U IVERSITATEA DI BUCURETI FACULTATEA DE CHIMIE COALA DOCTORAL CHIMIE

DETERMINAREA UNOR ANTIOXIDANI I A CAPACITII ANTIOXIDANTE TOTALE A UNOR PROBE COMPLEXE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Doctorand, Claudia-Valentina POPA Conductor tiinific, Profesor Dr. Andrei Florin DNE

Bucureti -2011-

Cuprins

Cuprins

CUPRI S
(numerotarea paginilor este cea din teza de doctorat)
LISTA DE ABREVIERI I TRODUCERE OBIECTIVELE TEZEI 1. RADICALI LIBERI. A TIOXIDA I. CAPACITATE A TIOXIDA T TOTAL. STRESUL OXIDATIV 1.1. Radicali liberi 1.2. Antioxidani. Capacitate antioxidant total 1.2.1. Clasificarea antioxidanilor 1.2.2. Antioxidani naturali neenzimatici 1.2.2.1. Antioxidani naturali neenzimatici liposolubili 1.2.2.2. Antioxidani naturali neenzimatici hidrosolubili 1.2.2.3. Compui cu structur fenolic 1.2.3. Antioxidani enzimatici 1.2.4. Antioxidani anorganici 1.3. Stresul oxidativ 2. OBI EREA EXTRACTELOR VEGETALE 2.1. Principii generale ale extraciei 2.2. Procedee de extracie 3. BIOLUMI ESCE . CHEMILUMI ESCE 4. METODE DE DETERMI ARE A A TIOXIDA ILOR I A CAPACITII A TIOXIDA TE A U OR PROBE COMPLEXE 4.1. Clasificarea metodelor de determinare a antioxidanilor i a capacitii antioxidante 4.2. Metode spectrofotometrice 4.3. Metode bazate pe luminescen 4.3.1. Metode bazate pe fluorescen 4.3.2. Metode bazate pe chemiluminescen, electrochemiluminescen i fotochemiluminescen 4.4. Metode electrochimice 4.5. Metode cromatografice 4.6. Metode de analiz prin injectare n flux 4.7. Alte metode de determinare a unor antioxidani i a capacitii antioxidante totale 5. DETERMI AREA U OR A TIOXIDA I I A CAPACITII A TIOXIDA TE TOTALE A U OR PROBE COMPLEXE 5.1. Metod FIA-CL cu injectarea probei ntr-un flux de ap oxigenat 5.1.1. Principiul metodei 5.1.2. Reactivi i materiale 5.1.2.1. Aparatura 7 9 11 13 13 18 21 22 22 32 37 53 56 57 63 63 65 69 73 73 75 85 85 88 98 99 100 108 111 112 112 113 113

5.1.3. Mod de lucru 5.1.4. Mod de calcul 5.1.5. Determinarea acidului L-ascorbic 5.1.6. Concluzii 5.2. Studiul influenei complexrii cu EDTA a ionilor de Co2+ (catalizator) asupra semnalului de chemiluminescen 5.2.1. Principiul metodei 5.2.2. Echilibre implicate n reacia de chemiluminescen bazat pe oxidarea luminolului de ctre radicalii HO. n prezena ionilor de Co2+ drept catalizator 5.2.3. Reactivi i materiale 5.2.3.1. Analiza apei oxigenate 5.2.3.2. Aparatura 5.2.4. Mod de lucru 5.2.5. Mod de calcul 5.2.6. Optimizarea condiiilor de lucru. Influena solvenilor asupra semnalului de chemiluminescen 5.3. Determinarea unor antioxidani folosind montajul de analiz prin injectare ntr-un flux de tampon borat 5.3.1. Mod de lucru 5.3.2. Mod de calcul 5.3.3. Determinarea unor antioxidani 5.3.3.1. Determinarea acidului uric 5.3.3.2. Determinarea acidului L-ascorbic 5.3.3.3. Determinarea acidului cafeic 5.3.3.4. Determinarea acidului galic 5.3.3.5. Determinarea Trolox 5.4. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor probe reale 5.4.1. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor probe de vin 5.4.2. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor ceaiuri 5.4.2.1. Obinerea infuziilor 5.4.2.2. Determinarea capacitii antioxidante totale 5.4.3. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor sucuri de fructe i a unor buturi necarbonatate 5.4.3.1. Obinerea probelor de analizat 5.4.3.2. Determinarea capacitii antioxidante totale 5.4.4. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte din fructe de Rubus idaeus L. i Vaccinium myrtillus L. 5.4.4.1. Obinerea extractelor 5.4.4.2. Determinarea capacitii antioxidante totale 5.4.5. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte din plante

116 116 117 118 119 120

120 123 126 126 128 129 133 137 138 138 138 138 144 145 148 150 151 151 157 157 157 158 158 160 165 165 166 169

Cuprins

Cuprins/cuvinte-cheie

5.4.5.1. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte din plante aparinnd familiei Lamiaceae, obinute prin macerare 5.4.5.1.1. Obinerea extractelor vegetale 5.4.5.1.2. Determinarea capacitii antioxidante totale 5.4.5.2. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte de Rosmarinus officinalis L. iradiate cu radiaii 5.4.5.2.1. Obinerea extractelor iradiate de rozmarin 5.4.5.2.2. Determinarea capacitii antioxidante totale 5.4.5.3. Determinarea capacitii antioxidante totale i a coninutului n polifenoli a unor extracte vegetale obinute prin extracie continu i extracie cu ultrasunete 5.4.5.3.1. Obinerea extractelor vegetale 5.4.5.3.2. Determinarea capacitii antioxidante totale, a coninutului n fenoli totali i flavonoide 5.4.5.4. Determinarea capacitii antioxidante i a coninutului n polifenoli a unor legume 5.4.5.4.1. Obinerea extractelor vegetale 5.4.5.4.2. Determinarea capacitii antioxidante i a coninutului n fenoli totali, flavonoide i antociani 5.4.6. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor probe de comprimate de Spirulin 500 mg supliment alimentar 5.4.6.1. Obinerea probelor de analizat 5.4.6.2. Determinarea capacitii antioxidante totale 5.4.7. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor produse cosmetice 5.4.7.1. Obinerea probelor de analizat 5.4.7.2. Determinarea capacitii antioxidante totale 5.5. Concluzii 6. DETERMI AREA I TRACELULAR A VARIAIILOR CO CE TRAIILOR IO ILOR DE Ca2+ CITOSOLIC CO DIII DE STRES OXIDATIV 6.1. Calciul intracelular, mesager secundar 6.2. Drojdia Saccharomyces cerevisiae i cile de transport ale ionilor de Ca2+ n celul 6.3. Rspunsul mediat de ionii de Ca la condiii de stres 6.4. Metode de determinare a rspunsului mediat de ionii de Ca la condiii de stres 6.4.1. Aequorina, protein bioluminescent 6.5. Determinarea rspunsului mediat de ionii de Ca2+ la condiii de stres oxidativ printr-o metod bazat pe bioluminescen 6.5.1. Principiul metodei 6.5.2. Mecanismul emisiei luminii de ctre aequorin
2+ 2+

169 169 169 171 172 172

176 177 177 185 185 185 193 193 193 195 195 196 197

6.2.1. Reactivi i materiale 6.2.1.1. Linii celulare i condiii de cretere 6.2.2. Mod de lucru 6.2.2.1. Studiul creterii liniilor celulare 6.2.2.2. Monitorizarea in vivo a pulsurilor ionilor de Ca2+ induse de stresul oxidativ 6.2.3. Mod de calcul 6.3. Rspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor supuse stresului oxidativ 6.3.1. Rspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la H2O2 6.3.2. Mobilizarea ionilor de Ca2+ sub aciunea stresului oxidativ indus de H2O2 6.3.3. Adaptarea celulelor la stresul oxidativ 6.3.4. Mobilizarea ionilor de Ca2+ n celulele expuse la concentraii letale de de H2O2 6.3.5. Rspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la alchilhidroperoxizi 6.4. Influena unor antioxidani i a unor extracte vegetale asupra rspunsului mediat de ionii de Ca2+ n condiii de stres oxidativ Influena vitaminei C asupra rspunsului mediat de ionii de Ca2+ n condiii de stres oxidativ 6.4.2. Rspunsul mediat de ionii de Ca2+ n condiii de stres oxidativ n prezena unor extracte vegetale 6.4.2.1. Obinerea extractului 6.4.2.2. Determinarea coninutului n fenoli totali i flavonoide 6.4.2.3. Monitorizarea rspunsului mediat de ionii de Ca2+ n condiii de stres oxidativ n prezena extractului 6.5. Discuii i concluzii CO CLUZII GE ERALE LUCRRI PUBLICATE DOME IUL TEZEI DE DOCTORAT CO TRACTE DE CERCETARE BIBLIOGRAFIE 6.4.1.

214 215 216 216 216 218 218 218 219 222 225 226

231 231 233 233 234 235 237 241 245 247 249

201 201 204 206 208 209 210 211 212

umerotarea tabelelor, figurilor i a indicaiilor bibliografice este cea din teza de doctorat

Cuvinte-cheie
Antioxidani, polifenoli, flavonoide, antociani, acid ascorbic, acid uric, acid cafeic, acid galic, Trolox, capacitate antioxidant total, activitate antioxidant, metod de analiz prin injectare n flux, (chemi)luminescen, luminol, ioni de Co(II), metode spectrofotometrice, capacitatea de ndeprtare a radicalului DPPH., extracie continu, extracie cu ultrasunete, stres oxidativ, calciu citosolic, aequorin, Saccharomyces cerevisiae.

Lista de abrevieri

Lista de abrevieri

LISTA DE ABREVIERI
AA AAPH ABTS ADA ADNc AEQ AGN/AGS AH AO AP AU BAPTA BL B-PE BR c CE CAT CD cit cit c CL CoQ CoQ10 CoQ10H2 CP Cys DAD DCPIP DO DPPH dw ECL EDTA EGTA ELISA acid L-ascorbic (vitamina C) 2,2'-azobis(2-amidinopropan), azo-iniiator R2N2 acid 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic) acid dehidro-L-ascorbic acid deoxiribonucleic complementar aequorin acizi grai nesaturai / acizi grai saturai donor(i) de hidrogen antioxidant/antioxidani 3-aminoftalat acid uric acid 1,2-bis(o-aminofenoxi)etan-N, N, N`, N`-tetracetic) bioluminescen B-ficoeritrina, o protein fluorescent roie, ce are legat covalent de partea proteic cromoforul ficobilin bilirubina concentraie extracie continu catalaza relaxare vibraional (vibrational relaxation, a collisional deactivation process) citosolic citocrom c chemiluminescen coenzima Q coenzima Q 10 (forma oxidat) coenzima Q 10h2 (forma redus) ceruloplasmina cistein diode array detector 2,6-diclorfenolindofenol densitate optic (optical density) radical 2,2-difenil-1-picril hidrazil sau metoda de analiz bazat pe capacitatea de ndeprtare a acestui radical (2,2-Diphenyl-1-Picryl Hydrazyl Radical Scavenging) extract sau produs vegetal uscat (dry weight) chemiluminescen generat electrochimic, electrochemiluminescen acid etilen-diaminotetracetic acid glicol-bis(2-aminoetileter)etan-N, N, N`, N`-tetracetic enzyme-linked immuno-sorbent, tehnic de determinare enzimatic a sngelui ce permite detectarea imunoglobulinelor ndreptate mpotriva unui agent bacterian sau viral

EMMA ET sau SET F FCM FCR FIA FNR (sau Fpr) FRAP

FRASC FTIR fw GC GPx G-SH / G-S-S-G HAT HPLC HPR IC IOU IR ISC L L, LH2 LC LDL LH MPC n NAD+ NADP+ ORAC P PAD

Electrophoretically Mediated Microanalysis (microanaliz mediat electroforetic) transfer de electron (Single Electron Transfer) fluorescen metoda Folin-Cioclteu reactiv Folin-Cioclteu metod de analiz prin injectare n flux (flow injection analysis) feredoxin-reductaza metoda analitic de determinare a capacitii antioxidante bazat pe reducerea ionului feric (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power) metod de analiz bazat pe capacitatea de reducere a ionului feric i pe msurarea concentraiei de ascorbat din probe (Total Ferric Reducing (Antioxidant) Activity and Ascorbate Concentration Measurement) Fourier Transform Infrared Spectroscopy extract sau produs vegetal proaspt (fresh weight) cromatografia de gaze glutation peroxidaza glutation (forma redus) / glutation disulfur (forma oxidat) transferul unui atom de hidrogen (Hydrogen Atom Transfer) cromatografie de lichide de nalt performan (high performance liquid chromatography) peroxidaza din hrean conversie intern (internal conversion) metoda inhibiiei reaciei cu oxigenul (Inhibited Oxygen Uptake) infrarou conversie intersistem (intersystem crossing) luminescen luminol cromatografia de lichide lipoproteine cu densitate mic (low-density lipoprotein, colesterol ru) donor de hidrogen (sau antioxidant) n reaciile ce decurg cu transfer de hidrogen, n etapele de iniiere i propagare moarte celular programat (programmed cell death) numr de determinri nicotinadenindinucleotid nicotinadenindinucleotid fosfat metoda de analiz bazat pe capacitatea de a reaciona cu oxigenul (Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay) a unor specii radicalice fosforescen photodiode array detector

Lista de abrevieri

Obiectivele tezei

Pc PCL

ficocianina (phycocyanin) fotochemiluminescen

OBIECTIVELE TEZEI
Obiectivele urmrite n aceast tez sunt: efectuarea unui studiu de literatur privind tematica tezei; elaborarea unor noi metode FIA-CL pentru determinarea activitii antioxidante a unor AO (substane pure) i a TAC a unor probe reale, complexe, pornind de la datele din literatura de specialitate. - realizarea unor montaje FIA-CL i elaborarea unor metode de analiz optimizate pentru determinarea activitii antioxidante a unor substane; - aplicarea metodelor FIA-CL elaborate la determinarea: unor AO substane pure (acid uric, acid ascorbic, acid cafeic, acid galic, Trolox); TAC a unor extracte, obinute prin mai multe metode (extracie continu, macerare, extracie cu ultrasunete, centrifugare), folosind solveni diferii (etanol, aceton, ap), din plante (condimente, legume, plante medicinale) i fructe; TAC a unor vinuri, infuzii din plante medicinale (ceaiuri), sucuri de fructe, buturi rcoritoare necarbonatate, precum i a unor produse suplimente alimentare (comprimate) i produse cosmetice (creme i geluri); - studiul variaiei TAC a unui extract de rozmarin la iradiere cu doze variate de radiaii ; - efectuarea unor corelaii ntre TAC i coninutul de polifenoli determinat prin metode spectrofotometrice convenionale a unor probe analizate; - efectuarea unor corelaii ntre TAC i capacitatea antioxidant determinat prin metoda DPPH a unor probe analizate; - efectuarea unor corelaii ntre valorile TAC ale probelor analizate determinate prin metodele FIA-CL studiate i valori reprezentative ale coninutului de AO i ale capacitii antioxidante raportate de literatur. determinarea n dinamic a modificrii concentraiei ionilor de calciu citosolic ([Ca2+]cit) ca rspuns la diferii factori de stres oxidativ n absena/prezena unor AO i a unor extracte vegetale - stabilirea unui sistem celular pentru determinarea intracelular a variaiilor [Ca2+]cit n celule de Saccharomyces cerevisiae n condiii de stres oxidativ; - identificarea condiiilor optime de nregistrare in vivo a semnalului de luminescen care apare n urma fluctuaiilor [Ca2+]cit; - monitorizarea variaiei luminescenei celulei n prezena unor inductori ai rspunsului mediat de Ca2+ (H2O2, hidroperoxizi organici); - studierea influenei unor AO (vitamina C) i a unor extracte vegetale asupra stresului oxidativ indus n celulele drojdiei S. cerevisiae.

PMT POD PSC r R RE RES RL RLU RMN RNS ROS SD RSD S SeCys SFA SIA SOD T TAC tBOOH TEAC TP TPTZ TRAP UE sau UAE VEAC

tub fotomultiplicator (photomultiplier tube) peroxidaza metoda analitic bazat pe capacitatea de ndeprtare a radicalului peroxil (Peroxyl Radical Scavenging Capacity) coeficient de corelaie Pearson nregistrator reticul endoplasmic rezonan electronic de spin (Electronic Spin Resonance, ESR) radical(i) liber(i) uniti relative de luminescen Rezonan Magnetic Nuclear specii reactive cu azot specii reactive cu oxigen deviaia standard (standard deviation) deviaia relativ standard (relative standard deviation) singlet selenocistein metod de analiz n flux segmentat (Segmented Flow Analyzer) metod de analiz prin injectare n flux segmentat (Sequential Injection Analysis) superoxid dismutaza triplet capacitate antioxidant total hidroperoxid de ter-butil metoda de determinare a capacitii antioxidante ca echivaleni trolox (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Assay) fenoli totali (total phenols) 2,4,6-tripiridil-s-triazin puterea (parametrul) antioxidant() de a capta radicalul peroxil (Total Peroxyl Radical Trapping Antioxidant Parameter Assay) extracie cu (asistat de) ultrasunete (ultrasonically assisted extraction) activitate antioxidant exprimat n echivaleni vitamin C

10

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

REZUMAT
5. DETERMI AREA U OR A TIOXIDA I I A CAPACITII A TIOXIDA TE TOTALE A U OR PROBE COMPLEXE n acest studiu, s-a urmrit elaborarea unei noi metode de analiz prin injectare n flux cu detecie chemiluminescent pentru determinarea activitii antioxidante a unor antioxidani (AO) substane pure i a capacitii antioxidante totale (TAC) a unor probe reale, complexe. Metodele elaborate se bazeaz pe sistemul chemiluminescent luminol/H2 O2/Co(II). Reacia de CL are loc ntre luminol (5-amino-2,3dihidroftalazin-1,4-diona) i radicalii HO., provenii din apa oxigenat n prezena ionilor de Co(II). Ionii de Co(II) catalizeaz descompunerea H2O2 cu generarea de ROS, n principal radicali HO ., conform reaciilor Fenton (64) i Haber-Weiss (65) [316, 366, 465, 476]: (64) Co2+ + H2O2 Co3+ + HO . + HO Co3+ + O2 .
\

Cnd n fluxul transportor s-a injectat acid ascorbic, acesta a reacionat (a consumat) apa oxigenat. n consecin, H2O2 nu a mai fost disponibil pentru a genera radicali HO ., care apoi s reacioneze cu luminolul i s produc CL. S-au obinut picuri cu vrful n jos (picuri negative). n varianta B s-a ncercat stabilizarea semnalului prin complexarea ionilor de Co(II) cu acid citric n raport molar de 1:1. Metoda a fost aplicat la determinarea vitaminei C, dar rezultatele nu au fost suficient de reproductibile. Din acest motiv, s-a realizat un al II-lea montaj FIA-CL prezentat n figura 31, alctuit din trei canale, prin care au fost pompate: (a) un flux transportor de borat de sodiu 0,05M, pH 9 n care se injecteaz proba de analizat; (b) un flux de ap oxigenat i (c) un flux de luminol/Co(II)/EDTA. Fluxul de ap oxigenat (b) se amestec cu fluxul (c) n bucla de amestecare (notat M n figura 31, cu lungimea de 150 cm). Fluxul oxidant-luminol/catalizator/complexant rezultat se ntlnete cu fluxul transportor de borat de sodiu 0,05M, pH 9 (a) nainte de intrarea n celula n flux (notat F n figura 31), unde are loc reacia de CL.
S 75 cm (a) I (b) (c) P w M w F PMT C

Co2+ + O2

(65)

Radicalii HO . generai, fiind extrem de reactivi, reacioneaz cu luminolul foarte repede. Luminolul este oxidat n mediu bazic n prezena catalizatorului, trecnd n final n acid 5-aminoftalic care este n form excitat. Acesta trece apoi n starea fundamental genernd o emisie de CL, care este msurat n uniti relative de CL (RLU). [17, 363, 365, 366, 375, 457, 459, 465]. Datele generate de un chemiluminometru sunt nregistrate cu ajutorul unui calculator cuplat la aparat i apoi sunt prelucrate corespunztor. Au fost concepute dou montaje FIA-CL. Montajul iniial a fost prevzut cu 2 canale. Pe baza aceleai variante constructive, au fost concepute dou variante de lucru, n care: - n varianta A, s-a folosit un flux transportor de H2O2 15 M i un flux de reactivi luminol 10-4 M/ Co(II) 10-5 M/Na2CO3 0,1 M, pH 10; - n varianta B, fluxul transportor a fost un amestec de H2O2 15 M/CoCl2 10-5 M/ acid citric 10-5 M, iar fluxul de reactiv- o soluie de luminol 10-4 M n Na2CO3 0,1 M, pH 10. Cele dou fluxuri de reactivi se amestec nainte de intrarea n celula n flux. Reacia de CL are loc n celula n flux: luminolul este oxidat n mediu bazic conferit de prezena carbonatului, de ctre radicalii HO . provenii din H2O2 n prezena ionilor de Co(II) drept catalizator, genernd o emisie de CL, relativ constant [17, 366, 459, 465].

Figura 31. Schema montajului FIA-CL cu trei canale, cu injectarea probei ntr-un flux de tampon borat 0,05 M, pH 9. P: pomp peristaltic; I: valv de injectare; F: celula n flux; M: bucl de amestecare (L = 150 cm); PMT: tub fotomultiplicator; C: computer; w: rezidii; (a): flux transportor de borat de sodiu 0.05 M, pH 9; (b): flux de H2O2; (c): flux de Co(II)/EDTA/luminol

Sistemul FIA este cuplat cu aparatul de chemiluminescen. Montajul FIACL utilizat a fost alctuit din: pomp peristaltic Gilson cu 4 canale; valv de injectare Rheodyne, model 5051, cu 4 canale i bucl de injectare; detector de chemiluminescen format din tub fotomultiplicator (PMT; tensiunea de alimentare = 1000 V), sistem de amplificare i ecran de afiare i celula n flux a chemiluminometrului. Celula a fost confecionat n laborator prin spiralarea unui tub de Teflon (diametru intern d.i. = 0,8 mm i lungimea de 50 cm) n acelai plan, obinndu-se

11

12

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

astfel opt spire. Celula s-a fixat pe o foi reflectorizant din aluminiu, care reflect radiaia luminoas ctre fereastra PMT (figura 24A). Aceast celul este plasat n faa ferestrei PMT (figura 24B).

i alimenteaz sistemul cu o anumit concentraie constant de HO. n concentraie foarte mic i pentru un timp relativ mare [17].

Figura 24. Celula n flux. A. vedere lateral; B. vedere din fa PMT: tub fotomultiplicator; Al: foi de aluminu; S: prob; R: reactiv; w: rezidii

Dup cum se observ n figura 24B, fluxul de prob (marcat cu culoarea roie) i cel de reactivi (desenat cu culoare albastr) se ntlnesc n faa celulei n flux, unde are loc reacia de CL. Radiaia luminoas este direcionat n faa PMT. Cu negru s-au marcat reziduurile. Montajul a fost cuplat cu un computer, prevzut cu un program de achiziionare i prelucrare a datelor. n figura 30 este prezentat imaginea ecranului calculatorului la nregistrarea unui semnal de fond. S-a utilizat varianta perfecionat a programului, care a permis: nregistrarea semnalelor de CL n funcie de timp la diferite valori ale timpului de achiziie, prelucrarea datelor nregistrate sub forma unor picuri specifice FIA-CL n timp real, o serie de faciliti n interpretarea acestor picuri nregistrate, ca de exemplu: posibilitatea mririi, micorrii, lirii sau ngustrii picurilor, posibilitatea opririi nregistrrii i citirii unei anumite valori de pe pic etc. Astfel, prin apsarea butonului PAUZ se ntrerupe nregistrarea i se pot marca anumite valori de pe grafic cu ajutorul reperelor concepute n acest scop. Valorile din nregistrare care se doresc a fi aflate apar n ferestrele care sunt indicate n figura 30 (sunt colorate n albastru i roz). Valorile intensitii CL s-au putut urmri grafic, dar s-au nregistrat numai n form numeric. Citirile s-au fcut la un interval selectat de 1 s. Fiierele se salveaz i apoi se redeschid prin programul MS-EXCEL. Datele nregistrate de calculator n form numeric au fost prelucrate ulterior folosind funciile disponibile n MS-EXCEL, inclusiv forma grafic. Metoda FIA-CL propus se bazeaz pe reacia n mediu bazic a luminolului cu radicalii HO. generai prin reacia de tip Fenton (64) provenii din H2O2 n prezena ionilor de Co(II) (catalizator) complexai cu EDTA. Complexarea cu EDTA asigur eliberarea ionilor de Co(II) la o concentraie foarte mic i cu o vitez relativ constant, ceea ce garanteaz formarea unui flux de RL cu o vitez relativ constant

Figura 30. Imaginea ecranului calculatorului n timpul nregistrrii semnalului de fond. RLU: uniti relative de luminescen Folosirea unui exces de complexant contribuie la asigurarea fluxului de RL constant, chiar dac intensitatea semnalului este mai sczut. n reacia de CL a luminolului cu H2O2, apar mai multe echilibre competitive [17, 316, 366, 459, 465, 476].

13

14

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

n mediul bazic, ionul HO, un nucleofil foarte puternic, atac protonul din grupa OH fenolic din luminol (5-amino-2,3-dihidroftalazin-1,4-diona), cu formare de ion enolat (LH). Luminolul monodisociat (LH) n mediul bazic reacioneaz cu radicalul HO. (generat din H2O2) i se formeaz diazaminochinona LH. . n prezen de oxigen molecular i ap, anionul radical LH. se oxideaz la luminol LH2). Pe de alt parte, LH. reacioneaz cu O2. la anionul hidroperoxid (L (LOO). Acesta din urm se afl n echilibru cu forma sa tautomer de endoperoxid, stare de tranziie instabil, care se descompune spontan la 3-aminoftalat n stare excitat de triplet (AP*) i N2. AP* se relaxeaz ulterior la starea fundamental (AP) cu emitere de radiaie luminoas ( = 430 nm) [17, 366, 367, 375, 459, 465, 476]. Folosind montajul i programul mbuntit menionate s-au nregistrat semnale cu aspectul celor prezentate n figura 32. Astfel, n absena unui AO, se nregistreaz un semnal de CL nu foarte mare, dar care rmne stabil i constant n timp. Valoare intensitii acestui semnal este notat cu ICL n figura 32. La injectarea unei probe cu AO, antioxidantul va neutraliza a o parte din radicalii HO., generai din reacia ionilor de Co2+ cu H2O2, ceea ce conduce la scderea semnalului de CL (pic negativ). Valoarea corespunztoare scderii semnalului de CL de fond n prezena unui AO a fost notat cu ICL (figura 32). Scderea intensitii ICL este corelat cu activitatea i concentraia antioxidantului.

Datele obinute pot fi prelucrate n mai multe moduri. Astfel, se poate reprezenta grafic: I`CL (RLU); (ICL/ICL - ICL); (I`CL/ICL) 100 n funcie de logaritmul concentraiei AO (M). n tez sunt date exemple de astfel de curbe obinute la determinarea acidului uric. Cele mai bune rezultate s-au obinut reprezentnd grafic (I`CL/ICL) 100 n funcie de concentraia AO (M). n acest ultim caz s-a calculat pentru ICL media semnalelor corespunztoare platoului nainte i dup injectarea probei. Pentru determinarea I`CL al probelor (standard sau probe reale) s-au efectuat cel puin dou injectri i s-a efectuat media acestora. 5.2.6. Optimizarea condiiilor de lucru. Influena solvenilor asupra semnalului de chemiluminescen S-au studiat i optimizat parametrii sistemului care au valorile optime indicate n paranteze: pH (valoare optim 9), debitul total pe toate cele 3 canale (Qtot. = 0,45 mL/min.), concentraiile ionilor de Co(II) i EDTA i raportul molar Co(II)/EDTA, concentraia luminolului (2,3 10-4 M), concentraia H2O2 (6 x 10-4 M preparat ntr-o soluie apoas de EDTA 2 x 10-4 M), volumul de injectare (Vinj = 70 L). Semnalele de CL au fost mai mici la raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA = 10-3 M) comparativ cu cele nregistrate la raport molar Co(II)/EDTA = 0,9 (c Co(II) = 0,804 10-3 M; cEDTA = 0,894 10-3 M). Totui, n majoritatea determinrilor a fost preferat raportul molar Co(II)/EDTA = 0,8 deoarece un mic exces de EDTA asigur producerea unui flux constant de radical hidroxil, n conformitate cu principiul metodei i echilibrele implicate n reacia de CL. Determinarea capacitii antioxidante a multor probe reale (extracte (hidro)alcoolice de plante, vinuri .a.) implic prezena alcooliilor sau a acetonei. Din acest motiv, s-a studiat influena a trei dintre cei mai utilizai solveni (etanol, aceton, metanol) asupra semnalului de CL. S-a demonstrat c prezena acetonei chiar i n concentraii mari (70 90%, v/v) a dus la o cretere cu cel mult 10% a semnalului analitic. Din acest motiv s-a preferat s se lucreze cu extracte prelucrate n aceton. S-a constat c pn la concentraii de cca. 20%, etanolul coninut n probele de analizat nu influeneaz semnalul de CL. Folosind un flux transportor de tampon borat preparat n etanol 7% (v/v) atunci cnd s-au analizat soluii etanolice s-a reuit diminuarea semnificativ a semnalului dat de soluiile etanolice. Au fost selectate soluii de etanol 80% (v/v) i aceton 70% (v/v) la prepararea probelor/extractelor de analizat deoarece au cele mai mici concentraii etanolice respectiv acetonice la care extractele vegetale nu au precipitat. Pentru a nltura posibilitatea interferenelor unor ioni metalici aflai n urme, care ar putea aciona ca i catalizatori competitori fa de Co(II), soluiile etanolice, acetonice i de H2O2 s-au preparat n EDTA 2 x 10-4 M [483].

Figura 32. Forma tipic a unui semnal de chemiluminescen. ICL: semnalul CL de fond; ICL: scderea semnalui de CL n prezena unei probe de AO injectate; RLU: uniti arbitrare de luminescen Dup trecerea probei cu AO, semnalul revine la valoarea iniial. S-a msurat valoarea semnalului de CL, ICL, pentru soluiile standard i pentru probele de analizat. Din valoarea ICL s-a sczut n toate cazurile att pentru etaloane ct i pentru probele de analizat, valoarea ICL msurat pentru o prob de comparaie (o prob care nu conine un AO) obinndu-se astfel ICL.

15

16

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

5.3. Determinarea unor antioxidani folosind montajul de analiz prin injectare ntr-un flux de tampon borat etoda FIA-CL dezvoltat a fost aplicat pentru determinarea a cinci antioxidani (substane pure), i anume: acid uric (0,6 100 M), acid ascorbic (0,8 300 M), acid cafeic (1 1000 M), acid galic (2,5 300 M) i Trolox (2,5 500 M). Domeniile de concentraie au fost indicate n paranteze. Determinrile au fost efectuate la volumul de injectare optim de 70 L. n cazul determinrii acidului uric s-a artat c sensibilitatea metodei crete de 10 ori (0,1 10 M) lucrnd cu un volum de injectare de 270 L. S-au trasat mai multe tipuri de drepte de calibrare (menionate anterior), n diferite condiii experimentale (raport molar Co(II)/EDTA, solveni diferii). n continuare se prezint cteva drepte de calibrare (I`CL/ICL x 100) n funcie de concentraia AO (M), reprezentative. De exemplu, n figura 39 se prezint curbele de calibrare (I`CL/ICL x 100) n funcie de concentraia acidului uric.

Pentru dreapta de calibrare (1) prezentat n figura 39B (domeniul de linearitate = 4 - 15 M), s-au calculat ecuaia dreptei i coeficientul de corelare urmtori: ICL/ICL 100 = 2,57 x concentraia acidului uric (M) + 11,2 (77) r2/n = 0,9968/6 Pentru dreapta de calibrare (2) din figura 39B (domeniul de linearitate = 6 - 35 M), s-au obinut: ICL/ICL 100 = 0,655 x concentraia acidului uric (M) + 37,5 (78) r2/n = 0,9851/6 La concentraii mai mari de 50 M curbele de calibrare se aplatizeaz (figura 39A). Alura dreptelor obinute la cele dou valori ale raportului molar Co(II)/EDTA este asemntoare, semnale ceva mai mari nregistrndu-se la raport 0,8. Din acest motiv, n continuare se vor prezenta numai drepte obinute la raport molar Co(II)/EDTA = 0,8. Se d cte un exemplu de curb de calibrare ICL/ICL 100 n funcie de concentraia (M) acidului ascorbic dizolvat n ap (din figura 43), acidului cafeic dizolvat n aceton : ap = 70% (v/v) (din figura 45), acidului galic dizolvat n etanol : EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v) (din figura 46) i troloxului dizolvat n etanol : ap = 80% (v/v) (figura 47). Condiiile experimentale n care au fost obinute datele nregistrate sunt specificate n legendele figurilor., ale cror titluri sunt cele din tez.

Figura 39. Curbe de calibrare (I`CL/ICL x 100) n funcie de concentraia acidului uric. Curbe de calibrare. B. Domeniu de liniaritate. Curba (1): Raport molar
Co(II)/EDTA = 0,9 [cCo(II) = 0,804 10-3 M; cEDTA= 0,894 10-3 M]; cluminol = 2,26 10-4 M; cH2O2 = 2 x 10-4 M (soluie n ap). Vinj = 70 L; Qtot. = 0,36 mL/min. Curba (2): Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 10-4 M; c H2O2 = 6 x 10-4 M (soluie n EDTA 2 x 10-4 M). Vinj . = 70 L. Qtot. = 0,45 mL/min. n ambele situaii experimentale fluxul transportor a fost o soluie de tampon borat 0,05M, pH 9, iar proba de comparaie a fost apa. Fiecare determinare a fost repetat de cel puin trei ori n zile diferite. Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare determinare. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezint SD

Figura 43. Curbe de calibrare (I`CL/ICL x 100) n funcie de concentraia acidului ascorbic. A. Curbe de calibrare. B. Domeniu de liniaritate Raport molar Co(II)/EDTA =
0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluie n EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 L. Flux transportor: soluie de tampon borat 0,05 M, pH 9 (soluie n ap). Proba de comparaie: apa. Fiecare determinare a fost repetat de cel puin trei ori n zile diferite. Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare determinare. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezint SD

17

18

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

Figura 45. Curbe de calibrare (I`CL/ICL x 100) n funcie de concentraia acidului cafeic obinute la raport molar Co(II)/EDTA = 0,8. A. Curbe de calibrare. B. Domeniile de liniaritate aferente. cEDTA= 10-3 M; cluminol = 2,3 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluie n
EDTA 2 x 10-4 M). , Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 L. Probele de solveni au fost supuse ultrasonrii (1 min.) naintea determinrilor, pentru o mai bun omogenizare i pentru ndeprtarea aerului. Flux transportor: soluie de tampon borat 0,05M, pH 9 (soluie n ap). Proba de comparaie: soluie de aceton 70% (v/v). Fiecare determinare a fost repetat de cel puin trei ori n zile diferite. Este prezentat un spectru tipic. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezint SD

Figura 47. Curba de calibrare (I`CL/ICL x 100) n funcie de concentraia Troloxului. n medalion este prezentat domeniu de liniaritate. Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8
(cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 10-4 M; cH2O2 = 8 x 10-4 M (soluie n EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 L. Flux transportor: soluie tampon borat 0,05M, pH 9, preparat n soluie de etanol 7% (v/v). Proba de comparaie: soluie de etanol 7% (v/v). Determinarea a fost efectuat de dou ori, n zile diferite. Este prezentat una dintre curbe. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezint SD

Figura 46. Curbe de calibrare (I`CL/ICL x 100) n funcie de concentraia acidului galic. A. Curbe de calibrare. B. Domeniile de liniaritate aferente. Raport molar
Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluie n EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 L. Probele de solveni au fost supuse ultrasonrii (1 min.) naintea determinrilor, pentru ndeprtarea aerului. Flux transportor: soluie de tampon borat 0,05M, pH 9, preparat n soluie de etanol 7% (v/v). Proba de comparaie: amestec de etanol: soluie EDTA 2 x 10-4 M =7% (v/v). Fiecare determinare a fost repetat de cel puin trei ori n zile diferite. Este prezentat un spectru tipic. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezint SD

Ecuaiile dreptelor de calibrare prezentate anterior sunt urmtoarele: Pentru dreapta de calibrare prezentat n figura 43B (domeniu liniar = 6 - 30 M) ICL/ICL 100 = 1,39 x concentraia acidului ascorbic (M) + 11,5 (89) r2/n = 0,9866/5 Pentru dreapta de calibrare prezentat n figura 45B (domeniu liniar = 4 - 50 M) ICL/ICL x 100 = 0,661 x concentraia acidului cafeic (M) + 10,5 (93) r2/n = 0,9988/6 Pentru dreapta de calibrare prezentat n figura 46B (domeniu liniar = 6 - 75 M) ICL/ICL x 100 = 0,580 x concentraia acidului galic (M) + 7,52 (96) r2/n = 0,9963/5 Pentru dreapta de calibrare prezentat n figura 47 medalion (domeniu liniar = 6 200 M, cu excepia celor trei puncte marcate cu cerculee roii) ICL/ICL 100 = 0,269 x concentraia Trolox (M) + 4,84 (98) r2/n= 0,9931/6 Au fost calculate urmtoarele RSD pentru diferite valori ale concentraiilor AO studiai (indicate ntre paranteze) i pentru 10 determinri/prob: 2,41% (cacid galic = 35 M); 2,98 % (cacid ascorbic = 20 M) i 1,0% (cacid uric = 8 M).

19

20

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

5.4. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor probe reale etoda FIA-CL studiat a fost aplicat la determinarea TAC dintr-o multitudine de probe reale: vinuri, ceaiuri (infuzii), sucuri de fructe, buturi rcoritoare necarbonatate, extracte vegetale, suplimente alimentare (comprimate) i produse cosmetice. De asemenea, s-a studiat variaia TAC a unui extract de Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae) la iradiere cu radiaii . Datele experimentale au fost comparate cu date din literatur. Pentru o serie de determinri rezultatele obinute prin metoda FIA-CL elaborat au fost comparate cu rezultatele obinute la determinarea prin metode spectrofotometrice a coninutului n fenoli totali (TP), flavonoide, antociani i a activitii antioxidante prin metoda DPPH.

n proba de vin analizat s-a determinat o concentraie care difer de valoarea determinat prin metoda direct cu mai puin de 3%. Aceasta dovedete c n cazul metodei studiate efectele de matrice sunt reduse. De altfel, literatura confirm faptul c specii ne-fenolice precum glucoz, etanol, acid tartaric i metabisulfitul de sodiu, mpreun sau individual, dau semnale de CL foarte mici i astfel nu interfer n determinrile compuilor fenolici [146]. 5.4.2. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor ceaiuri S-a determinat TAC a cinci infuzii (1,5 g material vegetal n 100 mL ap distilat clocotit; timp de infuzie cca. 15 minute) din plante medicinale cumprate din magazine locale. Valorile TAC s-au situat ntre 37,4 i 238 mg echivaleni acid galic/200 mL infuzie. Ceaiul verde i cel negru au cele mai mari TAC (238, fa de 129 mg echivaleni acid galic/200 mL). Rezultatele obinute sunt n concordan cu datele raportate n literatur [156, 489]. TAC a ceaiului negru este mai mic dect a ceaiului verde, deoarece n timpul oxidrii mare parte din coninutul n catechine al ceaiului verde este transformat n produi de oxidare ca tearubine i teaflavine, ceea ce duce la scderea capacitii antioxidante [489]. 5.4.3. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor sucuri de fructe i a unor buturi necarbonatate S-au analizat trei soiuri de mr, un soi de par cu i fr exocarp, precum i banane, kiwi, portocale i lmi. Sucurile s-au obinut cu ajutorul unui blender i centrifugare. Acestea au fost analizate imediat. De asemenea, s-a determinat TAC a dou probe de sucuri obinute n mod similar din fructele speciilor Vaccinium oxycoccos L. (merioare) i Hippophae rhamnoides L. (ctin). Fructele de pdure au fost pstrate congelate (- 18 C). Sucurile de merioare i ctin au fost analizate imediat dup obinere i dup ce au stat 24 de ore la temperatura camerei, n vase bine nchise. Valorile TAC ale sucurilor analizate imediat dup obinere au fost cuprinse ntre 4,23 i 37,5 mg echivaleni acid ascorbic/100 g fructe proaspete. Cea mai mare TAC au avut sucurile din merioare (16,5 mg echivaleni acid ascorbic/100 g) i ctin (21 mg echivaleni acid ascorbic/100 g), urmate de sucurile de citrice. Fructele prelucrate cu coaj au avut o TAC mai mare dect cele fr coaj, aspect semnalat i de literatur [115]. TAC a sucurilor analizate dup 24 ore a sczut cu cca. 40%, ceea ce justific alegerea modului de preparare a sucurilor i este n conformitate cu datele din literatur [113, 115]. De asemenea, s-au determinat valorile TAC pentru apte buturi rcoritoare necarbonatate comercializate pe piaa romneasc, i anume: Nestea de Piersici, Lipton Ice Tea de Piersici, Prigat Nectar de Pere, Prigat Nectar de Piersici, Prigat de Kiwi, Granini de Banane, i suc de mere Tymbark.

5.4.1. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor probe de vin S-au analizat patru probe de vin produse n Romnia, dou roii (Cabernet i Snge de taur) i dou albe (Feteasc i Sauvignon Blanc). Valorile TAC determinate au fost cuprinse ntre 0,19 i 0,55 g echivaleni acid galic/L vin i ntre 0,44 i 1,78 g echivaleni acid cafeic/L vin. Vinurile roii au prezentat o TAC de cca. 2 ori mai mare dect cele albe. Datele sunt n concordan cu cele raportate de literatur [156, 165, 166, 458, 489, 490]. Pentru verificarea acurateii rezultatelor, s-a aplicat metoda adiiilor standard cu aducere la acelai volum. Pentru aceasta, la o prob de vin rou Cabernet (diluat 1/200 cu soluie apoas de EDTA 2 x 10-4 M) s-au adugat volume cunoscute dintr-o soluie standard de acid galic 10-3 M (preparat n soluie apoas de EDTA 2 x 10-4 M). Concentraiile de acid galic adugate n prob au fost de: 0, 10, 20, 30, 40 i 50 moli/L. Probele au fost analizate cu ajutorul metodei studiate. n figura 48 se prezint rezultatele obinute.

Figura 48. Rezultatele experimentale obinute la aplicarea metodei adiiilor standard. Determinrile au fost efectuate n urmtoarele condiii experimentale: raport molar
Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluie n EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 L. Flux transportor: tampon borat 0,05 M, pH 9 ( soluie n ap). Proba de comparaie: apa.

21

22

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

Valorile TAC ale buturilor rcoritoare necarbonatate analizate au variat de la 5,46 la 66,9 mg echivaleni acid ascorbic/100 mL suc i ntre 3,20 i 104 mg echivaleni acid uric/100 mL suc. Dintre probele analizate, sucul de mere Tymbark a prezentat cea mai mare TAC. Rezultatele obinute prin metoda dezvoltat sunt n concordan cu cele raportate n literatur [113, 399, 408, 412, 489]. Fa de cantitatea de acid ascorbic declarat de unii productori, valorile determinate prin metoda FIA-CL dezvoltat au fost mai mari, pentru c n probele analizate sunt prezeni i ali AO. 5.4.4. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte din fructe de Rubus idaeus L. i Vaccinium myrtillus L. Au fost analizate apte extracte obinute n aceton 70% (v/v) cu un blender i centrifugare din fructe ale unor soiuri ameliorate aparinnd speciilor Rubus idaeus L. (zmeur, Rosaceae) i Vaccinium myrtillus L. (afin, Ericaceae). Aceste fructe au fost furnizate de ctre Institutul de Cercetare Dezvoltare pentru Pomicultur Piteti Mrcineni. S-a determinat TAC att pentru extractele proaspete, ct i dup 90 zile, timp n care soluiile acetonice au fost pstrate n frigider (+ 4C), n sticle brune, bine nchise. Valorile TAC determinate (mg echivaleni acid cafeic/100 g fruct) s-au situat ntre 135 i 192 pentru zmeur i ntre 146 i 223 pentru afine. Aceste date sunt n concordan cu cele din literatur [193-196]. Totodat, TAC a sczut cu 50% fa de valoarea iniial (excepie fcnd o singur prob), dup trei luni de pstrare n frigider. Aceast comportare este semnalat i de literatur [265, 266]. 5.4.5. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte din plante 5.4.5.1. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte din plante aparinnd familiei Lamiaceae, obinute prin macerare S-au analizat 10 extracte din plante din familia Lamiaceaae: Satureja hortensis L., (cimbru) Leonorus cardiaca L. (talpa-gtei), Lavandula officinalis Chaix et Vill (levnic), Ocinum basilicum L. (busuioc), Mentha langifolia L. (ment), Melissa officinalis L. (roini), Hyssopus officinalis L. (isop), Thymus serpyllum L. (cimbrior), Origanum majorana L. (mghiran), Origanum vulgare L. (oregan) obinute prin macerare (raport material vegetal: solvent de extracie = 1: 10, m/v; 5 zile) n etanol 96% (probe realizate de un colectiv al INCDIE ICPE SA, Bucureti). Acestea au fost apoi redizolvate 1:1 (m/v) n etanol: ap = 80% (v/v) i s-au analizat. TAC a extractelor vegetale analizate s-a situat ntre 0,90 i 125 echivaleni mg acid cafeic/g extract. Dintre probele analizate, extractele de oregan i mghiran au cele mai mari valori ale TAC. Cimbriorul a avut o valoare TAC mult mai mare dect cimbrul (53,4 fa de 0,90 mg acid cafeic/g). Valorile TAC obinute prin FIA-CL dezvoltat au fost comparate cu date din literatur [499-505].

5.4.5.2. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor extracte de Rosmarinus officinalis L. iradiate cu radiaii S-a studiat variaia TAC cu creterea dozei de iradiere a unui extract de R. officinalis L. (rozmarin, Lamiaceae). Extractul uscat, obinut prin extracie continu cu Soxhlet n etanol 96% (raport material vegetal: solvent de extracie = 1: 10, m/v; 10 ore), a fost iradiat cu doze cuprinse ntre 2,5 i 320 kGy (probe realizate de un colectiv al INCDIE ICPE SA, Bucureti) [12]. S-au analizat extractul neiradiat i cele iradiate, dizolvate (10 mg/10 mL) n aceton : EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v) i etanol : EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v). Soluiile extractului neiradiat au fost diluate 1:30 naintea analizelor. n aceleai condiii, soluiile acetonice s-au diluat 1:40. iar soluiile etanolice 1:20. S-a lucrat n aceleai condiii experimentale n ambele situaii experimentale, cu dou excepii: fluxul transportor de tampon borat 0,05M, pH 9 (care a fost preparat n ap pentru analiza soluiilor acetonice, respectiv n etanol 7%, v/v pentru analiza soluiilor etanolice) i proba de comparaie (ap pentru analiza soluiilor acetonice i etanol: EDTA 2 x 10-4 M =7%, v/v pentru analiza soluiilor etanolice). Nu s-au constatat variaii semnificative ale valorilor TAC determinate n cele dou situaii experimentale. n figura 50 se prezint TAC determinat prin FIA-CL a probelor preparate n aceton: EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v).

Figura 50. Capacitatea antioxidant total (TAC) depinde de doza de iradiere cu radiaii a extractului de rozmarin. Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M);
cluminol = 2,3 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluie n EDTA 2 x 10-4 M); Vinj. = 70 L; Qtot = 0,45 mL/min. Probele, preparate n amestec aceton: EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v) au fost supuse ultrasonrii (30 s) naintea determinrilor, pentru ndeprtarea aerului coninut. Flux transportor: tampon borat 0,05M, pH 9, preparat n ap. Proba de comparaie: apa. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 5.2.4.

Dup cum se poate vedea n figura 50, cu creterea dozei de iradiere valorile TAC au crescut, apoi au sczut, astfel nct extractul iradiat la 40 kGy a prezentat aproximativ aceeai TAC cu a extractului neiradiat.

23

24

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

Creterea TAC din extractul de rozmarin iradiat cu doze 5 kGy ar putea fi consecina unor scindri ale unor structuri chimice, cu apariia unor intermediari activi, care contribuie la mbuntirea capacitii protectoare n raport cu extractul neiradiat [12]. Se pare c n timpul iradierii, n matricea vegetal au loc reacii n cascad, n urma crora se formeaz intermediari precum carnosolul, cu activitate antioxidant (figura 51). Carnosolul poate bloca RL, trecnd n rosmanol [12] care, la rndul su, poate reaciona cu un alt RL, continund lanul de reacii. Prezena unor astfel de compui n extractele de rozmarin ar putea explica intensificarea activitii antioxidante a extractului de rozmarin, care a fost observat dup expunerea la radiaii mai mici de 40 kGy.

UAE (60 minute) (probe obinute de ctre un colectiv de cercettori de la Institutul de Chimie Organic C.D. Neniescu, Bucureti) [161]. Pentru determinarea TAC, extractele au fost apoi redizolvate (10 mg/10 mL) n aceton: EDTA 2 10-4 M = 70% (v/v). Valorile TAC ale extractelor vegetale studiate au variat ntre 28,6 i 7049 mg echivaleni acid galic/100 g dw i ntre 63,4 i 6061 mg echivaleni acid cafeic/100 g dw. TAC determinat pentru extractele obinute prin extracie continu au fost mai mari dect cele obinute prin extracie cu ultrasunete, cu excepia extractului de A. graveolens. n general, extractele de C. sinensis, R. officinalis i S. officinalis au avut o TAC mai mare dect P. sativum, A. graveolens i L. officinale. Extractele au fost analizate i prin metode spectrofotometrice convenionale [161], determinndu-se: - coninutul n TP, care a variat de la 60,0 la 3455 mg echivaleni acid galic/100 g dw, de la 21,0 la 2739 mg echivaleni acid cafeic/100 g dw i de la 103 la 4581 mg echivaleni acid ferulic/100 g dw. - coninutul n flavonoide, care s-a situat ntre 56,3 i 345 mg echivaleni quercetol /100 g dw. Rezultatele acestui studiu sunt n concordan cu datele de literatur n ceea ce privete coninutul n TP i flavonoide pentru cteva extracte de plante [184, 504, 515-517, 457]. S-a efectuat o corelaie ntre valorile TAC determinate prin metoda FIA-CL elaborat i cele ale coninutului n TP determinate prin metoda convenional FolinCioclteu pentru toate cele ase probe analizate. Cele mai bune corelaii s-au obinut pentru extractele obinute prin metoda cu extractorul Soxhlet cnd cei doi parametrii urrmrii au fost exprimai n echivaleni acid galic (r2 = 0,9821) i pentru extractele obinte prin UAE cnd TAC i TP au fost raportai n echivaleni acid cafeic (r2 = 0,9648) [161]. 5.4.5.4. Determinarea capacitii antioxidante i a coninutului n polifenoli a unor legume Au fost analizate extracte din Brassica oleracea L. var. capitata f. rubra (Brassicaceae, varza roie), Allium cepa L. (Alliaceae, ceapa roie sau purpurie) i Beta vulgaris L. (Chenopodiaceae, sfecla roie), obinute prin extracie continu, cu extractorul de tip Soxhlet i UAE. S-a lucrat cu materiale vegetale n stare proaspt. S-a folosit etanol 96% (raport material vegetal: solvent de extracie = 1: 10, m/v; 2 ore) [207]. Extractele au fost obinute de un colectiv de cercettori de la Institutul de Chimie Organic C.D. Neniescu, Bucureti [207]. Pentru determinarea TAC, extractele obinute au fost redizolvate (100 mg/10 mL) n etanol: EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v).

Figura 51. Mecanismul oxidrii n cascad a acidului carnosinic [12] 5.4.5.3. Determinarea capacitii antioxidante totale i a coninutului n polifenoli a unor extracte vegetale obinute prin extracie continu i extracie cu ultrasunete S-au analizat ase extracte din plante aromate i medicinale aparinnd familiei Apiaceae (Anethum graveolens L. mrar; Levisticum officinale L. Koch., leutean; Petroselinum sativum Hoffm., ptrunjel), Lamiaceae (R. officinalis L., rozmarin; Salvia officinalis L., salvie) i Theaceae (Camellia sinensis (L.) Kuntze, ceai verde). Extractele au fost obinute n etanol 96% (raport material vegetal: solvent de extracie = 1: 10, m/v) prin extracie continu (6 ore) cu extractorul de tip Soxhlet i

25

26

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

Valorile TAC ale extractelor vegetale obinute prin metoda continu cu extractorul Soxhlet variaz ntre 37,5 i 379 mg echivaleni acid galic /100 g plant proaspt, iar pentru extractele obinute prin UAE ntre 35,5 i 586 mg/100 g. Extractele au fost analizate i prin metode spectrofotometrice [207], determinndu-se: - capacitatea antioxidant prin metoda DPPH. Evaluarea activitii antioxidante a celor trei extracte analizate s-a realizat n termeni de scdere a absorbanei DPPH (%), comparativ cu rutinolul i cianidolul, ca standarde. Extractele analizate reduc absorbana DPPH cu 24,4 77,4%. Cea mai mare activitate antioxidant a fost determinat n extractul de varz roie (77,4% pentru o concentraie de 0,1 mg/mL) obinut prin tratare cu ultrasunete, comparativ cu rutinolul (88,7%, concentraia standardului fiind de 0,1 mg/mL). Comparnd activitatea de ndeprtare a radicalului de ctre extracte cu activitatea cianidolului (63%) n concentraie de 0,1 mg/mL, se poate concluziona c nu numai antocianii sunt responsabili pentru activitatea antioxidant a extractelor, ci i ali polifenoli contribuie la aceasta. Valorile activitii antioxidante determinate cu metoda DPPH variaz n aceeai ordine cu valorile TAC determinate prin noua metod FIA-CL. - coninutul n TP. Pentru extractele obinute cu extractorul de tip Soxhlet coninutul n TP a variat de la 61,3 la 411 mg echivaleni acid galic/100 g plant proaspt, iar cel al extractelor obinute prin UAE ntre 76,9 i 521 mg echivaleni acid galic/100 g. Coninutul n TP al extractelor analizate sunt n concordan cu valorile TAC determinate prin FIA-CL, ceea ce demonstreaz contribuia polifenolilor la TAC a plantelor i care, totodat, demonstreaz faptul c FIA-CL este o metod eficient pentru determinarea TAC a unor probe reale. - coninutul n flavonoide, care s-a situat ntre 13,4 i 108 mg echivaleni rutinol/100 g plant proaspt pentru extractele obinute prin extracie continu i ntre 7,32 i 79,4 mg echivaleni rutinol/100 g pentru extractele obinute prin UAE. - coninutul n antociani, care a variat ntre 8,05 i 164 mg echivaleni cianidol/100 g plant proaspt la extractele obinute cu extractorul Soxhlet i ntre 7,29 i 55,4 mg echivaleni rutinol/100 g pentru cellat tip de extracte. S-a constatat c extractele de varz roie sunt bogate n flavonoide i antociani. Extractele de sfecl roie s-au caracterizat prin valori mici ale cantitilor de polifenoli i TAC. Rezultatele prezentate sunt n concordan cu datele din literatur [312, 502, 518, 520 - 522].

5.4.6. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor probe de comprimate de Spirulin 500 mg supliment alimentar Prin metoda FIA-CL dezvoltat s-a determinat TAC a trei probe de comprimate de Spirulin 500 mg supliment alimentar de la productori diferii (Ozone, Walmark i Hofigal), care au fost centrifugate (0,5 g/14 mL) n soluii etanolice de concentraii diferite: 7% (v/v), respectiv 80% (v/v). n cazul probelor preparate n etanol 80% (v/v) valorile TAC au fost de cca. dou ori mai mari dect n cazul probelor pentru care s-a folosit etanol 7% (v/v), ceea ce confirm capacitatea de extracie mult mai mare a etanolului 80% (v/v). Dintre probele analizate s-a evideniat, cu o valoare superioar a TAC, produsul comercializat de Hofigal. 5.4.7. Determinarea capacitii antioxidante totale a unor produse cosmetice S-au analizat dou probe de creme i una de gel de la doi productori diferii: Hofigal Activ. Crem pentru prevenirea i atenuarea ridurilor (productor Hofigal); Crem pentru mini (productor Cosmetic plant) cu extract de glbenele, vitamina A i F i respectiv Plant Intim gel (productor Hofigal). Cele trei produse cosmetice au fost supuse extraciei discontinue cu etanol: EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v) i aceton: EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v). Dup centrifugarea extractelor obinute (3 000 rpm, 7 min.) supernatantele au fost filtrate, inute la frigider (+ 4C) peste noapte, a II-a zi din nou filtrate i diluate (cu excepia probei notate P3) 1:10 (v/v) naintea determinrilor. Valorile TAC au variat ntre 7,53 i 405 echivaleni mg acid galic/100 g produs atunci cnd solventul folosit la extracia principiilor active a fost acetona 70% (v/v). Cnd solventul de extracie a fost etanolul 80% (v/v), valorile TAC au fost mai mici, situndu-se ntre 24 i 72,6 echivaleni mg acid galic/100 g. Produsele Hofigal analizate au avut valori TAC mai mari atunci cnd extraciile au fost fcute n aceton, pentru c o mai mare parte din AO din produsele cosmetice analizate se dizolv mai bine n acest solvent.

27

28

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

6. DETERMI AREA I TRACELULAR A VARIAIILOR CO CE TRAIILOR IO ILOR DE CA2+ CITOSOLIC CO DIII DE STRES OXIDATIV -au folosit celule de Saccharomyces cerevisiae cu diferite mutaii implicate n transportul i homeostazia calciului. n celulele acestei drojdii se regsesc o serie de procese metabolice conservate. Calciul reprezint unul din mesagerii secundari cu rol major n declanarea rspunsului celulelor eucariote la diferii factori de stres (prin diverse mecanisme de semnalizare mediat de Ca2+) ca de exemplu: stres hiper- i hipotonic i stres generat de temperaturi joase [548, 549], stres hiperosmotic i stresul salin [550], generarea intracelular de H2O2 de ctre feniletilamin [551], stres alcalin [552]. Scopul acestui studiu a fost acela de a demonstra c ionii de Ca2+ sunt implicai n rspunsul celulelor la stresul oxidativ, aspect nesemnalat de literatur. Determinarea semnalului mediat de Ca2+ este dificil, deoarece acest semnal se transmite datorit unor modificri brute (creteri) i de scurt durat (ms) a [Ca2+]cit. Pentru a evalua influxul de calciu s-a aplicat tehnologia aequorinei recombinante (recombinant aequorin technology) cu detecie bioluminescent [531]. Este o metod non-invaziv, care permite msurarea i compararea fluctuaiilor de calciu simultan n diferite organite sau compartimente i, prin urmare, evaluarea contribuiei lor relative la rspunsul obinut la stimul [531, 569].

Figura 56. Mecanismul emisiei luminii de ctre aequorin (dup [531]) Prin msurarea radiaiei luminoase astfel emise se pot evidenia variaiile [Ca2+]cit. 6.5.4.2. Monitorizarea in vivo a pulsurilor ionilor de Ca2+ induse de stresul oxidativ Monitorizarea calciului citosolic a fost efectuat prin utilizarea sistemului de expresie ADNc pentru apoaequorin [586]. Celulele de drojdie au fost transformate cu plasmidul pYX212-cytAEQ [571]. Acest plasmid conine n structura sa o secven ADN care codific apoaequorina i permite exprimarea exclusiv citosolic a genei aequorinei n celule de S. cerevisiae. Transformarea drojdiei a fost realizat utiliznd metoda cu acetat litiu modificat [588]. S-a monitorizat variaia [Ca2+]cit ca rspuns la stresul oxidativ indus de H2 O2 i de hidroxidul de ter-butil (tBOOH). Pentru aceasta, s-a urmrit emisia luminii cu un luminometru. S-a nregistrat intensitatea bioluminescenei (1 citire/s), care a fost raportat n uniti relative de luminescen (RLU). S-a reprezentat grafic variaia intensitii bioluminescenei (RLU) pe 107 celule n timp (s), dar i rspunsul relativ maxim n funcie de concentraia unui oxidant. Rspunsul relativ maxim reprezint raportul dintre intensitatea luminescenei nregistrat n prezena unui stimul la fiecare secund i media intensitii luminescenei pentru suspensia celular (celule neexcitate) monitorizat timp de 1 minut (sau de cte ori a crescut semnalul n prezena unui stimul/stresor fa de linia de baz). 6.6.1. Rspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la H2O2 n figura 59A se prezint variaiile intensitii de luminescen nregistrate pentru celulele liniei parentale (wild-type, WT) supuse stresului oxidativ indus de H2O2 n concentraii de 0,5 10 mM. Se observ c H2O2 a iniiat creteri imediate i picuri luminescente de scurt durat, indicnd creteri brute de Ca2+ citosolic. Pulsurile de calciu au putut fi nregistrate pentru concentraii sczute, de pn la 0,5 mM. O cretere abrupt urmat de o scdere rapid a luminescenei cauzate de [Ca2+]cit au putut fi observate pentru concentraii 2 mM.

6.4.1. Aequorina, protein bioluminescent Aequorina este o protein Ca2+-dependent, alctuit din apoaequorin (avnd un singur lan polipeptidic, M = 21 kDa) i cofactorul coelenterazin (M = 400 Da). Substratul oxigen-preactivat, 2-hidroperoxicoelenterazina este legat ferm dar nu covalent, de apoprotein [569, 573-575]. 6.5. Determinarea rspunsului mediat de ionii de Ca2+ la condiii de stres oxidativ printr-o metod bazat pe bioluminescen 6.5.2. Mecanismul emisiei luminii de ctre aequorin Coelenterazina este o molecul hidrofob. Ea ptrunde n celul i, n prezena oxigenului molecular i a ionilor de Ca2+, cele dou componente structurale ale aequorinei reconstituie spontan proteina funcional, capabil s emit lumin n prezena calciului [569]. Cnd cele trei situsuri de legare a Ca2+ sunt ocupate cu aceti ioni, aequorina sufer o modificare structural, se comport ca o oxigenaz care transform coelenterazina ntr-o form excitat, coelenteramida i se elibereaz CO2. Coelenteramida se relaxeaz la starea fundamental i emite lumin albastr ( = 469 nm). n figura 56 este prezentat mecanismul de aciune al aequorinei, implicnd emiterea luminii [531, 568, 573].

29

30

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

Figura 59. Rspunsul celulelor la diferite concentraii de H2O2. A. Efectul H2O2 asupra intensitii lumiscenei celulelor. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 6.5.4. Sgeata indic momentul adugrii H2O2. B. Rspunsul relativ maxim al celulelor supuse ocurilor oxidative cu H2O2. Fiecare determinare a fost repetat de cel
puin trei ori n zile diferite; nu s-au nregistrat variaii semnificative (P < 0,05). RLU: uniti relative de luminescen.

n figura 59B se prezint rspunsul relativ maxim al celulelor supuse ocurilor oxidative prin adugarea n mediul de cultur a H2O2 n concentraii cuprinse ntre 0,5 i 10 mM. Se constat c pentru celulele WT transformate cu plasmidul pYX212-cytAEQ amplitudinea pulsului crete odat cu creterea concentraiei de H2O2. n aceleai condiii, tratamentul cu H2O2 al celulelor transformate cu vectorul nul pYX212 (de control) nu prezint rspuns luminescent. 6.6.2. Mobilizarea ionilor de Ca2+ sub aciunea stresului oxidativ indus de H2O2 n figura 60 se prezint efectul expunerii la H2O2 a liniei parentale i a liniilor nul mutante cch1, mid1 i yvc1, n absena i n prezena agentului de complexare (1,2-bis(o-aminofenoxi)etan- N,N,N',N'-tetraacetic acid) (BAPTA). n absena BAPTA, expunerea celulelor liniei slbatice la H2O2 (concentraie final 2 mM, subletal) a dus la obinerea unor picuri de luminescen caracterizate de cretere brusc i de scurt durat. Creterea intensitii luminoase este cauzat de creterea concentraiei de Ca2+ din citosol (figura 60A). Dup expunerea la H2O2, comportamentul celulelor liniilor nul mutante cch1 i mid1 (crora le lipsesc genele care codific componentele canalului de calciu Cch1p/Mid1p din membrana plasmatic) este diferit. Astfel, comparativ cu semnalul dat de celulele liniei WT semnalul corespunztor fluxului de ioni de Ca2+ a sczut aproape la jumtate n celulele cch1 (figura 60B), n timp ce creterea [Ca2+]cit pentru linia mutant mid1 este mai mare (figura 61C). Aceasta sugereaz c Cch1p este parial responsabil pentru influxul de Ca2+ la aplicarea stresului oxidativ indus de H2O2, acionnd probabil independent de Mid1p. Figura 60. Expunerea la H2O2 a liniilor celulare testate, n absena i n prezena agentului de complexare BAPTA. Tulpinile izogene exprimnd coelentarazina
reconstituit cytAEQ au fost expuse ocului oxidativ indus de H2O2 (concentraie final 2 mM). BAPTA (concentraie final 5 mM)a fost adugat cu 1 minut naintea introducerii H2O2. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 6.5.4. Sgeile indic momentul adugrii H2O2. Fiecare determinare a fost repetat de cel puin trei ori n zile diferite, nu s-au nregistrat variaii semnificative (P <0,05). Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare tulpin testat: (A). WT; (B). Nul mutant cch1; (C) Nul mutant mid1; (D) WT pretratat cu BAPTA; (E). Nul mutant cch1 pretratat cu BAPTA; (F). Nul mutant mid1 pretratat cu BAPTA; (G). Nul mutant yvc1; (H). Nul mutant yvc1 pretratat cu BAPTA. RLU: uniti relative de luminescen.

Creterea concentraiei ionilor de Ca2+ citosolic, ca rezultat la expunerea celulelor la H2O2, a fost atenuat de prezena chelatorului ionilor de Ca2+ BAPTA, sugernd astfel c fluxul de Ca2+ provine parial din exteriorul celulelor. Se observ c tratamentul cu BAPTA asupra ambelor linii celulare cch1 (figura 60E) i mid1 (figura 60F) au atenuat influxul de ioni de Ca2+ la nivele comparabile cu cele detectate n cazul celulelor liniei slbatice tratate cu BAPTA (figura 60D), indicnd astfel c sub influena stresului oxidativ indus de H2O2,

31

32

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

calciul extracelular poate ptrunde n citosol prin intermediul unui transportor care este diferit de canalul Cch1p/Mid1p. Adugarea de BAPTA nu a suprimat complet creterea semnalului analitic, sugernd c, dup expunerea la H2O2, resursele interne sunt de asemenea mobilizate. Plecnd de la aceast observaie, a fost monitorizat fluxul de ioni de Ca2+ indus de H2 O2 i n celule crora le lipsete Yvc1p, canalul membranar vacuolar responsabil pentru eliberarea Ca2+ din vacuole n citosol. Din figura 60G se observ c amplitudinea pulsului de Ca2+ nregistrat n absena complexantului BAPTA este mult mai mic dect a picului celulelor WT. Acest pic rezidual a fost practic eliminat prin adugare de BAPTA (figura 60H) sugernd c pulsul de calciu de intensitate mic observat n celulele de yvc1 a fost rezultatul influxului de Ca2+ din exteriorul celulei. Avnd n vedere aceste aspecte i faptul c semnalul de luminescen al celulelor liniei slbatice a sczut cu cca. 50% n prezen de BAPTA (figura 60 A i D) se poate concluziona c ionii de Ca2+ pot proveni din exteriorul celulei dar i prin eliberarea din vacuol de ctre Yvc1p [295], printr-un feedback pozitiv [563, 564]. 6.6.3 Adaptarea celulelor la stresul oxidativ A fost investigat dezvoltarea celulelor n medii suplimentate cu stresori oxidativi pe linii celulare mutante care au prezentat diferite nivele tranzitorii ale Ca2+ citosolic. S-a observat c n cazul liniilor celulare cch1 i yvc1, tolerana la H2O2 i tBOOH a fost mai ridicat dect n cazul celulelor liniei slbatice, deci nivelul mai sczut al creterii Ca2+ citosolic n timpul stresului oxidativ poate fi un efect de protecie a creterii celulare. Linia celular mid1 a prezentat cea mai mare i brusc eliberare a ionilor de Ca2+ n prezena stresorilor. Explicaia const n aceea c aceast linie celular a fost puin mai sensibil fa de linia slbatic i considerabil mai sensibil dect liniile celulare cch1 i yvc1 la stresul oxidativ. Suplimentarea mediului cu chelatorul de Ca2+ glicol-bis(2-aminoetileter), , , -tetraacetic acid (EGTA) a crescut tolerana celulelor la oxidani. Suplimentarea mediului cu Ca2+ a dus la creterea sensibilitii fa de H2O2. S-a constatat c celulele yvc1, au fost cele mai tolerante la H2O2. Aceste observaii sugereaz faptul c ansele de supravieuire a celulelor sunt mai mari dac [Ca2+]cit n timpul ocurilor oxidative sunt mici [295]. 6.6.4. Mobilizarea ionilor de Ca2+ n celule expuse la concentraii letale de H2O2 Pentru a determina dac celulele se comport diferit atunci cnd sunt supuse stresului oxidativ mai intens, celulele liniilor parental i yvc1 au fost expuse la concentraii letale de H2O2 (10 mM), n prezena i absena complexantului BAPTA. n ambele situaii experimentale semnalele nregistrate pentru celulele WT au

prezentat aproximativ aceeai amplitudine, indicnd faptul c n condiii de stres oxidativ letal, celulele se bazeaz n principal pe depozitele de Ca2+ intracelular. Celulele yvc1 au prezentat o slab luminescen mediat de Ca2+ sugernd faptul c atunci cnd celulele se confrunt cu concentraii letale, de H2O2 celulele utilizeaz vacuolele ca principal surs pentru ca ionii de Ca2+ s fie direcionai n citosol [295]. Rspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la alchil-hidroperoxizi S-a monitorizat rspunsul mediat de ionii de Ca2+ dat de celulele acelorai linii (WT i nul mutante cch1, mid1 i cch1) la stresul oxidativ indus de tBOOH. Experimentele au fost asemntoare celor descrise la studierea comportamentului celulelor la expunerea la H2O2, iar rezultatele similare. Totui, n cazul expunerii liniilor celulare testate la ocul oxidativ indus de tBOOH, contribuia vacuolar pare mai sczut. De asemenea, gradul de mobilizare a calciului vacuolar nu este dependent de concentraia de tBOOH, spre deosebire de situaia ntlnit la determinrile [Ca2+] n condiiile stresului oxidativ indus de H2O2 [295]. 6.6.5. 6.7. Influena unor antioxidani i a unor extracte vegetale asupra rspunsului mediat de ionii de Ca2+ n condiii de stres oxidativ -a studiat influena vitaminei C i a unui extract alcoolic din smburi de struguri albi caracterizat printr-un coninutul n TP de 29 mg echivaleni acid galic/100 g material vegetal uscat i o cantitate de flavonoide de 13 mg echivaleni quercetol/100 g). asupra rspunsului mediat de Ca2+ al celulelor liniei parentale supuse stresului oxidativ indus de H2O2. Msura n care prezena AO are sau nu rol protector mprotriva stresului oxidativ indus de H2O2 a fost determinat prin nregistrarea semnalului luminescent mediat de ionii de Ca2+ i compararea cu semnalul nregistrat n absena sa.

6.7.1. Influena vitaminei C asupra rspunsului mediat de ionii de Ca2+ n condiii de stres oxidativ Celulele WT au fost supuse stresului oxidativ indus de concentraii de H2O2 subletale (2 mM), respectiv letale (10 mM). Peste suspensiile celulare s-a adugat apoi vitamina C (5 mM, concentraie final). Rezultatele sunt prezentate n figura 67.

33

34

Rezumatul tezei

Rezumatul tezei

Figura 67. Efectul vitaminei C asupra rspunsului mediat de ionii de Ca2+ dat de celulele supuse stresului oxidativ indus de H2O2. Concentraia final a vitaminei C,
adugat direct n tubul luminometrului, a fost aceeai n ambele experimente (5 mM). Este prezentat un spectru pentru fiecare concentraie de H2O2: (A). 2 mM; (B). 10 mM. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 6.5.4. Sgeile indic momentul adugrii H2O2 i a vitaminei C.

n prezena H2O2 s-a nregistrat o cretere brusc i de scurt durat a intensitii luminescenei (indicnd creteri brute ale [Ca2+]cit), urmat de o scdere rapid a luminescenei (figura 67A). La adugarea vitaminei C, s-a nregistrat o scdere brusc a semnalului de luminescen (de cca. 2,5 ori) (figura 67A). n condiiile expunerii celulelor la oc oxidativ (figura 67B), scderea amplitudinii picului a fost nesemnificativ, ceea ce sugereaz c efectul protector al vitaminei C este limitat de concentraia oxidantului. Pentru a vedea dac vitamina C are, ntr-adevr, efect protector asupra celulelor supuse stresului oxidativ, sau scderea semnalului nregistrat este o posibil consecin a reaciei dintre acidul ascorbic i H2O2, n urmtoarele experimente celulele liniei parentale s-au tratat cu vitamina C imediat nainte de introducerea stresorului sau s-au pre-incubat 2, respectiv 5 ore cu vitamin C. Apoi celulele au fost expuse la H2 O2 i s-a determinat luminescena (figura 68). Dup cum se observ din figura 68A adugarea vitaminei C (2 mM, concentraie final) peste suspensia cu celule de tip WT a dus la o scdere brusc a semnalului de bioluminescen cu cca. 70% fa de semnalul dat de celulele netratate. Mrirea concentraiei AO la 5 mM (concentraie final) a avut drept consecin accentuarea pantei descendente a semnalului nregistrat, ceea ce confirm faptul c prezena vitaminei C modific rspunsul celulelor mediat de Ca2+. Introducnd direct n cuva luminometrului un volum de H2O2 corespunztor unei concentraii finale de 2 mM (subletal), semnalul a crescut, dar maximul picului a atins puin mai mult de 1/3 din nlimea picului nregistrat n situaia invers, cnd s-a adugat mai nti stresorul i apoi vitamina C. Aceeai tendin s-a nregistrat i n cazul introducerii oxidantului n concentraie final de 5 mM (datele nu sunt prezentate).

Figura 68. Evidenierea efectului protector al vitaminei C. A. Vitamina C a fost adugat direct n tubul luminometrului (sunt indicate concentraiile finale ale acesteia); B. suspensia de celule de tip slbatic WT a fost incubat 2 ore cu 20 mM vitamin C; C. suspensia de celule de tip slbatic WT a fost incubat5 ore cu 20 mM vitamin C. H2O2 a fost adugat direct n tubul luminometrului n concentraiile finale indicate. Fiecare determinare a fost repetat de trei ori n zile diferite, nu s-au nregistrat variaii semnificative (P <0,05). Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare tip de experiment. S-a lucrat conform modului de lucru descris n capitolul 6.5.4. Sgeile indic momentul adugrii H2O2 i a vitaminei C. Din figura 68B se constat c n cazul pre-incubrii celulelor cu AO, semnalele nregistrate s-au diminuat semnificativ fa de amplitudinea semnalului obinut n absena vitaminei C (figura 67A, primul pic). Mrirea timpului de preincubare la 5 ore (figura 68C) nu a condus la modificri semnificative ale rezultatelor experimentale. Totui, n acest caz (incubare 5 ore) s-a nregistrat o uoar cretere a valorii semnalului fa de semnalul prezentat n figura 68B (timp de incubare 2 ore). Acest aspect poate fi explicat prin aceea c vitamina C e sensibil la temperatur i mai puin stabil n timp. Valoarea semnalului de luminescen a sczut n prezena vitaminei C sub 10 000 RLU, indiferent dac celulele liniei slbatice testate au fost pre-incubate cu vitamina C sau dac aceasta s-a introdus direct n tubul luminometrului. Aceste rezultate conduc la ideea c este posibil ca vitamina C s ofere protecie celulelor mpotriva stresului oxidativ indus de H2O2. Rezultate similare s-au obinut i cnd s-a testat efectul protector al extractului vegetal.

35

36

Concluzii generale

Concluzii generale

CO CLUZII GE ERALE
S-au realizat dou montaje i s-au elaborat noi metode FIA-CL pentru determinarea unor antioxidani i a capacitii antioxidante totale a unor probe reale (extracte vegetale, vinuri, buturi rcoritoare necarbonatate etc.). Rezultate reproductibile s-au obinut cu montajul FIA-CL cu 3 canale, prin care au fost pompate: un flux transportor de borat de sodiu, un flux de H2O2 i un flux de luminol/Co(II)/EDTA. S-a utilizat o celul n flux confecionat n laborator. S-a mbuntit programul de achiziie i prelucrare a datelor. S-au studiat i optimizat parametrii operaionali ai metodei. S-a studiat influena acetonei, etanolului i metanolului asupra semnalului de CL. S-a realizat o diminuare semnificativ a semnalului dat de etanolul coninut n probele de analizat prin pomparea unui flux transportor de borat de sodiu preparat n etanol: ap = 7% (v/v). Pentru a nltura posibilitatea interferenelor unor urme de ioni metalici, care ar putea aciona ca i catalizatori competitivi fa de Co(II), soluiile etanolice, acetonice i de H2O2 s-au preparat n EDTA 2 x 10-4 M. S-au trasat mai multe tipuri de curbe de calibrare, reprezentnd I`CL, ICL / ICL, ICL / (ICL - ICL) i I`CL / ICL x 100 n funcie de concentraia AO (M) sau I`CL / ICL x 100 n funcie de concentraia AO la scal logaritmic. Valoarea ICL corespunde semnalului de fond. Valoarea I`CL corespunde scderii semnalului ICL n prezena unei probe de AO (ICL), din care s-a sczut semnalul probei de comparaie. S-au ales curbele de calibrare ICL/ICL 100 n funcie de concentraia antioxidantului (M), pentru c acestea oglindesc cel mai bine complexitatea determinrilor analitice. S-au studiat cinci antioxidani n stare pur, n domeniile de concentraii indicate n parantez: acid uric (0,1 100 M), acid L- ascorbic (0,8 300 M), acid cafeic (1 1000 M), acid galic (2,5 300 M) i Trolox (2,5 500 M). Domeniile de liniaritate au variat n funcie de condiiile de lucru. De exemplu, la raportul molar optim Co(II)/EDTA = 0,8, domeniile liniare au fost: 6 40 M (pentru acidul uric); 6 30 M (pentru acidul ascorbic); 2,5 50 M (pentru acidul cafeic); 4 100 M (pentru acidul galic) i 6 200 M (pentru Trolox). S-au calculat RSD pentru diferite valori ale concentraiilor antioxidanilor studiai (indicate ntre paranteze) i pentru 10 determinri/prob. Acestea sunt: 2,41% (cacid galic = 35 M); 2,98 % (cacid ascorbic = 20 M) i 1,0% (cacid uric = 8 M). Metoda FIA-CL dezvoltat a fost aplicat pentru determinarea TAC a: patru probe de vin; cinci tipuri de ceaiuri (infuzii) medicinale; sucuri i extracte de la 10 tipuri de fructe; apte buturi rcoritoare necarbonatate; trei suplimente alimentare Spirulin 500 mg (comprimate) de la trei productori diferii; precum i trei tipuri (un gel, dou creme) de produse cosmetice. De asemenea, s-a determinat capacitatea antioxidant total a extractelor obinute din 12 specii de Lamiaceae, trei specii de Apiaceae i cte o specie de Theaceae, Brassicaceae, Alliaceae i Chenopodiaceae.

Extractele vegetale alcoolice, acetonice sau n ap analizate au fost obinute prin macerare, extracie continu (cu extractorul de tip Soxhlet), extracie asistat de ultrasunete i centrifugare. Din produsele cosmetice s-au obinut extracte acetonice prin metoda discontinu. S-a studiat variaia TAC a unui extract de Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae) la iradiere cu radiaii (doze cuprinse ntre 2,5 320 kGy). Exactitatea (acurateea) metodei dezvoltate a fost verificat la analiza unei probe de vin prin metoda adausurilor standard. Diferena ntre concentraia determinat prin metoda adausurilor i cea obinut prin metoda direct a fost mai mic de 3%. Aceasta dovedete c n cazul metodei studiate efectele de matrice sunt reduse. Sensibilitatea metodei FIA-CL dezvoltat pentru determinarea TAC a fost cu 2 - 3 ordine de mrime mai mare dect cele obinute n cazul metodelor spectrofotometrice utilizate, ceea ce este n conformitate cu datele raportate n literatur. S-au analizat 10 probe/or. Consumul de reactivi a fost de 3 mL/prob. S-au stabilit corelaii bune ntre rezultatele experimentale obinute cu metoda FIA-CL dezvoltat i cele obinute cu metode spectrofotometrice convenionale de determinare a coninutului de fenoli totali, flavonoide, antociani i a activitii antioxidante cu metoda DPPH. Rezultatele obinute au fost n concordan cu date reprezentative raportate n literatur. S-au determinat variaiile intracelulare ale concentraiilor ionilor de citosolic ([Ca2+]cit) n celule de Saccharomyces cerevisiae cu diferite mutaii implicate n transportul i homeostazia calciului, ca rspuns la stresul oxidativ indus de H2O2 i de hidroperoxidul de ter-butil (tBOOH) n absena/prezena unor AO (substane pure) i a unor extracte vegetale. Rezultatele prezentate n acest studiu dovedesc pentru prima dat faptul c stresul oxidativ exogen induce o cretere de scurt durat a [Ca2+]cit, ionii provenind att din exteriorul celulei ct i din vacuole. Atunci cnd se confrunt cu concentraii mai mari, letale, de H2O2, celulele utilizeaz vacuolele ca principal surs de calciu citosolic. n partea final a lucrrii s-a studiat influena prezenei vitaminei C i a unui extract din smburi de struguri (caracterizat din punct de vedere al coninutului n polifenoli) asupra semnalului analitic. Scderea semnalului luminescent mediat de ionii de Ca2+ n prezena acidului L-ascorbic i a extractului comparativ cu semnalul analitic obinut n absena acestora arat posibilul efect protector al acestora. Rezultatele ncurajatoare privind posibila influen benefic a vitaminei C i a extractului folosit n experimente asupra stresului oxidativ indus n celulele drojdiei S. cerevisiae pot constitui o direcie de cercetare n viitor.

37

38

Bibliografie selectiv

Bibliografie selectiv

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
12. S. Jipa, T. Zaharescu, W. Kappel, A.F. Danet, C.-V. Popa, M. Bumbac, L.M. Gorghiu and A.M. Mari, The effects of -irradiation on the antioxidant activity of rosemary extract. Optoelectron. Adv. Mat.-Rapid Commun., 2009, 3(12), 1315-1320 17. D.L. Giokas, A.G. Vlessidis and N.P. Evmiridis, On-line detection of antioxidants freeradical scavenging activity based on Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence by flow injection analysis. Anal. Chim. Acta, 2007, 589(1), 59-65 113. V. Kabasakalis, D. Siopidou and E. Moshatou, Ascorbic acid content of commercial fruit juices and its rate of loss upon storage. Food Chem., 2000, 70(3), 325-328 115. S.C. Achinewhu, Ascorbic acid content of some Nigerian local fruits and vegetables. Plant Food Hum. utr., 1983, 33(4), 261-266 146. C. Proestos, I. S, Boziaris, M. Kapsokefalou and M. Komaitis, Natural antioxidant constituents from selected aromatic plants and their antimicrobial activity against selected pathogenic microorganisms. Food Technol. Biotechnol., 2008, 46(2), 151-156 156. K.W. Lee, Y.J. Kim, H.J Lee and C.Y. Lee, Cocoa has more phenolic phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and red wine. J. Agric. Food Chem., 2003, 51(25), 7292-7295 161. C.-V. Popa, L. Lungu, M. Savoiu, C. Bradu, V. Dinoiu and A.F. Danet, Total antioxidant activity, phenols and flavonoids content of several plant extracts. Int. J. Food Prop., 2011, DOI 10.1080/10942912.2010.498545 165. P. Stratil, V. Kuban and J. Fojtova, Comparison of the phenolic content and total antioxidant activity in wines as determined by spectrophotometric methods. Czech J. Food Sci., 2008, 26(4), 242-253 166. O. Doka and D. Bicanic, Determination of Total Polyphenolic Content in Red Wines by Means of the Combined HeNe Laser Optothermal Window and FolinCiocalteu Colorimetry Assay. Anal Chem., 2002, 74(9), 2157-2161 184. M. Hajimahmoodi, M. Hanifeh, M.R. Oveisi, N. Sadeghi and B. Jannat, Determination of total antioxidant capacity of green teas by the ferric reducing/antioxidant power assay. Iran. J. Environ. Health Sci. Eng., 2008, 5(3), 167-172 193. R.L. Prior, G. Cao, A. Martin, E. Sofic, J. McEwen, C. O`Brien, N. Lischner, M. Ehlenfeldt, W. Kalt, G. Krewer and C.M. Mailand, Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity and variety of Vaccinium species. J. Agric. Food Chem., 1998, 46(7), 2686-2693 194. G.A. Garzon, C.E. Narvaez, K.M. Riedl and S.J. Schwartz, Chemical composition, anthocyanins, non-anthocyanin phenolics and antioxidant activity of wild bilberry (Vaccinium meridionale Swartz) from Colombia. Food Chem., 2010, 122(4), 980-986 195. E. Sariburun, S. ahin, C. Demir, C. Turkben and V. Uylaser, Phenolic content ant antioxidnat activity of raspberry and blackberry cultivars, J. Food Sci., 2010, 75 (4), 328-335 196. D. Burdulis, L. Ivanauskas, V. Dirse, S. Kazlauskas and A. Razukas, Study of diversity of anthocyanin composition in bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits, Medicina (Kaunas), 2007, 43(12), 971-977 207. L. Lungu, C.-V. Popa, M. Savoiu, A.F. Danet and V. Dinoiu, Antioxidant activity of Brassica oleracea L., Allium cepa L. and Beta vulgaris L. extracts, Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(10), 911-914

265. M.B. Hossain, C. Barry.-Ryan, A.B. Martin-Diana and N.P. Brunton, Effect of drying method on the antioxidant capacity of six Lamiaceae herbs. Food Chem., 2010, 123(1), 85-91 266. J.-H. Jeong, H. Jung, S.-R. Lee, H.-J. Lee, K.T. Hwang and T.-Y. Kim, Anti-oxidant, anti-proliferative and anti-inflammatory activities of the extracts from black raspberry fruits and wine. Food Chem., 2010, 123(2), 338-344 295. C.-V. Popa, I. Dumitru, L.L. Ruta, A.F. Danet and I.C. Farcasanu, Exogenous oxidative stress induces Ca2+ release in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS J., 2010, 277(19), 4027-4038 312. P. Stratil, B. Klejdus and V. Kuban, Determination of Total Content of Phenolic Compounds and Their Antioxidant Activity in Vegetables Evaluation of Spectrophotometric Methods. J. Agric. Food Chem., 2006, 54(3), 607-616 316. I. Parejo, C. Codina, C. Petrakis and P. Kefalas, Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH. (2,2,-diphenyl-1picrylhydrazyl) free radical assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000, 44(3), 507-512 363. Encyclopedia of Analytical Science, Editorin-chief Alan Tounshend, Academic Press Limited, Harcourt Brace & Company Publishers, London, p. 15261528, 1557, 3679-3688, 3887-3892, 5395-5400 365. A. Meghea, L. Popa si M. Giurginca, Evaluarea capacitii de protecie a antioxidanilor prin chemiluminescen. Rev. Chim. (Bucharest), 2003, 54(5), 455-457 366. M.J. Navas and A.M. Jimenez, Chemiluminescent methods in olive oil analysis. J. Amer. Oil Chem. Soc., 2007, 84(5), 405-411 367. C. Dodeigne, L. Thunus and R. Lejeune, Chemiluminescence as diagnostic tool. A review. Talanta, 2000, 51(3), 415 439 375. A.M. Garcia-Campagna and W.R.G. Baeyens, Chemiluminescence in Analytical Chemistry, Marcel Dekker, Inc, New York-Basel, 2001, p. 42-50, 227-228, 503-510 399. A.M. Pisoschi, A.F. Danet and S. Kalinowski, Ascorbic acid determination in commercial fruit juice samples by cyclic voltammetry. J. Autom. Methods Manag., 2008, vol. 2008, doi:10.1155/2008/937651, http://www.hindawi.com/journals/jammc 408. A. Nezamzadeh, M.K. Amini and H. Faghihian, Square-wave voltametric determination of ascorbic acid based on its electrocatalytic oxidation at zeolite-modified carbon-paste electrodes. Int. J. Electrochem. Sci., 2007, 2(8), 583-594 412. A.M. Pisoschi, G.-P. Negulescu and A. Pisoschi, Ascorbic Acid Determination by an Amperometric Ascorbate Oxidase-based Biosensor. Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(4), 339344 457. N. Erdemoglu, N.N. Turan, I. Cakici, B. Sener and A. Aydm, Antioxidant activities of some Lamiaceae plant extracts. Phytother. Res., 2006, 20(1), 9-13 458. C.-V. Popa, A.F. Danet, S. Jipa and T. Zaharescu, Determination of Total Antioxidant Activity of Wines Using a Flow Injection Method with Chemiluminescence Detection. Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(1), 11-16 459. M. Sariahmetoglu, R.A. Wheatley, I. Cakici, I. Kanzik and A. Townshend, Flow injection analysis for monitoring antioxidant effects on luminol chemiluminescence of reactive oxygen species. Anal. Lett., 2003, 36(4), 749-765 465. I. Parejo, Ch. Petrakis and P. Kefalas, A transition metal enhanced luminol chemiluminescence in the presence of a chelator. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000, 43(3), 183-190

39

40

Bibliografie selectiv

Bibliografie selectiv

476. C. Lu, G. Song and J.-M. Lin, Reactive oxygen species and their chemiluminescencedetection methods. Trends Anal. Chem., 2006, 25(10), 985-995 483. G.R. Buetner and B.A. Jurkiewicz, Catalytic metals, ascorbate, and free radicals: combinations to avoid. Radiat. Res., 1996, 145(5), 532-541 489. N. Pellegrini, M. Serafini, B. Colombi, D. del Rio, S. Salvatore, M. Bianchi and F. Brighenti, total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy assessed by three different in vitro assays. J. utr., 2003, 133(9), 2812-2819 490. N. Paixao, R. Perestrelo, J.C. Marques and J.S. Camara, Relationship between ntioxidant capacity and total phenolic content of red, rose and white wines. Food Chem., 2007, 105(1), 204-214 499. M.A.A. Meireles, Extracting bioactive compounds for food products: theory and application, M.A.A. Meireles ed., CRC Press, Taylor and Francis Group, 2008, p. 186 500. A. Armatu, S. Colceru-Mihul, C. Bubueanu, E. Draghici and L. Pirvu, Evaluation of antioxidant and free scavenging potential of some Lamiaceae species growing in Romania. Rom. Biotech. Lett., 2010, 15(3), 5274-5280 501. G. Ozkan, O. Sagdic, L. Ekici, I. Ozturk and M. Musa Ozcan, Phenolic compounds of Origanum sipyleum L. extract and its antioxidant and antibacterial activities. J. Food Lipids, 2007, 14(2), 157-169 502. M.P. Kahkonen, A.T. Hopia, H.J. Vuorela, J.-P. Rauha, K. Pihlaja, T.S. Kujala and M. Heinonen, Antioxidant activity of plant extracts containinig phenolic compounds. J. Agric. Food Chem., 1999, 47(10), 3954-3962 503. A. Matkowski, P. Tasarz and E. Szypula, Antioxidant activity of herb extracts from five medicinal plants from Lamiaceae, subfamily Lamioideae. J. Med. Plant Res., 2008, 2(11), 321-330 504. A. Wojdylo, J. Oszmianski and R. Czemerys, Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem., 2007, 105(3), 940-949 505. S. Dragland, H. Senoo, K. Wake, K. Holte and R. Blomhoff, Several culinary and medicinal herbs are important sources of dietary antioxidants. J. utr., 2003, 133(5), 12861290 515. S. Suteerapataranon and D. Pudta, Flow injection analysis-spectrophotometry for rapid determination of total polyphenols in tea extracts. J. Flow Injection Anal., 2008, 25(1), 61-64 516. C. Anesini, G.E. Ferraro and R. Filip, Total polyphenol content and antioxidant capacity of commercially available tea (Camellia sinensis) in Argentina. J. Agric. Food Chem., 2008, 56(19), 9225-9229 517. U. Justesen and P. Knuthsen, Composition of flavonoids in fresh herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs traditional Danish dishes. Food Chem., 2001, 73(2), 245-250 518. D. Sreeramulu and M. Ragunath, Antioxidant activity and phenolic content of roots, tubers and vegetables commonly consumed in India. Food Res. Int., 2010, 43(4), 1017-1020 520. A.A. Franke, L.J. Custer, C. Arakaki and S.P. Murphy, Vitamin C and flavonoid levels of fruits and vegetables consumed in Hawaii, J. Food Comp. Anal., 2004, 17(1), 1-35 521. P.D. Makris, G. Boskou and K.N. Andrikopoulos, Polyphenolic content and in vitro antioxidant characteristics of wine industry and other agri-food solid waste extracts. J. Food Comp. Anal., 2007, 20(2), 125-135 522. G. Mazza and E. Miniati, G. Mazza and E. Miniati eds. Introduction in anthocyanins in fruits, vegetables and grains. CRC Press, Boca Raton, 1993

531. A. Mithofer and C. Mazars, Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+signatures in plant cells. Biol. Proced. Online, 2002, 4(1), 105-118 548. A.F. Batiza, T. Schulz and P.H. Masson, Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem., 1996, 271(38), 23457-23462 549. M. Kanzaki, M. Nagasawa, I. Kojima, C. Sato, K. Naruse, M. Sokabe and H. Iida, Molecular Identification of a Eukaryotic, Stretch-Activated Nonselective Cation Channel. Science, 1999, 285(5429), 882-886 550. T.K. Matsumoto, A.J. Ellsmore, S.G. Cessna, P.S. Low, J.M. Pardo, R.A. Bressan and P.M. Hasegawa, An osmotically induced cytosolic Ca2+ transient activates calcineurin signaling to mediate ion homeostasis and salt tolerance of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem., 2002, 277(36), 33075-33080 551. R. Pinontoan, Krystofova, S. Kawano T., I.C. Mori, F.I. Tsuji, H. Iida and S. Muto, Phenylethylamine Induces an Increase in Cytosolic Ca2+ in Yeast. Biosci, Biotechnol, Biosci., 2002, 66(5), 1069-1074 552. L. Viladevall, R. Serrano, A. Ruiz, G. Domenech, J. Giraldo, A. Barcelo and J. Arino, Characterization of the calcium-mediated response to alkaline stress in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem., 2004, 279(42), 43614-43624 563. E.G. Locke, M. Bonilla, L. Liang, Y. Takita and K.W. Cunningham, A Homolog of Voltage-Gated Ca2+ Channels Stimulated by Depletion of Secretory Ca2+ in Yeast. Mol Cell Biol., 2000, 20(18), 6686-6694 564. X.L. Zhou, A.F. Batiza, S.H. Loukin, C.P. Palmer, C. Kung and Y. Saimi, The transient receptor potential channel on the yeast vacuole is mechanosensitive. Proc atl Acad Sci USA, 2003, 100(12), 71057110 568. J.J. Rudd and V.E. Franklin-Tong, Unravelling response-specificity in Ca2+ signalling pathways in plant cells. ew Phytol., 2001, 151(1), 7-33 569. M.R. Knight, A.K. Campbell, S.M. Smith and A.J. Trewavas, Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. ature, 1991, 352(6335), 524-526 571. K. Tomonori, S. Nobuya, T. Koji, U. Nobuyuki and M. Muto, Salicylic Acid Induces Extracellular Superoxide Generation Followed by an Increase in Cytosolic Calcium Ion in Tobacco Suspension Culture: The Earliest Events in Salicylic Acid Signal Transduction. Plant Cell Physiol., 1998, 39(7), 721-730 573. A Chiesa., E. Rapizzi, V. Tosello, V. Pinton, M. De Virgilio, K.E. Fogarty, R. Rizzuto, Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signaling. Biochem. J., 2001, 355(Part I), 1-12 574. D. Prasher, R.O. McCann and M.J. Cormier, Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 126(3), 1259-1268 575. E.S. Vysotski, S.V. Markova, L.A. Frank, Calcium-Regulated Photoproteins of Marine Coelenterates. Mol. Biol. (Mosk.), 2006, 40(3), 404407 586. J. Nakajima-Shimada, H. Iida, F.I. Tsuji and Y. Anraku, Monitoring of intracellular calcium in Saccharomyces cerevisiae with an apoaequorine cDNA expression system. Proc atl Acad Sci USA, 1991, 88(15), 6878-6882 588. R. Schiestl and R.D. Gietz, High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acid as carrier. Curr Genet., 1989, 16(5-6), 339-346

41

42

Lista lucrrilor publicate n domeniul tezei

Lista lucrrilor publicate n domeniul tezei/Contracte de cercetare

LUCRRI PUBLICATE DOME IUL TEZEI DE DOCTORAT

ARTICOLE 1. C.-V. Popa, L. Lungu, M. Savoiu, C. Bradu, V. Dinoiu and A.F. Danet, Total antioxidant activity, phenols and flavonoids content of several plant extracts, Int. J. Food Prop., 2011, doi:10.1080/10942912.2010.498545 2. C.-V. Popa, I. Dumitru, L. L. Ruta, A.F. Danet and I. C. Farcasanu, Exogenous oxidative stress induces Ca2+ release in the yeast Saccharomyces cerevisiae, FEBS J., 2010, 277(19), 4027-4038 (3 citri) 3. C.-V. Popa, A.F. Danet, S. Jipa and T. Zaharescu, Determination of total antioxidant activity of wines using a flow injection method with chemiluminescence detection, Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(1), 11-17 (3 citri) 4. L. Lungu, C.-V. Popa, M. Savoiu, A.F. Danet and V. Dinoiu, Antioxidant activity of Brassica oleracea L., Allium cepa L. and Beta vulgaris L. extracts, Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(10), 911-914 5. S. Jipa, T. Zaharescu, W. Kappel, A.F. Dne, C.-V. Popa, M. Bumbac, L.M. Gorghiu and A.M. Maris, The effects of -irradiation on the antioxidant activity of rosemary extract, Optoelectron. Adv. Mat. Rapid Commun., 2009, 3(12), 1315 1320 6. L. Lungu, C.-V. Popa, J. Morris and M. Savoiu, Evaluation of phytotoxic activity of Melia azedarach L. extracts on Lactuca sativa L., Rom. Biotech. Lett., 2011, 16(2), 6089-6095 COMU ICRI (SELECIE) 1. A.F. Danet and C.-V. Popa, A new flow injection methods for chemiluminescence determination of total antioxidant activity of plant extracts (Oral presentation), International Conference on Ecological Materials and Technologies, September 25-26th, 2008, Bucharest, Romania 2. S. Jipa, T. Zaharescu, W. Kappel, T. Setnescu, M. Lungulescu, A. Mantsch, M. Bumbac, R. Olteanu, I.M. Gorghiu, C. Dumitrescu, A.F. Danet and C.-V. Popa, Extract of Rosemary (Rosmarinus officinalis) as a radioprotective agent (Oral presentation), International Conference on Ecological Materials and Technologies, September 25-26th, 2008, Bucharest, Romania 3. A.F. Danet, C.-V. Popa and I. Cristea, Determination of total antioxidant capacity (TAC) of some fruit extracts and juices using FIA and batch versions of a chemiluminometric method (Oral presentation), 17th International Conference on flow injection analysis including related techniques, July 3-8th, 2011, Krakow, Poland

4. A.F. Danet and C.-V. Popa, Total Antioxidant determination in plant extracts by FI chemiluminescence spectrometry using luminol and Co(II) catalyst in the presence of a chelating agent (Poster), XIII International Symposium on Luminescence Spectrometry., September 7-11th, 2008, Bologna, Italy 5. A.F. Danet, C.-V. Popa, T. Zaharescu and S Jipa, Total antioxidant determination of some plant extracts, wines and fruit juices by FI chemiluminescence spectrometry using luminol and Co(II) catalyst in the presence of a chelating agent (Poster), FLOW ANALYSIS XI, September 1418th, 2009, Pollensa, Mallorca, Spain 6. A.F. Danet and C.-V. Popa, Flow injection method with chemiluminescence detection for total antioxidant activity determination (Poster ), XIIV International Symposium on Luminescence Spectrometry, July 13 16th, 2010, Prague, Czech Republic

CO TRACTE DE CERCETARE
1. PNII 71-079/2007 ECOMAT Fabricarea de materiale polimerice ecologice multifuncionale stabilizate cu antioxidani polifenolici din plante; membru 2. PNII 71-098/2007 SENSALIM Senzori i aparatur pentru controlul calitii unor produse alimentare; membru 3. PN II, IDEI, ID_965.176-/2007 Mecanisme moleculare implicate n rspunsul celulelor de Saccharomyces cerevisiae la condiii de stres metalic i stres oxidativ, 2007-2010; membru.

//

43

44