UNIVERSITATEA TEHNICĂ „GHEORGHE ASACHI” DIN

IAȘI
FACULTATEA DE INGINERIE CHIMICĂ ȘI PROTECȚIA
MEDIULUi

PROIECT

Coordonator:
Prof. dr. ing. Teodor Măluţan

Masterand:
Roxana Elena VLEJU
(CPA, 2503)

Iași
-2018-
 Tema proiectului:
Determinarea antioxidanțiolor din ceai verde și negru prin metoda HPLC

2
 Cuprins:

1. Introducere …………………………………………………………………...……...4
2. Consideraţii generale ……………………………………………………………......4
3. Metoda si aparatură …………………………………………………………..……...6
4. Rezultate şi discuţii. Descrierea metodei de analiză …………………………... .…7
5. Concluzii .....…………………………..……………………………...……....….…..12
Bibliografie

3
 1. Introducere
Ceaiul este una dintre cele mai populare băuturi din lume și este consumată de peste
două treimi din populația lumii. Consumul de ceai a fost asociat cu efecte anticancerigene,
antimutagene și cardioprotective pe baza studiilor experimentale care utilizează culturi celulare
și animale .
Amandoua ceaiurile ( verde și negru) provin din planta camellia Sinensis. Diferenta este
data de timpul necesar frunzelor pentru oxidare; ceaiul verde nu este oxidat deloc, in timp ce
cel negru este supus la oxidare completa. Ceaiurile maronii sunt semi-oxidate.
2.Considerații generale
Ceaiul conține compusi fenolici (flavonoide), minerale și oligoelemente esențiale pentru
sănătatea umană. Au fost realizate diverse studii privind valoarea medicamentelor și efectele
benefice asupra sănătății consumului de ceai. Unele dintre posibilele efecte benefice ale
ceaiului sunt: activitatea antioxidantă, stimularea sistemului imunitar, efectul protector
împotriva unor tipuri de cancer ca: cancerul pulmonar, prostata și cancerul de sân și scăderea
nivelului de colesterol din sânge .
Flavonoidele din ceai sunt un grup de polifenoli naturali ce se găsesc în ceaiul verde și
negru. Printre aceștia, se enumeră:
- epicatechină (EC),
- epigallocatechină (EGC),
- galat epicatechină (ECG)
- galat epigallocatechină (EGCG).
Acidul galic este un acid trihidroxibenzoic, un tip de acid fenolic. Se găsește în frunze
de stejar, afine, plante de ceai etc. Numeroase studii au demonstrat efectele anticancerigene ale
acestuia precum și protecția hepatică pe care o conferă. Totuși aceste studii nu au fost
demonstrate clinic.
Pe langa aceti compusi, ceaiul verde și negru furnizează organismului si o cantitate
considerabila de cafeina. Aceasta are efecte pozitive asupra sistemului nervos, energizează
organismul, combate cancerul și accelerează absorbția la nivel intestinal.

4
Structura chimică a antioxidanților ( flavonoidelor) din ceai

Structura chimică a cafeinei și a acidului galic

5
 Beneficiile biologice ale acestora se datorează puternicei lor activități antioxidante
precum și potențialului lor de a inhiba dezvoltarea celulelor cancerigene.
Ceaiul negru conține mai puțin flavanoizi decât ceaiul verde din cauza procesului de
fermentație care generează polimerii de epicatechină cunoscuți sub numele de theaflavine și
thearubigins și derivații lor de galat.
3. Metoda si aparatură
Numeroase investigații independente au demonstrat corelația directă între consumul de
ceai cu prevenirea, întârzierea sau debutul bolilor degenerative cronice, inclusiv cancerul.
Ceaiurile sunt surse bogate de un număr mare de nutrienți, inclusiv vitamine / antioxidanți,
minerale / micronutrienți, enzime și fibre dietetice. Acești fitonutrienți structurali pot avea
mecanisme complementare și suprapuse, sau identice, ale acțiunii potențiale de prevenire a
bolii. Un astfel de mecanism include proprietăți antioxidante, antibacteriene, antivirale
îmbunătățind activitatea enzimelor de detoxifiere, sistemul imunitar, reducerea agregării
trombocitelor, promovarea unui profil al lipidelor sănătoase, reducerea hipertensiunii și
modularea metabolismului hormonal.
Cromatografia de Înaltă Performanţă (HPLC) este o metodă uzuală utilizată pentru
separarea unor compuși precum coloranți, antioxidanți etc
Materiale:
 Cromatograf Agilent 1200 compus din
 Pompa cuaternară;
 Coloana tip C12;
 Degazor pentru solventi;
 Autosampler ( răcit la 4 grade C);
 Incinta termostatată;
 Diodă de detecție (DAD);
 Calculator.

Condiţii de lucru:
 Coloană cromatografică tip C12 (4 µm 250 mm×4.6 mm Phenomenex RP-MAX);
 Faze mobile: Solutia A- acid fosforic 0,1%; Solutia B-acetonitril;
 Temperatura: 40 ºC;
 Debit: 1ml/min;
 Lungimea de undă 310 nm;

6
  Volum de injectie:20 µL;
 Timp de analiză: 40 min.
4. Rezultate și discutii. Descrierea metodei de analiză
S-au supus analizei mai multe tipuri de ceai verde si ceai negru. Pentru prepararea
ceaiului, s-au pus frunzele în apă dedurizata fierbinte timp de 3 minute. După fierbere,
preparatul a fost filtrat pentru a îndepărta particulele rămase în suspensie .
Separarea cromatografică s-a realizat în gradient linear 10-30%.
Faza mobila circula prin coloana cromatografica cu un debit de 1 mL/min.
Pentru stabilirea timpului de retentie corespunzator fiecarui compus fenolic din amestec
se foloseste standardul de fenoli care in prealabil a fost diluat. Prin injectarea în sistemul
cromatografic a câte 20 µL din fiecare solutie diluata de compus fenolic se determina timpul de
retentie corespunzator fiecaruia. Prin urmare, identificarea compusilor fenolici separati din
proba de analizat se va realiza automat prin intermediul soft-ului cromatografului, prin
compararea timpilor de retentie ai acestora cu timpii de retentie ai standardelor introduse în
prealabil în sistemul HPLC.

Figura 1. Cromatografia HPLC a amestecului de standarde

Pentru a cuantifica totalul polifenolilor din infuziile de ceai datele obținute au fost
exprimate în echivalenți ai acidului galic.
Compușii fenolici din ceaiul verde și negru au fost identificați pe baza timpului lor de
retenție, a spectrului de absorbție și a modelului de fragmentare a MS (spectrometriei de masa)
și, acolo unde este posibil, prin cromatografie cu un standard autentic. Trebuie remarcat faptul
7
că o serie de compusi fenolici găsiți în ceaiuri nu sunt disponibili sub formă purificată.
Rezultate obtinute in urma analizei ceaiului verde si ceaiului negru:

Figura 2. Compușii fenolici majori (A) ceai verde și (B) ceai negru.

Identificarea picurilor:
1. Acid galic (AG)
2. Theogallin
3. Epigallocatechină (EGC)
4. Theobromina
5. Acid cafeoilchinic
6. Galat de epigalocatechină
7. Catechina
8. Acid cafeoilchinic
9. Cafeina (CAF)

8
10. Epicatechina ( EC)
11. Galatul de epigalocatechina ( EGCG)
12. Acidul cumaroilchinic
13. Galat de epicatechina ( ECG)

Tabel 1. Timpii de retenție inregistrați pentru fiecare component

Peak Component Timp retentie (min)

1 Acid galic 5,8
Theogallina
2 6,2

3 Epigallocatechină 9,4
4 Teobromina 10,7
Acid cafeoilchinic
5 13,2

Galat de
6 epigalocatechină 15,9

7 Catechina 18,4

8 Acid cafeoilchinic 21,3

9 Cafeina 22,1
10 Epicatechina 25,5
Galat de
11 26,8
epigalocatechină
Acidul
12 cumaroilchinic 27,6

13 Galat de epicatechina 38,3

Astfel s-au obținut următoarele valori, mentionate in tabelul următor:

9
 Tabel 2. Conținutul de flavonoide, acid galic și cafeina din ceai verde si negru
exprimat în mg/g
Nr de
Proba probe EGCG EGC ECG EC CAF AG
analizate
Ceai
3 73,3 32,1 10,4 14,1 38,3 0,7
verde
Ceai
3 27,9 3,9 11,5 7,4 47,2 2,5
negru

Figura 3. Graficile corespunzătoare conținutului de substante antioxidante din cele

două ceaiuri
Capacitatea antioxidantă a fenolilor se datorează mai multor factori:
1) activității de absorbție a radicalilor,
2) efectului de chelatare a ionilor metalici,
3) stabilității radicalului rezultat format după scufundare,
4) sensibilității la pH și în faza lipofilă.
S-a demonstrat că activitatea de absorbție a radicalilor liberi este legată de potențialul
de oxidare electrochimic al flavonoidelor.
Rezultatele studiului, indică faptul că epicatechina și catechina au un potențial mai
puternic de captare a radicalilor decât EGC și acidul galic. Aceasta se datorează probabil
stabilității pH-ului epicatecinei și catechinei. Așa cum este prezentat în figura 3, catechina și
epicatechina sunt mai stabile în intervalul de pH de la 5 la 7 decât EGC și acidul galic. Analiza
flavanolului de ceai a arătat variații mari între ceaiurile de la diferite branduri. Această variație

10
a fost mai mare decât deviația standard a concentrațiilor de flavanol determinate în ceaiurile
aceluiași brand, dar cu numere diferite de loturi. Prin urmare, am concluzionat că diferența
dintre mărci se datorează mai degrabă condițiilor și tehnologiilor de producție diferite ale
companiilor de ceai decât diferențelor între loturile de producție, termenul de valabilitate și
condițiile de depozitare.

Figura 4. Zona picurilor obtinute in urma analizei HPLC a acidului galic, EGC,
EC, EGCG și ECG expuse la pH 3-7

11
 5 . Concluzii
 Capacitatea antioxidantă este puternic legată de conținutul de fenoli și de flavonoizi;
 EGCG, ECG , EGC şi EC sunt catechinele majoritare din ceaiul verde și ceaiul negru
 Puterea antioxidantă a ceaiului verde este considerabil mai mare decât ceaiul negru.
 Studiile au arătat că antioxidanții din ceai cu un număr mai mare de grupe hidroxi-
fenolice au o putere antioxidantă mai mare.
 Ceaiul negru conținea mai puțin flavanoizi decât ceaiul verde din cauza procesului de
fermentație care generează polimerii de epicatechină.
 Comparativ cu ceaiul verde, ceaiul negru are o cantitate considerabil mai mare de
cofeina și acid galic;

12
 Bibliografie
1. International Tea Committee. Annual Bulletin of Statistics; ITC: 2002.
2. Catechin Content of 18 Teas and a Green Tea Extract Supplement Correlates With
the Antioxidant Capacity, Susanne M. Henning, Claudia Fajardo-Lira, Hyun W.
Lee, Arthur A. Youssefian, Vay L. W. Go, and David Heber, Article in
Nutrition and Cancer, February 2003.
3. Toxic and Essential Mineral Elements Content of Black Tea Leaves and Their Tea
Infusions Consumed in Iran, Maryam Salahinejad, Fereydoon Aflaki, Article in
Biological trace element research, August 2009.
4. HPLC-MSn Analysis of Phenolic Compounds and Purine Alkaloids in Green and
Black Tea, DANIELE DEL RIO, AMANDA J. STEWART, WILLIAM MULLEN,
JENNIFER BURNS, MICHAEL E. J. LEAN, FURIO BRIGHENTI, AND ALAN
CROZIER,
5. Mineral Elements Profile, Bioactive Compounds And Antioxidant Capacity Of Wild
Blueberry And Of Pharmaceutical Preparations From Blueberry (Vaccinium
Myrtillus), TÜNDE JURCA, LAURA VICAȘ, IMRE TÓTH, MIHÁLY BRAUN,
ELEONORA MARIAN, ALIN TEUSDEA, SIMONA VICAȘ, MARIANA
MUREȘAN, Article in Farmacia, January 2016.
6. Kiehne, A.; Engelhardt, U. H. Theromspray-LC-MS analysis of various groups of
polyphenols in tea. II. Chlorogenic acids, theaflavins and thearubigins. Z. Lebensm.-
Unters. Forsch. 1996, 202, 299-302.
7. Total Antioxidant Capacity of Teas by the Ferric Reducing/ Antioxidant Power
Assay, Iris F. F. Benzie and Y. T. Szeto, Department of Nursing and Health
Sciences, The Hong Kong Polytechnic University, Kowloon, Hong Kong SAR, J.
Agric. Food Chem. 1999, 47, 633−636.

13