Lipazele-clasificare, mecanism de acţiune, factori

care influenţeaza activitatea catalitică

În ultimii ani lipazele au fost intens folosite ca biocatalizatori pentru o diversitate

de reacţii ce se desfăşoară în sistem folosind solvenţi organici cum ar fi de exemplu
sinteza esterilor şi modificarea lipidelor.Într-un sistem apos aceşti biocatalizatori sunt
capabili să catalizeze hidroliza triacilglicerolilor cu formare de acizi graşi şi glicerol,
compuşi foarte importanţi în industria chimică.
Hidroliza catalizată de lipază a trioleinei a fost deasemeni folosită pentru
producerea de mono- şi di-gliceride cu utilizare largă în calitate de emulgatori în industria
alimentară şi chimică. Aproximativ 75% din enzimele produse in Europa, incluzând şi
lipazele au acţiune hidrolitică.
Rolul biologic al lipazelor pentru organismele vii:
-asigură funcţionarea membranelor;
-participă la metabolismul lipidic;
-participă la procesul de depozitare a grăsimilor de rezervă.
Lipazele sunt enzime cu răspândire largă care s-au izolat dintr-o varietate de surse:
animale, vegetale şi microbiene, fiind cunoscute şi lipaze produse de archaea. Lipazele de
diferite provenienţe se deosebesc între ele sub aspectul proprietăţilor şi caracterului
acţiunii.
Lipazele microbiene prezintă un potenţial uriaş în domeniul tehnologiilor alimentare,
al ştiinţelor medicale şi în industria chimică, deoarece:

1) au specificitate largă de substrat;

2) nu necesită cofactori.
3) sunt stabile în solvenţi organici;

1.1. Lipazele: membre ale familiei de α/ß-hidrolaze

Hidrolazele sunt enzime care catalizează reacţia de scindare a moleculelor cu fixarea

componentelor apei la produsele rezultate, dupa reacţia generală:
 R-R' + HOH ↔ R-H + R' –OH

Din această clasă fac parte enzimele care hidrolizează proteinele până la aminoacizi,
polizaharidele până la monzaharide şi lipidele până la acizi graşi şi glicerol. Reacţiile
catalizate de hidrolaze se produc cu modificări enrgetice mici, cu degajare de energie
liberă mică, deci ele nu constituie o sursă energetică importantă pentru organism.
Hidrolazele au totuşi un rol deosebit in metabolismul substanţelor aduse cu
alimentaţia deoarece ele descompun moleculele mari care intră în compoziţia alimentelor,
în molecule uşor de asimilat. În general reacţiile de hidroliză enzimatică sunt reversibile,
iar principalele legături chimice care pot fi scindate sunt : legatura ester, legatura
glicozidică, legatura peptidică.

Clasa hidrolaze (E.C. 3.x.x.x) conţine un număr mare de diferite enzime:

acetilcolinesteraze (E.C. 3.1.1.7), amidaze (E.C. 3.5.1.x), amilaze (E.C. 3.2.x.y),
carboxilesteraze (E.C. 3.1.1.1), celulaze (E.C. 3.2.1.4), esteraze (E.C. 3.1.x.x), lipaze
(E.C. 3.1.1.3), serin-proteaze (E.C. 3.4.16 + 3.4.21) etc. Comun tuturor lipazelor şi
esterazelor este faptul ca ele prezintă o structură α/ß, adică 8 structuri paralele în ß-foaie
pliată sunt înconjurate de α-helixuri.
Fig 1. Structura α/β hidrolază a lipazelor. Enzima hidrolizează esterii la interfaţa lipide-
apă, în apă accesul la situsul serinic,reprezentat cu albastru, fiind blocat de un helix
(colorat cu verde).

Fig 2. Lipaza acţionând la interfaţa creată de substrat: helixul reprezentat cu portocaliu

se roteşte permiţand substratului( colorat cu galben) ataşarea la situsul activ.
 Fig 3. Poziţia helixului în enzima liberă (colorat cu verde )şi in complexul enzimă-
substrat (colorat cu portocaliu)

Hidrolazele sunt capabile să catalizeze reversibil hidroliza legăturilor covalente iar

lipazele hidrolizează legături ester, cum sint cele din triacilgliceroli.Lipazele scindeaza
toţi cei trei acizi graşi ai gliceridei, însa nu simultan, ci succesiv, fapt foarte important
pentru procesul de absorbţie a lipidelor.
Lipazele mai catalizează şi alte tipuri de reacţii, cu importanţă industrială: într-un
mediu lipsit de apă, esterificarea acizilor carboxilici cu un alcool (reacţie de esterificare)
sau cu un rest alcool al unui ester secundar (reacţie de interesterificare). Într-o reacţie de
interesterificare, în absenţa apei, poate avea loc şi transferul unui rest acil al unui ester pe
un alt ester. Într-o reacţie de transesterificare, un rest acil este transferat fie pe un alcool
(alcooliză), fie pe un acid (acidoliză).
Acţiunea lipazelor are o mare importanţa pentru păstrarea alimentelor, mai ales a
celor ce conţin cantităti mari de lipide. Prin acţiunea acestor enzime, în timpul depozitării
produselor alimentare se produce o rapidă descompunere a gliceridelor in acizi graşi şi
glicerol, ceea ce conduce la o creştere a acidităţii produselor şi la deprecierea lor
calitativă.
Lipazele catalizează hidroliza triacilglicerolilor până la glicerol şi acizi graşi.
Contrar esterazelor lipazele sunt activate numai când sund adsorbite la interfaţa ulei-apa,
şi nu hidrolizează substraturile dizolvate în interiorul lichidului. În urma procesului de
emulsionare lipaza separă esterii glicerinei de acizii graşi cu lanţ lung precum trioleina si
tripalmitina. Lipazele au o activitate mică în soluţiile apoase care conţin substraturi
solubile. În contrast, esterazele arată o cinetică normală Michaelis-Menten în soluţii
apoase.
Reacţia de scindare hidrolitică a esterilor nu este cantitativă, starea de echilibru se
atinge în prezenţa catalizatorilor din ambele direcţii. Reacţia de hidroliză are loc, în cea
mai mare parte în faza omogenă grasă. Hidroliza care se petrece la interfaţa grăsime-apă
este redusă. Viteza de hidroliză este cu atat mai mare cu cât cantitatea de apă în faza
grasă este mai mare. Solubilitatea apei este redusă în grăsimea neutră, în schimb este mult
mai mare în acizii graşi. Din acest motiv, în cazul grăsimilor neutre, viteza de hidroliza la
început este mai mică şi apoi creşte rapid, pe masură ce apar acizi graşi liberi, atinge o
valoare maximă de alcool şi apoi scade, scăzând şi concentraţia grăsimii nehidrolizate.
Substanţele detergente care măresc solubilitatea apei în faza grasă accelerează şi
procesul de hidroliză. Proporţia dintre componente: ester, alcool, acid şi apă la starea de
echilibru este dată de legea acţiunii maselor. În prezenţa unei cantităti mari de apă, în
cazul hidrolizei grăsimilor, glicerina, fiind uşor solubilă în apă, va trece în cea mai mare
parte în faza apoasă şi echilibrul se va deplasa spre faza apoasă. În prezenţa unei cantităţi
mici de apă, echilibrul se va deplasa spre sinteză.
La eucariote lipazele sunt implicate în diferite etape ale metabolismului lipidic
incluzând: digestia grăsimilor, absorbţia, reconstituirea şi metabolismul lipoproteinelor.
Faptul că lipazele şi lipidele interacţionează la interfaţa nu este încă pe deplin clar şi
reprezintă un subiect de investigare intensă. Cercetarile privind lipazele sunt concentrate
în special pe caracterizarea structurală, elucidarea mecanismului de acţiune, cinetică,
secvenţierea şi clonarea genelor de lipază. În comparaţie cu acest efort o mică parte a
cercetărilor s-a realizat prin dezvoltarea sistemelor de producere a lipazelor de uz
comercial in bioreactoare.

1.2. Specificitatea lipazelor

Lipazele manifestă diferite specificităţi faţă de grăsimi/uleiuri. Specificitatea
lipazelor poate fi clasificată în 5 tipuri (conform Rogalska, citat de Pfeffer, 2008):

1) specificitate de substrat

Triacilgliceridele nu reprezintă unicul substrat pentru lipaze: diacilgliceridele,

monoacilgliceridele şi fosfolipidele pot fi, de asemenea, hidrolizate. Unele lipaze
manifestă preferinţă pentru anumiţi acilgliceroli. Lipaza din Penicilium camembertii, de
exemplu, manifestă o activitate catalitică mai mare faţă de mono- şi diacilgliceroli, dar nu
şi faţă de triacilgliceroli.

2)Regiospecificitate (specificitate regionala).

 Fig 4. Reactii posibile catalizate de lipaza

Lipazele au capacitatea de a face distincţie între poziţiile 1, 2 sau 3 ale gliceridelor,

astfel: lipazele cu specificitate 1,3 (cunoscute ca lipaze specifice sn1,3), cum sunt cele
secretate de Rhizopus oryzae şi Rhizomucor miehei, hidrolizează preferenţial legăturile
esterice din poziţiile 1 şi 3, în timp ce lipazele cu specificitate pentru poziţia 2 (lipaze
specifice sn2), produse de Candida antarctica, Candida parapsilosis sunt puţin
numeroase şi manifestă preferinţă pentru poziţia 2.

3) Lipaze nespecifice

Unele lipaze nu prezintă nici specificitate de substrat nici stereospecificitate. Aceste

enzime hidrolizează orice legătură esterică. Astfel de lipaze sunt produse de Candida
rugosa şi Pseudomonas cepacia.

4) Lipaze acil-specifice

Unele lipaze prezintă specificitate pentru anumiţi acizi graşi, aşa cum este cazul
lipazei din Geotrichum candidum, care prezintă o specificitate strictă pentru acizii graşi
nesaturaţi cu dubla legătură în Δ9 (de ex. acidul oleic). Alte lipaze ce aparţin acestui grup
prezintă specificitate înaltă faţă de acizii graşi cu lanţ scurt, aşa cum este cazul lipazelor
din Penicillium roquefortii.

5)Lipaze stereospecifice

Aceste lipaze pot face distincţia între poziţiile 1 şi 3 ale trigliceridelor, exemple
fiind lipaza linguală umană şi unele lipaze produse de Pseudomonas fluorescens şi
Humicola languinosa (Pfeffer, 2008).

1.3 Grăsimile şi uleiurile ca substraturi ale lipazelor

Grăsimile şi uleiurile se deosebesc, în primul rând, prin starea de agregare: solide,

semisolide sau lichide, mai mult sau mai puţin vâscoase. Ele au origine vegetală sau
animală, fiind constituite în special din triacilgliceroli ai acizilor graşi cu număr par de
atomi de carbon. Prin grăsimi se înţeleg produsele solide sau semisolide la 20ºC, în timp
ce uleiurile sunt lichide. Toate sunt nemiscibile cu apa şi au o densitate mai mică decât
aceasta. Proprietăţile fizice ale grăsimilor şi uleiurilor sunt determinate de lungimea
lanţului acizilor graşi constituenţi şi de numărul dublelor legături din aceştia. Acizii graşi
saturaţi cu lanţ lung prezintă un punct de topire mai ridicat decât acizii graşi nesaturaţi, cu
lanţ scurt. Lipidele vegetale sunt, de regulă, bogate în acizi graşi nesaturaţi, exclusiv cu
număr par de atomi de carbon, în care dublele legături au configuraţia cis. Cei mai
comuni acizi graşi prezenţi în gliceride sunt acidul dodecanoic (lauric), acidul
tetradecanoic (miristic), acidul octadecanoic (stearic), acidul hexadecanoic (palmitic) şi
acidul oleic (Tabelul 1).

Tabelul 1
Compoziţia în acizi graşi a celor mai importante grăsimi şi uleiuri vegetale, %
(după Pfeffer, 2008)
Grăsimi/uleieuri 10:0 12:0 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 20:1 22:1
Ulei de rapiţă - - 0,5 4 1 60 20 9 2 2
Ulei de floarea- - - - 6 4 28 61 - - -
soarelui
Grăsime de 7 48 17 9 2 7 1 - - -
cocos
Ulei din seminţe 5 50 15 7 2 15 1 - - -
de palmier
Ulei de palmier - - 2 42 5 41 10 - - -
Ulei de soia - - - 10 3 41 36 - 1 -

În ultimii 60 de ani, producţia de grăsimi şi uleiuri s-a dublat (2006/07 mai mult de 100
milioane tone) (Tabelul 2). A crescut, în special, producţia de ulei de rapiţă (Brassica
napus oleifera), ulei de soia (Glycine max), grăsime de palmier şi ulei de floarea-soarelui
(Helianthus annuus), în timp ce cantitatea de ulei de peşte a scăzut.

Tabelul 2
 Producţia mondială de uleiuri şi grăsimi (milioane tone) in diverse perioade
(pentru perioada 2003-2007, datele reprezintă predicţia)
(după Pfeffer, 2008)
Ulei/grăsime 1978-1982 1986-1990 2003-2007
Soia 12,4 15,3 23,0
Palmier 4,5 9,1 23,0
Seminţe oleaginoase 10,7 14,6 15,7
Grăsimi animale 11,2 11,9 15,7
Rapiţă 3,9 7,5 8,4
Măsline 7,3 8,3 8,4
Nucă de cocos 3,4 4,3 7,3
Altele 2,8 4,6 3,0
Total 56,2 75,6 104,5

Grăsimile şi uleiurile sunt importante componente ale produselor alimentare.

Valorile nutriţionale şi senzoriale precum şi proprietăţile fizice ale trigliceridelor sunt
mult influenţate de factori ca: poziţia la care se leagă acizii graşi la molecula de glicerol,
de lungimea lanţului moleculei de acid gras şi gradul de nesaturare. Lipazele permit
modificarea proprietăţilor lipidelor prin modificarea poziţiei legării acizilor graşi în
molecula de glicerol şi înlocuirea unuia sau mai multor acizi graşi cu alţii noi. În acest fel
lipidele relativ ieftine pot ajunge la valori mai ridicate şi cu proprietăţi îmbunătăţite.
Untul de cacao, o grăsime de valoare ridicată, conţine acid stearic şi acid palmitic şi
are un punct de topire de aproximativ 37˚C. Tehnologiile care se bazează pe mecanismul
de acţiune al lipazelor incluzând hidroliza mixtă şi reacţii de sinteză sunt utilizate în
comerţ pentru a îmbunătăţi unele proprietăţi nedorite ale grăsimilor cu cele ale
substituienţilor din untul de cacao. O versiune a acestui proces utilizează lipaza
imobilizată pe Rhizomucor miehei în reacţia de transesterificare unde înlocuieşte acidul
palmitic din untul de palmier în acid stearic. Unele studii descriu un tip de lipază ce
catalizează procesele de interesterificare a grăsimii din unt şi care are drept rezultat o
scădere considerabilă a lanţului de acizi graşi saturaţi.
 Dintre găsimile vegetale, cele mai utilizate sunt uleiul de palmier, uleiul de soia,
uleiul de rapiţă, uleiul de floarea soarelui, untul de arahide, untul de cacao, uleiul de
măsline, uleiul de bumbac. Consumul total de grăsimi vegetale a fost de 118
milioane tone în 2001, la nivel mondial. În unele ţări din sud-estul Asiei, precum
Malaiezia şi Indonezia, există culturi extinse de palmieri din care se produce uleiul.
În lume, numai în anul 2001, s-a produs aproximativ 23 milioane tone de ulei de
palmier, din care Malaiezia a furnizat 12 milioane tone (52%). Glicerolul şi acizii
graşi se obţin din grăsimi prin hidroliză chimică sau catalizată de lipaze. Glicerolul
este materie primă pentru obţinerea nitroglicerinei şi oxidului de propilenă, în timp
ce acizii graşi sunt transformaţi în metil-esteri, care sunt utilizaţi drept carburanţi, şi
în amide, alcooli şi diverşi reactivi chimici (Yamane, 2002)..

Oamenii consumă şi grăsimi animale, precum ulei de peşte, unt, untură, seu etc. În
1998, la nivel mondial, s-au consumat aproximativ 18 milioane tone grăsime
animală, ceea ce reprezintă doar o cantitate mică în comparaţie cu uleiurile
vegetale. Printre uleiurile comestibile, cele din peşte sunt unice prin conţinutul de
acizi graşi polinesaturaţi din categoria ω-3, care sunt esenţiali pentru om (acizii
eicosapentaenoic şi docosahexaenoic).

Fosfolipidele au şi ele o importanţă nutriţională şi tehnologică mare. Principalele

surse de fosfolipide sunt licitina din soia şi lecitina din gălbenuşul de ou. Producţia
anuală de lecitină din soia şi gălbenuş a fost, în Japonia, în 2001, de 6500 tone, respectiv
250 tone. Fosfolipidele, deşi utilizate actualmente mai mult ca emulgatori în industria
alimentară şi cea cosmetică, prezintă potenţial ridicat ca nutraceutice.

Lipazele sunt responsabile, în primul rând, de hidroliza acilglicerolilor. Au

răspândire largă şi sunt indispensabili pentru degradarea triacilglicerolilor în natură. Pe
lângă semnificaţia lor bilogică, lipazele manifestă un potenţial excelent pentru
biotehnologii. Aceste enzime posedă proprietatea unică de a acţiona la interfaţa apoasă şi
neapoasă, distingându-se de esteraze. Activitatea catalitică a lipazelor depinde, în mare
măsură, de starea de agregare a substratelor. Studiile experimentale au arătat că activarea
implică demascarea centrului activ şi modificări conformaţionale, care necesită prezenţa
picăturilor de ulei în apă. Studii recente asupra structurii unor lipaze au evidenţiat unele
aspecte privind activitatea hidrolitică, activarea la interfaţă şi stereoselectivitatea
lipazelor. Enzime precum proteazele şi carbohidrazele sunt folosite pe scară larga, la
nivel industrial. Deşi, actualmente, lipazele reprezintă 5% din piaţa enzimelor,
potenţialul lor va creşte spectaculos datorită aplicaţiilor din ce în ce mai numeroase.