185

Capitolul VII. Determinarea activitii antioxidante/antiradicalice

a inhibitorilor

VII.1. Activitatea antioxidant a reductorilor naturali
Numeroase studii experimentale i epidemiologice au demonstrat c antioxidanii
prezeni n alimente pot inhiba cancerigeneza prin influena lor la nivel molecular n
etapa de iniiere, promovare i progresie. Dintre aceti compui n ultimii ani s-au stu-
diat polifenolii, constitueni ai plantelor. Activitatea antioxidant a polifenolilor este
determinat de prezena grupelor hidroxilice n inelul B n poziiile 3' i 4' i, ntr-o
msur mai mic de grupa hidroxilic din inelul C n poziia 4'. Flavonolii, n special
catehina, cvercetina, kempferolul i glucozidele lor, sunt constitueni ai ceaiului verde
i negru [434], vinului rou [434]. Dietele bogate n fructe i legume, struguri, posed
efect protector n bolile cardiovasculare, n diferite forme de cancer [436,437], methe-
moglobinemie, au efecte antiinflamatoare, antimutagene [438] .a. Aceste efecte pro-
tectoare au fost atribuite n mare msur antioxidanilor ce includ, n afar de flavo-
noizi, de asemenea caratenoizi, vitaminele C i B. Majoritatea constituenilor polife-
nolici din produsele alimentare (flavonoli ca cvercetina i kempferolul, flavone ca
luteolina, flavanoli ca (+)-catehina, antocianidinele de exemplu, cianidina, malvidi-
na i glicozidele lor) prezint eficien major n comparaie cu antioxidanii nutrieni:
vitamina C, E, -carotene, care sunt uor adsorbii n intestin [439]. Strugurii i vinul
conin concentraii nalte de antioxidani. Din studiul activitii antioxidante totale medii
a vinului rou s-a constatat c 54,76% este determinat de contribuia catehinei i a
epicatehinei, care alctuiesc n jur de 63,54% din constituenii fenolici (191 i 82 mg/l,
respectiv) [439].









Fig. VII.1. Structura chimic a catehinelor prezente n ceai i n vin.
Catehine (R
1
- OH, R
2
- H), galocatehine (R
1
- OH, R
2
- OH), catehingalat (R
1
- GA, R
2
- H),
galocatehingalat (R
1
- GA, R
2
- OH).

Prezena grupelor orto-dihidroxilice n inelul B confer catehinelor abilitatea de
a capta radicalii [430]. Adiia gruprii galat- n poziia 3 a inelului C al catehinelor
mrete efectul de captare a radicalilor. Principalii metabolii ai (-)-epicatehinei (EC)
i ai (+)-catehinei, identificai n plasm dup administrarea oral, sunt (-)-epicatehin-
5-o--glucuronide i (+)-catehin-5-o--glucuronide [431]. Aceste glucoronide conju-
gate prezint efect de captare a radicalilor comparabil cu substanele iniiale, deoa-

186

rece gruprile orto-dihidroxilice n poziiile 3- i 4- din inelul B nu sunt substituite.
Dimpotriv, metilarea n poziia 3- a grupei hidroxile a inelului B cu obinerea 3-o-
metil-(-)-epicatehin-5-o--glucuronide i 3-o-metil-(+)-catehin-5-o--glucuronide a
dus la scderea activitii de captare a superoxizilor.
Metaboliii epigalocatehingalatului (EGCG) exercit efecte antioxidative similare
cu compuii lor neconjugai, determinate de prezena grupei di- sau trihidroxil n
inelul B sau n grupa component galat. Metaboliii izolai i determinai n urin,
(-)-5-(3,4,5-trihidroxifenil)--valerolactona i (-)-5-(3,4-dihidroxifenil)--valerol-
actona, posed proprieti antioxidante [432]:

Polifenolii sunt captatori eficieni ai radicalilor liberi n diferite sisteme in vitro.
Abilitatea compuilor de a capta radicalii este parial determinat de potenialul de
reducere a unui electron, care este o msur a reactivitii antioxidanilor, ca donori
de hidrogen sau electron [4]. Un potenial sczut de reducere indic la faptul c se
cheltuie energie mai puin pentru donarea hidrogenului sau electronului i este un
factor determinant n activitatea antioxidant. Din Tabelul VII.1 constatm c EGCG
(0,43 V) i EGC (0,43 V) [446] au un potenial de reducere mai mic dect vitamina E
(0,48 V), ceea ce denot c ei sunt donori de electroni mai activi dect vitamina E [434].
Totui, vitamina C are un potenial de reducere semnificativ mai mic (0,28 V) dect
toi polifenolii.
n adiia hidrogenului sau n activitatea donatoare de electron, eficiena antioxi-
danilor este, de asemenea, determinat prin viteza interaciunii lor cu radicali liberi ce
se introduc n sistem (constanta vitezei de captare) i stabilitatea radicalului antioxidant
rezultat. Bazndu-se pe studiile experimentale, care permit compararea reactivitii
unui ir de flavonoizi cu radicalul hidroxil (OH), anionul superoxid (O
2
-
) i radicalul
azid (N
3
), Bors i Michel [435] concluzioneaz c catehinele sunt ageni superiori de
(VII.1)
Acid galic

187

captare a radicalilor n comparaie cu flavonolii monomerici i flavonele, reprezentnd
principalii antioxidani n vinul rou i ceai.
Tabelul VII.1
Potenialul de reducere i activitate antioxidant a inhibitorilor

Astfel, o importan mare asupra proprietilor inhibitoare ale polifenolilor are
gradul de polimerizare, care crete odat cu galoilarea. Fraciile polifenolice extrase
din struguri, cu un grad diferit de polimerizare, au avut un efect antioxidant/antiradicalic
i antiproliferativ diferit [435]. Soluiile de polifenoli extrase din struguri au fost frac-
ionate cu RP-HPLC n dou fracii cu grad de polimerizare diferit. Activitatea anti-
oxidant/antiradicalic determinat prin testul DPPH pentru fracia polifenolic din
struguri, compus din monomeri i oligomeri mici, a fost mai nalt n comparaie cu
fracia care includea flavonoli i oligomeri procianidinici cu mas molecular mare.
Activitatea de captare a radicalilor formai din catehinele ceaiului au fost exami-
nate pentru diferite sisteme in vitro. Studiul determinrii activitii antiradicalice a ca-
tehinelor prin metoda spectrometric (RES) a demonstrat eficiena de captare a oxige-
nului singlet (
1
O
2
),O
2
-
, OH i a radicalului peroxil HO
2
[436,438].
Prin generarea radiolitic a speciilor de oxigen reactiv n prezena diferitelor cate-
hine, ce sunt constitueni activi ai ceaiului, s-a constatat c paguba ADN, produs de
aceste particole reactive, se micoreaz cel mai mult n prezena EGCG [440]. Astfel,
66% din activitatea antioxidant a ceaiului verde este determinat de epigalocatehin
i epigalocatehingalat, ceea ce este n corespundere cu coninutul acestor compui n
ceaiul verde (20,44% din 26,71% de polifenoli totali). n majoritatea sistemelor exami-
nate, EGCG a fost un captator de radicali mai eficient dect ECG, EGC sau EC, deoa-
rece grupa trihidroxil n inelul B i componenta galat n poziia 3 a inelului C mresc
activitatea antioxidant a catehinelor n diferite sisteme.
Extracte apoase din frunze de Peumus boldus conin catehine i alcaloizi n raport
de 37:1 i sunt utilizate n complicaiile hepatice. Activitatea antiradicalic a acestor
extracte, determinat prin testul cu DPPH, se datoreaz n majoritate coninutului de
catehine [457], care este cu mult mai nalt dect coninutul de alcaloizi.
Antioxidant
Potenial de reducere
(pH 7, 20C)
Activitatea antioxidant,
mM TEAC
(-)-Epicatehina 0,57 2,4 0,02
(-)-EGC 0,43 3,8 0,06
(-)-ECG 0,53 4,9 0,02
(-)-EGCG 0,43 4,8 0,02
Teaflavin 0,51 2,9 0,08
Teaflavin digalalt 0,54 6,2 0,43
Ceai verde (1 ppm) - 3,8 0,03
Ceai negru - 3,5 0,03
Vitamina E 0,48 1,0 0,03
Vitamina C 0,28 1,0 0,02

188

La fel, au fost investigate extractele obinute din plante aromatice i medicinale
(salvia, lavandula, calendula, echinaceea .a.) prin utilizarea testului cu DPPH i ABTS
[458]. S-a constatat c aceste extracte posed activitate foarte nalt de captare a radi-
calilor liberi, n special Salvia officinalis. A fost observat corelarea ntre activitatea
antiradicalic a extractelor i coninutul total de compui fenolici.
Radicalii stabili ca 1,1-difenil-2-picrilhidrazil radical (DPPH) i ABTS
+
radical-
cation (2,2-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-acid sulfonic) sunt utilizai pentru evaluarea
activitii antioxidante ale flavonoizilor in vitro. Utilizarea testului de activitate antioxi-
dant echivalent Trolox (AAET) a demonstrat c catehinele i teaflavina sunt mult mai
efective n reducerea cation-radicalului ABTS
+
dect vitamina E i vitamina C [439].
Rice-Evans i alii [439] au studiat activitatea antioxidant total (AAT) i activitatea
antioxidant echivalent Trolox (AAET) pentru polifenolii ce se conin n ceaiul verde,
negru i n vinul rou.
AAET msoar concentraia soluiei de Trolox (mM) cu un potenial antioxidant
echivalent la o concentraie standard a compusului supus cercetrii. Autorii au constatat
c activitatea antioxidant a constituenilor polifenolici ai ceaiului verde (Tab. VII.1)
n corelare cu coninutul lor n ordinea descreterii activitii antioxidante este: epiga-
locatehin (34%) epigalocatehingalat (32%) >> epicatehingalat (7%) epicatehin
(6%) > catehin (1%) [439].
Catehinele au fost mult mai eficiente i n captarea radicalului DPPH, conform
irului: EGCGECG>EGC>EC [436,437]. Astfel, constatm c prin ambele metode
(testul cu DPPH radical i ABTS
+
radical-cation) au fost obinute rezultate similare.
Supraproducerea oxidului de azot(II) i a peroxinitrilului (ONOO
-
), produs al
interaciunii rapide ntre O
2
-

i ON, este bine asociat cu inflamaiile cronice i poate
fi asociat cu etiologia i patologia bolilor cronice.
Studii efectuate in vitro au definit potenialul antioxidant al polifenolilor ca para-
metru ce determin capacitatea de captare a radicalilor liberi, cum ar fi radicalii super-
oxizi (O
2
-
), oxigenul singlet (
1
O
2
), radicalul hidroxil (OH), radicalul peroxil (HO
2
),
monooxidul de azot (ON) i peroxinitritul (ONOO
-
), care, la rndul lor, stau la baza
apariiei diferitelor patologii. Structurile chimice ce contribuie la activitatea antioxi-
dant a polifenolilor (structura vecinal dihidroxi- sau trihidroxi-) posed proprietatea
de chelare a ionilor de metal prin formarea complecilor i de a preveni generarea ra-
dicalilor liberi. Aceast structur de asemenea permite delocalizarea electronilor, con-
ferind reactivitate nalt de distrugere a radicalilor liberi.
S-a demonstrat c flavonoizii, inclusiv catehinele, sunt eficiente n captarea NO
in vitro [440]. Ceaiul verde i ceaiul negru au manifestat proprietatea de captare a NO
in vitro, ns ceaiul verde a fost de aproape cinci ori mai puternic dect ceaiul negru
[441]. Inhibiia nitrozrii tirozinei a fost investigat ca un etalon al activitii de captare
a ONOO
-
de ctre flavonoizi. n acest test, catehinele ceaiului au fost cu mult mai efec-
tive dect vitamina E. EGCG, ECG i acidul galic au manifestat proprieti egale de
inhibiie n procesul de nitrozare a tirozinei, dar mai nalte ca EGC i EC, sugernd astfel
c componenta galat a fost structura important n interaciunea cu ONOO
-
. Adiional,

189

EGCG a manifestat proprieti inhibitorii mai puternice n formarea 8-hydroxy-2-
doexyguanosine, care este un produs al interaciunii speciilor active de azot (ONOO
-
)
cu ADN, dect vitamina C i glutationul [442]. Mecanismul exact al activitii inhibi-
torii nu este cunoscut, dar se pare c cteva structuri sunt importante n conferirea
acestei activiti. Toate catehinele au grupa dihidroxilic (o-3,4-OH) n inelul B care
particip n delocalizarea electronului i la stabilizarea formei radicalice [443]. Galo-
catehinele (EGC i EGCG) au grupa trihidroxilic n inelul B (3,4,5-OH), n timp ce
catehingalaii (EGC i EGCG) au componenta galat esterificat n poziia 3 a inelului C
i 3 grupri hidroxile. Componenta galat mpreun cu 3 grupri hidroxile (3,4,5-OH)
este asociat cu creterea activitii antioxidante [436]. Studiile efectuate n domeniul
oxidrii produselor cu radicalul peroxil (HO
2
) n prezena galocatehinelor au constatat
c gruparea 3,4,5-OH din inelul B este principala poziie n proprietatea antioxidant
a EGC i EGCG [444,445].
Radicalii liberi n diferite sisteme se pot forma n rezultatul descompunerii per-
oxidului de hidrogen n prezena diferitelor metale: Fe
2+
, Cu
2+
, Cr
3+
.a. n rezultatul re-
ducerii H
2
O
2
prin reacia Fenton n prezena Cr
3+
(care este toxic i cauzeaz genotoxi-
citate), se formeaz radicalul OH

:
Cr(III) + H
2
O
2
Cr(IV) + OH

+ OH
-
(VII.2)
Radicalul hidroxil format in vivo iniiaz paguba oxidativ a ADN cu formarea
8-OH-dG, care este un biomarcher n acest proces [441]. n rezultatul studiului, Silvia
Lopez-Burillo i al. [441] au constatat c antioxidanii inhib procesele oxidative ale
ADN. Dintre polifenolii studiai n [441] cel mai nalt efect inhibitor l posed (-)-epi-
galocatehin-3-galatul (EGCG) n concentraie de 1 M i mai mare, care reduce for-
marea 8-OH-dG. Catehinele ceaiului pot forma compleci stabili cu Cu(II) i Cr(III)
i, n rezultat, are loc generarea radicalilor OH

[442]. Dar, s-a constatat c n cazul

EGCG radicalii OH

sunt scindai de gruparea galat existent n complex i astfel nu se

manifest efectul prooxidant al acestui compus [443].
Ceaiul verde i cel negru poate inhiba oxidarea lipoproteinelor indus de Cu
2+

[442]; astfel, contribuie la prevenirea arterosclerozei i a altor boli cardiovasculare.
Inhibiia acestui proces este determinat de faptul c polifenolii pot chela metalele i
micora astfel concentraia formelor active ale oxigenului, care, la rndul su, particip
la oxidarea proteinelor.
Antocianidinele i catehinele au fost testate pentru activitate inhibitorie in vitro
asupra enzimelor ciclooxigenaze (COX), care activeaz creterea celulelor cancerigene
i influeneaz proliferarea celulelor de cancer uman [434]. S-a constatat c cel mai
puternic efect inhibitor al enzimelor COX posed cianidina, care are n inelul B grupele
3',4'-dihidroxilice. Activitatea inhibitoare a descrescut pentru delfinidin i pelargoni-
din, care au grupri 3',4',5'-trihidroxilice i 4'-hidroxilic n inelul B, respectiv. Din
punctul de vedere al legturii dintre structur i activitate, numrul i poziia gruprilor
hidroxilice n inelul B al antocianidinelor influeneaz activitatea inhibitoare a acestor
compui. Pentru catehine cis-, trans-izomeria i epimerizarea nu au influenat semnifi-
cativ activitatea inhibitoare asupra enzimelor COX, dar prezena grupelor galoil n

190

structura catehinelor a influenat mai mult activitatea lor inhibitoare asupra enzimelor
COX. Din rezulatele obinute n inhibiia proliferrii celulelor de cancer sub aciunea
antocianidinelor i catehinelor, s-a constatat c gradul de inhibiie este mai nalt pentru
derivaii galoil ai catehinelor [434] (galocatehina 95%, epigalocatehina 100% i
galocatehingalat 97%), iar pentru antocianidine n jur de 75%.
S-a constatat c unii colorani naturali pot fi antioxidani nutriionali importani i
prezena lor n alimente la fel poate reduce riscul bolilor cardiovasculare, al cancerului
[448-450]. Mai multe cercetri s-au axat pe studierea a astfel de colorani naturali cum
sunt carotenoidele, antocianidinele i curcuminoizii, care au manifestat proprieti anti-
oxidante, antiinflamatorii, antibacteriene (antivirale), anticancerigene i efecte antitumo-
rale [451,452]. Colorani naturali importani sunt betalainele care se conin n sfecla roie.
Studii recente [453,454] au demonstrat c betalainele din sfecla roie posed efect anti-
radicalic i activitate antioxidant mai nalt dect carotenoizii. Concentraia inhibitoare
IC
50
a betaninei pentru oxidarea proteinelor cu densitate sczut este mai superioar
dect a catehinei, adic betanina are activitate antioxidant mai nalt dect (+)-catehina.
Dei betalainele (betanina, betaxantina, izobetaina, amarantina) nu sunt flavo-
noizi, ele conin grupa o-difenol-monoglicozidic i gruparea amino-, manifestnd
astfel foarte bune proprieti electrodonoare [454]. Moleculele de betalaine sunt foarte
buni donori de electroni, deoarece conin grupe hidroxile (-OH), aminogrupri (=NH)
i grupe tiolice (-SH). Activitatea antioxidant/antiradicalic pentru diferite betalaine
depinde de structura chimic i crete odat cu creterea numrului grupelor hidroxili-
ce i aminogrupelor din molecul, iar glicozilarea reduce activitatea lor antiradicalic
[455]. Un captator de radicali liberi n sisteme biologice este acidul uric [456].
VII.2. Metode de evaluare a activitii antioxidante/antiradicalice
a inhibitorilor prin testul cu radicalul DPPH

S-a studiat activitatea antioxidant/antiradicalic a diferiilor inhibitori: cverce-
tina (Cv), rezveratrolul (Rezv), acidul dihidroxifumaric (DFH
4
), esterul dimetilic al aci-
dului dihidroxifumaric (EDMD) i extracte din semine de
struguri (Eneox extract enotaninic neoxidat, ENOXIL
extract enotaninic oxidat). n acest scop a fost utilizat testul
DPPH, care include determinarea variaiei concentraiei
radicalului DPPH n rezultatul interaciunii lui cu com-
ponenii antioxidani. Utilizarea DPPH-radicalului (2,2-
difenil-1-picrilhidrazil) (Fig.VII.2) permite de a determina
activitatea antioxidant/antiradicalic a compuior puri i
a extractelor din produse vegetale dup variaia concen-
traiei de DPPH ce se consum dup urmtorul mecanism:
DPPH + RedH
2
DPPH-H + RedH
DPPH
Red + DPPH-H (VII.3)
Abilitatea compuilor de a capta radicali este determinat de proprietatea lor de a ceda
electroni sau hidrogen, adic de mrimea potenialului de reducere al antioxidanilor. Cu
ct mai mic este potenialul de reducere cu att mai activ este antioxidantul (Tab. VII.1).
Fig. VII.2. Structura
chimic a DPPH

-radicalului
(2,2-difenil-1-picrilhidrazil).

191

n studille experimentale a fost determinat activitatea antiradicalic a antioxi-
danilor dup variaia concentraiei DPPH n soluie alcoolic (75%). Descreterea
absorbanei a fost determinat la = 517 nm la 1, 5, 10 minute, timp de dou ore. n
procesul experimental concomitent se obinea curba cinetic nul (fr antioxidant),
care indic variaia concentraiei DPPH n timp. Pentru fiecare antioxidant s-a studiat
variaia concentraiei radicalului DPPH n funcie de concentraia reductorului. Apoi
s-a calculat concentraia rezidual de DPPH (%) n funcie de timp i s-au construit
curbele cinetice. Rezultatele comportamentului cinetic al reductorilor studiai este
prezentat n Figura VII.3.










(a) (b) (c)









(d) (e) (f)
Fig. VII.3. Curbele cinetice de consum al DPPH la interaciunea cu: (a) Rezv; (b) ENOXIL;
(c) Eneox; (d) DFH
4
; (e) EDMD; (f) Cv; n soluii alcoolice de 75%; [DPPH] = 5 10
-5
M.

Evoluia reaciilor cinetice depinde de natura antioxidanilor testai. n acest con-
text exist trei tipuri de comportament [447]: 1) comportament de cinetic rapid, la care
timpul de reacie t < 1 min.; 2) comportament de cinetic intermediar (5 < t < 30 min.);
3) comportament de cinetic lent, cnd reacia decurge de la 1 h pn la 6 h i mai mult.
Din FiguraVII.3, unde sunt prezentate curbele cinetice ale variaiei concentraiei (%)
de DPPH, constatm c Rezv (a) interacioneaz foarte rapid. Astfel, rezveratrolul
poate fi clasificat ca antioxidant ce particip n reacie cu radicalii DPPH

dup un com-
portament de cinetic rapid. Ceilali inhibitori pot fi clasificai la tipul comportamen-
tului de cinetic intermediar. Conform metodei utilizate n [447], activitatea antiradi-
calic a fost evaluat din cota-parte de DPPH rmas, la echilibru. Activitatea antiradi-

192

0
20
40
60
80
100
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
[Red]/[DPPH']
DPPH', %
(+)-Ct Cv Rezv DFH4 EDMD
calic (AAR) a fost definit ca fiind cantitatea de antioxidant necesar pentru descre-
terea concentraiei iniiale de DPPH cu 50% i s-a numit concentraie eficient CE
50

(mol/L antiox./mol/L DPPH).
VII.2.1. Studiul activitii antioxidante/antiradicalice
a inhibitorilor naturali prin utilizarea testului
cu radicalul DPPH
Din datele experimentale (Fig. VII.3) constatm c concentraia de DPPH este
stabil pentru majoritatea antioxidanilor la t = 120 min. Astfel, reeind din aceste date,
am construit dependena concentraiei (%) de DPPH la 120 min. n funcie de raportul
molar al antioxidantului i DPPH (Fig. VII.4).
(a) (b)
Fig. VII.4. Dependena concentraiei (%) a DPPH de raportul molar [Red]/[DPPH]:
(a) (+)-Ct, Cv, Rezv, DFH4, EDMD; (b) ENOXIL, Eneox.

Datele obinute pentru CE
50
sunt prezentate n Tabelul VII.2. Din rezultatele expe-
rimentale obinute observm c cea mai mic CE
50
a fost pentru Eneox (CE
50
Eneox
= 0,08)
i cea mai mare pentru Rezv (CE
50
Rezv
= 0,5). O alt carecteristic mai ampl a activi-
tii antiradicalice a reductorilor este puterea antiradicalic (PAR), care se determin
ca mrimea invers a CE
50
(1/CE
50
). Conform datelor prezentate n Tabelul VII.2, PAR
pentru antioxidanii studiai variaz ntre 2,012,5. Cea mai sczut PAR s-a deter-
minat pentru Rezv (2,0) i cea mai nalt pentru Eneox (12,5). Extractul ENOXIL are
PAR
Enx
egal cu 6,7.
Valoarea stoechiometric egal cu CE
100
, determinat prin multiplicarea CE
50

cu doi, alctuiete concentraia eficient necesar pentru reducerea a 100% DPPH.
n acest caz, clasificarea eficienei antiradicalice nu va fi corect pentru compuii ce
au un comportament de cinetic lent, fiindc reacia poate s nu parcurg pn la
capt.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
[Red]/[DPPH']
[DPPH'], %
ENX Eneox

193

n Tabelul VII.2 este prezentat pentru toi reductorii studiai valoarea stoechio-
metric care variaz n limitele 0,2-1,0. La fel, s-a calculat mrimea invers a CE
100

(1/CE
100
), ce determin numrul de moli de DPPH care pot fi redui de 1 mol de
reductor.
Tabelul VII.2
Clasificarea eficienei antiradicalice n acord cu comportamentul cinetic
Comportament
cinetic
Compui
Concentraie
eficient CE
50

Valoarea
stoechiome-
tric CE
50
x2
PAR
(1/CE
50
)
Nr. de moli
DPPH redus
(1/ CE
100
)
Comportament
de cinetic
rapid (1 min.)
Rezveratrol 0,5 1,0 2,0 1,0
Comportament
de cinetic
intermediar
(5-30 min.)
ENOXIL 0,15 0,30 6,7 3,3
Eneox 0,08 0,16 12,5 6,25
Comportament
de cinetic
lent
Cvercitina 0,10 0,20 10,0 5,0
(+)-Catehina 0,11 0,22 10,0 5,0
DFH
4
0,11 0,22 10,0 5,0
EDMD 0,15 0,30 6,7 3,3

Conform datelor cuprinse n Tabelul VII.2, pentru compuii care au un compor-
tament de cinetic intermediar, 1/CE
100
coincide cu numrul de atomii de hidrogen
sau grupe hidroxile, disponibili pentru redare. Pentru cvercetin, (+)-catehin 1/CE
100

este n jur de 5, astfel o molecul de (+)-catehin reduce cinci molecule de DPPH,
ceea ce coincide cu numrul grupelor hidroxile ce particip n procesul de reducere
(primele dou etape sunt indicate n ecuaia (VII.4)):

(VII.4)

194

0
20
40
60
80
100
0 0.1 0.2 0.3 0.4
C[Red], g/L
G
r
a
d
u
l

d
e

i
n
h
i
b
i

i
e
,

%
ENX Eneox
0
20
40
60
80
100
-4.7 -4.38 -4.06 -3.74 -3.42
lg[Red]
G
r
a
d
u
l

d
e

i
n
h
i
b
i

i
e
,

%
(+)-Catehina Cvercitina Rezveratrol
DFH4 EDMD
Din rezultatele experimentale obinute s-a calculat 1/CE
100
pentru rezveratrol i
s-a constatat c o molecul de rezveratrol reduce o molecul de DPPH. Lund n
consideraie formula de structur a rezveratrolului, constatm c gruparea dihidroxi-
lipsete, adic nu avem grupe dihidroxilice vecinale. n acest caz, mecanismul de
nlturare a radicalilor este diferit fa de compuii ce conin grupe dihidroxilice sau
trihidroxilice. Activitatea antiradicalic a (+)-catehinei este mai sczut dect cea a
cvercetinei.
Valoarea stoechiometric calculat pentru DFH
4
este 0,22, iar numrul de moli de
DPPH redui de o molecul de DFH
4
este egal cu 5, dei numrul gruprilor hidroxi-
lice este egal cu 2. Gradul de inhibiie, n %, al DPPH-radicalului s-a calculat dup
formula [458]: GI = [A
control
A
test
]100/A
control
, unde A
control
este absorbana controlu-
lui (soluiei de DPPH fr reductor) i A
test
absorbana probei testate (a soluiei de
DPPH i a reductorului). Gradul de inhibiie la t = 30 min. n funcie de concentraia
inhibitorilor studiai este prezentat n Figura VII.5.
Din rezultatele experimentale obinute constatm c GI crete odat cu creterea
concentraiei reductorilor n intervlul 210
-5
510
-4
M. n cazul interaciunii radica-
lului DPPH cu DFH
4
, Cv, (+)-Ct, pentru intervalul de concentraii 210
-5
110
-4
M
avem o variaie mai mare a GI (~30-90%), iar cu creterea [Red]o > 110
-4
M gradul de
inhibiie variaz nensemnat.


Fig. VII.5. Gradul de inhibiie la t = 30 min. n funcie de concentraia
inhibitorilor studiai.

Esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric i ENOXIL (extractul din semine
de struguri oxidat) [455] interaconeaz mai lent cu DPPH i GI variaz de la ~20%
pn la ~70% pentru intervalul 210
-5
110
-4
M, dar, cu creterea n continuare a
[Red]
o
pn la 510
-4
M, GI atinge ~90% fa de control. Pentru rezveratrol creterea
GI n primul interval de concentraii ale Red crete cel mai puin (~20-35%), iar n
continuare la 510
-4
M atinge 90%. Cel mai rapid se cheltuie radicalul DPPH la con-
centraii mici sub aciunea Eneox (extractului neoxidat de enotanine din semine de
(+)-Catehin
DFH4
Cvercetin

195

struguri). Pentru C
red
= 210
-5
M avem un GI = 50%. GI coreleaz pozitiv cu 1/CE
100

calculat pentru aceti reductori (Tab. VII.2). Cel mai mare numr de molecule de
DPPH este redus de ctre Eneox (6,25), n continuare Cv, (+)-Ct, DFH
4
au 1/CE
100

egal cu aproximativ 5, EDMD i ENOXIL cu 3,3, iar Rezv reduce cel mai mic numr
de molecule de DPPH (1,0).
Comparnd GI al reductorilor (Fig. VII.6) pentru [Red]o =110
-4
M, obinem c
cel mai nalt grad de inhibiie l are DFH
4
(94%), iar cel mai mic Rezv (46%).
Rezveratrolul are o activitate
inhibitoare mai mic, deoarece este
un monofenol, adic nu conine
gruparea o-difenolic. Poziia
grupei a doua sau a treia hidroxilic
este important. Acei compui, la
care a doua grup hidroxilic este n
poziia orto- sau para-, au o
activitate mai nalt dect n poziia
meta- [447].
Astfel, am constatat c (+)-Ct,
Cv au activitate de captare a radica-
lilor mult mai nalt comparativ cu
rezveratrolul, deoarece (+)-Ct i Cv
conin grupa dihidroxilic. Extractul Eneox, care conine i galocatehine, conine grupa
trihidroxilic, de aceea are activitate antiradicalic mai nalt (EC
50
= 0,08).
Dac comparm activitile antiradicalice ale (+)-Ct i Cv (Fig. VII.6) constatm
c GI este mai mare pentru Cv (83%). Diferena structurii chimice dintre molecula de
Cv i (+)-Ct este determinat de legtura dubl 2,3 n conjugare cu 4-oxo n inelul C,
care este responsabil pentru delocalizarea electronilor de la inelul B. La fel, grupele 3
i 5-OH din inelul A, mpreun cu grupa 4-oxo din inelul C, mresc activitatea antira-
dicalic a Cv comparativ cu cea a (+)-Ct.
Aceste aspecte structurale ale flavonolilor (Cv), prin care se deosebesc de flava-
noli (Ct), le confer activitate antiradicalic mai nalt.
Eficiena orto- i para-difenolilor este legat de stabilizarea radicalului aril-oxil
de ctre legtura de hidrogen sau de regenerarea unei molecule de difenol:



Rezv Enx Ct Cv Eneox EDMD DFH4
46
57
77
83
85
91
94
0
20
40
60
80
100
G
r
a
d
u
l

d
e

i
n
h
i
b
i

i
e
,

%
Rezv Enx Ct Cv Eneox EDMD DFH4
Fig. VII.6. GI n f(Red), pentru [Red]o = 110
-4
M.
Cvercetina

196

Cuvelier i Shahidi au studiat influena substituiei orto-metoxi i au constatat c
radicalul ariloxil de asemenea se stabilizeaz prin donarea electronului i astfel crete
eficiena antioxidant/antiradicalic.
Din rezultatele experimentale prezentate n Figura VII.6 constatm c pentru
Eneox GI este cel mai nalt pentru concentraii mici, iar cu creterea C
Eneox
> 110
-4
M,
GI scade. Bors [33] a sugerat ideea c stabilitatea radicalului flavonoid ariloxil n
unele cazuri poate da natere efectelor prooxidante. Acest efect poate fi explicat prin
formarea legturilor ntmpltoare, neateptate n cazul creterii concentraiei antioxi-
danilor, care, la rndul su, micoreaz GI al inhibitorului.
Pentru DFH
4
s-a obinut cel mai nalt grad de inhibiie la
4
DFH
C = 110
-4
M.
Prezena grupei asigur o mare capacitate de donare a hidrogenului i
ulterior stabilizarea radicalului format. Potenialele reductoare ale inhibitorilor sunt
invers proporionale cu puterea de donare a electronilor. Un efect important asupra
proprietilor electrofile l are grupa carboxil.
Concluzii
Prin medota TEAC s-au demonstrat aceleai corelaii. Capacitatea antioxidant
determinat pentru reductonii studiai prin testul ABTS
.+
n sisteme peroxidice
indic la proprietile reductoare ale antioxidanilor, care pot fi aranjai n urm-
torul ir: taninurile > (+)-catehina > DFH
4
> cvercetina > rezveratrolul > acidul
ascorbic > enotaninele.