Enzime

Enzymes are the tools of life.

Enzime
- compui biologici, cu rol de biocatalizatori (substane organice cu molecul mare)
- proteine puin stabile, care pot suferi o inactivare reversibil sau o denaturare
- peste 2000 enzime cunoscute; sunt studiate ~ 100 i doar o mic parte sunt investigate

Analiza enzimatic:
determinarea activitii enzimelor n fluide biologice i organe
determinarea unor compui prin reacii n care intervin enzime (ofer specificitate,
elimin necesitatea separrii)

nsuiri:

catalizeaz numai reacii termodinamic posibile

nu modific echilibrele chimice
particip la reacii n cantiti mici
specificitate
sensibile la inhibitori

Aciunea enzimelor

Ea in
prezenta
enzimei

Ea'
E substrat
E eliberata din
reactie

Natura i structura enzimelor

Din punct de vedere structural
Enzime de natur exclusiv proteic
Enzime de natur heteroproteic

Parte proteic: apoenzim (fr cofactorul

necesar catalizei)
Parte neproteic: coenzim (substan cu M mic
care mpreun cu apoenzima formeaz enzima
complet)

Clasificarea enzimelor i nomenclatura

conform IUB (cod din 4 cifre)

Clasificarea enzimelor
Clasa
1.
2.
3.
4.

Oxidoreductaze
Transferaze
Hidrolaze
Liaze

5.
6.

Izomeraze
Ligaze

Reacii catalizate
oxidare-reducere
transfera grupe de atomi
hidroliza
adaug/ndeprteaz atomi la/de la o
dubl legatur
rearanjare a atomilor
combin molecule n prezena ATP

Activitatea enzimatic
Unitate enzimatic (U)

unitate internaional de
activitate enzimatic = cantitatea de enzim care transform
1 mol Substrat/min la 25o C n condiii optime
La determinarea activitii enzimatice se accept c
activitatea i concentraia enzimei sunt direct proporionale.

dS
dP
=+
= k[E ]
dt
dt

Concentraia enzimei: cantitate (mg sau g) pe unitate de

material biologic (g sau L)

Factorii care influeneaz reaciile

enzimatice
R. enzimatice sunt reversibile; condiiile de r. se aleg pentru a deplasa
echilibrul ntr-un anumit sens
k1

k2

S + E SE E + P
k 1

Concentraia

enzimei: viteza de reacie este proporional cu [SE]

Pentru [S] n exces i constant, la adaos de E crete [SE] i viteza de reacie
baza determinrii E prin msurarea vitezei de reacie

Concentraia substratului (ec. Michaelis-Menten)

[S] mic i [E] const. cinetic de ord. 1, viteza de reacie depinde de [S]
[S] exces cinetic de ord. 0 (viteza de reacie constant, indep. de [S]; Vmax
pt. [E])

Reprezentarea Michaelis-Menten
Vmax

1 enzim

2 inhibitor
2
Vmax/2

Km

Km

[S]

Constanta Michaelis Km concentraia lui S pentru care viteza de reacie

este din viteza maxim
Km 1-10-8 M

Vmax [ S ]
V=
[S ] + K m

 pH pt. Vmax difer

pentru r. direct i
invers
Temperatura
influen f. diferit asupra
enzimelor
Cofactorii entiti
neproteice, anorganice
sau organice (coenzime)
Inhibitori

Precauii n analiza enzimatic

Analiz rapid
Evitarea inhibitorilor (ex. metale grele)
Temperatur adecvat
Incubare

Enzime
Specifice plasmei (funcionale) - sintetizate n ficat i eliberate constant n
plasm
Ex.: enzimele coagulrii, ceruloplasmina

Nespecifice plasmei (enzime de secreie, enzime celulare)

Concentraia n plasm crete ca rezultat al traversrii barierelor celulare
Ex.: enzime de secreie amilaza, lipaza, tripsina
enzime celulare AST, ALT, CK, LD

Principalele enzime plasmatice cu valoare de diagnoz

Enzime musculare
Enzimele ficatului
Enzime pancreatice
Alte enzime

Enzime de diagnostic
Enzime
musculare

Creatinkinaza (CK) 2.7.3.2.

Lactatdehidrogenaza (LD)
1.1.1.27

Enzimele
ficatului

Aspartataminotransferaza
(AST) 2.6.1.1
Alaninaminotransferaza
(ALT) 2.6.1.2.
-Glutamiltransferaza (GGT)
2.3.2.2
Fosfataza alcalina (ALP)
3.1.3.1
5 Nucleotidaza 3.1.3.5.
Colinesteraza 3.1.1.7.
Glutamatdehidrogenaza
(GLD) 1.4.1.3.

Enzimele
pancreasului

Amilaza (AML) 3.2.1.1.

Lipaza 3.1.1.3.
Tripsina 3.4.21.4.
Chimotripsina 3.4.21.1.
Elastaza (1) 3.4.21.36

Alte enzime de diagnostic: Fosfataza acida (ACP) 3.1.3.2 si G6PD 1.1.1.49.

Enzime de diagnostic
Enzima
Cod/Clasa
Lactatdehidrogenaza
LD, LDH
(1.1.1.27/
Oxidoreductaza)
Creatinkinaza
CK, CPK
2.7.3.2./ Transferaze
Aspartat
transaminaza AST,
GOT
2.6.1.1./Transferaza
Fosfataza alcalin
ALP
3.1.3.1./Hidrolaza
Amilaza AMS, AMY
3.2.1.1./Hidrolaza
Fosfataza acid, ACP
3.1.3.2./ Hidrolaze

Definiie
Catalizeaz reversibil
reducerea piruvatului la
lactat (+ NADH )
Enzim dimer, catalizeaz
formarea ATP din ADP i
creatinfosfat n muchi
Catalizeaz transferul unei
grupri amino de la un donor
(a.a.) la un acceptor (2cetoacid)
Catalizeaz eliminarea
acidului fosforic dintr-un
ester monofosforic n m.
bazic
Catalizeaz hidroliza
legturii 1,4 glicozidice din
oligozaharide cu 3 sau
>>unit. glucoz
Catalizeaz eliminarea
acidului fosforic dintr-un
ester monofosforic n m. acid

Denumire
sistematic
L-Lactat: NAD+
oxidoreductaz

Semnificaie
clinic
Infarct,
Afeciuni
hepatice
Carcinom

ATP: creatin Nfosfotransferaza

Monoester
ortofosforic
fosforhidrolaza

Infarct,
Afeciuni
musculare
Infarct,
Afeciuni
hepatice,
musculare
Afeciuni
hepatice
Afeciuni osoase

1,4 D-glucan
gluconhidrolaza

Pancreatit
acut

Monoester
ortofosforic
fosforhidrolaza

Carcinom de
prostat

L-aspartat: 2oxaloglutarat
aminotransferaza

Principiul msurrii activitii

enzimatice
Fotometrie:

Creterea concentraiei produsului

Scderea concentraiei substratului
Scderea concentraiei de coenzim
Creterea concentraiei de coenzim modificat
n determinrile enzimatice se prepar ntotdeauna un martor (prob
paralel n care nu se adaug enzim sau se adaug un inhibitor ori un
agent care distruge enzima).

Determinarea practic a activitii

enzimatice
Msurarea vitezei de reacie prin evaluarea modificrii produse
ntr-un interval de timp fixat
Viteza de reacie d.p. cu cantitatea de enzim activ

Determinarea n 2 puncte (timp fix de incubare)

- un martor
- prob de enzim activ

Msurare continu
- testul optic introdus de Warburg, Christian, 1936, pentru
determinarea enzimelor transportoare de hidrogen

Determinarea practic a activitii

enzimatice
Testul optic

A
b
s
o
r
b
a
n
t
a
X
10-3

Test optic determinarea n UV a

enzimelor NAD i NADP
dependente de pH
Test optic simplu
Test optic cuplat cu o reacie
indicatoare
Test optic cuplat cu o reacie
auxiliar i o reacie indicatoare
Lungime de und, nm

Testul optic (test Wartburg)

H

O
C

NH2
N

NH2
O

CH2

O
O

N
O

CH2

OH

OH
ox
- 2 [H]

red
+ 2 [H]

H O
C

HO

OH

NH2
N

NH2
O

CH2
HO

OH

O
O

N
O

CH2

O
+ H

OH

OH

A
b
s
o
r
b
a
n
t
a
X
10-3

Lungime de und, nm

Test optic simplu (determinarea LD)

340 nm

LD, pH 7.4-7.8

piruvat+NADH2

lactat + NAD

Msurare fotometric la 340 nm

LD, pH 8.8-9.8

piruvat+NADH2

lactat + NAD

Test optic cuplat cu o reacie

indicatoare
- cnd enzima nu reacioneaz direct cu NAD se cupleaz o reacie indicatoare;
produsul format prin aciunea enzimei de determinat este dozat printr-o alt
enzim i NAD

Msurare fotometric
la 340 nm

Ex.: alanin transaminaza

L-alanina + cetoglutarat
piruvat+NADH2

LD, pH 7.5

ALT

piruvat + L-glutamat

lactat + NAD

Intrebri
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Cum se exprim activitatea enzimatic i cum se coreleaz

aceasta cu concentraia?
Enumerai cel puin 3 factori care influeneaz activitatea
enzimatic i explicai influena unuia dintre acetia.
Enzimele cu rol de diagnostic sunt n general cele specifice sau
cele nespecifice plasmei?
Explicai principiul testul optic introdus de Warburg pentru
determinarea enzimelor transportoare de hidrogen.
Cum se prepar proba martor la determinarea unei enzime?
Ce variante de msurare exist ntr-o determinare
spectrofotometric pe baza testului optic?
Dai 2 exemple de enzime cu rol de diagnostic i explicai
semnificaia.