Universitatea Tehnica “Gheorghe Asachi” din Iasi

Facultatea de Inginerie Chimica si Protectia Mediului

ANALIZA VITAMINELOR SOLUBILE

IN APA SI GRASIMI PRIN HPLC
Metode de caracterizare si testare a materialelor

Masterand:
Gheorghiu Ioana-Adriana
Profesor coordonator:
Grupa 2502
Prof.dr.ing. Teodor Malutan
Specializarea: PFC

2018
 Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)

Termenul de cromatografie de lichide este utilizat

pentru a denumi o gama extinsa de sisteme cromatografice
care au în comun faptul ca utilizeaza o faza mobila lichida.

Cromatografia de lichide clasica a fost

caracterizata de utilizarea unor coloane cu diametre
mari, umplute cu particule de faza stationara de o
granulatie fina si prin care faza mobila trecea sub
influenta fortei gravitationale.
 Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)

Principalele avantaje ale cromatografiei de lichide de înalta performanta sunt:

- permite si analizarea probelor greu volatile sau instabile termic

- realizarea separarii unor amestecuri complexe de substante
- capacitate de separare ridicata
- viteza ridicata a separarii
- monitorizarea continua a efluentului coloanei
- automatizarea procedurii analitice si a prelucrarii datelor
 Partea experimentala – consideratii generale

Cromatografele de lichide de înaltă

performanţă sunt formate dint-un
sistem de vase cu solvenţi, o pompă
de înaltă presiune, coloană
cromatografică, unul sau mai
mulţi detectori si un sistem de
prelucrare a datelor; ele mai sunt
completate cu elemente de reglare
automată a debitului, a presiunii si a
temperaturii.
 Vitaminele sunt substanțe chimice organice necesare în cantități
mici pentru ca organismul să fie sănătos. Aceste se clasifica in doua mari
categorii:
• Solubile in apa
• Liposolubile

Vitaminele solubile în apă includ vitaminele din grupa B (tiamina,

riboflavina, nicotinamide)si vitamina C.
Vitaminele solubile în grăsimi includ în principal vitamina A
(retinol), E (tocoferol), D (radiostol), K.

În metodele tipice HPLC, vitaminele sunt determinate utilizând o

fază mobilă apoasă cu un conținut redus de solvenți organici, în timp ce
vitaminele solubile în grăsimi sunt determinate folosind un solvent organic
mobil.
 Vitaminele au fost separate pe coloana
Acclaim® PolarAdvantage (PA) II
cu o singură injecție . Datorită diferențelor mari
în metodele de preparare a probelor, această
metodă este ineficientă în analiza probelor
solide, cum ar fi multivitaminele comprimate.

Pregătirea probelor necesită mai mult de

un solvent pentru a extrage eficient vitamine
solubile în apă sau în grăsimi; prin urmare, nu
este posibilă o singură injecție din eșantion.
Daca se utilizeaza metoda injectarii double,
exista riscul ca unii compuși puternic reținuti din
prima injectare sa interfere cu analiza de
vitamina solubila in grasime la a doua injectie.
 Pentru separarea vitaminelor solubile în
apă (cu o faza mobile apoasa) si a vitaminelor
solubile in grasimi (cu o fază mobilă neapoasă )
au fost utilizate coloane HPLC cu fază inversă -
Acclaim PA, PA2 și C18.
Soluția propusă are următoarele avantaje:
• separarea simutana a 21 de vitamine solubile in
apa si grasimi in 25 minute
• orice interferență de la prima injecție este
eliminata
Solubilitatea și stabilitatea vitaminelor solubile în apă și grăsimi
 Riboflavina (vitamina B2) se dizolvă ușor într-o soluție bazică, dar
este instabilă, astfel încât soluția stoc trebuie să fie pregătită în
momentul utilizării. Stocul proaspăt pregătit este diluat cu apă pentru a
obține o serie de soluții standard de riboflavină pentru a face curba de
calibrare.
In acest scop se pregatesc solutii de 1, 10 si 50 μg / ml.
Structuri chimice, spectre UV și lungimi de undă de detecție

Spectrele UV ale vitaminelor

solubile în apă și grăsimi variază în mod
semnificativ datorită structurilor lor
multiple și, prin urmare, este necesară
detectarea lungimii de unda pentru
obținerea celei mai bune sensibilități.

Exemplu:
Cromatogramele de vitamina B6
colectate la (A) 210 și (B) 280 nm într-o
tabletă cu multivitamine și minerale.
Deși are mai multă absorbție la
210 nm, vitamina B6 este cel mai bine
detectată la 280 nm unde interferențele
sunt eliminate.
 Acclaim PA, PA2 și C18 sunt coloane cu bază
de siliciu proiectate pentru separări de înaltă
eficiență și fabricate cu silice de puritate superioară.

Acclaim 120 C18 este o coloana de înaltă

performanță ( coloana cu fază inversă) și prezintă
un monostrat dens legat de octadecildimetilsiloxan
(ODS) pe un substrat de silice foarte pur, sferic, cu
structură de pori de 120 Å.

Coloana Acclaim PA este o coloană de silice

cu fază inversă cu un grup polar sulfonamidic
încorporat pentru a îmbunătăți faza staționară.
Coloana Acclaim PA2 este o coloană de fază inversă
bazată pe silice dar cu un grup polar încorporat
diferit. Această fază staționară are o amidă
încorporat.
 Pe coloana PA2, timpul de retenție al acidului nicotinic a crescut atunci când
valoarea pH-ului a crescut la 5, apoi a început să scadă (Figura 5B). În schimb, a
variat putin, crescând pe coloana PA (Figura 5A) și a prezentat o creștere foarte mică
pe coloana C18.
 Comparativ cu coloana C18,
coloanele PA și PA2 au demonstrat mai
bine selectivitatea pentru compușii cu
polaritate ridicată (adică tiamină, acid
ascorbic, acid nicotinic, piridoxină și
piridoxal) în domeniul de la pH 3,0 până
la 4,0.

Cromatograme de acid nicotinic pe (A) Acclaim

PA2 și (B) Coloane Acclaim PA la pH 3,6
Cromatograme de (A) comprimat de Cromatograma unui comprimat de
vitamine și minerale pentru femeile
vitamine și minerale (pentru femei) și
însărcinate
(B) același eșantion cu standarde.
 Bibliografie

 Nollet, Leo M.L. Food Analysis by HPLC; 2nd Edition, Marcel Dekker, Inc.: New York, Basel, 2000
 Determination of Thiamine Hydrochloride, Pyridoxine Hydrochloride, Niacin, Niacinamide, and
Caffeine in Health Foods, GB/T 5009. 197-2003
 Determination of Vitamin A, D, E Content in Milk Powder and Formula Foods for Infants and
Young Children, GB/T 5413. 9-1997
 Dionex Corporation. Determination of Water- and Fat-Soluble Vitamins in Nutritional
Supplements by HPLC with UV Detection. Application Note 251, LPN 2533, 2010, Sunnyvale, CA
 Dionex Corporation. Determination of Water- and Fat-Soluble Vitamins in Functional Waters by
HPLC with UV-PDA Detection. Application Note 216, LPN 2145, 2009, Sunnyvale, CA
 Dionex Corporation. HPLC Assay of Water-Soluble Vitamins, Fat-Soluble Vitamins, and a
Preservative in Dry Syrup Multivitamin Formulation. Application Note 252, LPN 2548, 2010,
Sunnyvale, CA
 www.scribd.com
 www.wikipedia.ro
VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE!