori sunt critici, deoarece optimizarea parametrilor procesului pentru
hidroliza enzimatică a cărnii este esențială pentru dezvoltarea unui proces
economic și optim.

Metodologia suprafeței de răspuns a fost folosită în investigațiile industriale

și în alte procese, datorită utilizării sale practice în optimizarea acestora.
Această metodologie presupune utilizarea tehnicilor de proiectare experimentală
pentru a investiga și a învăța despre forma funcțională a unui proces care implică
una sau mai multe variabile dependente influențate de diverși factori sau
variabile independente (Box și alții 1978 ) . Diverși autori au folosit această
tehnică pentru a studia hidroliza enzimatică a deșeurilor viscerale de catla
( Bhaskar și alții 2008 ), melc de nămol ( Xia și alții 2007 ), concentrat solubil de
pește ( Nilsang și alții 2005 ) și subprodusele de somon ( Gbogouri și alții 2005).
2004 ).Obiectivul prezentei lucrări a fost de a evalua influența variabilelor
asupra hidrolizei enzimatice a cărnii de piept de pui. Obiectivele specifice au
fost (1) modelarea influenței temperaturii, raportului enzimă:substrat și pH-ului
asupra gradului de hidroliză și recuperare a proteinelor; (2) să optimizeze
reacția pentru a obține gradul maxim de hidroliză și recuperare a proteinelor
folosind metodologia suprafeței de răspuns; şi (3) să se caracterizeze
hidrolizatul obţinut în condiţiile optimizate.
 2. Materiale și metode

Material

Pieptul de pui congelat a fost achiziționat de la Doux Frangosul Industry

(Muntenegru, Brazilia). Principalele caracteristici ale cărnii, obținute conform
AOAC (1995) , sunt rezumate în Tabelul 1 .

Tabelul 1-. Compoziția chimică a cărnii de piept de pui.

Analiză (%, bază umedă) Conţinut
Umiditate 74,10 ± 0,14
Proteine 19,36 ± 0,94
Gras 1,55 ± 0,12
Frasin 1,10 ± 0,01
Valorile reprezintă medii a 3 determinări ± abateri standard.

Pentru hidroliza enzimatică a fost utilizată proteaza comercială Alcalase®

2.4L (Novozymes, Bagsvaerd, Danemarca), care este o serin endopeptidază
obţinută din Bacillus licheniformis , cu o activitate declarată de 2,4 AU/g.

Hidroliza enzimatică

Experimentele de hidroliză au fost efectuate într-un reactor agitat controlat

termostatic de 500 ml utilizând procedura pH-stat, așa cum este descrisă de
Adler-Nissen (1985). Probele au fost decongelate peste noapte. Tendoanele,
nervii, pielea și grăsimea vizibilă au fost îndepărtate din carne, care a fost apoi
fragmentată, măcinată într-un robot de bucătărie și omogenizată cu apă distilată
(raport carne:apă, 1:3 g/g). Amestecul a fost apoi încălzit la temperatura dorită
şi pH-ul a fost ajustat cu NaOH 2 N. Enzima a fost adăugată la amestec și pH-ul
reacției a fost menținut constant prin adăugarea continuă de NaOH 2 N.
Cantitatea de bază consumată a fost înregistrată la intervale regulate (la fiecare
5 min în prima oră, 10 min în a 2-a oră, 15 min în a 3-a și a 4-a oră și 30 min până
la pH constant). Testele au fost efectuate în diferite condiții în ceea ce privește
temperatura (43 până la 77 °C), raportul enzimă:substrat (0,8% până la 4,2%
g/g) și pH (7,16 până la 8,84), conform tabelului 2. Procesul hidrolitic a fost
încheiat prin încălzirea amestecului la 85 °C timp de 20 de minute, asigurând
inactivarea enzimei. Timpul total pentru hidroliză a variat de la 0,5 la 6 ore, în
funcție de condițiile de rulare experimentale. Suspensia rezultată a fost
centrifugată la 3500 rpm (Beckman Coulter, model Allegra 25R, Fullerton,
California, SUA) timp de 20 de minute pentru a separa lipidele prezente.

Tabelul 2-. Plan experimental (cod și valori reale) pentru gradul de hidroliză și
recuperarea proteinelor din proteoliza cărnii de pui cu ajutorul Alcalase.

Variabile independente Variabile

Punct de Real Codificat dependente
proiectare T ES pH T ES pH DH RELATII CU
(°C) (%) (%) PUBLICUL(%)
1 50 1.5 7.50 −1 −1 −1 21.99 80,21
2 70 1.5 7.50 1 −1 −1 13.88 64,26
3 50 3.5 7.50 −1 1 −1 33,79 90,69
4 70 3.5 7.50 1 1 −1 13.75 66,37
5 50 1.5 8.50 −1 −1 1 25.19 83.16
6 70 1.5 8.50 1 −1 1 6,71 34,72
7 50 3.5 8.50 −1 1 1 30.31 91,82
8 70 3.5 8.50 1 1 1 9.40 48,57
9 43 2.5 8.00 −1,68 0 0 25.31 86,38
10 77 2.5 8.00 1,68 0 0 4,52 34,56
11 60 0,8 8.00 0 −1,68 0 19.84 77,60
12 60 4.2 8.00 0 1,68 0 30.94 90,66
13 60 2.5 7.16 0 0 −1,68 37,80 85,24
14 60 2.5 8,84 0 0 1,68 27.12 87,82
15 60 2.5 8.00 0 0 0 26.79 89,85
16 60 2.5 8.00 0 0 0 26.05 87.09
17 60 2.5 8.00 0 0 0 25.31 88,92
T = temperatura; ES = raport enzimă:substrat; DH = gradul de hidroliză; și

PR = recuperarea proteinelor.

Design experimental

Un design central rotativ compozit cu 3 variabile a fost utilizat pentru a evalua

influența variabilelor independente, temperatura, raportul enzimă:substrat și
pH-ul, asupra gradului de hidroliză și recuperare a proteinei, așa cum se arată în
Tabelul 2 .
 S-a presupus că a existat o funcție matematică ϕ pentru variabila de răspuns
Y în ceea ce privește variabilele independente:

(1)

unde β 0 , β i , β ii și β ij sunt coeficienții de regresie constanți, liniari, pătratici

și, respectiv, încrucișați ai modelului, iar X i și X j reprezintă variabilele
independente în valori codificate.

Determinarea gradului de hidroliză

Gradul de hidroliză (DH) a fost obținut prin metoda pH-stat și definit ca

raportul procentual dintre numărul de legături peptidice scindate ( h ) și numărul
total de legături disponibile pentru hidroliza proteolitică (h total)(AdlerNissen
1985). S-a calculat după următoarea ecuație:

(2)

unde B este consumul de NaOH (mL) pentru a menține pH-ul constant în timpul
reacției; N b este normalitatea bazei; MP este masa proteinei (g, N × 6,5); h
total este numărul total de legături peptidice din substratul proteic (7,6 mEq/g
proteină); și α este gradul de disociere al grupărilor α-NH2 exprimat ca:

(3)

Valoarea pK variază semnificativ cu temperatura și poate fi estimată după cum

urmează ( Kristinsson și Rasco 2000 ):

(4)

unde T este temperatura (K).

Determinarea recuperării proteinelor

Recuperarea proteinei, sau raportul dintre procentul de proteină din hidrolizat

și cel din substratul original, a fost utilizat ca indice de dizolvare a proteinei și
calculat folosind următoarea ecuație:
 (5)

unde PR este recuperarea proteinei (%); MP este masa de proteină prezentă în

substratul original (g); MP s este masa de proteină prezentă în supernatant (g);
MP p este masa de proteină prezentă în precipitat (g); x s este conținutul de
proteine din supernatant (g proteină/100 g supernatant); x p este conținutul de
proteine din precipitat (g proteină/100 g precipitat); M s este masa
supernatantului (g); iar M p este masa precipitatului (g).

Conținutul de proteine din supernatant și din precipitat a fost determinat prin

metoda Kjeldahl (AOAC 1997).

Compoziția de aminoacizi

Compozițiile de aminoacizi ale cărnii de pui și hidrolizatului proteic au fost

determinate prin digestie în HCI 6 N/fenol 0,1% la 110 °C timp de 20 de ore,
conform metodei Pico-Tag așa cum este descrisă de White și alții (1986 ) . După
hidroliza acidă, derivatizarea probei a fost inițiată prin adăugarea a 20 μL dintr-
o soluție de etanol:apă:trietilamină:fenilizotiocianat (7:1:1:1, v/v), care a fost
amestecată folosind un mixer vortex și lăsată să stea la temperatura camerei
timp de 20 min. Identificarea aminoacizilor a fost efectuată prin cromatografie
lichidă de înaltă performanță folosind o coloană cu fază inversă (Pickering
Laboratories, model PCX 3100, Mountain View, California, SUA).

Conținutul de triptofan a fost determinat după hidroliza enzimatică a probei,

folosind Pronase la 40 ° C timp de 24 de ore, urmată de o reacție colorimetrică
cu p-dimetilaminobenzaldehidă și acid sulfuric 21,2 N la întuneric la 25 ° C timp
de 6 ore. Apoi s-a adăugat 0,045% azotit de sodiu, iar transmisia citită la 590
nm după 30 de minute utilizând un spectrofotometru (model DU640, Beckman
Coulter) ( Spies 1967 ).

Electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-

PAGE)

Electroforeza SDS-PAGE a fost efectuată pe hidrolizatul proteic și pe carnea

de pui conform Schagger și Jagow (1987) pentru proteine și peptide cu greutăți
moleculare sub 26,6 kDa și conform lui Laemmli (1970) .) pentru molecule cu
greutăți moleculare mai mari de 14,4 kDa. A fost utilizat un gel de stivuire de
4%, iar gelurile de separare au fost de 15,5% și, respectiv, 12% pentru fiecare
metodă. Greutatea moleculară aparentă a fiecărei benzi de proteine a fost
estimată folosind markeri de greutate moleculară. Standardele cu greutate
moleculară mică (Sigma Chemical Co., Saint Louis, Mo., SUA) au inclus
triozofosfat izomeraza din mușchiul de iepure (26,6 kDa), mioglobina din inima
de cal (17,0 kDa), α-lactalbumină din lapte de bovină (14,2 kDa), și aprotinină din
plămânul de bovine (6,5 kDa). Standardele cu greutate moleculară ridicată (Bio-
Rad Laboratories, Hercules, California, SUA) au inclus fosforilaza b (97,4 kDa),
albumină serică (66,2 kDa), ovalbumină (45,0 kDa), anhidrază carbonică (31,0
kDa), inhibitor de tripsină (21,5 kDa). kDa) și lizozimă (14,4 kDa).

Analize statistice

Pentru a obține coeficienții de regresie a fost efectuată o analiză a varianței

(ANOVA) folosind pachetul software Statistica 5.0 (Statsoft, Tulsa, Okla.,
USA). Doar variabilele cu un nivel de încredere peste 90% ( P < 0,1) au fost
considerate semnificative. Metodologia suprafeței de răspuns (RSM) a fost
utilizată pentru a optimiza hidroliza enzimatică pentru gradul maxim de hidroliză
și recuperarea proteinelor.

Rezultatele compoziției totale de aminoacizi a cărnii de piept de pui și a

hidrolizatului proteic obținut în condiții optime au fost analizate prin testul
ANOVA și Tukey, folosind același pachet software.

3. Rezultate și discuții

Design experimental

Datele experimentale au fost obținute folosind 17 combinații ale variabilelor

independente: temperatură, raport enzimă:substrat și pH, așa cum se arată în
Tabelul 2 .

Neglijând termenii nesemnificativi ( P > 0,1), Tabelul 3 prezintă efectele

factorilor semnificativi asupra răspunsurilor: gradul de hidroliză și recuperarea
proteinelor. S-a observat că toți factorii liniari și pătratul temperaturii au fost
semnificativi ( P ≤ 0,1) în ceea ce privește gradul de hidroliză. Cu toate acestea,
ceilalți factori au prezentat valori P ridicate și, prin urmare, nu au putut fi
considerați semnificativi. Analizând recuperarea proteinei de răspuns, doar
factorii temperatură, (L) și (Q), ES (L) și T × pH (I) au fost semnificativi la
P≤ 0,1, factorul de temperatură (L) prezentând un efect mai mare decât ceilalți
factori. Deși pH (L) nu este semnificativ statistic la un nivel de încredere de
90%, termenul a fost inclus în model odată ce termenul încrucișat T × pH (I) este
semnificativ.

Tabelul 3—. Efecte estimate și valori P pentru răspunsurile gradului de hidroliză

și recuperare a proteinelor, după excluderea termenilor nesemnificativi.
Factori Efect Eroare Valoarea P
estimat
Gradul de hidroliză
Rău 26,2741 1,3682 < 0,0001
T (L) −7,5057 1,1247 < 0,0001
T (Q) −4,9762 1,1515 0,0001
ES (L) 2,7933 1,1247 0,0288
pH (L) −2,1792 1,1247 0,0766
Recuperarea proteinelor
Rău 83,9588 2,0362 < 0,0001
T (L) −32.1027 3,3476 < 0,0001
T (Q) −20,4296 3,4323 < 0,0001
ES (L) 8,3608 3,3476 0,0296
pH (L) −5,7055 3,3476 0,1163
T × pH −12,8550 4,3718 0,0134
T = temperatura; ES = raport enzimă:substrat; DH = gradul de hidroliză;

PR = recuperarea proteinelor; (L) = liniar; și (Q) = pătrat.

Rezultatele din designul experimental au fost ajustate la un model de regresie

de ordinul 2 în T, ES și pH. Modelul a fost testat pentru adecvarea și „bunătatea
potrivirii” prin ANOVA fără a lua în considerare termenii nesemnificativi ( P ≥
0,1), așa cum se arată în Tabelul 4 . Când valoarea Fc este mai mare decât
valoarea Ft , variația este explicată prin regresie și nu prin reziduu . Astfel,
regresia este semnificativă și modelul poate fi considerat predictiv.

Tabelul 4—. Analiza varianței pentru răspunsurile gradului de hidroliză și

recuperarea proteinelor.
Sursă SS DF DOMNIȘOARĂ Fc Ft*
Gradul de hidroliză
Regresia 1263,42 4 315,85 18.2 2.48
Rezidual 207.31 12 17.28 - -
Lipsa de potrivire 206.22 10 20.62 - -
 Pură eroare 1.09 2 0,55 - -
Total 1470,73 16 - - -
Recuperarea proteinelor
Regresia 5549,90 5 1109,98 29.04 2.45
Rezidual 420,50 11 38.23 - -
Lipsa de potrivire 416,56 9 46,28 - -
Pură eroare 3,94 2 1,97 - -
Total 5970,41 16 - - -
SS = suma pătratelor; DF = grade de libertate; MS = pătrat mediu; F c = valoarea
calculată a distribuției F ; și Ft = valoarea distribuției F tabelată ( P ≤ 0,1).

Au fost propuse modele polinomiale de ordinul doi pentru a explica gradul de

hidroliză și recuperarea proteinelor în termeni de variabilele codificate, așa cum
se arată în Eq. 6 și 7 :

(6)

(7)

unde DH este gradul de hidroliză (%), PR este recuperarea proteinei (%), T este
temperatura (valoarea codificată) și ES este raportul enzimă:substrat (valoarea
codificată) .

Valorile coeficienților de determinare R 2 ale modelului ajustat au fost 0,8590

și, respectiv, 0,9296 pentru gradul de hidroliză și, respectiv, de recuperare a
proteinei, indicând că modelele explică 85,90% și 92,96% din variația totală.

4. Concluzii
Hidroliza enzimatică a cărnii de piept de pui a evidențiat influența variabilelor
procesului: temperatură, raport enzimă:substrat și pH asupra răspunsurilor
gradului de hidroliză și refacerii proteinelor. În condițiile optimizate
(temperatura de 52,5 °C, raport enzimă:substrat de 4,2% g/g și pH 8,00),
hidroliza cărnii de piept de pui folosind Alcalase a dus la un grad de hidroliză și
recuperare a proteinelor de aproximativ 31% și 91%. %, respectiv. Profilurile
SDS-PAGE au arătat că mai multe benzi de proteine prezente în carne au fost
scindate după reacția de hidroliză. Compoziția de aminoacizi a hidrolizatului a
arătat niveluri ridicate de acid glutamic, acid aspartic, lizină și leucină. Nu au
existat aminoacizi limitatori în hidrolizat, iar aminoacizii esențiali au fost
prezenți în cantități adecvate sau excesive, conform standardului proteic
recomandat de FAO/OMS. Hidrolizatul cărnii de piept de pui a arătat un
potențial bun pentru aplicații precum suplimentarea cu proteine în sistemele
alimentare.