Determinarea vitaminei A

Descoperirea de vitamina A poate fi derivat de la cercetare datnd de la 1906, indicnd faptul c ali factori dect carbohidrati , proteine , i grsimi au fost necesare pentru a menine bovine sntoase. Deoarece "ap- solubil factorul B "( vitamina B ) a fost recent descoperit, cercetatorii au ales numele de "grsime-solubil factorul A" (vitamina A). n 1919, Steenbock (Universitatea din Wisconsin), a propus o relaie ntre pigmeni galben de plante (beta-caroten) si vitamina A. Vitamina A a fost prima oara sintetizat in 1947 de doi chimiti olandeze, David Adriaan van Dorp i Jozef Ferdinand Arens. Vitamina A (retinol sau vitamina A, retinei, iar patru carotenoide , inclusiv beta-caroten ) este o vitamina care este nevoie de retinei a ochiului, n forma unui metabolit specific, molecula de lumin absoarbe retiniene , care este necesar att pentru sczut -lumina ( scotopic viziune) i viziune de culoare . Vitamina A, de asemenea, funcioneaz ntr-un rol foarte diferite ca form oxidat ireversibil de retinol cunoscut sub numele de acid retinoic , care este un important hormon-ca factor de crestere pentru epiteliale celule i altele. n alimente de origine animal, principala forma de vitamina A este un ester , n principal palmitat de retinil , care este convertit la retinol (chimic un alcool ), n intestinul subire. Funciile de retinol formular ca o form de depozit de vitamine, i pot fi convertite la i de la ei vizual activ aldehida form, retinei . Acidul asociat (acid retinoic), un metabolit care poate fi sintetizat ireversibil de vitamina A, vitamina are doar o activitate parial, i nu n funcie de nivelul retinei pentru ciclul vizuale. Toate formele de vitamina A au un beta-ionone inel de la care un isoprenoid lan este ataat, numit un grup de retinil. Ambele caracteristici structurale sunt eseniale pentru activitatea de vitamina, pigmentul portocaliu din morcovi - beta-caroten - poate fi reprezentat ca dou grupuri de retinil conectate, care sunt utilizate n organism pentru a contribui la un nivel de vitamina. alfa-caroten si gama- caroten au, de asemenea, un grup de retinil singur, ceea ce le da o oarecare activitate de vitamina. Nici unul dintre celelalte caroten au activitate de vitamina. Carotenoide beta- criptoxantin dispune de un grup de ionone i are o activitate de vitamina la om.

Vitamina A poate fi gsit n dou forme principale de alimente :

Retinolul , forma de vitamina A absorbit atunci cnd mnnc surse de alimentare de origine animal, este un galben, grsime-solubil substan. Deoarece formularul de alcool pur este instabil, vitamina se gaseste in tesuturile ntr-o form de ester de retinil. Acesta este, de asemenea, produs comercial i administrat ca esteri, cum ar fi acetat de retinil sau palmitat .

Caroteni alfa-caroten, beta-caroten si gamma-caroten funcioneaz ca vitamina A la ierbivorele i animale omnivor, care dein enzima necesare pentru a converti acesti compusi la retinei . n general, sunt carnivore convertoare srace ale ionine care conin carotenoizi, i carnivore pure, cum ar fi pisici i dihori domestici nu dispun de betacaroten 15,15 '-monooxygenase i nu se poate converti orice carotenoide a retinei (rezultat n nici una dintre carotenoizi fiind forme de vitamina A pentru aceste specii). Echivalene de retinoizi si carotenoide (UI) Deoarece unele carotenoide pot fi convertite n vitamina A, ncercri au fost fcute

pentru a determina ct de mult din ele n dieta este echivalent cu o sum anumit de retinol, astfel nct se pot face comparaii de beneficiul de diferite produse alimentare. Situaia poate fi confuz, deoarece echivalene acceptate s-au schimbat. Timp de muli ani, un sistem de echivalene n care o unitate internaional (UI) a fost egal cu 0,3 micrograme de retinol, 0,6 micrograme de -caroten, sau de 1,2 micrograme de alte carotenoide provitamina A, a fost folosit. Mai trziu, o unitate numit echivalent retinol (RE), a fost introdus. nainte de 2001, unul RE corespundea micrograme retinol 1, 2 g -caroten dizolvat n ulei (acesta este numai parial dizolvat n cele mai multe pastile de suplimente nutritive, datorit solubilitii foarte sraci, n orice mediu), 6 g -caroten n alimente normale ( deoarece nu este absorbit, precum i atunci cnd n uleiuri), i 12 micrograme, fie -caroten , -caroten , sau - criptoxantina n produsele alimentare. Mai nou de cercetare a artat c absorbia de provitamina A de carotenoide este doar jumtate la fel de mult ca sa crezut anterior. Ca urmare, n 2001, SUA Institutul de Medicina a recomandat o nou unitate, activitate echivalent retinol (RAE). Fiecare micrograme RAE

corespunde micrograme retinol 1, 2 g de -caroten n ulei, 12 g de "dietetic", beta-caroten, sau 24 micrograme de alte trei dietetice provitamina-A carotenoizi. Deoarece conversia de retinol de carotenoide provitamina de ctre organismul uman este reglementat n mod activ de ctre suma de retinol la dispoziia organismului, conversiile se aplic strict doar pentru vitamina A-deficit de oameni. Absorbia de provitamine depinde n mare msur de cantitatea de lipide ingerate cu provitamina, lipide crete absorbia de provitamina. Concluzia care poate fi tras de cercetare noi este faptul c fructele i legumele nu sunt la fel de utile pentru obinerea de vitamina A, aa cum a fost gandit, cu alte cuvinte, UI c aceste alimente au fost raportate s conin au fost n valoare de mult mai puin dect acelai numr de UI de grsime, uleiuri i dizolvate ntr-o anumit msur () suplimente. Acest lucru este important pentru vegetarieni , ca orbirea de noapte este rspndit n rile n care carnea de puin sau vitamina A-fortificate alimente sunt disponibile. O prob vegan dieta pentru o zi, care ofer suficiente de vitamina A a fost publicat de ctre Consiliul pentru Alimentaie i Nutriie .Pe de alt parte, valorile de referin pentru retinol sau echivalentele sale, oferite de Academia Nationala de Stiinte , au sczut. ADR (pentru barbati) din 1968 a fost de 5000 UI (1500 retinol micrograme). n 1974, ADR a fost stabilit la 1000 RE (1000 micrograme retinol), n timp ce acum aporturile de referin alimentar este de 900 RAE (900 micrograme sau 3000 UI retinol). Acest lucru este echivalent cu 1800 micrograme de -caroten supliment (3000 UI) sau de 10800 g de -caroten n alimente (18000 UI).

Surse Vitamina A se gaseste in mod natural in multe alimente:

ficat (de vita, porc, pui, curcan, pete) (6500 micrograme 722%), inclusiv ulei de ficat de cod Verzii ppdie (5588 UI 112%) [14] de morcovi (835 g 93%) broccoli frunze (800 g 89%) - Potrivit USDA de baze de date buchetelele de broccoli au mult mai puin. [15]

cartofi dulci (709 micrograme 79%) unt (684 g 76%) varz (681 micrograme 76%) spanac (469 g 52%) dovleac (400 g 41%) varza (333 micrograme 37%) Brnz Cheddar (265 micrograme 29%) pepene galben pepene galben (169 micrograme 19%) ou (140 micrograme 16%) caise (96 micrograme 11%) papaya (55 micrograme 6%) mango (38 micrograme 4%) mazre (38 micrograme 4%) broccoli (31 micrograme 3%) lapte (28 micrograme 3%)

Not: datele preluate de la USDA de baze de date valorile bracketate sunt echivalene de retinol de activitate (RAEs) i procentul de adulti de sex masculin ADR , la 100 de grame de produs alimentar (medie).

Funciilor metabolice Vitamina A joaca un rol ntr-o varietate de funcii de pe tot corpul, cum ar fi:

Viziune Gene transcriere Funcia imunitar Dezvoltrii embrionare i de reproducere Metabolismului osos Hematopoieza Si sanatatea pielii celulare Antioxidant de activitate

Viziune Rolul de vitamina A n ciclul vizual este legat de forma retinei. n cadrul ochi, 11 - cisretiniene este obligat s rodopsinei (tije) i iodopsin (conuri), de la reziduuri conservate lizin. Ca lumina intra in ochi, de 11 - cis-retiniene este izomerizai la toate "trans" form. All-"trans" disociaz de retina de la opsin ntr-o serie de trepte numit foto-albire. Acest izomerizare induce un semnal nervos de-a lungul nervului optic la centrul vizual al creierului. Dup separarea de la opsin, toate-"trans"-retiniene este reciclat i convertit napoi la 11 - "cis", retina forma de o serie de reactii enzimatice. n plus, unele din toate "trans", a retinei pot fi convertite la toate, "trans", forma retinol si apoi transportate cu un interphotoreceptor-retinol de proteina de legare (IRBP), la celulele epiteliale de pigment. Esterificarea n continuare n toate de esteri de "trans" retinil permit stocarea de all-trans-retinol n celulele epiteliale de pigment s fie refolosite atunci cand este nevoie.Etapa final este de conversie de 11 - cis-retiniene va rebind la opsin de a reforma rodopsinei n retinei. Rodopsinei este necesar pentru a vedea n lumin sczut (de contrast), precum i pentru vederea de noapte. Acesta este motivul pentru care o deficienta de vitamina A va inhiba procesul de reformare a rodopsinei i conduce la una din primele simptome, orbire noapte.

Gene transcriere Vitamina A, n forma de acid retinoic, joac un rol important n transcriere gena. Odat ce retinol a fost preluat de ctre o celul, aceasta poate fi oxidat pentru a retinei (retinaldehyde), prin dehidrogenazelor retinol i apoi retinaldehyde poate fi oxidat la acid retinoic de dehidrogenazelor retinaldehyde. De conversie de retinaldehyde la acid retinoic este un pas ireversibil, ceea ce nseamn c producia de acid retinoic este strict reglementat, ca urmare a activitii sale ca un ligand pentru receptorii nucleare. Dermatologie Vitamina A, i mai precis, acidul retinoic, pare a menine sntatea pielii normale prin comutarea de pe gene si diferentierea keratinocitelor (celule imature ale pielii) in celule mature epidermice, mecanismele exacte spatele agenti farmacologici retinoid terapie n tratamentul bolilor dermatologice sunt in curs de cercetare. Pentru tratamentul de acnee , de droguri retinoid cel mai prescris este de 13-cis retinoic acid ( isotretinoin ). Acesta reduce dimensiunea i secreia glandelor sebacee. Dei este cunoscut faptul ca 40 mg de isotretinoin se va rupe pn la echivalentul a 10 mg de ATRA - mecanismul de aciune al medicamentului (numele original Accutane de brand), rmne necunoscut i este o chestiune de unele controverse. Isotretinoin reduce numrul de bacterii n ambele conducte si suprafata pielii. Acest lucru este considerat a fi un rezultat al reducerii n sebum, o sursa de substante nutritive pentru bacterii. Isotretinoin reduce inflamatia prin inhibarea rspunsurilor chemotactici de monocite i neutrofile. Izotretinoinul, de asemenea, a fost demonstrat de a iniia remodelare a glandelor sebacee, determinnd schimbri n expresia genelor care induc selectiv apoptoza . Isotretinoin este un teratogen , cu un numr de potenial de efecte secundare. Prin urmare, utilizarea sa necesit supraveghere medical. Retiniana / retinol comparativ cu acid retinoic Vitamina A obolani defavorizate pot fi pstrate n stare bun de sntate, cu suplimente de acid retinoic . Acest lucru inverseaz efectele de cretere piticirea de deficit de vitamina A, precum i etapele timpurii ale xeroftalmie . Cu toate acestea, astfel de obolani arat infertilitate

(n att brbai, ct i femei), i continu degenerare a retinei, artnd c aceste funcii necesit retinei sau retinol, care sunt intraconvertable, dar care nu pot fi recuperate de la acid retinoic oxidat. Cerina de retinol pentru a salva reproducere in vitamina A obolani cu deficit de acum este cunoscut a fi cauzat de o cerin pentru sinteza local de acid retinoic de retinol n testicul i de embrioni. Deficien Deficit de vitamina A este estimat a afecta aproximativ o treime din copiii sub vrsta de cinci ani n jurul lumii. Se estimeaz de a pretinde viaa de 670.000 copii sub cinci ani anual. Aproximativ 250,000-500,000 copii n rile n curs de dezvoltare devin orb n fiecare an pentru a cauza deficit de vitamina A, cu cea mai mare prevalen n Asia de Sud i Africa. Deficit de vitamina A poate avea loc fie ca un primar sau un deficit secundar. Un primar de vitamina A deficit apare n rndul copiilor i adulilor care nu consuma un aport adecvat de provitamina A carotenoizi din fructe i legume sau de vitamina A semifabricate de la animale i de produse lactate. Intarcare timpurie de la laptele matern poate crete, de asemenea, riscul de deficit de vitamina A. Un deficit de vitamina secundar este asociat cu sindrom de malabsorbie cronic de lipide, productia de bila tulburri i de pres, i de expunerea cronic la oxidani, cum ar fi fumul de tigara, i alcoolismul cronic. Vitamina A este o vitamin solubil n grsimi i depinde de solubilizare micelar pentru dispersie n intestinul mic, ceea ce duce la utilizarea incorect de vitamina A de la low-diete de grasimi. Deficitul de zinc poate afecta, de asemenea, absorbia, transportul, metabolismul i de vitamina A., Deoarece este esenial pentru sinteza de vitamina A, proteine de transport i ca cofactor n conversia de la retinol retiniene n populaiile subnutriti, prize de comune mici de vitamina A si zinc, crete gradul de severitate al deficitului de vitamina A i conduce semne fiziologice i simptome de deficit. Un studiu n Burkina Faso au aratat reducerea majora a morbiditatii malariei combinat cu vitamina A si zinc , n suplimentarea copiii mici. Datorita functiei unice de retina ca un cromofor vizual, una dintre cele mai vechi manifestri specifice i de deficit de vitamina A este cu probleme de vedere, n special n lumin

redus - orbirea de noapte . Deficit persistent d natere la o serie de schimbri, cea mai devastatoare care apar n ochi. Unele alte modificri oculare sunt menionate ca xeroftalmie . n primul rnd exist uscaciune a conjunctivei ( xeroza ), ca lacrimal normal i mucus-secretoare epiteliului este nlocuit de un epiteliu keratinized. Aceasta este urmata de acumularea de resturi de keratina din plci mici, opace ( pete Bitot lui ) i, eventual, eroziunea de suprafata corneei uniformizat, cu nmuiere i distrugerea corneei ( keratomalacia ) i orbire totala. Alte modificri includ afectat imunitate (risc crescut de infectii ale urechii, infecii ale tractului urinar, boala meningococica), hiperkeratoza (noduli albe la foliculii de par), keratoza pilaris i metaplazie scuamoasa a epiteliului mucoasei cailor respiratorii superioare i a vezicii urinare la un epiteliu keratinized. Cu relaii la stomatologie, un deficit de vitamina A duce la smalt hipoplazie. Vitamina alimentare adecvat, dar nu in exces A, este deosebit de important pentru femeile gravide i care alpteaz, pentru dezvoltarea normal a ftului. Deficiene nu pot fi compensate prin postnatale suplimentarea. Excesul de vitamina A, care este cel mai frecvent cu suplimente de ridicat de vitamina doze, poate provoca malformaii congenitale i, prin urmare, nu trebuie s depeasc valorile zilnice recomandate. Vitamina A inhibarea metabolice, ca urmare a consumului de alcool in timpul sarcinii este mecanismul de elucidat pentru sindromul de alcool fetal i se caracterizeaz prin efecte teratogene potrivesc cel mai bine de vitamina A deficit matern. Suplimentarea cu vitamina A Eforturile globale de sprijinire a guvernelor naionale, n abordarea deficit de vitamina A sunt conduse de Alianta Globala pentru Vitamina A (Gava), care este un parteneriat informal ntre A2Z, canadian Ageniei Internaionale pentru Dezvoltare , Helen Keller International , Iniiativa de micronutrieni , UNICEF , USAID , i Banca Mondial . Comun Gava activitate este coordonat de ctre Iniiativa Micronutrienti. n timp ce strategii includ aportul de vitamina A, printr-o combinaie a alptrii i aportul dietetic, livrare pe cale oral de doze mari de suplimente n continuare strategia principal pentru reducerea deficitului. O meta-analiz a 43 studii au aratat ca vitamina A suplimentarea de copii sub cinci care sunt la risc de deficit reduce mortalitatea cu pn la 24%. Aproximativ 75% din

vitamina A necesare pentru activitatea de suplimentarea de ctre rile n curs de dezvoltare este furnizat de ctre Iniiativa de micronutrieni, cu sprijin de la Agenia Canadian pentru Dezvoltare Internaional. Abordri de fortificare a alimentelor sunt din ce n ce mai realizabil, dar nu poate asigura un nivel de acoperire nc. Organizaia Mondial a Sntii estimeaz c Suplimentarea cu vitamina A a reuit s evite 1,25 milioane de decese cauzate de deficit de vitamina A n 40 de ri din 1998. n 2008, sa estimat c o investiie anual de 60 milioane de suplimente de vitamina A si zinc, combinate ar genera beneficiile de mai mult de 1 miliard de USD pe an, cu fiecare dolar cheltuit de beneficii de mai mult de US $ 17. Aceste intervenii combinate s-au clasat de Consensul de la Copenhaga 2008, ca de investiii din lume cel mai bun de dezvoltare. Toxicitate Deoarece vitamina A este solubila in grasimi, care dispune de orice excese luate n prin diet este mult mai greu dect cu ap, solubile vitamine B si vitamina C, vitamina A de toxicitate este posibil. n general, toxicitatea acut apare la doze de 25.000 UI / kg de greutate corporal, cu toxicitate cronic apare la 4.000 UI / kg de greutate corporal pe zi timp de 6-15 luni. [38] Cu toate acestea, toxice hepatice pot s apar la niveluri ct mai sczute 15.000 UI pe zi, la 1,4 milioane UI pe zi, cu o doz zilnic medie toxica de 120000 UI pe zi, n special cu consumul excesiv de alcool. La persoanele cu insuficien renal , 4000 UI poate provoca daune substaniale. n plus, consumul excesiv de alcool poate crete toxicitatea. Copiii se pot atinge niveluri toxice la 1.500 UI / kg de greutate corporal. Un consum excesiv de vitamina poate duce la greata, iritabilitate, anorexie (apetitului redus), vrsturi, vedere nceoat, dureri de cap, pierderea parului, dureri musculare si abdominale i de slbiciune, somnolen, i alterarea statusului mental. n cazurile cronice, caderea parului, piele uscat, uscarea mucoaselor, febra, insomnie , oboseala, pierderea in greutate, fracturi osoase, anemie, i diaree pot fi deloc evident pe partea de sus a simptomelor asociate cu o toxicitate mai puin grav. Unele dintre aceste simptome sunt, de asemenea, comune pentru acnee tratament cu isotretinoin . Cronic doze mari de vitamina A, i, de

asemenea, farmaceutice retinoizi , cum ar fi 13-cis de acid retinoic , poate produce sindromul pseudotumor cerebri . Acest sindrom include dureri de cap, vedere nceoat i confuzie, asociat cu creterea presiunii intracerebrale. Simptomele incep sa se rezolva atunci cand aportul de substane ofensatoare este oprit. Aportul cronic de 1500 RAE de vitamina A pot fi asociate cu fracturi de old i osteoporozei, deoarece suprima cldirea osoas, stimulnd n acelai timp distrugerea osului. [43] Acest lucru se poate datora faptului c un exces de vitamina A poate bloca exprimarea anumitor proteine dependente de vitamina K pentru a reduce eficacitatea de vitamina D, dar nu a fost nc dovedit. Un aport ridicat de vitamine a fost asociat cu fracturi spontane la animale. Studiile efectuate pe culturi de celule s-au legat de resorbie osoas a crescut i a sczut formarea osoas, cu prize mari. Aceast interaciune poate s apar, deoarece vitaminele A i D, pot concura pentru acelai receptor i apoi s interacioneze cu hormon paratiroidian, care reglementeaz de calciu. ntr-adevr, un studiu de Forsmo et al. arat o corelaie ntre densitatea mineral osoas sczut i de aportul prea mare de vitamina A. Efectele toxice ale vitaminei A au fost dovedit a afecta n mod semnificativ n curs de dezvoltare fetusi. Dozele terapeutice utilizate pentru tratamentul acneei s-au dovedit a perturba activitatea celulelor neuronale cefalice. Fatul este deosebit de sensibil la vitamina A de toxicitate n timpul perioadei de organogeneza. Aceste toxice avea loc doar cu semifabricate (retinoizi), vitamina A. (cum ar fi de la ficat) Formularele de carotenoide (cum ar fi beta-caroten ca n morcovi), nu d astfel de simptome, cu excepia cazului n suplimente i alcoolism chronoic, dar aportul alimentar excesiv de beta-caroten poate duce la carotenodermia , care provoac modificri de culoare portocaliu-galben a pielii. Fumatorii si consumatorii de alcool cronice au fost observate de a avea risc crescut de mortalitate din cauza cancerului pulmonar, cancerul esofagian, cancerul gastro-intestinale si a cancerului de colon. hepatic (ficat), a prejudiciului a fost gasit in studiile umane i animale, n cazul n care consumul de alcool este asociat cu doze mari de vitamina A i beta-caroten suplimentarea.

Cercetatorii au reusit sa creeze solubile n ap forme de vitamina A, care au crezut ar putea reduce potentialul de toxicitate. Cu toate acestea, un studiu din 2003 a constatat n ap solubil vitamina A. a fost de aproximativ 10 ori mai toxic ca vitamina solubila in grasimi Un studiu din 2006 a constatat copii de ap-solubil vitamina A si D, care sunt de obicei solubila in grasimi, sufera de astm de dou ori la fel de mult ca un grup de control completat cu vitamine solubile in grasimi. [51] Vitamina A i derivaii si, n uz medical Retinil palmitat a fost folosit in creme de piele, n cazul n care este defalcate la retinol si aparent metabolizat la acid retinoic, care are o activitate puternic biologice, aa cum este descris mai sus. Cele retinoizi , (de exemplu, acidul 13-cis-retinoic ), constituie o clasa de compusi chimici chimic legate de acid retinoic, i sunt folosite n medicin pentru a modula functii gene, n loc de acest compus. Cum ar fi acidul retinoic, compuii aferente nu au vitamina A plin de activitate, dar nu au efecte puternice asupra expresiei genelor si diferentierea celulelor epiteliale. Farmaceutic folosesc doze de mega natural derivai de acid retinoic sunt utilizate n prezent pentru cancer, HIV, i n scopuri dermatologice. La doze mari, efectele secundare sunt similare cu vitamina A de toxicitate. Reacii adverse severe legate de vitamina A de toxicitate, precum i o gam mic optim de utilizare sunt obstacole-cheie n dezvoltarea de vitamina Aderivate farmaceutic pentru uz terapeutic. Cromatografia de lichide Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o gama extinsa de sisteme cromatografice care au n comun faptul ca utilizeaza o faza mobila lichida. Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul ca permite si analizarea probelor greu volatile sau instabile termic, iar faptul ca si faza mobila participa la separare ofera posibilitati suplimentare pentru realizarea unor separari eficiente.

Cromatografia de lichide clasica a fost caracterizata de utilizarea unor coloane cu diametre mari, umplute cu particule de faza stationara de o granulatie fina si prin care faza mobila trecea sub influenta fortei gravitationale. Aceste sisteme, care se mai folosesc azi n separarile cromatografice lichid-solid, au permis realizarea separarii unor amestecuri complexe de substante n conditii foarte bune, nsa viteza de separare este mica iar analiza suplimentara a compusilor separati prin metode spectroscopice este mai dificila. Aparitia cromatografiei de lichide de nalta performanta (HPLC) a permis eliminarea acestor deficiente si chiar impunerea cromatografiei de lichide ca o metoda mai performanta de analiza dect cromatografia de gaze. Principalele avantaje ale cromatografiei de lichide de nalta performanta sunt: Capacitate de separare ridicata Viteza ridicata a separarii Posibilitatea monitorizarii continue a efluentului coloanei Realizarea unor analize repetate si reproductibile utiliznd aceeasi coloana Automatizarea procedurii analitice si a prelucrarii datelor

Primul cromatograf de lichide modern a fost construit de Csaba Horvth la Universitatea din Yale n 1964 si a tehnica fost denumita cromatografie de lichide de nalta presiune (HPLC). n continuare, termenul care s-a impus a fost cel de cromatografie de lichide de nalta performanta. Prima separare realizata de grupul lui Horvth a fost cea a unor componente ale acizilor nucleici. Dezvoltarea extraordinara a acestei tehnici n ultimii zeci de ani se datoreste n mare masura faptului ca a permis analiza unor compusi care puteau fi separati foarte greu pe alte cai, de exemplu a biomoleculelor. Principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt: cromatografia de adsorbtie lichid-solid (LSC) cromatografia de repartitie lichid-lichid (LLC)

cromatografia ionica (IC) cromatografia prin excluziune (SEC)

Factorii care influenteaza disponibilitatea fazei stationare Asa cum rezulta din ecuatia volumului de retentie, nu numai taria interactiunii dintre solut si faza stationara va fi cea care determina retentia solutului ci si volumul fazei stationare prezente n sistem si accesibile solutului. Volumul fazei stationare cu care componentele amestecului de analizat pot interactiona depinde de starea fizica a fazei stationare si a suportului. Daca faza stationara este un solid poros si dimensiunile porilor suportului sunt comparabile cu diametrele moleculare ale componentelor de separat, atunci faza stationara va fi selectiva pentru marimea moleculelor acestora. Moleculele anumitor soluti vor putea patrunde n interiorul porilor si vor interactiona cu mai multa faza stationara dect alte molecule mai mari care vor fi partial excluse de la aceste interactiuni. Asadar, separarea va fi controlata de fenomenul de excluziune bazat pe marimea moleculelor si de aceea se numeste cromatografie de excluziune. Daca faza stationara va fi chirala, cantitatea de faza stationara disponibila pentru a interactiona cu solutul va fi doar aceea care din punct de vedere steric se potriveste cu orientarea spatiala a moleculei de solut. Acest tip de cromatografie se numeste cromatografie de lichide chirala. Trebuie mentionat ca n functie de natura fazei stationare ambele aceste tipuri, cromatografia de excluziune sau cromatografia chirala, pot sa se ncadreze fie n categoria cromatografiei lichidlichid fie n a celei de tip lichid-solid. Eficienta de separare a coloanei cromatografice n timpul deplasarii prin coloana cromatografica nu este suficient ca benzile de elutie ale celor doi soluti sa migreze diferentiat, ci este necesar ca ele sa fie destul de nguste pentru ca sa se separe ct mai complet una de alta. Parametrul de eficienta care ne arata posibilitatea separarii a doi compusi pe baza selectivitatii termodinamice este coeficientul de separare , definit pe baza raportului factorilor de capacitate a celor doi soluti.

Se observa ca coeficientul de separare coreleaza interactiunile din faza stationara si cele din faza mobila. Asadar n cromatografia de lichide, coeficientul de separare poate fi optimizat prin doua modalitati: alegerea corespunzatoare a fazei stationare; alegerea corespunzatoare a fazei mobile.

Toti factorii care modifica interactiunile moleculare sau intensitatea acestora, att n faza mobila ct si n sau faza stationara vor determina n acelasi timp si modificarea selectivitatii. n cromatografia de lichide, faza stationara (indiferent ca este polara sau nepolara) va adsorbi ntotdeauna n mod preferential o anumita componenta a eluentului, iar grosimea stratului de adsorbtie (df) depinde de natura fazei stationare si a solventului adsorbit (Figura 1)Cu ct ne ndepartam de suprafata, cu att scade taria legaturii acestei adsorbtii si este discutabil unde trebuie plasata delimitarea dintre faza mobila adsorbita si cea neadsorbita. Daca se modifica compozitia fazei mobile acest lucru determina automat si schimbarea compozitiei stratului de faza mobila adsorbita la suprafata fazei stationare, iar drept consecinta modificarea interctiunilor dintre solut si cele doua faze.

Figura 1. Formarea stratului de faza mobila adsorbita pe suprafata fazei stationare Analiza calitativa n cromatografia de lichide Primul parametru care a fost utilizat pentru identificare n cromatografia de lichide a fost volumul de retentie ajustat Vr. Exista nsa o problema majora privind utilizarea acestui parametru, aceea legata de determinarea volumului mort. Volumul de retentie ajustat este diferenta dintre volumul de retentie si volumul mort, nsa volumul mort (VM) ar trebui sa fie doar volumul fazei mobile din coloana si nu volumul total de lichid care se gaseste ntre injector si detector. Volumul mort total (VMt) va include si volumele aferente injectorului, tubulaturii de conectare ntre injector, detector si coloana si celulei de masura. El se poate determinat doar utiliznd un solut care nu se adsoarbe pe faza stationara si care are aceeasi marime moleculara cu cea a solutului analizat pentru a avea aceleasi interactiuni de excluziune. Daca nsa volumul de retentie ajustat este mult mai mare dect volumul mort total, atunci orice solut care nu se adsoarbe poate fi utilizat pentru determinarea volumului mort si n acest caz volumul de retentie ajustat poate fi utilizat drept parametru calitativ. Aceasta utilizare este nsa limitata de dependenta volumului de retentie ajustat de conditiile de analiza, mai ales de lungimea coloanei si debitul fazei mobile.

Tehnici ale cromatografiei de lichide 1. Cromatografia de adsorbtie lichid-solid Cromatografia lichid-solid (LSC), numita si cromatografie de adsorbtie, utilizeaza o faza mobila lichida si o faza stationara solida formata dintr-o pulbere poroasa avnd capacitate mare de adsorbtie si o suprafata specifica ce variaza ntr-un domeniu foarte larg, ntre 50-1000 m2/g. Acest tip de cromatografie se bazeaza pe interactiunea moleculelor solutului cu centrii activi aflati pe suprafata unui adsorbent solid care reprezinta faza stationara. Adsorbentul se poate gasi fie ntr-o coloana (n cazul cromatografiei pe coloana) fie pe suprafata unei placi (n cazul cromatografiei n strat subtire). Granulatia umpluturii variaza pe un domeniu larg, de la 5 m n cazul celor folositi n HPLC si pna la mai mult de 100 m n cazul celor folositi n cromatografia pe coloane clasice.

Cromatografia lichid-solid poate fi utilizata cu rezultate bune att pentru separarea compusilor polari ct si a celor nepolari si este folosita cu precadere n separarile cantitative ale amestecurilor de substante organice, atunci cnd aceste amestecuri nu sunt foarte complexe. n general, compusii care se pot separa cel mai bine prin tehnica LSC sunt cei care au caracter neionic si sunt solubili n solventi organici. Compusii neionici solubili n apa se separa mai bine prin cromatografie de lichide pe faza inversa sau cromatografie cu faze chimic legate. Din punct de vedere istoric, a fost prima tehnica cromatografica utilizata (vet). Faze mobile utilizate n cromatografia lichid-solid n cromatografia LSC se utilizeaza un mare numar de faze mobile lichide, ct si amestecuri ale acestora de compozitie fixa sau compozitie variabila n timp. n cromatografia de lichide, faza mobila poarta numele de eluent, iar procesul de antrenare a solutului prin coloana de catre faza mobila se numeste elutie. Pentru o separare buna, n special n cazul componentelor cu polaritati mult diferite, trebuie utilizata o faza mobila a carei putere de elutie creste. Aceasta putere de elutie este influentata de trei factori: interactiunile dintre moleculele eluentului si moleculele solutului; interactiunile dintre moleculele fazei mobile adsorbite si moleculele de solut aflate n faza mobila adsorbita; interactiunile dintre moleculele de faza mobila adsorbite si adsorbent.

Rolul solventilor n LSC este foarte important, deoarece ei sunt n competitie cu moleculele solutului pentru centrii activi polari ai adsorbentului. Cu ct interactiunile dintre faza mobila si faza stationara sunt mai puternice, cu att adsorbtia solutului va fi mai slaba si invers. Chiar de la nceputurile cromatografiei de adsorbtie s-a constatat ca n cazul adsorbentilor polari solventii nepolari (de exemplu hidrocarburile alifatice saturate sau halogenate) sunt eluenti slabi n comparatie cu solventii polari (alcooli, acizi).

Puritatea solventilor este un aspect foarte important n LSC, deoarece prezenta apei sau a altor compusi polari poate afecta mult performantele coloanei, iar eventuala prezenta a unor compusi care absorb n UV este nedorita atunci cnd se folosesc detectoare n UV. Tehnica cromatografiei lichid-solid pe coloana Cromatografia de adsorbtie este potrivita mai ales pentru separarea compusilor cu mase moleculare medii, polari si nepolari dar fara sarcini electrice. Cromatografia de lichid-solid se poate realiza prin trei tehnici posibile: cromatografie lichid-solid clasica, pe coloana; cromatografie n strat subtire; cromatografie lichid-solid de nalta performanta.

Dintre acestea, cromatografia lichid-solid pe coloana se utilizeaza practic numai n scopuri preparative, n timp ce cea de nalta performanta se utilizeaza mai ales n scop analitic, dar si preparativ. Coloanele utilizate n LSC sunt confectionate n general din sticla, avnd lungimea cuprinsa ntre 10-90 cm si diametrul interior ntre 1-5 cm. Raportul dintre lungimea si diametrul coloanei trebuie sa fie in intervalul 10-20. Aceste coloane pot fi prevazute cu slifuri la ambele capete, pentru a permite atasarea unei plnii de separare pe post de rezervor de solvent n partea superioara, respectiv a unui vas de tip Bchner n partea inferioara pentru colectarea fractiunilor eluate (Figura 2).

Figura2. Coloana utilizata pentru cromatografia lichid-solid Tehnica cromatografiei LSC pe coloana consta din trei etape principale: umplerea si pregatirea coloanei; ncarcarea probei; elutia componentelor probei.

Cromatografia de repartitie lichid-lichid Cromatografia lichid-lichid (LLC) are acelasi principiu ca si extractia, adica se bazeaza pe distributia moleculelor solutului ntre doua faze lichide nemiscibile, n conformitate cu solubilitatea acestora n cele doua faze. Mediul care realizeaza separarea consta dintr-un suport inert (silicagel, kieselguhr) pe care este depus un strat de faza stationara lichida, iar separarea se realizeaza prin trecerea unui flux de faza mobila ce contine proba analizata peste faza stationara. Faza stationara se poate gasi mpachetata ntr-o coloana sau dispusa n strat subtire pe o placa de sticla sau folie de aluminiu.

Faze stationare. Faze stationare legate chimic Cromatografia lichid-lichid se clasifica n functie de polaritatea relativa a fazei stationare si fazei mobile n doua categorii: Cromatografie lichid-lichid pe faze normale, n care faza stationara este polara iar faza mobila nepolara; Cromatografie lichid-lichid pe faze inverse, n care faza stationara este nepolara iar faza mobila polara. Faza mobila n cromatografia de lichide, alegerea naturii si compozitiei fazei mobile are o importanta cruciala pentru a obtine o separare eficienta. Puritatea solventilor utilizati este esentiala. Ele nu pot contine alte materiale dect n urme. n cazul utilizarii de detectoare n UV, solventii trebuie sa fie lipsiti chiar si de urme de substante care sa absoarba n UV. De asemenea, prezenta unor particule solide in faza mobila poate determina distrugerea pompei sau injectorului sau nfundarea coloanei. Din aceste motive, solventii cromatografici sunt scumpi si costul lor reprezinta cea mai mare parte a costului unei analize cromatografice. Au aparut sisteme cromatografice care realizeaza recircularea solventului n cazul n care acesta nu contine un solut detectabil, pentru a reduce costurile. Proprietatea cea mai importanta a solventilor utilizati n cromatografia de lichide este polaritatea. Puterea de elutie a unei faze mobile depinde de polaritatea sa totala, polaritatea fazei stationare si natura componentilor analizati. Optimizarea compozitiei fazei mobile Modificarea compozitiei fazei mobile reprezinta cea mai simpla metoda pentru a influenta rezolutia componentilor n cromatografia de lichide. Pentru separari relativ simple, este posibil ca analiza sa fie efectuata cu un singur amestec de solventi, adica n sistem izocratic. Totusi, gasirea amestecului optim nu este usoara tinnd cont de faptul ca n general este vorba despre un amestec de doi (binar) pna la patru (cuaternar) solventi. Exista o serie de metode

pentru determinarea acestui punct optim bazate pe secvente de analize care permit ajustarea compozitiei pna la atingerea celei optime, pe baza unor algoritmuri de tip simplex. Dezavantajul unei asemenea metode este ca necesita un numar mare de determinari cromatografice. Cea mai buna metoda de determinare a compozitiei optime consta n folosirea unui triunghi (n cazul sistemelor ternare) respectiv a unui tetraedru (n cazul sistemelor cuaternare), compozitia optima fiind data de un punct n interiorul acesti triunghi sau tetraedru (Figura3).

Figura 3. Optimizarea compozitiei fazei mobile Aparatura utilizata n cromatografia lichid-lichid Asa cum s-a aratat, cromatografia de lichide de nalta performanta s-a dezvoltat dupa ce teoria separarilor cromatografice a demonstrat ca pentru obtinerea unei eficiente de separare ridicate, comparabila cu cea realizata n cromatografia de gaze, este nevoie de utilizarea unor umpluturi cu granulatie fina, de ordinul a 5-10 m. Pentru a avea nsa viteze de elutie corespunzatoare, n aceste situatii se impune folosirea unor presiuni ridicate la intrarea eluentului n coloana. Pe de alta parte, folosirea unor coloane scurte a dus la scaderea importanta a capacitatii de ncarcare cu proba, ceea ce a necesitat construirea unor detectoare de mare sensibilitate.

Figura 1.2. Schema unui cromatograf de lichide de nalta performanta (HPLC) Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt: - sistemul de alimentare cu faza mobila - dispozitivul pentru introducerea probei - una sau doua pompe - coloana - detectorul - sistemul de prelucrare a datelor Detectorul spectrofotometric n UV-VIS Se bazeaza pe masurarea transmitantei celulei de masura atunci cnd aceasta este strabatuta de eluentul care contine componentele separate n coloana cromatografica. Conditia

necesara este ca aceste componente sa aiba absorbtie suficient de mare n domeniul spectral n care functioneaza detectorul, iar eluentul sa fie transparent n domeniul respectiv. Detectoarele spectrofotometrice n UV-VIS se pot utiliza pentru analiza compusilor aromatici si a celor care poseda legaturi conjugate: olefine, compusi carbonilici, dervati azoici, nitroderivati, dar si a proteinelor, enzimelor, acizilor nucleici si steroizilor Exista trei tipuri de detectoare n UV-VIS: Detectorul cu lungime de unda fixa Detectorul cu lungime de unda variabila Detectorul cu sir de diode.

Detectorul cu fluorescenta Este probabil cel mai sensibil detector folosit in cromatografia de lichide, cantitatea minima detectabila fiind de pna la 100 de ori mai mica dect n cazul detectoarelor UV-VIS. El poate detecta compusii care prezinta fluorescenta sau pe aceia care pot fi transformati n compusi flourescenti. Prin fluorescenta se ntelege proprietatea unor molecule de a emite o radiatie n momentul n care au atins o stare electronica excitata n urma absorbtiei unei radiatii. Un proces de fluorescenta cuprinde doua etape. n prima etapa, absorbtia unui foton determina trecerea moleculei respective ntr-o stare electronica excitata. Revenirea ntr-o stare energetica stabila are loc de asemenea prin emisia unui foton, adica prin ceea ce este numit fluorescenta. Energiile fotonilor absorbiti, respectiv emisi pot varia n functie de nivelele energetice ntre care are loc tranzitia. n general, emisia se face la lungimi de unda mai mari (adica energii mai mici) dect excitatia. Intensitatea fluoprescentei este proportionala cu concentratia compusului respectiv. Detectorul refractometric diferential Este un detector universal, cu buna stabilitate dar mai putin sensibil, care masoara variatia indicelui de refractie n prezenta componentelor separate n coloana cromatografica. Are

si dezavantajul ca este foarte sensibil la schimbarile de temperatura, deci trebuie termostatat cu mare precizie (0,001C pentru a putea fi utilizat la sensibilitatea maxima). De asemenea, nu poate fi utilizat n cazul n care elutia se face cu gradient si nu se pot folosi dect solventi care au indice de refractie mult diferit de cel al compusilor analizati. Cu toate aceste limitari, detectorul de indice de refractie este extrem de util pentru analiza compusilor neionici, care nu absorb n UV si nu prezinta fluorescenta. Cromatografia ionica Cromatografia ionica (IC) reprezinta de fapt versiunea de nalta performanta a cromatografiei de schimb ionic clasice. Poate fi realizata att utiliznd echipamente HPLC uzuale ct si cromatografe construite special pentru aceasta tehnica. Se pot separa att cationi ct si anioni, folosind rasini schimbatoare de ioni corespunzatoare, nsa schimbatorii coventionali au creat probleme pentru separarile HPLC datorita vitezei mici de difuzie prin masa de rasina si datorita compresibilitatii materialului. Aceste probleme au fost rezolvate prin legarea rasinii pe suprafata unor particule sferice de sticla cu diametre cuprinse ntre 30-50 m, realiznd o umplutura peliculara, sau prin legare de suprafata unor microparticule rigide, realiznd o umplutura de tip faza inversa. Asemenea faze stationare pot fi folosite pentru separarea cu rezolutii ridicate att ale unor amestecuri continnd cationi ct si a celor care contin anioni. Eluarea se face cu o faza mobila tamponata si cu tarie ionica crescatoare. Cromatografia prin excluziune Cromatografia prin excluziune (SEC) se bazeaza pe separarea moleculelor de solut n conformitate cu marimea lor. Tehnica separarii compusilor solubili n apa si care are loc n solutii apoase este denumita cromatografie prin gel-filtrare si este utilizata de exemplu pentru purificarea proteinelor. Separarile care au loc n solutii neapoase sunt cunoscute sub numele de cromatografie de permeatie prin gel. n ambele cazuri mecanismul separarii este identic si se bazeaza doar pe marimea relativa a porilor fazei stationare comparativ cu marimea moleculelor de solut, neavnd loc interactiuni ntre solut si faza stationara.

Alegerea tipului de cromatografie de lichide pentru o anumita separare Pentru alegerea tipului de cromatografie pentru o anumita separare este necesara cunoasterea caracteristicilor fizice ale amestecului respectiv. La mase moleculare mai mari de 2000, metoda de separare este cromatografia prin gel-filtrare sau permeatia prin gel. n cazul separarii compusilor cu mase moleculare mai mici de 2000, alegerea metodei celei mai potrivite se poate face conform schemei prezentate n Figura 4.25.

Figura 4.25. Alegerea sistemului cromatografic: IC = cromatografie ionica; LSC = cromatografie lichid-solid; BPC = cromatografie cu faze chimic legate; RPC = cromatografie cu faze inverse. Trebuie nsa mentionat ca o anticipare corecta a metodei cromatografice potrivite nu se poate face cu certitudine si ea trebuie confirmata de experimente, iar n cazul amestecurilor complexe de multe ori este necesara o combinare a mai multor tehnici. Determinarea vitaminei A Comune de specii de peti din Cambodgia au fost prelevate i screening pentru vitamina A de coninut. Continutul de vitamina A-compusi activi, a fost determinata de nalt performan cromatografie lichid, n probe de pete crud, tot de la 29 de pete speciilor i n piese de prime, de la 24 de specii comestibile. Probele au fost analizate n apte specii selectate. Dou specii, Parachela siamensis Rasbora tornieri i a avut foarte mare de vitamina A continutul> 1500 RAE/100 g de pete crud, ntreg, i ase specii (Barbodes Altus, Barbodes gonionatus,

Dermogenys pusilla, Puntioplites proctozysron i thynnoides Thynnichthys) au avut un coninut ridicat de 500-1500 RAE/100 g de pete crud, tot. Dou specii, Puntioplites thynnoides proctozysron i Thynnichthys a avut continut mare de vitamina A n pri prime, comestibile, dup angajarea tradiional curare practici (RAE: cantitatea de vitamina A compusi active din produsele alimentare este exprimat ca echivalent de activitate retinol (RAE), definit ca bioefficacy relativ la all-trans-retinol. Consecinele estimri revizuite de carotenoide pentru controlul de vitamina A deficienta n rile n curs de dezvoltare. Dehydroretinoids (vitamina A2) nu sunt convertite la all-trans-retinol, dar care au funcii similare metabolice. Determinarea de vitamina A active din compui de pete Vitamina A a fost analizata prin cromatografie lichid de nalt performan(HPLC), astfel cum este descris de ctre Leth i Jacobsen(1993). Retinoizi i b-caroten au fost izolati prin hidroliz alcalin i de extras n dietileter. Acetat de vitamina A a fost adugat ca standard intern pentru procedura prin HPLC. Dup fracionare pe o silice coloana, cu un gradient de funcionare de la 0,5% la 8,5% izopropanol n n-heptan, retinoizi au fost msurate de la UV 325 nm i b-caroten, la 450 nm.Factorul de rspuns pentru retinol a fost evaluat, n timp ce factorii de corecie stabiliti de Zonta (1984) pentru vitamina A-active de compui. Pentru conversia la activitatea de retinol echivalente (RAE), urmtorii factori de funcionare a activiti biologice, n legtur cu retinol a fost folosit: 75% pentru 13-cis de retinol. Procedura de analiz a fost identica cu procedura pentru un screening anterior de specii de peti din Bangladesh . Screening-ul a fost efectuat ntr-un mod treptat: (1) un eantion de peste crud, de fiecare cate unul dintre cele 29 de specii au fost analizate; (2) o prob de piese de prime, comestibile din cele 16 specii cu cel mai mare continut de vitamina A. Probele au fost analizate.

Concluzie
Coninutul de vitamina A a fost confirmat pentru a fi extrem de variabil ntre speciile de peti. Screening-ul de 29 de pete comun specii din bazinul Mekong din Cambodgia, dou specii, aparinnd categoriei,'' foarte bogate in vitamina A'', au fost identificate.Distribuia relativ ntre vitamina A1 i vitamina A2 este specific speciei i vitamina A2 contribuia pentru vitamina A total de coninut variaz de la 5% la 90% n specii de peti ecranate.

Bibliografie 1. Medical News. "Ce este de vitamina A?" . http://www.news-medical.net/health/What-isVitamin-A.aspx . 1. Meschino de sntate. http://www.meschinohealth.com/books/vitamin_a . 2. Statele Unite ale Americii de azi - Stiri. de risc ", steaguri de studiu de utilizare de zi cu zi, printre vitamina vrst Adus de 1 mai 2012. 3. Moore, T.; Holmes, PD (1971). "Producia de vitamina A deficit experimental la obolani i oareci", animale de laborator. 4. VanPelt, hmm, DeRooij, DG (1991). "Spermatogenezei la retinol-deficit de obolani meninut pe acid retinoic" Endocrinologie 5. Organizaia Mondial a Sntii, prevalena global de deficit de vitamina A n rndul populaiilor cu risc 1995-2005, OMS baza de date globala de vitamina A deficit. 6. scincedirect.com