Sunteți pe pagina 1din 27

Determinarea vitaminei A

Descoperirea de vitamina A poate fi derivat de la cercetare datând de la 1906, indicând faptul că alţi factori decât carbohidrati , proteine , şi grăsimi au fost necesare pentru a menţine bovine sănătoase. Deoarece "apă- solubil factorul B "( vitamina B ) a fost recent descoperit, cercetatorii au ales numele de "grăsime-solubil factorul A" (vitamina A). În 1919, Steenbock (Universitatea din Wisconsin), a propus o relaţie între pigmenţi galben de plante (beta-caroten) si vitamina A. Vitamina A a fost prima oara sintetizat in 1947 de doi chimişti olandeze, David Adriaan van Dorp şi Jozef Ferdinand Arens.

Vitamina A (retinol sau vitamina A, retinei, iar patru carotenoide , inclusiv beta-caroten ) este o vitamina care este nevoie de retinei a ochiului, în forma unui metabolit specific, molecula de lumină absoarbe retiniene , care este necesar atât pentru scăzut -lumina ( scotopic viziune) şi viziune de culoare . Vitamina A, de asemenea, funcţionează într-un rol foarte diferite ca formă oxidat ireversibil de retinol cunoscut sub numele de acid retinoic , care este un important hormon-ca factor de crestere pentru epiteliale celule şi altele.

În alimente de origine animală, principala forma de vitamina A este un ester , în principal palmitat de retinil , care este convertit la retinol (chimic un alcool ), în intestinul

subţire. Funcţiile de retinol formular ca o formă de depozit de vitamine, şi pot fi convertite la şi

de la ei vizual activ aldehida formă, retinei . Acidul asociată (acid retinoic), un metabolit care poate fi sintetizat ireversibil de vitamina A, vitamina are doar o activitate parţială, şi nu în funcţie

de nivelul retinei pentru ciclul vizuale.

Toate formele de vitamina A au un beta-ionone inel de la care un isoprenoid lanţ este ataşat, numit un grup de retinil. Ambele caracteristici structurale sunt esenţiale pentru activitatea de vitamina, pigmentul portocaliu din morcovi - beta-caroten - poate fi reprezentat ca două grupuri de retinil conectate, care sunt utilizate în organism pentru a contribui la un nivel de vitamina. alfa-caroten si gama- caroten au, de asemenea, un grup de retinil singur, ceea ce le da o oarecare activitate de vitamina. Nici unul dintre celelalte caroten au activitate de vitamina. Carotenoide beta- criptoxantină dispune de un grup de ionone şi are o activitate de vitamina la om.

Vitamina A poate fi găsit în două forme principale de alimente :

Retinolul , forma de vitamina A absorbit atunci când mănâncă surse de alimentare de origine animală, este un galben, grăsime-solubil substanţă. Deoarece formularul de alcool pur este instabil, vitamina se gaseste in tesuturile într-o formă de ester de retinil. Acesta este, de asemenea, produs comercial şi administrată ca esteri, cum ar fi acetat de retinil sau palmitat .

Caroteni alfa-caroten, beta-caroten si gamma-caroten funcţionează ca vitamina A la ierbivorele şi animale omnivor, care deţin enzima necesare pentru a converti acesti compusi la retinei . În general, sunt carnivore convertoare sărace ale ionine care conţin carotenoizi, şi carnivore pure, cum ar fi pisici şi dihori domestici nu dispun de beta- caroten 15,15 '-monooxygenase şi nu se poate converti orice carotenoide a retinei (rezultat în nici una dintre carotenoizi fiind forme de vitamina A pentru aceste specii).

Echivalenţe de retinoizi si carotenoide (UI)

Deoarece unele carotenoide pot fi convertite în vitamina A, încercări au fost făcute pentru a determina cât de mult din ele în dieta este echivalentă cu o sumă anumită de retinol, astfel încât se pot face comparaţii de beneficiul de diferite produse alimentare. Situaţia poate fi confuz, deoarece echivalenţe acceptate s-au schimbat. Timp de mulţi ani, un sistem de echivalenţe în care o unitate internaţională (UI) a fost egal cu 0,3 micrograme de retinol, 0,6 micrograme de β-caroten, sau de 1,2 micrograme de alte carotenoide provitamina A, a fost folosit. Mai târziu, o unitate numit echivalent retinol (RE), a fost introdus. Înainte de 2001, unul RE corespundea micrograme retinol 1, 2 g β-caroten dizolvat în ulei (acesta este numai parţial dizolvată în cele mai multe pastile de suplimente nutritive, datorită solubilităţii foarte săraci, în orice mediu), 6 g β-caroten în alimente normale ( deoarece nu este absorbit, precum şi atunci când în uleiuri), şi 12 micrograme, fie α-caroten , γ-caroten , sau β- criptoxantina în produsele alimentare.

Mai nou de cercetare a arătat că absorbţia de provitamina A de carotenoide este doar jumătate la fel de mult ca sa crezut anterior. Ca urmare, în 2001, SUA Institutul de Medicina a recomandat o nouă unitate, activitate echivalentă retinol (RAE). Fiecare micrograme RAE

corespunde micrograme retinol 1, 2 g de β-caroten în ulei, 12 g de "dietetic", beta-caroten, sau 24 micrograme de alte trei dietetice provitamina-A carotenoizi.

Deoarece conversia de retinol de carotenoide provitamina de către organismul uman este reglementată în mod activ de către suma de retinol la dispoziţia organismului, conversiile se aplică strict doar pentru vitamina A-deficit de oameni. Absorbţia de provitamine depinde în mare măsură de cantitatea de lipide ingerate cu provitamina, lipide creşte absorbţia de

provitamina.

Concluzia care poate fi trasă de cercetare noi este faptul că fructele şi legumele nu sunt la fel de utile pentru obţinerea de vitamina A, aşa cum a fost gandit, cu alte cuvinte, UI că aceste alimente au fost raportate să conţină au fost în valoare de mult mai puţin decât acelaşi număr de UI de grăsime, uleiuri şi dizolvate într-o anumită măsură () suplimente. Acest lucru este important pentru vegetarieni , ca orbirea de noapte este răspândită în ţările în care carnea de puţin sau vitamina A-fortificate alimente sunt disponibile.

O probă vegan dieta pentru o zi, care oferă suficiente de vitamina A a fost publicat de către Consiliul pentru Alimentaţie şi Nutriţie .Pe de altă parte, valorile de referinţă pentru retinol sau echivalentele sale, oferite de Academia Nationala de Stiinte , au scăzut. ADR (pentru barbati) din 1968 a fost de 5000 UI (1500 retinol micrograme). În 1974, ADR a fost stabilit la 1000 RE (1000 micrograme retinol), în timp ce acum aporturile de referinţă alimentar este de 900 RAE (900 micrograme sau 3000 UI retinol). Acest lucru este echivalent cu 1800 micrograme de β-caroten supliment (3000 UI) sau de 10800 g de β-caroten în alimente (18000 UI).

Surse

Vitamina A se gaseste in mod natural in multe alimente:

ficat (de vita, porc, pui, curcan, peşte) (6500 micrograme 722%), inclusiv ulei de ficat de

cod Verzii păpădie (5588 UI 112%) [14]

de morcovi (835 g 93%)

broccoli frunze (800 g 89%) - Potrivit USDA de baze de date buchetelele de broccoli au

mult mai puţin. [15] cartofi dulci (709 micrograme 79%)

unt (684 g 76%)

varză (681 micrograme 76%)

spanac (469 g 52%)

dovleac (400 g 41%)

varza (333 micrograme 37%)

Brânză Cheddar (265 micrograme 29%)

pepene galben pepene galben (169 micrograme 19%)

ou (140 micrograme 16%)

caise (96 micrograme 11%)

papaya (55 micrograme 6%)

mango (38 micrograme 4%)

mazăre (38 micrograme 4%)

broccoli (31 micrograme 3%)

lapte (28 micrograme 3%)

Notă: datele preluate de la USDA de baze de date valorile bracketate sunt echivalenţe de retinol de activitate (RAEs) şi procentul de adulti de sex masculin ADR , la 100 de grame de produs alimentar (medie).

Funcţiilor metabolice Vitamina A joaca un rol într-o varietate de funcţii de pe tot corpul, cum ar fi:

Viziune

Gene transcriere

Funcţia imunitar

Dezvoltării embrionare şi de reproducere

Metabolismului osos

Si sanatatea pielii celulare

Antioxidant de activitate

Viziune

Rolul de vitamina A în ciclul vizual este legat de forma retinei. În cadrul ochi, 11 - cis- retiniene este obligat să rodopsinei (tije) şi iodopsin (conuri), de la reziduuri conservate lizină. Ca lumina intra in ochi, de 11 - cis-retiniene este izomerizaţi la toate "trans" formă. All-"trans" disociază de retina de la opsin într-o serie de trepte numit foto-albire. Acest izomerizare induce un semnal nervos de-a lungul nervului optic la centrul vizual al creierului. După separarea de la opsin, toate-"trans"-retiniene este reciclată şi convertit înapoi la 11 - "cis", retina forma de o serie de reactii enzimatice. În plus, unele din toate "trans", a retinei pot fi convertite la toate, "trans", forma retinol si apoi transportate cu un interphotoreceptor-retinol de proteina de legare (IRBP), la celulele epiteliale de pigment. Esterificarea în continuare în toate de esteri de "trans" retinil permit stocarea de all-trans-retinol în celulele epiteliale de pigment să fie refolosite atunci cand este nevoie.Etapa finală este de conversie de 11 - cis-retiniene va rebind la opsin de a reforma rodopsinei în retinei. Rodopsinei este necesar pentru a vedea în lumină scăzută (de contrast), precum şi pentru vederea de noapte. Acesta este motivul pentru care o deficienta de vitamina A va inhiba procesul de reformare a rodopsinei şi conduce la una din primele simptome, orbire noapte.

Gene transcriere Vitamina A, în forma de acid retinoic, joacă un rol important în transcriere gena. Odată

ce retinol a fost preluat de către o celulă, aceasta poate fi oxidat pentru a retinei (retinaldehyde), prin dehidrogenazelor retinol şi apoi retinaldehyde poate fi oxidat la acid retinoic de dehidrogenazelor retinaldehyde. De conversie de retinaldehyde la acid retinoic este un pas

ireversibil, ceea ce înseamnă că producţia de acid retinoic este strict reglementată, ca urmare a activităţii sale ca un ligand pentru receptorii nucleare.

Dermatologie

Vitamina A, şi mai precis, acidul retinoic, pare a menţine sănătatea pielii normale prin

comutarea de pe gene si diferentierea keratinocitelor (celule imature ale pielii) in celule mature epidermice , mecanismele exacte spatele agenti farmacologici retinoid terapie în tratamentul bolilor dermatologice sunt in curs de cercetare. Pentru tratamentul de acnee , de droguri retinoid

cel mai prescris este de 13-cis retinoic acid ( isotretinoin ). Acesta reduce dimensiunea şi secreţia glandelor sebacee. Deşi este cunoscut faptul ca 40 mg de isotretinoin se va rupe până la echivalentul a 10 mg de ATRA - mecanismul de acţiune al medicamentului (numele original Accutane de brand), rămâne necunoscută şi este o chestiune de unele controverse.

Isotretinoin reduce numărul de bacterii în ambele conducte si suprafata pielii. Acest lucru este considerat a fi un rezultat al reducerii în sebum, o sursa de substante nutritive pentru bacterii. Isotretinoin reduce inflamatia prin inhibarea răspunsurilor chemotactici de monocite şi neutrofile. Izotretinoinul, de asemenea, a fost demonstrat de a iniţia remodelare a glandelor sebacee, determinând schimbări în expresia genelor care induc selectiv apoptoza . Isotretinoin este un teratogen , cu un număr de potenţial de efecte secundare. Prin urmare, utilizarea sa necesită supraveghere medicală.

Retiniana / retinol comparativ cu acid retinoic

Vitamina A şobolani defavorizate pot fi păstrate în stare bună de sănătate, cu suplimente de acid retinoic . Acest lucru inversează efectele de creştere piticirea de deficit de vitamina A, precum şi etapele timpurii ale xeroftalmie . Cu toate acestea, astfel de şobolani arată infertilitate

(în atât bărbaţi, cât şi femei), şi continuă degenerare a retinei, arătând că aceste funcţii necesită

retinei sau retinol, care sunt intraconvertable, dar care nu pot fi recuperate de la acid retinoic

oxidat. Cerinţa de retinol pentru a salva reproducere in vitamina A şobolani cu deficit de acum este cunoscut a fi cauzat de o cerinţă pentru sinteza locală de acid retinoic de retinol în testicul şi

de embrioni.

Deficienţă

Deficit de vitamina A este estimat a afecta aproximativ o treime din copiii sub vârsta de

cinci ani în jurul lumii. Se estimează de a pretinde viaţa de 670.000 copii sub cinci ani anual. Aproximativ 250,000-500,000 copii în ţările în curs de dezvoltare devin orb în fiecare an pentru a cauza deficit de vitamina A, cu cea mai mare prevalenţă în Asia de Sud şi Africa.

Deficit de vitamina A poate avea loc fie ca un primar sau un deficit secundar. Un primar de vitamina A deficit apare în rândul copiilor şi adulţilor care nu consuma un aport adecvat de provitamina A carotenoizi din fructe şi legume sau de vitamina A semifabricate de la animale şi de produse lactate. Intarcare timpurie de la laptele matern poate creşte, de asemenea, riscul de deficit de vitamina A.

Un deficit de vitamina secundar este asociat cu sindrom de malabsorbţie cronică de lipide, productia de bila tulburări şi de presă, şi de expunerea cronică la oxidanţi, cum ar fi fumul de tigara, şi alcoolismul cronic. Vitamina A este o vitamină solubilă în grăsimi şi depinde de solubilizare micelară pentru dispersie în intestinul mic, ceea ce duce la utilizarea incorectă de vitamina A de la low-diete de grasimi. Deficitul de zinc poate afecta, de asemenea, absorbţia, transportul, metabolismul şi de vitamina A., Deoarece este esenţial pentru sinteza de vitamina A, proteine de transport şi ca cofactor în conversia de la retinol retiniene În populaţiile subnutriti, prize de comune mici de vitamina A si zinc, creşte gradul de severitate al deficitului de vitamina A şi conduce semne fiziologice şi simptome de deficit. Un studiu în Burkina Faso au aratat reducerea majora a morbiditatii malariei combinat cu vitamina A si zinc , în suplimentarea copiii mici.

Datorita functiei unice de retina ca un cromofor vizual, una dintre cele mai vechi

manifestări specifice şi de deficit de vitamina A este cu probleme de vedere, în special în lumină

redusă - orbirea de noapte . Deficit persistent dă naştere la o serie de schimbări, cea mai devastatoare care apar în ochi. Unele alte modificări oculare sunt menţionate ca xeroftalmie . În primul rând există uscaciune a conjunctivei ( xeroza ), ca lacrimal normală şi mucus-secretoare epiteliului este înlocuit de un epiteliu keratinized. Aceasta este urmata de acumularea de resturi de keratina din plăci mici, opace ( pete Bitot lui ) şi, eventual, eroziunea de suprafata corneei uniformizată, cu înmuiere şi distrugerea corneei ( keratomalacia ) şi orbire totala. Alte modificări includ afectată imunitate (risc crescut de infectii ale urechii, infecţii ale tractului urinar, boala meningococica), hiperkeratoza (noduli albe la foliculii de par), keratoza pilaris şi metaplazie scuamoasa a epiteliului mucoasei cailor respiratorii superioare şi a vezicii urinare la un epiteliu keratinized. Cu relaţii la stomatologie, un deficit de vitamina A duce la smalt hipoplazie.

Vitamina alimentare adecvată, dar nu in exces A, este deosebit de important pentru femeile gravide şi care alăptează, pentru dezvoltarea normală a fătului. Deficienţe nu pot fi

compensate prin postnatale suplimentarea. Excesul de vitamina A, care este cel mai frecvent cu

suplimente de ridicat de vitamina doze, poate provoca malformaţii congenitale şi, prin urmare, nu trebuie să depăşească valorile zilnice recomandate.

Vitamina A inhibarea metabolice, ca urmare a consumului de alcool in timpul sarcinii

este mecanismul de elucidat pentru sindromul de alcool fetal şi se caracterizează prin efecte

teratogene potrivesc cel mai bine de vitamina A deficit maternă.

Suplimentarea cu vitamina A

Eforturile globale de sprijinire a guvernelor naţionale, în abordarea deficit de vitamina A sunt conduse de Alianta Globala pentru Vitamina A (Gava), care este un parteneriat informal între A2Z, canadian Agenţiei Internaţionale pentru Dezvoltare , Helen Keller International , Iniţiativa de micronutrienţi , UNICEF , USAID , şi Banca Mondială . Comun Gava activitate este coordonată de către Iniţiativa Micronutrienti.

În timp ce strategii includ aportul de vitamina A, printr-o combinaţie a alăptării şi aportul dietetic, livrare pe cale orală de doze mari de suplimente în continuare strategia principal pentru reducerea deficitului. O meta-analiză a 43 studii au aratat ca vitamina A suplimentarea de copii sub cinci care sunt la risc de deficit reduce mortalitatea cu până la 24%. Aproximativ 75% din

vitamina A necesare pentru activitatea de suplimentarea de către ţările în curs de dezvoltare este furnizat de către Iniţiativa de micronutrienţi, cu sprijin de la Agenţia Canadiană pentru Dezvoltare Internaţională. Abordări de fortificare a alimentelor sunt din ce în ce mai realizabil, dar nu poate asigura un nivel de acoperire încă.

Organizaţia Mondială a Sănătăţii estimează că Suplimentarea cu vitamina A a reuşit să evite 1,25 milioane de decese cauzate de deficit de vitamina A în 40 de ţări din 1998. În 2008, sa estimat că o investiţie anuală de 60 milioane de suplimente de vitamina A si zinc, combinate ar

genera beneficiile de mai mult de 1 miliard de USD pe an, cu fiecare dolar cheltuit de beneficii de mai mult de US $ 17. Aceste intervenţii combinate s-au clasat de Consensul de la Copenhaga 2008, ca de investiţii din lume cel mai bun de dezvoltare.

Toxicitate

Deoarece vitamina A este solubila in grasimi, care dispune de orice excese luate în prin dietă este mult mai greu decât cu apă, solubile vitamine B si vitamina C, vitamina A de toxicitate este posibil.

În general, toxicitatea acută apare la doze de 25.000 UI / kg de greutate corporală, cu toxicitate cronică apare la 4.000 UI / kg de greutate corporală pe zi timp de 6-15 luni. [38] Cu toate acestea, toxice hepatice pot să apară la niveluri cât mai scăzute 15.000 UI pe zi, la 1,4 milioane UI pe zi, cu o doză zilnică medie toxica de 120000 UI pe zi, în special cu consumul excesiv de alcool. La persoanele cu insuficienţă renală , 4000 UI poate provoca daune substanţiale. În plus, consumul excesiv de alcool poate creşte toxicitatea. Copiii se pot atinge niveluri toxice la 1.500 UI / kg de greutate corporală.

Un consum excesiv de vitamina poate duce la greata, iritabilitate, anorexie (apetitului redus), vărsături, vedere înceţoşată, dureri de cap, pierderea parului, dureri musculare si abdominale şi de slăbiciune, somnolenţă, şi alterarea statusului mental. În cazurile cronice, caderea parului, piele uscată, uscarea mucoaselor, febra, insomnie , oboseala, pierderea in greutate, fracturi osoase, anemie, şi diaree pot fi deloc evident pe partea de sus a simptomelor asociate cu o toxicitate mai puţin gravă. Unele dintre aceste simptome sunt, de asemenea, comune pentru acnee tratament cu isotretinoin . Cronic doze mari de vitamina A, şi, de

asemenea, farmaceutice retinoizi , cum ar fi 13-cis de acid retinoic , poate produce sindromul pseudotumor cerebri . Acest sindrom include dureri de cap, vedere înceţoşată şi confuzie, asociată cu creşterea presiunii intracerebrale. Simptomele incep sa se rezolva atunci cand aportul de substanţe ofensatoare este oprit.

Aportul cronică de 1500 RAE de vitamina A pot fi asociate cu fracturi de şold şi osteoporozei, deoarece suprima clădirea osoasă, stimulând în acelaşi timp distrugerea osului. [43] Acest lucru se poate datora faptului că un exces de vitamina A poate bloca exprimarea anumitor proteine dependente de vitamina K pentru a reduce eficacitatea de vitamina D, dar nu a fost încă dovedită. Un aport ridicat de vitamine a fost asociată cu fracturi spontane la animale. Studiile efectuate pe culturi de celule s-au legat de resorbţie osoasă a crescut şi a scăzut formarea osoasă, cu prize mari. Această interacţiune poate să apară, deoarece vitaminele A şi D, pot concura pentru acelaşi receptor şi apoi să interacţioneze cu hormon paratiroidian, care reglementează de calciu. Într-adevăr, un studiu de Forsmo et al. arată o corelaţie între densitatea minerală osoasă scăzută şi de aportul prea mare de vitamina A.

Efectele toxice ale vitaminei A au fost dovedit a afecta în mod semnificativ în curs de dezvoltare fetusi. Dozele terapeutice utilizate pentru tratamentul acneei s-au dovedit a perturba activitatea celulelor neuronale cefalice. Fatul este deosebit de sensibil la vitamina A de toxicitate

în timpul perioadei de organogeneza. Aceste toxice avea loc doar cu semifabricate (retinoizi), vitamina A. (cum ar fi de la ficat) Formularele de carotenoide (cum ar fi beta-caroten ca în

morcovi), nu dă astfel de simptome, cu excepţia cazului în suplimente şi alcoolism chronoic, dar aportul alimentar excesiv de beta-caroten poate duce la carotenodermia , care provoacă modificări de culoare portocaliu-galben a pielii.

Fumatorii si consumatorii de alcool cronice au fost observate de a avea risc crescut de

mortalitate din cauza cancerului pulmonar, cancerul esofagian, cancerul gastro-intestinale si a

cancerului de colon. hepatică (ficat), a prejudiciului a fost gasit in studiile umane şi animale, în

cazul în care consumul de alcool este asociat cu doze mari de vitamina A şi beta-caroten

suplimentarea.
suplimentarea.

Cercetatorii au reusit sa creeze solubile în apă forme de vitamina A, care au crezut ar putea reduce potentialul de toxicitate. Cu toate acestea, un studiu din 2003 a constatat în apă solubil vitamina A. a fost de aproximativ 10 ori mai toxic ca vitamina solubila in grasimi Un studiu din 2006 a constatat copii de apă-solubil vitamina A si D, care sunt de obicei solubila in grasimi, sufera de astm de două ori la fel de mult ca un grup de control completat cu vitamine solubile in grasimi. [51]

Vitamina A şi derivaţii săi, în uz medical

Retinil palmitat a fost folosit in creme de piele, în cazul în care este defalcate la retinol si aparent metabolizat la acid retinoic, care are o activitate puternic biologice, aşa cum este descris mai sus.

Cele retinoizi , (de exemplu, acidul 13-cis-retinoic ), constituie o clasa de compusi chimici chimic legate de acid retinoic, şi sunt folosite în medicină pentru a modula functii gene, în loc de acest compus. Cum ar fi acidul retinoic, compuşii aferente nu au vitamina A plin de activitate, dar nu au efecte puternice asupra expresiei genelor si diferentierea celulelor epiteliale.

Farmaceutică folosesc doze de mega natural derivaţi de acid retinoic sunt utilizate în prezent pentru cancer, HIV, şi în scopuri dermatologice. La doze mari, efectele secundare sunt similare cu vitamina A de toxicitate. Reacţii adverse severe legate de vitamina A de toxicitate, precum şi o gamă mică optimă de utilizare sunt obstacole-cheie în dezvoltarea de vitamina A- derivate farmaceutică pentru uz terapeutic.

Cromatografia de lichide

Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o gama extinsa de sisteme cromatografice care au în comun faptul ca utilizeaza o faza mobila lichida.

Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul ca permite si analizarea probelor greu volatile sau instabile termic, iar faptul ca si faza mobila participa la separare ofera posibilitati suplimentare pentru realizarea unor separari eficiente.

Cromatografia de lichide clasica a fost caracterizata de utilizarea unor coloane cu diametre mari, umplute cu particule de faza stationara de o granulatie fina si prin care faza mobila trecea sub influenta fortei gravitationale. Aceste sisteme, care se mai folosesc azi în separarile cromatografice lichid-solid, au permis realizarea separarii unor amestecuri complexe de substante în conditii foarte bune, însa viteza de separare este mica iar analiza suplimentara a compusilor separati prin metode spectroscopice este mai dificila. Aparitia cromatografiei de lichide de înalta performanta (HPLC) a permis eliminarea acestor deficiente si chiar impunerea cromatografiei de lichide ca o metoda mai performanta de analiza decât cromatografia de gaze. Principalele avantaje ale cromatografiei de lichide de înalta performanta sunt:

  • - Capacitate de separare ridicata

  • - Viteza ridicata a separarii

  • - Posibilitatea monitorizarii continue a efluentului coloanei

  • - Realizarea unor analize repetate si reproductibile utilizând aceeasi coloana

  • - Automatizarea procedurii analitice si a prelucrarii datelor

Primul cromatograf de lichide modern a fost construit de Csaba Horváth la Universitatea din Yale în 1964 si a tehnica fost denumita cromatografie de lichide de înalta presiune (HPLC). În continuare, termenul care s-a impus a fost cel de cromatografie de lichide de înalta performanta. Prima separare realizata de grupul lui Horváth a fost cea a unor componente ale acizilor nucleici. Dezvoltarea extraordinara a acestei tehnici în ultimii zeci de ani se datoreste în mare masura faptului ca a permis analiza unor compusi care puteau fi separati foarte greu pe alte cai, de exemplu a biomoleculelor.

Principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt:

  • - cromatografia de adsorbtie lichid-solid (LSC)

  • - cromatografia de repartitie lichid-lichid (LLC)

  • - cromatografia ionica (IC)

  • - cromatografia prin excluziune (SEC)

Factorii care influenteaza disponibilitatea fazei stationare

Asa cum rezulta din ecuatia volumului de retentie, nu numai taria interactiunii dintre solut si faza stationara va fi cea care determina retentia solutului ci si volumul fazei stationare prezente în sistem si accesibile solutului. Volumul fazei stationare cu care componentele amestecului de analizat pot interactiona depinde de starea fizica a fazei stationare si a suportului. Daca faza stationara este un solid poros si dimensiunile porilor suportului sunt comparabile cu diametrele moleculare ale componentelor de separat, atunci faza stationara va fi selectiva pentru marimea moleculelor acestora. Moleculele anumitor soluti vor putea patrunde în interiorul porilor si vor interactiona cu mai multa faza stationara decât alte molecule mai mari care vor fi partial excluse de la aceste interactiuni. Asadar, separarea va fi controlata de fenomenul de excluziune bazat pe marimea moleculelor si de aceea se numeste cromatografie de excluziune. Daca faza stationara va fi chirala, cantitatea de faza stationara disponibila pentru a interactiona cu solutul va fi doar aceea care din punct de vedere steric se potriveste cu orientarea spatiala a moleculei de solut. Acest tip de cromatografie se numeste cromatografie de lichide chirala. Trebuie mentionat ca în functie de natura fazei stationare ambele aceste tipuri, cromatografia de excluziune sau cromatografia chirala, pot sa se încadreze fie în categoria cromatografiei lichid- lichid fie în a celei de tip lichid-solid.

Eficienta de separare a coloanei cromatografice

În timpul deplasarii prin coloana cromatografica nu este suficient ca benzile de elutie ale

celor doi soluti sa migreze diferentiat, ci este necesar ca ele sa fie destul de înguste pentru ca sa se separe cât mai complet una de alta. Parametrul de eficienta care ne arata posibilitatea separarii

a doi compusi pe baza selectivitatii termodinamice este coeficientul de separare α, definit pe baza

raportului factorilor de capacitate a celor doi soluti.

- cromatografia ionica (IC) - cromatografia prin excluziune (SEC) Factorii care influenteaza disponibilitatea fazei stationare Asa

Se observa ca coeficientul de separare coreleaza interactiunile din faza stationara si cele din faza mobila.

Asadar în cromatografia de lichide, coeficientul de separare poate fi optimizat prin doua modalitati:

  • - alegerea corespunzatoare a fazei stationare;

  • - alegerea corespunzatoare a fazei mobile.

Toti factorii care modifica interactiunile moleculare sau intensitatea acestora, atât în faza mobila cât si în sau faza stationara vor determina în acelasi timp si modificarea selectivitatii.

În cromatografia de lichide, faza stationara (indiferent ca este polara sau nepolara) va adsorbi întotdeauna în mod preferential o anumita componenta a eluentului, iar grosimea stratului de adsorbtie (d f ) depinde de natura fazei stationare si a solventului adsorbit (Figura 1)Cu cât ne îndepartam de suprafata, cu atât scade taria legaturii acestei adsorbtii si este discutabil unde trebuie plasata delimitarea dintre faza mobila adsorbita si cea neadsorbita. Daca se modifica compozitia fazei mobile acest lucru determina automat si schimbarea compozitiei stratului de faza mobila adsorbita la suprafata fazei stationare, iar drept consecinta modificarea interctiunilor dintre solut si cele doua faze.

Se observa ca coeficientul de separare coreleaza interactiunile din faza stationara si cele din faza mobila.

Figura 1. Formarea stratului de faza mobila adsorbita pe suprafata fazei stationare

Analiza calitativa în cromatografia de lichide

Primul parametru care a fost utilizat pentru identificare în cromatografia de lichide a fost volumul de retentie ajustat Vr. Exista însa o problema majora privind utilizarea acestui parametru, aceea legata de determinarea volumului mort. Volumul de retentie ajustat este diferenta dintre volumul de retentie si volumul mort, însa volumul mort (V M ) ar trebui sa fie doar volumul fazei mobile din coloana si nu volumul total de lichid care se gaseste între injector si detector. Volumul mort total (V Mt ) va include si volumele aferente injectorului, tubulaturii de conectare între injector, detector si coloana si celulei de masura. El se poate determinat doar utilizând un solut care nu se adsoarbe pe faza stationara si care are aceeasi marime moleculara cu cea a solutului analizat pentru a avea aceleasi interactiuni de excluziune. Daca însa volumul de retentie ajustat este mult mai mare decât volumul mort total, atunci orice solut care nu se adsoarbe poate fi utilizat pentru determinarea volumului mort si în acest caz volumul de retentie ajustat poate fi utilizat drept parametru calitativ. Aceasta utilizare este însa limitata de dependenta volumului de retentie ajustat de conditiile de analiza, mai ales de lungimea coloanei si debitul fazei mobile.

Tehnici ale cromatografiei de lichide 1. Cromatografia de adsorbtie lichid-solid

Cromatografia lichid-solid (LSC), numita si cromatografie de adsorbtie, utilizeaza o faza mobila lichida si o faza stationara solida formata dintr-o pulbere poroasa având capacitate mare de adsorbtie si o suprafata specifica ce variaza într-un domeniu foarte larg, între 50-1000 m 2 /g. Acest tip de cromatografie se bazeaza pe interactiunea moleculelor solutului cu centrii activi aflati pe suprafata unui adsorbent solid care reprezinta faza stationara. Adsorbentul se poate gasi fie într-o coloana (în cazul cromatografiei pe coloana) fie pe suprafata unei placi (în cazul

cromatografiei în strat subtire). Granulatia umpluturii variaza pe un domeniu larg, de la 5 μm în

cazul celor folositi în HPLC si pîna la mai mult de 100 μm în cazul celor folositi în cromatografia pe coloane clasice.

Cromatografia lichid-solid poate fi utilizata cu rezultate bune atât pentru separarea compusilor polari cât si a celor nepolari si este folosita cu precadere în separarile cantitative ale amestecurilor de substante organice, atunci când aceste amestecuri nu sunt foarte complexe. În general, compusii care se pot separa cel mai bine prin tehnica LSC sunt cei care au caracter neionic si sunt solubili în solventi organici. Compusii neionici solubili în apa se separa mai bine prin cromatografie de lichide pe faza inversa sau cromatografie cu faze chimic legate.

Din punct de vedere istoric, a fost prima tehnica cromatografica utilizata (Ţvet).

Faze mobile utilizate în cromatografia lichid-solid

În cromatografia LSC se utilizeaza un mare numar de faze mobile lichide, cât si amestecuri ale acestora de compozitie fixa sau compozitie variabila în timp. În cromatografia de lichide, faza mobila poarta numele de eluent, iar procesul de antrenare a solutului prin coloana de catre faza mobila se numeste elutie. Pentru o separare buna, în special în cazul componentelor cu polaritati mult diferite, trebuie utilizata o faza mobila a carei putere de elutie creste. Aceasta putere de elutie este influentata de trei factori:

  • - interactiunile dintre moleculele eluentului si moleculele solutului;

  • - interactiunile dintre moleculele fazei mobile adsorbite si moleculele de solut aflate în faza mobila adsorbita;

  • - interactiunile dintre moleculele de faza mobila adsorbite si adsorbent.

Rolul solventilor în LSC este foarte important, deoarece ei sunt în competitie cu moleculele solutului pentru centrii activi polari ai adsorbentului. Cu cât interactiunile dintre faza mobila si faza stationara sunt mai puternice, cu atât adsorbtia solutului va fi mai slaba si invers. Chiar de la începuturile cromatografiei de adsorbtie s-a constatat ca în cazul adsorbentilor polari solventii nepolari (de exemplu hidrocarburile alifatice saturate sau halogenate) sunt eluenti slabi în comparatie cu solventii polari (alcooli, acizi).

Puritatea solventilor este un aspect foarte important în LSC, deoarece prezenta apei sau a altor compusi polari poate afecta mult performantele coloanei, iar eventuala prezenta a unor compusi care absorb în UV este nedorita atunci când se folosesc detectoare în UV.

Tehnica cromatografiei lichid-solid pe coloana

Cromatografia de adsorbtie este potrivita mai ales pentru separarea compusilor cu mase moleculare medii, polari si nepolari dar fara sarcini electrice.

Cromatografia de lichid-solid se poate realiza prin trei tehnici posibile:

  • - cromatografie lichid-solid clasica, pe coloana;

  • - cromatografie în strat subtire;

  • - cromatografie lichid-solid de înalta performanta.

Dintre acestea, cromatografia lichid-solid pe coloana se utilizeaza practic numai în scopuri preparative, în timp ce cea de înalta performanta se utilizeaza mai ales în scop analitic, dar si preparativ.

Coloanele utilizate în LSC sunt confectionate în general din sticla, având lungimea cuprinsa între 10-90 cm si diametrul interior între 1-5 cm. Raportul dintre lungimea si diametrul coloanei trebuie sa fie in intervalul 10-20. Aceste coloane pot fi prevazute cu slifuri la ambele capete, pentru a permite atasarea unei pâlnii de separare pe post de rezervor de solvent în partea superioara, respectiv a unui vas de tip Büchner în partea inferioara pentru colectarea fractiunilor eluate (Figura 2).

Figura2. Coloana utilizata pentru cromatografia lichid-solid Tehnica cromatografiei LSC pe coloana consta din trei etape principale:

Figura2. Coloana utilizata pentru cromatografia lichid-solid Tehnica cromatografiei LSC pe coloana consta din trei etape principale:

  • - umplerea si pregatirea coloanei;

  • - încarcarea probei;

  • - elutia componentelor probei.

Cromatografia de repartitie lichid-lichid

Cromatografia lichid-lichid (LLC) are acelasi principiu ca si extractia, adica se bazeaza pe distributia moleculelor solutului între doua faze lichide nemiscibile, în conformitate cu solubilitatea acestora în cele doua faze. Mediul care realizeaza separarea consta dintr-un suport inert (silicagel, kieselguhr) pe care este depus un strat de faza stationara lichida, iar separarea se realizeaza prin trecerea unui flux de faza mobila ce contine proba analizata peste faza stationara. Faza stationara se poate gasi împachetata într-o coloana sau dispusa în strat subtire pe o placa de sticla sau folie de aluminiu.

Faze stationare. Faze stationare legate chimic

Cromatografia lichid-lichid se clasifica în functie de polaritatea relativa a fazei stationare si fazei mobile în doua categorii:

  • - Cromatografie lichid-lichid pe faze normale, în care faza stationara este polara iar faza mobila nepolara;

  • - Cromatografie lichid-lichid pe faze inverse, în care faza stationara este nepolara iar faza mobila polara.

Faza mobila

În cromatografia de lichide, alegerea naturii si compozitiei fazei mobile are o importanta cruciala pentru a obtine o separare eficienta. Puritatea solventilor utilizati este esentiala. Ele nu pot contine alte materiale decât în urme. În cazul utilizarii de detectoare în UV, solventii trebuie sa fie lipsiti chiar si de urme de substante care sa absoarba în UV. De asemenea, prezenta unor particule solide in faza mobila poate determina distrugerea pompei sau injectorului sau înfundarea coloanei. Din aceste motive, solventii cromatografici sunt scumpi si costul lor reprezinta cea mai mare parte a costului unei analize cromatografice. Au aparut sisteme cromatografice care realizeaza recircularea solventului în cazul în care acesta nu contine un solut detectabil, pentru a reduce costurile.

Proprietatea cea mai importanta a solventilor utilizati în cromatografia de lichide este polaritatea. Puterea de elutie a unei faze mobile depinde de polaritatea sa totala, polaritatea fazei stationare si natura componentilor analizati.

Optimizarea compozitiei fazei mobile

Modificarea compozitiei fazei mobile reprezinta cea mai simpla metoda pentru a influenta rezolutia componentilor în cromatografia de lichide. Pentru separari relativ simple, este posibil ca analiza sa fie efectuata cu un singur amestec de solventi, adica în sistem izocratic. Totusi, gasirea amestecului optim nu este usoara tinând cont de faptul ca în general este vorba despre un amestec de doi (binar) pâna la patru (cuaternar) solventi. Exista o serie de metode

pentru determinarea acestui punct optim bazate pe secvente de analize care permit ajustarea compozitiei pâna la atingerea celei optime, pe baza unor algoritmuri de tip simplex. Dezavantajul unei asemenea metode este ca necesita un numar mare de determinari cromatografice. Cea mai buna metoda de determinare a compozitiei optime consta în folosirea unui triunghi (în cazul sistemelor ternare) respectiv a unui tetraedru (în cazul sistemelor cuaternare), compozitia optima fiind data de un punct în interiorul acesti triunghi sau tetraedru (Figura3).

pentru determinarea acestui punct optim bazate pe secvente de analize care permit ajustarea compozitiei pâna la

Figura 3. Optimizarea compozitiei fazei mobile Aparatura utilizata în cromatografia lichid-lichid

Asa cum s-a aratat, cromatografia de lichide de înalta performanta s-a dezvoltat dupa ce teoria separarilor cromatografice a demonstrat ca pentru obtinerea unei eficiente de separare ridicate, comparabila cu cea realizata în cromatografia de gaze, este nevoie de utilizarea unor umpluturi cu granulatie fina, de ordinul a 5-10 μm. Pentru a avea însa viteze de elutie corespunzatoare, în aceste situatii se impune folosirea unor presiuni ridicate la intrarea eluentului în coloana. Pe de alta parte, folosirea unor coloane scurte a dus la scaderea importanta a capacitatii de încarcare cu proba, ceea ce a necesitat construirea unor detectoare de mare sensibilitate.

Figura 1.2. Schema unui cromatograf de lichide de înalta performanta (HPLC) Principalele componente ale cromatografului de

Figura 1.2. Schema unui cromatograf de lichide de înalta performanta (HPLC) Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt:

  • - sistemul de alimentare cu faza mobila

  • - dispozitivul pentru introducerea probei

  • - una sau doua pompe

  • - coloana

  • - detectorul

  • - sistemul de prelucrare a datelor

Detectorul spectrofotometric în UV-VIS

Se bazeaza pe masurarea transmitantei celulei de masura atunci când aceasta este strabatuta de eluentul care contine componentele separate în coloana cromatografica. Conditia

necesara este ca aceste componente sa aiba absorbtie suficient de mare în domeniul spectral în care functioneaza detectorul, iar eluentul sa fie transparent în domeniul respectiv. Detectoarele spectrofotometrice în UV-VIS se pot utiliza pentru analiza compusilor aromatici si a celor care poseda legaturi conjugate: olefine, compusi carbonilici, dervati azoici, nitroderivati, dar si a proteinelor, enzimelor, acizilor nucleici si steroizilor

Exista trei tipuri de detectoare în UV-VIS:

  • - Detectorul cu lungime de unda fixa

  • - Detectorul cu lungime de unda variabila

  • - Detectorul cu sir de diode.

Detectorul cu fluorescenta

Este probabil cel mai sensibil detector folosit in cromatografia de lichide, cantitatea minima detectabila fiind de pâna la 100 de ori mai mica decât în cazul detectoarelor UV-VIS. El poate detecta compusii care prezinta fluorescenta sau pe aceia care pot fi transformati în compusi flourescenti.

Prin fluorescenta se întelege proprietatea unor molecule de a emite o radiatie în momentul în care au atins o stare electronica excitata în urma absorbtiei unei radiatii. Un proces de fluorescenta cuprinde doua etape. În prima etapa, absorbtia unui foton determina trecerea moleculei respective într-o stare electronica excitata. Revenirea într-o stare energetica stabila are loc de asemenea prin emisia unui foton, adica prin ceea ce este numit fluorescenta. Energiile fotonilor absorbiti, respectiv emisi pot varia în functie de nivelele energetice între care are loc tranzitia. În general, emisia se face la lungimi de unda mai mari (adica energii mai mici) decât excitatia. Intensitatea fluoprescentei este proportionala cu concentratia compusului respectiv.

Detectorul refractometric diferential

Este un detector universal, cu buna stabilitate dar mai putin sensibil, care masoara variatia indicelui de refractie în prezenta componentelor separate în coloana cromatografica. Are

si dezavantajul ca este foarte sensibil la schimbarile de temperatura, deci trebuie termostatat cu mare precizie (0,001ºC pentru a putea fi utilizat la sensibilitatea maxima). De asemenea, nu poate fi utilizat în cazul în care elutia se face cu gradient si nu se pot folosi decât solventi care au indice de refractie mult diferit de cel al compusilor analizati. Cu toate aceste limitari, detectorul de indice de refractie este extrem de util pentru analiza compusilor neionici, care nu absorb în UV si nu prezinta fluorescenta.

Cromatografia ionica

Cromatografia ionica (IC) reprezinta de fapt versiunea de înalta performanta a cromatografiei de schimb ionic clasice. Poate fi realizata atât utilizând echipamente HPLC uzuale cât si cromatografe construite special pentru aceasta tehnica. Se pot separa atât cationi cât si anioni, folosind rasini schimbatoare de ioni corespunzatoare, însa schimbatorii coventionali au creat probleme pentru separarile HPLC datorita vitezei mici de difuzie prin masa de rasina si datorita compresibilitatii materialului. Aceste probleme au fost rezolvate prin legarea rasinii pe suprafata unor particule sferice de sticla cu diametre cuprinse între 30-50 μm, realizând o umplutura peliculara, sau prin legare de suprafata unor microparticule rigide, realizând o umplutura de tip faza inversa. Asemenea faze stationare pot fi folosite pentru separarea cu rezolutii ridicate atât ale unor amestecuri continând cationi cât si a celor care contin anioni. Eluarea se face cu o faza mobila tamponata si cu tarie ionica crescatoare.

Cromatografia prin excluziune

Cromatografia prin excluziune (SEC) se bazeaza pe separarea moleculelor de solut în conformitate cu marimea lor. Tehnica separarii compusilor solubili în apa si care are loc în solutii apoase este denumita cromatografie prin gel-filtrare si este utilizata de exemplu pentru purificarea proteinelor. Separarile care au loc în solutii neapoase sunt cunoscute sub numele de cromatografie de permeatie prin gel. În ambele cazuri mecanismul separarii este identic si se bazeaza doar pe marimea relativa a porilor fazei stationare comparativ cu marimea moleculelor de solut, neavând loc interactiuni între solut si faza stationara.

Alegerea tipului de cromatografie de lichide pentru o anumita separare

Pentru alegerea tipului de cromatografie pentru o anumita separare este necesara cunoasterea caracteristicilor fizice ale amestecului respectiv. La mase moleculare mai mari de 2000, metoda de separare este cromatografia prin gel-filtrare sau permeatia prin gel. În cazul separarii compusilor cu mase moleculare mai mici de 2000, alegerea metodei celei mai potrivite se poate face conform schemei prezentate în Figura 4.25.

Alegerea tipului de cromatografie de lichide pentru o anumita separare Pentru alegerea tipului de cromatografie pentru

Figura 4.25. Alegerea sistemului cromatografic: IC = cromatografie ionica; LSC = cromatografie lichid-solid; BPC = cromatografie cu faze chimic legate; RPC = cromatografie cu faze inverse.

Trebuie însa mentionat ca o anticipare corecta a metodei cromatografice potrivite nu se poate face cu certitudine si ea trebuie confirmata de experimente, iar în cazul amestecurilor complexe de multe ori este necesara o combinare a mai multor tehnici.

Determinarea vitaminei A

Comune de specii de peşti din Cambodgia au fost prelevate şi screening pentru vitamina A de conţinut. Continutul de vitamina A-compusi activi, a fost determinata de înaltă performanţă cromatografie lichidă, în probe de peşte crud, tot de la 29 de peşte speciilor şi în piese de prime, de la 24 de specii comestibile. Probele au fost analizate în şapte specii selectate. Două specii, Parachela siamensis Rasbora tornieri şi a avut foarte mare de vitamina A continutul> 1500 RAE/100 g de peşte crud, întreg, şi şase specii (Barbodes Altus, Barbodes gonionatus,

Dermogenys pusilla, Puntioplites proctozysron şi thynnoides Thynnichthys) au avut un conţinut ridicat de 500-1500 RAE/100 g de peşte crud, tot. Două specii, Puntioplites thynnoides proctozysron şi Thynnichthys a avut continut mare de vitamina A în părţi prime, comestibile, după angajarea tradiţională curăţare practici (RAE:

cantitatea de vitamina A compusi active din produsele alimentare este exprimat ca echivalent de activitate retinol (RAE), definit ca bioefficacy relativ la all-trans-retinol. Consecinţele estimări revizuite de carotenoide pentru controlul de vitamina A deficienta în ţările în curs de dezvoltare. Dehydroretinoids (vitamina A2) nu sunt convertite la all-trans-retinol, dar care au funcţii similare metabolice. Determinarea de vitamina A active din compuşi de peşte Vitamina A a fost analizata prin cromatografie lichidă de înalt performanţă(HPLC), astfel cum este descris de către Leth şi Jacobsen(1993). Retinoizi şi b-caroten au fost izolati prin hidroliză alcalină şi de extras în dietileter. Acetat de vitamina A a fost adăugat ca standard intern pentru procedura prin HPLC. După fracţionare pe o silice coloana, cu un gradient de funcţionare de la 0,5% la 8,5% izopropanol în n-heptan, retinoizi au fost măsurate de la UV 325 nm şi b-caroten, la 450 nm.Factorul de răspuns pentru retinol a fost evaluat, în timp ce factorii de corecţie stabiliti de Zonta (1984) pentru vitamina A-active de compuşi. Pentru conversia la activitatea de retinol echivalente (RAE), următorii factori de funcţionare a activităţi biologice, în legătură cu retinol a fost folosit:

75% pentru 13-cis de retinol. Procedura de analiză a fost identica cu procedura pentru un screening anterior de specii de peşti din Bangladesh . Screening-ul a fost efectuat într-un mod treptat:

(1) un eşantion de peste crud, de fiecare cate unul dintre cele 29 de specii au fost analizate; (2) o probă de piese de prime, comestibile din cele 16 specii cu cel mai mare continut de vitamina A.

Probele au fost analizate.

Concluzie

Conţinutul de vitamina A a fost confirmat pentru a fi extrem de variabil între speciile de peşti. Screening-ul de 29 de peşte comun specii din bazinul Mekong din Cambodgia, două specii, aparţinând categoriei,'' foarte bogate in vitamina A'', au fost identificate.Distribuţia relativă între vitamina A1 şi vitamina A2 este specific speciei şi vitamina A2 contribuţia pentru vitamina A total de conţinut variază de la 5% la 90% în specii de peşti ecranate.

Bibliografie