7.

Determinarea vitaminelor din produsele alimentare

7.1. Noțiuni generale

Vitaminele sunt substanțe naturale pe care organismul nu le poate sintetiza în măsura
nevoilor sale,trebuind sa le primească din exterior, odată cu alimentele. Vitaminele au fost
clasificate în două mari grupe: liposolubile și hidrosolubile și au fost denumite prin litere
alfabetice. Ulterior, odată cu elucidarea acțiunii lor, au căpătat și denumirea acestor acțiuni.
Cele mai importante vitamine liposolubile sunt : vitamina A (antixeroftalmică sau
retinolul), a cărei acțiune principală constă în acomodarea vizuală la lumină. Ea intră în structura
pigmentului retinian, rodopsina, care se descompune la lumina; vitamina A are rol în sinteza
continuă a rodopsinei. Vitamina A intervine de asemenea, in procesele de creștere osoasă, în
formarea malțului și a dentinei. Are un rol important în menținerea integrității celulelor
epiteliale, componentelor și mucoaselor, constituind un factor de protecție față de unele
agresiuni, fapt pentru care se mai denumește impropiu și antiinfecțioasă. Nevoile organismului în
vitaina A se exprimă în unități internaționale, fiind in jur de 1 000- 2 000 laa copii, 2 500 la
adulți și adolescenți și până la 4 000 la femeile care alăptează.
În natură, vitamina A se găsește ca atare în alimentele de origine animală ca: ficatul de
pește și orice mamifer,în lapte, dar mai ales în unt, smântână, în gălbenuș. De asemenea, se
găsește sub formă de provitamină în unele alimente vegetale ca: morcovi,tomate, salată verde,
sfeclă, caise piersici,vișine, căpsuni, pepene, banane și altele.
Vitamina D (antirahitică sau calciferolul) are rol important în absența calciului,
depunerea sa în oase. Lipsa vitaminei D duce la apariția rahitismului la copii. Este, de asemenea,
incriminată în unele leziuni exsudative și în cariogeneză. Nevoile în vitamina D sunt dependente
de asigurarea cerințelor organismului prin transformarea provitaminei cutanate în vitamină sub
acțiunea radiațiilor ultraviolete. Pentru copii însă și pentru femei în perioada maternității , rația
de vitamină D se consideră a fi egală cu 400 u.i. (la copiii prematuri rația este mai mare, dat fiind
faptul că cea mai mare parte a calciului se depune în ultimul trimestru de sarcină). Copiii
alimentați artificial au de asemenea nevoi crescute de vitamina D.
Principalele surse de alimente de vitamina D sunt: ficatul-mai ales de pește, untul,
smântâna, brânzeturile și gălbenusul de ou.
Vitamina E (antisterilității sau tocoferolul) are rol în asigurarea funcției de reproducere,
lipsa sa producând sterilitate la bărbați și avort spontan la femei. Are de asemenea rol în
asigurarea troficității musculare și țesuturilor, ceea ce a făcut să mai fie denumită și
antidistrofică. În concluzie, vitamina E are și un rol important antioxidant, asigurând în special
oxidarea acizilor grași nesaturați, fapt pentru care necesarul în vitamina E este dependent de
cantitatea de acizi grași nesaturați; la copii nevoia de vitamina E este de 5-6 mg zilnic.
Alimentele bogate în vitamina E sunt mai ales uleiurile vegetale (de porumb, de floarea
soarelui), cerealele și unele leguminoase uscate (fasole,mazăre)
Vitamina K (antihemoragică sau filochinona) intervine în coagularea sângelui luând
parte la sinteza unor factori ai procesului de coagulare . Nevoile exacte de vitamina K nu sunt
bine cunoscute. La copilul mic și la femeile gravide, nevoile par a fi mai crescute.
Principalele alimente care asigură vitamina K sunt: legumele verzi (spanac,urzici, ceapă
verde), unele fructe, ficatul și gălbenușul de ou.
1
 Cele mai importante vitamine hidrosolubile sunt: vitamina B1 cae are rol mai ales în
metabolismul glucidic prin participarea la constituția unor enzime cu rol in aceste metabolism.
Lipsa vitaminei B1 produce tulburări în metabolismul glucidelor cu producerea de acidoză,
insomnii, cefalee, apatie până la nevrită și atrofie musculară. Vitamina B1 intervine și în buna
funcționare a aparatului cardiovascular, în lipsa sa apărând tulburări de ritm, scăderea tensiunii
arteriale etc.
Rația de vitamina B1 se corelează cu cheltuielile energetice ale organismului, fiind
considerată egală cu 0,4 mg vitamină B1 pentru 1 000 calorii; la copii și femei în perioadă
maternității, rația poate fi crecută la 0,6 mg la 1 000 calorii.
Principalele surse alimentare în vitamina B1 sunt vitamine cereale, leguminoase, drojdia
de bere, carnea, mai ales de porc, unele fructe, laptele și derivatele lui, precum și ouăle.
Vitamina B2 (riboflavina) intră în sinteza unor enzime cu rol în respirația celulară, în
care acționează ca donator și acceptor de hidrogen. Carența de vitamina B2 se manifestă prin
inflamații ale mucoaselor (stomatită,glosită) și tegumentelor (dermatite), căderea părului,
întârzieri în creștere și altele.
Ca și vitamina B1 nevoile de vitamina B2 sunt calculate tot față de cheltuiala de
energie, fiind considerate de 0,25 mg la 1 000 calorii, la copilul mic ele pot crește de 0,4-0,5 mg,
iar la femei în perioada sarcinii chiar la 0,6 mg la 1 000 calorii. Alimentele care asigură cel mai
mare aport de vitamina B2 sunt laptele și brânzeturile, ficatul, ouăle și drojdia de bere; cantități
mai mici se găsesc în carne, pește, cereale, legume și fructe.
Vitamina PP (antipelagroasă sau niacina) ia parte la sinteza unor enzime cu rol oxido-
reducător. Ea joacă rol principal în eliminarea enegiei din moleculele de glucide, lipide și
protide. Lipsa sau carența sa produce pelagra (de fapt o policarență) caracterizată prin scăderea
în greutate , tulburări digestive, aparișia de eritem cutanat sub acțiunea radiațiilor solare, iar în
cazuri grave și tulburări psihice.
Nevoile se exprima tot față de cheltuiala de energie, fiind necesari 6 echivalenți
niacinici la 1000 de calorii. Un echivalent niacinic este egal cu un mg de vitamina PP sau 60 mg
de trptofan, datorită faptului că în organism niacina poate fi sintetizată cu concursul vitaminei B6
plecând de la triptofan.
Alimentele bogate in factor antipelagros sunt: ficatul, carnea, peștele, laptele,
brânzeturile, ouăle, cerealele (cu excepția porumbului), unele legume și fructe.
Vitamina C (antiscorbutică sau acidul ascorbic) are multiple funcții, din care cea mai
importantă constă în participarea sa la porcesele oxido-reducătoare, activează o serie de enzime
celulare și serice, ia parte la sinteza colagenului etc.
Lipsa de vitamina C se manifestă prin scăderea rezistenței perețilot capilari și
favorizarea hemoragiilor cutanate, subperiostale, digestive. Pe lângă acestea apare anemia
(vitamina C participând la transformarea bivalentă a fierului trivalent), osteoporoză, căderea
dinților, scăderea în greutate, sensibilitate la infecții etc. Sindromul principal cunoscut în carența
vitaminei C este scorbutul. Nevoile de vitamina C variază după diferiți autori, fiind în medie
între 30-70 mg/zi (10 mg zilnic previne scorbul). Alimentele cu conținut crescut în vitamina C
sunt mai aes fructele și legumele (citricele, tomatele, varza,ardeii).

2
 Tabelul 7.1.
Vitaminele utilizate în alimentație

Necesarul
Numele Denumire minim
Solubilitate Deficiență, boală Supradoză
vitaminei chimică zilnic
mediu

Orbire de
Vitamina
Retinol Grăsimi noapte, Keratom 25.000 ui 620μg
A
alacia
Vitamina
Tiamină Apă Beriberi - 1 mg
B1
Vitamina
Riboflavină Apă Ariboflavinoză - 1,1 mg
B2
Vitamina
Niacină Apă Pelagra 2.500 mg 12 mg
B3
Vitamina Acid
Apă Paresteziază - -
B5 pantotenic
Vitamina
Piridoxină Apă - 400 mg 1,1 mg
B6
Vitamina
Biotină Apă - - 30 µg
B7
Vitamina
Acid folic Apă * 1.000 µg 320 μg
B9
Vitamina Cianocobalam
Apă Anemie - 2 µg
B12 ină
Vitamina
Acid ascorbic Apă Scorbut - 75 mg
C
Lamisterol, Er
gocalciferol, C
2 µg pentru
alciferol, Dihi
Vitamina toate
drotachisterol, Grăsimi Rahitism 50.000 IU
D1-D4 vitaminele
7-
D
dehidrositoster
ol
Vitamina
Tocoferol Grăsimi - 50.000 IU 12 mg
E
Vitamina
Naftoquinonă Grăsimia - - 75 µg
K

Un organism poate supraviețui pentru un timp fără vitamine, deși deficitul prelungit de
vitamine poate duce la boli, de obicei dureroase și potențial fatale. Rezervele organismului de
vitamine pot varia foarte mult; un adult poate avea un deficit de vitamina A sau B12 de un an sau

3
mai mult înainte să apară vreo boală, în timp ce vitamina B1 din rezerve nu rezistă mai mult de
două săptămâni.
Vitaminele solubile în grăsimi pot fi păstrate ca rezervă în organism și sunt toxice când
sunt luate în exces. Vitaminele solubile în apă nu sunt păstrate în organism, cu excepția vitaminei
B12, rezerva ei aflându-se în ficat.
Tabelul 7.2.
Efecte ale vitaminelor și surse ale acestora

Vitam
Efecte Surse
ina
 întreține vederea, în special cea nocturnă
 ajută la formarea oaselor și dinților
morcovi, ardei kapia, ardei
 întreține sănătatea pielii, gingiilor, mucoaselor
gras, sfeclă roșie, spanac, varză
 protejează contra infecțiilor
A roșie, tomate, salată
 reglează multiplicarea celulară
verde, unt, brânză, ouă, lapte, urz
și troficitatea mucoaselor și a țesuturilor
ică
 necesară în funcția de reproducere
 protejează celulele de acțiunea radicalilor liberi
 are valoare în transmiterea influxului nervos
 are rol important în combaterea unor afecțiuni
ca:
o polinevrite de diferite origini
legume uscate,fulgide cereale, or
o pareze, paralizii medulare și ale
ez integral, pâine integrală,
B1 nervilor periferici și boli infecțioase
drojdie de
ale sistemului nervos
bere, tărâțe de grâu, lapte
o accidente vasculare și
afecțiuni cardiovasculare
o afecțiuni hepatice și ale căilor biliare
o stări de dezechilibru acido-bazic
 este esențială în producerea de energie
 indicată la alăptare
 este indicată în:
o conjunctivită, keratită
o catar de primăvară, afecțiuni alergice
B2 cereale integrale, lactate
o hemoragii retiniene,
blefarospasm, fotofobie, hemeralopie
o enterocolite, porfinurie, insuficiență
hepatică
o anemii, tulburări de absorbție a fierului
 favorizează absorbția calciului și fosforului
 indirect stimulează depunerea sărurilor
minerale în oase
 indicații:
gălbenuș
D o rahitism, osteomalacie, fracturi
de ou, unt, lapte de vacă
o carii repetate
o decalcifiere în timpul sarcinii
o psoriazis, leziuni cutanate, lupus
tuberculos

4
  contraindicații:
o nefrite, litiază renală
o procese degenerative cardiovasculare
o arterioscleroză
o nu se administrează doze mari în timpul
sarcinii!
 protejează organismul față de acțiunea
radicalilor liberi
 participă la formarea și protejarea globulelor
roșii și ale țesuturilor
 indicații:
o sterilitate (la ambele sexe)
o avort habitual, iminență de avort
ulei de germeni de porumb, ulei
o vărsături
de germeni de floarea soarelui,
o tulburări neuromusculare survenite în
semințe de floarea
E cursul sarcinii
soarelui, alune, spanac, pâine
o prurit vulvar
neagră, unt, cartofi prăjiți, făină
o hepatită epidemică și cronică
de grâu, varză, ouă
o distrofii musculare
o reumatism muscular
o insuficiență cardiacă
o infarct miocardic
o psoriazis
o acnee
o sclerodermie
 participă la formarea de protrombină (un spanac, salată verde, urzici, roșii,
K coagulant natural al sângelui) mazăre, cereale, uleiuri vegetale
 participă la formarea oaselor , ouă, lactate

7.2. Metode de determinarea a vitaminelor

7.2.1.Identificarea β carotenului (provitamina A) și a vitaminelor A
Vitamina A este un alcool polietenic din clasa terpenelor, concentrat mai ales în ulei
extras din ficat de pește. În susrsele vegetale, vitamina A se găsește sub formă inactivă de
provitamină (β caroten). Carotenoidele ajunse în organismul animal prin alimentație se vor
transforma în vitamina A activă, sub acțiunea carotenazei.
Vitamina A există ca atare în regnul animal și sub formă de caroten (provitamină) , în
regnul vegetal. Există 4 carotenoide care pot fi transformate în vitamina A: alfa, beta, gama-
carotenul și criptoxantina. Activitatea biologică maximă apare la betacaroten din care organismul
poate elabora două molecule de vitamina A. Această transformare are loc mai ales în mucoasa
intestinală, însă utilizarea digestivă a carotenilor este mică (5-35%), stânjenită mai ales de efectul
de barieră al membranelor celulare celulozice. Concentrația carotenilor în produsele alimentare
scade de obicei în ordinea: beta, alfa, gama-caroten, respectiv (90,10, 0,1%), iar activitatea
biologică în același fel (100, 50, 30%).
Carotenii sunt substanțe insolubile în apă sau soluții apoase, dar solubile în grăsime și
solvenți nepolari. Cu toate acestea carotenul poate exista dispersat în soluții apoase, după
complexarea lui prin intermediul proteinelor. În acest fel se explică concentrația lui mare în

5
produsele vegetale bogate în apă. Carotenoidele au o anumită sensibilitate la acțiunea
ultravioletelor, oxigenului, acizilor și mai puțin a temperaturii. Conținutul maxim apare în
fructele colorate sau legumele verzi (însoțește clorofila). Vitamina A există în regnul animal,
unde se cunosc trei structuri ale acestei vitamine: vitamina A1 și A2 ( care diferă printr-o grupare
metilenică) și vitamina A3 care de fapt este lipsită de activitate biologică. Ca și provitamina este
liposolibilă și solubilă în solvenți organici. Este sensibilă la acțiunea oxigenului și se distruge
procesul de râncezire sub acțiunea peroxizilor. Fierberea sau încălzirea absența exigenului o
influentează puțin.
Vitamina A se găsește în special în produsele animale, cum sunt: laptele și derivatele,
ouă, carne de pește, viscere (ficat) etc.
Principiul metodei: Metoda se bazează pe reacția de culoare pe care o dau
provitaminele și vitaminele A cu acidul percloric. Deoarece lipidele împiedică această reacție, se
realizează inițial o saponificare a probei cu o soluție alcalină.
Proba de analizat: material vegetal:morcovi, cătină.
Reactivi și material:
-cloroform
-hidroxid de potasiu, soluție alcoolică 5%
-acid percloric, soluție 70%
-mojar, pâlnie de separare, pipete gradate de 10 ml, eprubete
Mod de lucru: Se mărunțesc 1 g de probă, se mojarează cu 2 ml soluție de hidroxid de
potasiu. Amestecul se introduce într-o pâlnie de separare , se adaugă 2 ml cloroform. Se agită
puternic, se lasă în repaus 15 minute pentru separarea straturilor și apoi se colectează faza
cloroformică într-o eprubetă. Se introduce 1 ml de soluție cloroformică de vitamina A într-o altă
eprubetă și se adaugă 4-5 picături de acid percloric. În cazul unei reacții pozitive, se observă
apariția unei culori galbene, care trece imediat în albastru.
7.2.2. Determinarea spectrofotometrică a vitaminei A și carotenoizilor
Principiul metodei de determinare a vitaminei A se bazează pe purificarea extractului
din produsul alimentar pe coloană de absorbant și dezvoltarea culorii cu reactivul Karr-Price
(SbCl3). Se evaluează apoi concentrația spectrofotometric.
Materiale și reactivi:
 alumină activă. Se activează alumina prin încălzirea la 800°C. Se introduce apoi
într-un balon de sticlă cu dop în care se adaugă 5% din greutatea ei în apă. Se
agită pentru repartizarea cât mai uniformă a conținutului, care nu trebuie să
prezinte aglomerări cu umiditate mai mare. Se lasă să stea cca 21 de ore pentru
repartiția cât mai uniformă a umidității și apoi se poate folosi
 cloroform purificat prin distilare. Se aruncă 10% din porțiunea de la începutul și
sfârșitul distilării
 hexan. Se distilează și se separă fracțiunea între 64-68° C ; solventul trebuie să fie
lipsit de alcool, esteri etc
 alcool 95% lipsit de aldehide (control prin reactivul Schiff)
 soluție de acetonă în hexan de 4 și 15%
 soluție de KOH 50%
 reactiv SbCl3 care trebuie să fie transparente, nehidratate și incolore, se titrează
puțin în cloroform și apoi se adaugă o nouă porțiune de solvent încălzind ușor
6
 prin dizolvare . Se răcește și se adaugă 30 ml acetonă, aducându-se la 1 litru cu
cloroform. Dacă soluția nu este clară se filtrează sau se lasă să stea să se
decanteze. Păstrată în sticle brune, este stabilă câteva luni.
 Soluție etanol de vitamina A se folosește acetatul de ulei de semințe de bumbac,
sau capsule farmaceutice de vitamina A, cu concentrația cunoscută
 Soluție de caroten cristalizat formată prin amestecarea a 10% alfa-caroten și 90%
beta-caroten și dizolvare în hexan purificat.(Se verifică puritatea carotenilor prin
curba spectrofotometrică).
Prepararea coloanei de adsorbție
Se confecționează o coloană mică de cromatografie care se astupă cu un dop de vată de
sticlă. Se introduce apoi adsorbantul activ ca mai sus în coloana în care se exercită vacuum.
Adaosul se face în porțiuni mici, bătând ușor în pereții coloanei cu o baghetă învelită în cauciuc
pentru a asigura omogenizarea adsorbantului. Înălțimea stratului de adsorbant trebuie să fie de 7
cm. Se adaugă în partea superioară a coloanei un strat de 1 cm Na2SO4 anhidru pulverizat, pentru
deshidratarea suplimentară a solvenților.
Coloana se verifică în ceea ce privește capacitatea funcțională saponificând 0,1 g
vitamina A la care s-au adăugat 2 g ulei de semințe de bumbac proaspăt. Se extrage în hexan, se
diluează, astfel ca să conțină 5-10 gama-caroten și 30 gama vitamina A saponificată. Se diluează
la 15 ml cu hexan , se spală coloana pregătită ca mai sus cu hexan pur, potrivindu-se în acest
timp viteza de scurgere la două picături pe secundă. În coloana incă îmbibată cu solvent pur, se
toarnă mixtura de vitamine. Se eluează apoi carotenul reținut cu soluția de acetonă în hexan 4%
(sunt necesari cca 20-30 ml de eluat). Se caută apoi să se identifice zona de fixare inelară a
vitaminei A , examinând coloana pentru scurtă vreme în lumina ultravioletă cu lungime de undă
mică. Zona aceasta nu trebuie să fie mai jos de 2 cm de la vârful coloanei. Se eluează vitamina
cu o soluție de acetonă în hexan (soluția de 15%). Se folosesc de obicei 30 ml eluat. Se
examinează ultimul ml de eluat în ultraviolet și dacă el este fluorescent se mai folosesc încă
câtiva cm de soluție 15% de acetonă în hexan. Se evaporă soluțiile obținute în rotavapor sau
vacuum, se adaugă 1 ml cloroform pentru redizolvarea vitaminei A și se determină colorimetric
aceasta ca mai jos. Se calculează apoi retentivitatea și recuperarea de pe coloană.
Modul de lucru
În prealabil se face un martor al tuturor reactivilor, inclusiv uleiul de semințe de
bumbac. Extincția acestuia trebuie să fie 0 sau foarte aproape de 0. Curba etalon se face
cântărind vitamina A acetat pe o sticlă de ceas tarată la balanța analitică care se aduce apoi
cantitativ la un balon cotat cu cloroform purificat. Soluția trebuie să fie ferită de lumină și nu
trebuie păstrată mai mult de 8 ore. Se fac 5-6 diluții convenabile cu cloroform astfel alese, încât
după dezvoltarea culorii să aibă o transmisie între 20 și 85%. Se tratează curba extincției față de
concentrație;la nivelul de concentrație propus de metodă, aceasta va fi în mod obișnuit o dreaptă.
Pentru caroten se fac în același mod o serie de diluții de alfa și beta caroten în hexan și se
determină concentrația ca și la proba de analiză. Înainte de determinare se va face, de asemenea,
o corecție a pigmenților galbeni care pot să existe în eluatul vitaminei A . În cazul în care această
cantitate de pigmenți interferenți este sesizabilă vizual, se procedează la stabilirea unei
corecții,astfel: proba saponificată și extrasă ca mai sus se cromatrafiază și se eluează cu acetona
15% din hexan. Se determină concentrația pigmenților galbeni în aceste fracțiuni, folosind curba
de etalonare pentru caroten. Se evaporă solventul și se solvă reziduul rămas în cloroform. Se fac
apoi o serie de diluții convenabile (în limita scării etalon) și se lucrează ca la vitamina A
7
(folosind reactivul SbCl3). Se obține factorul de corecție pentru reacția acestor pigmenți cu SbCl3
reprezentând grafic concentrația pigmentului galben determinată la 440 nm față de concentrația
vitaminei A determinată de curba etalon pentru această vitamină.
Prelucrarea probelor
Pentru produsele care au un conținut mic de vitamina A se cântăresc 40 g; pentru cele
cu conținutul între 4000 - 20000 u, se iau 20-40 g și pentru cele cu conținut superior se folosesc
10 g de probă, care se introduc într-un balon de 500 ml. Dacă se analizează concentrate sau
mixturi cu un conținut mic de grăsime, se adaugă 1 g ulei de bumbac proaspăt peste proba din
balon. Se adaugă apă de trei ori greutatea probei(ml), se agită bine în așa fel încât toate
particulele probei să fie umectate și se adaugă un volum (în ml) de soluție de KOH egal cu
greutatea probei. Se agită din nou pentru omogenizare. Se refluxează 30 de minute la o viteza de
2 picături pe secundă. Se agită de 3 ori balonul în acest interval de timp pentru a dispersa și a
omogeniza conținutul. Se mai repetă încă o dată această operație înainte de terminarea refluxării
și de extracție. Se răcește la temperatura camerei în curent de apă. Se adaugă apoi apă la
conținutul balonului în volum egal cu de două ori greutatea probei. Se extrage de 3 ori cu hexan,
prima dată folosind un volum de hexan de 2-3 ori greutatea probei și apoi în cantități egale cu
greutatea probei. Pentru probele mai concentrate se pot folosi cantități mai mari de hexn și se
repetă această operația până la epuizarea completă a vitaminei A. Dacă în probă sunt cantități
mai mari decât pigmenții carotenoizi, nu vor fi îndepărtați toți în cele 3 extracții,dar ce rămâne în
extractul alcoolic alcalin constă din carotenoizi polihidroxilați și oxidați. Se adună toate
extractele hexanice într-o pâlnie de separare. Se toarnă 100 ml apă răcită în pâlnie, se agită și se
scurge după spălare, reținând stratul hexanic, inclusiv eventuala emulsie. Se mai repetă spălarea
cu alte porțiuni similare de apă, până când acestea nu mai prezintă reacție alcalina în prezența
felolftaleinei. Dacă emulsia este persistentă se spală a 3 oară cu soluție alcoolica 10% care
conține și 0,1% acid clorhidric. După spălarea cu soluție alcoolică, urmele din aceasta trebuie
îndepărtate prin alte doua spălari cu apă bidistilată. Se separă apoi straturile, se filtrează printr-un
dop de vată într-un balon potrivit și apoi se spală pâlnia și vata adunând acest solvent, în balon
cotat care se aduce apoi la semn.
Separarea cromatografică
Se va căuta să se cromatografieze o cantitate de extract care să conțină în medie 30
gama de vitamina A. În cazul în care cantitatea de vitamina A este prea mică, se poate concentra
soluția așa încât cantitatea de solvent trecut pe coloană, să nu depășească 25 ml. Se trece apoi
soluția pe coloană și se spală înainte ca întreaga soluție să se scurgă pe coloană, cu 20 ml hexan
pur, în așa fel încât coloana să fie în permanență îmbibată cu solvent. Procesul de separare și de
cromatografiere va fi la fel cu cel de la testarea coloanei. Criptoxantina și pigmenții similari
eluează odata cu vitamina A. Se diluează apoi eluatul obținut la un volum convenabil (50 ml). Se
iau apoi 10 ml și se introduc într-un tub colorimetric pentru a evolua colorația galbenă a
carotenului prezent. Dacă acesta este în cantități mai mari (nu numai urme), se va face corecția
pentru pigmenți galbeni ca mai sus. Se evaporă apoi solventul în vid la 60-65° pe baia de apă, se
solvă reziduul în 1 ml cloroform și se colorimetrează la o lungime de undă de 620 nm folosind 1
ml cloroform și 9 sau 10 ml de SbCl3 (clorură de stibiu). Eprubeta se așează în colorimetru în
timpul adaosului reactivului de SbCl3, pentru ca citirea să se poată face cât mai rapid,deoarece
colorația albastră începe să se modifice în cca 3-5 secunde. Pentru ca proba să fie
corespunzătoare evaluării colorimetrice, soluția în timpul colorimetrării trebuie să fie fără
turbiditate și de un albastru clar. Se calculează rezultatul cu ajutorul curbei etalon. Se calculează
8
factorul recuperare pentru vitamina A, adăgând vitamina A în cantitate cunoscută la o probă
dublă sau la un martor din fiecare serie de analize care se prelucrează similar.

Vitamina A gama/kg= (Cn-Cc)· 1 000/Cx· R

Unde:
Cn=concentrația necorectată a vitaminei A în gama/ml în diluția finală
Cc=concentrația pentru pigmenții galbeni exprimată cu μg vitamina A/ml în soluție
finală
Cx=greutatea probei în g/ml în soluția finală
R=factorul de recuperare al vitaminei A

Determinarea carotenului în eluatul carotenic

Se determină extincția soluției preparate ca mai sus la 436 nm și se calculează
concentrația carotenilor după curba eralon făcută cu concentrații diferite de soluții etalon.
Observație
În ultimii ani se folosește frecvent lichid cromatografia de înală performanță pentru
determinarea rapidă a carotenilor sau altor pigmenți vegetali ce-i însoțesc. Extracția se face ca
acetonă după alcalinizare(pH 8-9) cu Na2CO3. Se centrifughează și se extrag pigmenții până la
epuizare în pâlnie cu eter etilic. Se face cromatografierea de înaltă performanță în sistem de
pompă izocratică injector și DAD pe coloană RPC-18 (HP hypersil ODS) fază mobilă CH3OH/
ACN / THF 35:58:7 cu eluție izocratică. Debit 1 ml/min t°=30° C volum injectat 2 μl. Lungimea
de undă pentru detecție semnal A 425 nm; Semnal B 400 nm; Semnal c 504 nm. Durata analizei
cca 45`.
7.2.3. Identificarea vitaminei E
Vitamina E are în structură un inel cromatic substituit. Se găsește în uleiul de germeni
de grâu, de porumb, în salata verde, embrioni de grâu și de porumb, ulei de măsline, de soia, de
floarea soarelui. Majoritatea alimentelor conțin această vitamină, de aceea este întâlnită foarte rar
avitaminoza E.
Principiul metodei: Se bazează pe proprietatea tocoferorilor de a se oxida sub acțiunea
unor agenti oxidanți, precum clorura ferică, acidul azotic concentrat, la compuși de tip chinonic
colorați specific.
Proba de analizat:
-soluție uleioasă de vitamina E farmaceutică (0,3 mg/ml)
-germeni de grâu proaspeți și deshidratați
-ulei de măsline (floarea soarelui), ulei de germeni de grâu
Reactivi și materiale:
-acid azotic concentrat
-cloroform
-eprubete, mojar, pipete de 1 și 2 ml, baie de nisip, clește de lemn/manșon de hârtie
Mod de lucru: Se mojarează 1 g de germeni de grâu (sau se amestecă 1 ml ulei vegetal)
cu 5 ml (saul 2 ml) cloroform timp de 1-2 minute. Apoi, se lasă în repaus 10 minute, pentru
extracția vitamine E.
Într-o eprubetă, se introduce o parte din extractul vitaminic solid, iar în paralel, în altă
eprubetă, se prepară o probă martor (se introduc 10 picături soluție de vitamina E). Se adaugă

9
câteva picături de acid azotic concentrat. La încălzirea eprubetelor, se va dezvolta o culoare roșie
cărămizie, datorită formării unei chinone, în cazul unei reacții pozitive.
Observații:
-metoda este rapidă și nu interferă cu carotenii
-reacția este dată și de produșii de oxidare ai vitaminei E.
7.2.4. Identificarea vitaminei C (vitamina antiscorbutică)
Vitamina C sau acidul L ascorbic este un derivat al hexozelor, sintetizat de toate
organismele, cu excepția omului, maimuței, cobaiului. Necesarul de vitamina C pentru om este
în general de 10-100 ori mai mare decât celelalte vitamine. Vitamina este larg răspândită în
natură, mai ales în legume și fructe proaspete.
Din punct de vedere chimic,vitamina C este γ lactona unui acid hexonic, se mai numește
acid ascorbic, deși nu are gruparea carboxilică liberă, aceasta fiind blocată de legătura lactonică,
formată între atomii de carbon C1 și C4.
Are un rol bilogic deosebit de important, domeniul său de activitate fiind foarte larg,
încât se poate aprecia că nu există proces fizioloc sau metabolic esențial, la care ea să nu
participe. Majoritatea reacțiilor la care participă acidul ascorbic, sunt reacții de oxidoreducere.
Acest compus reprezintă unul dintre cei mai puternici agenți reducători din celule.
Acidul L ascorbic și derivații săi, se folosesc în industria alimentară ca aditivi, cu rol
antioxidant.
Principiul metodei: Se bazează pe oxidarea vitaminei C sub acțiunea fericianurii de
potasiu și reacția ferocianurii obținute cu FeCl3 urmată de formarea unui compus colorat-
albastru de Berlin.
Proba de analizat: probă verde (măceșe, citrice, ardei iute, frunze pătrunjel, ace de
brad).
Reactivi și materiale:
-acid clorhidric-soluție 2%
-K3[Fe(CN)6] (fericianură de potasiu) -soluție 2% proaspăt preparată
-Clorură ferică- soluție 3%
-Cilindru gradat de 100 ml;vase Erlenmayer de 50, 100 ml; pipete gradate de 5 ml;hârtie
de filtru;mojar
Mod de lucru: Se cântărește 1 g de material vegetal și se mojarează cu 4 ml acid
clorhidric. Apoi, amestecul se trece într-un cilindru gradat de 50 ml (sau într-un vas Erlenmayer
de 50 ml) și se aduce la semn cu soluție de acid clorhidric. Se filtrează pe hârtie de filtru cutat
într-un pahar Erlenmayer. În cazul citricelor , se introduce 1 ml suc de citrice filtrat într-un vas
Erlenmayer; se adaugă 10 ml acid clorhidric și se lasă 10 minute, pentru extracția vitaminei.
Se introduc 10 ml filtrat într-o eprubetă, se adaugă 1 picătură soluție fericianură de
potasiu și 1 picătură soluție de clorură ferică. Se va obține o colorație albastră, datorită formării
unei sări complexe (albastru de Berlin).
7.2.5. Determinarea fluorimetrică a vitaminei B1
Denumită tiamină datorită conținutului în sulf, structura vitaminei B1 ca și sinteza ei s-a
cunoscut și făcut abia în 1936, deși acțiunea ei fiziologică era deja descoperită și parțial studiată.
Tiamina este formată dintr-un nucleu piridinic și unul tiazolic.
Vitamina B1 este o vitamina hidrosolubilă, solubilă în alcool și insolubilă în solvenți
organici (eter,eter de petrol, cloroform, benzen, toluen etc). Ea este relativ termostabilă (mai ales
10
în soluție neutră sau acidă). Mediul acid este favorabil conservării. Este de asemenea relativ
fotosensibilă și radiațiile UV cu lungimea de undă scurtă o distrug rapid. O serie de compuși
chimici cum ar fi borații, acționează distructiv asupra vitaminei. Substanțele reducătoare
(zaharuri), ionii de cupru exercită o acțiune protectoare. Acțiunea de conservare a acestor
componenți este mai intensă în mediul neutru sau în mediul alcalin decât în mediu acid. În unele
alimente vitamina B1 este puternic inactivată de acțiunea unei enzime specifice, tiaminaza. Prin
oxidare, vitamina B1 trece rapid în tiocrom lipsit de activitate biologică și incolor dar puternic
fluorescent. Reacția este specifică tiaminei și stă la baza determinării ei chimice. Rolul fiziologic
al vitaminei B1 este considerabil și constă în participarea ei la tiaminopirofosfat (coferment) la
activitatea carboxilazei. Dată fiind hidrosolubilitatea remarcabilă și deci posibilitatea pierderilor
prin extracție, spălarea sau fierberea alimentelor, râspândirea inegală și sensibilitatea față de unii
factori fizico-chimici, apare justificat controlul concentrației ei în alimente.
Deși pentru determinarea vitaminei B1 au fost propuse metode spectrofotometrice,
colorimetrice și cromatografice, metoda fluorometrică bazată pe oxidarea tiaminei la tiocrom,
pare a fi rămas și astăzi tehnica ce întrunește maximum de avantaje, atât în ceea ce privește
rapiditatea cât și specificitatea.
Principiul metodei se bazează pe oxidarea tiaminei cu fericianură de potasiu (în soluție
alcalină) la tiocrom, extragerea acestuia cu alcool izobutilic și evaluarea concentrației
fluorometric.
Reactivi:soluția acidă de clorură de potasiu 25%: într-un balon cotat de 1000 ml se
introduc 8,5 ml HCl conc. și se aduce la semn cu soluție de clorură de potasiu 25%
-fericianura de potasiu soluție 1%
-fericianură de potasiu soluție alcalină: într-un balon cotat de 100 ml e introduc 3 ml
fericianură de potasiu 1% și se aduce la semn cu soluție de KOH 15%. Soluția trebuie preparată
proaspăt și ținută la întuneric (este instabilă)
-alcool izobutilic purificat: se purifică de eventualele substanțe fluorescente distilându-
se între 105-108°C în aparatura de sticlă. Se poate folosi în locul alcoolului izobutilic, alcool
izoamilic sau n-butilic
-vitamina B1 soluție etalon de rezervă: într-un balon cotat de 250 ml se introduc 25 mg
tiamină ținută în prealabil 30 de ore în exsicator pe P2O5 se dizolvă în HCl 0,01 N și se aduce la
semn cu aceeași soluție; 1 ml din această soluție conține 100 micrograme tiamină; se păstrează la
întuneric și la frigider
-vitamina B1 soluție etalon de lucru: din soluția de rezervă se face o diluție 1:10 cu apă
distilată; din aceasta se iau 10 ml într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 75 ml H2SO4 0,1 N, 6
ml acetat de sodiu 2,5 M și se aduce la semn cu apă distilată. 1 ml conține 1 microgram tiamină.
-permutit: se folosește permutit sau zeolit de 75-80 mesh care se activează tratându-l cu
o cantitate de trei ori greutatea lui, acid acetic 3% și se încălzește pe baie de apă la fierbere timp
de 15`. Se decantează și se repetă încă de 2-3 ori operația cu acid acetic, apoi o dată cu clorură de
potasiu 25% și încă o dată cu acid acetic 3%. Se spală apoi cu apă distilată în repetate rânduri,
până când eluentul nu mai dă reacția pentru clor pozitivă cu o soluție de azotat de argint. Se
usucă la etuvă la 105°.
-preparat enzimatic pentru hidroliza enzimatică a tiaminei legate. În acest scop se poate
folosi un preparat cu activitte diastatică și fosforolitică ca aspergol sau clarază.

11
 Modul de lucru
Se vor pregăti în prealabil coloanele de purificare. În acest scop se introduce într-un tub
de cromatografie o cantitate de cca 6 g permutit activat.
Permutitul va forma o coloană de cca 15 cm înălțime. În timpul introducerii
absorbantului se va tasa coloana prin trepidații permanente pentru ca stratul absorbantului să fie
cât mai omogen și să nu prezinte locuri goale. Capacitatea de retenție a coloanei este de cca 10
gama tiamină. Dacă se depășește în proba de analizat această cantitate, ea poate să treacă prin
coloană fără să fie absorbită determinând pierderi. Se folosește pentru eluția tiaminei o cantitate
triplă de soluție de clorură de potasiu, care va asigura eluția cantitativă a tiaminei din absorbant
și antrenarea în efluent.
După confecționarea coloanei, ea se pregătește pentru lucru introducând 20 m apă
distilată și reglând curgerea acesteia prin acțiunea ușoară a vidului (o trompă de apă). Se va
examina de asemenea coloana să nu prezinte bule de aer în stratul de permutit, deoarece acest
fenomen diminuează capacitatea de adsorbție a cationitului.
Eficacitatea coloanei se verifică cu ajutorul unei soluții pure de tiamină cu care trebuie
să obțină o recuperare de 90-95%. În cazul în care această valoare nu este realizată, permutitul
trebuie înlocuit. Coloana poate fi reactivată după o determinare, spălând-o de câteva ori cu
porțiuni de câte 10-15 ml apă distilată, apoi cu 15 ml acid acetic 3% și apoi din nou cu apă
distilată.
Pentru efectuarea determinărilot propriu-zise, se ia din proba de analiză o cantitate de 5-
10 g produs care trebuie să cuprindă 10-30 gama tiamină și se introduce într-un balon cotat de
100 ml adăugând 75 ml H2SO4 0,1 N pentru hidroliză acidă. Se încălzește timp de o jumătate de
oră balonul pe baie de apă la fierbere, agitând periodic pentru facilitarea acestui proces. După
terminarea hidrolizei acide, se răcește balonul la temperatura de 35°C și se adaugă preparat
enzimatic în proporție de 3% raportat la greutatea substanței uscate din probă. Se agită cât mai
bine pentru obținerea unei suspensii în întreaga cantitate de lichid a preparatului enzimatic.
Pentru facilitatea acestui fenomen, preparatul enzimatic se triturează în prealabil cu câțiva ml de
acetat de sodiu 3,5 M și apoi se trece în balon. Se va realiza cu ajutorul aceleeași soluții un pH în
balonul cotat între 4 și 5. Cantitatea necesară pentru acest lucru este de cca 6 ml (se controlează
cu hârtie indicatoare). Se termostatează balonul la 38°C timp de 16 ore, resuspendând reziduul
din când în când prin agitare. Se răcește apoi la 20°C și se aduce cu apă distilată la semn. Se
filtrează și se păstrează doar filtratul care trece limpede; 25 ml din acest filtrat se purifică
trecându-l pe coloana reparată ca mai înainte (și reglată de așa manieră prin aplicarea unui vid
slab), ca să se obțină o scurgere de o picătură/secundă. După trecerea soluției probei, se spală
coloana cu câteva porțiuni de apă distilată. Se eluează apoi tiamina reținută de cationit cu 10 ml
soluție acidă de clorură de potasiu și se repetă apoi cu o altă porțiune de 10 ml. Eluatul este
colectat într-un balon de 25 ml care se aduce la semn cu aceeași soluție. O cotă parte din soluția
astfel obținută se tratează în pâlnie de separare cu 3 ml soluție alcalină de fericianură de potasiu
agitând ușor. Cantitatea maximî de eluat exidat de cei 3 ml de fericianură este de 5 ml. În cazul
când cota supusă oxidării este mai mică de 5 ml, se va completa volumul acesteia la 5 ml cu apă
distilată. Se extrage tiocromul rezultat în urma oxidării, prin agitare energică timp de un minut și
jumătate cu 10 ml alcool izobutilic sau izoamilic. Se separă stratul organic și se tratează cu 2 g
Na2SO4 anhidru pentru deshidratare și clarificare. Se fluorometrează. Pentru corecția
fluorescențelor parazite ale reactivilor se face în paralel o probă martor procedând ca mai sus,
dar în locul soluției alcaline de fericianură se folosesc 3 ml de hidroxid de sodiu 15%. Valorea
12
fluorescenței acestei probe se scade din valoarea probei de analizat. Cantitatea de tiamină din
probă se află cu ajutorul unei curbe etalon și apoi se calculează la 100 g produs, ținând cont de
diluțiile făcute.
Curba etalon
În mai multe pâlnii de separare se introduc cantități de soluție etalon de tiamină de lucru
cu un conținut (de tiamină) între 0,5 și 5 micrograme. Se completează volumul la 5 ml cu apă
distilată și se procedează ca la analiza probei.

13