BIOTEHNOLOGII IN INDUSTRIA ALIMENTARA

SUPORT CURS ANUL III TPPA +CEPA

BIOTEHNOLOGII CLASICE SI MODERNE

Progresele considerabile nregistrate n ultimul secol n domeniul biotehnologiei , avnd la baza o serie de descoperiri tiniifice, dintre care amintim descoperirea ADN-ului, n 1953 i stabilirea tehnicilor de manipulare genetic n 1973, au pus bazele unei biotehnologii moderne cu considerabile efecte economice i sociale . Realizrile din ultimele decenii n domeniul ingineriei genetice, au determinat pe oamenii de tiin s anticipeze c secolul XXI va fi dominat de aceast activitate, aa cum secolul XX a fost dominat de descoperirile fizicii: tehnica informatic, fisiunea nuclear, explorarea cosmosului . Cele mai cunoscute descoperiri ale ingineriei genetice din secolul XX sunt: interferonul (o protein sintetizat de celula uman ca rspuns la atacul unor virusuri i care astzi se folosete pentru tratarea cancerului hepatic), insulina produs de bacterii, hormoni de cretere umani sau diferite vaccinuri . Cele mai multe cercetri, cu cele mai multe rezultate au fost realizate n domeniul medicinei i industriei farmaceutice: producia de hormoni, de antigene, de enzime, de reactivi necesari diagnosticrii. In domeniul industriei, biotehnologiile asigur valorificarea deeurilor industriale pentru obinerea de materiale plastice, combustibili sau substane chimice . Microorganismele sunt utilizate s transforme biomasa necomestibil n hran i energie A aprut aadar o ramur a ingineriei genetice, biotehnologia modern, care foloseste ca maini i aparate de producie microorganismele sau diferii constitueni celulari ai microorganismelor . Dezvoltarea biotehnologiilor va determina schimbri fundamentale n domeniul agroalimentar. Astfel prin tehnologia manipularii materialului genetic, ADN recombinat, se anticipeaz o cale de realizare de recolte mai bogate prin transferul genelor fixatoare de azot la plantele de interes major din punct de vedere al alimentatiei . Au fost realizate astfel materii prime vegetale cu coninut nutritiv mai ridicat, mai rezistente la boli i atacul duntorilor, secet, frig. Este posibil, spun specialitii, ca peste 100 de ani, configuraia plantelor de cultur i configuraia animalelor s fie foarte diferite fa de cele din zilele noastre. Industria alimentar este poate cel mai vechi utilizator al biotehnologiilor, fermentaia ca proces biotehnologic fiind cunoscut de milenii. In antichitate, drojdiile erau folosite pentru fabricarea pinii, vinului , berii. In urm cu 5000 de ani sumerienii fabricau 20 de tipuri de bere. Biotehnologiile moderne au un domeniu vast de exploatare n industria modern.A crescut producia mondial de enzime exogene, utilizate n aproape toate ramurile industriale, sinteza de aminoacizi eseniali cu ajutorul bacteriilor, obinerea de alcool folosit ca substituent al petrolului sau producerea de biomasa prin valorificarea pe calea fermentaiei a unor plante cu cretere rapid. Beneficiile biotehnologiilor moderne au impus dezvoltarea lor foarte rapid la nivel mondial . 1.Creterea i diversificarea produciei vegetale Primele generaii de produse alimentare modificate genetic (OMG sau GMO) au fost bine primite de fermieri n SUA, prin creterea produciei agricole. Spre exemplu, studiile au artat c, o specie de porumb modificat genetic, rezistent la aciunea duntoare a insectelor, a

manifestat o rezisten crescut i la la aciunea altor microorganisme: fungi, mucegaiuri care atacau porumbul nemodificat. De asemenea, nivelul de micotoxine produse de diferite specii de mucegaiuri sunt mult mai mici la porumbul-GMO. 2.Beneficii nutritive i igienice O mare varietate de produse biotehnologice din clasa uleiurilor sau grsimilor alimentare sunt deja pe pia.Cu ajutorul biotehnologiilor vegetale a fost redus coninutul de acizi grai saturai din cteva sortimente de uleiuri vegetale . Prin biotehnologie a fost rezolvat o problem de igien alimentar, atunci cnd uleiurile vegetale erau hidrogenate pentru cretera stabilitii la tratament termic sau pentru obinerea margarinei. Cercetarile biotehnologice au vizat de asemenea creterea coninutului proteic al cartofului. Aceti cartofi transgenici conin un numr important de aminoacizi, care n mod normal nu se gsesc n cartof. Pentru orz au fot create specii bogate n vitaminaA sau cu un coninut mai bogat de fier. A fost creat o roie modificat genetic care conine de trei ori mai mult antioxidantlicopen.Consumul de licopen este asociat cu scderea riscului producerii cancerului i scderea nivelului colesterolului din snge . Din punct de vedere al igienei alimentare, biotehnologia ncearc s resolve i urmtoarele probleme: Identificarea proteinelor alergenice din lapte, soia, alune i eliminarea lor din produciile vegetale viitoare Descreterea coinutului natural de substane toxice, prezente n produsele alimentare 3. Creterea calitii produselor Biotehnologiile sunt de asemenea utilizate pentru modificarea caracteristicilor materiilor prime pentru a fi mai atractive pentru consumator i mai uor de procesat. Cercetarile efectuate au determinat: creterea conservabilitii fructelor i vegetalelor proaspete ardeii, morcovii i salata sunt mai crocante obinerea de soiuri cu smburi puini pentru pepeni i struguri creterea sezonalitii soiurilor de tomate, cpuni creterea aromei roiilor, ardeilor, perelor crearea de specii de ceai i cafea fr cofein Cercettorii japonezi au identificat enzima care produce substana care declaneaz lcrimarea atunci cnd tiem ceapa. Este numai o problem de timp pn cnd va fi creat o specie de ceap fr aceast enzim. Foarte multe cercetri au fost efectuate pentru schimbarea raportului ap-amidon din diferite leguminoase. Astfel, un cartof cu un coninut ridicat de amidon, va fi mai sntos pentru om, deoarece el va absorbi mai puin ulei n timpul prjirii. De asemenea, obinerea amidonului din cartof se va face cu un consum energetic mult mai redus. Cu aceleai scopuri, este n cercetare i o specie de tomate pentru obinerea pastei de tomate. Creterea cu 1.2% a substanei uscate din cartofi, ar aduce o economie energetic de 35 milioane de $ procesatorilor americani .

De beneficiile biotehnologiilor beneficiaz i industria de lactate. Specialitii din Noua Zeeland utilizeaz n present biotehnologiile animale pentru creterea coninutului de cazein din lapte cu 13% , pentru obinerea unei cantiti mrite de brnzeturi. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC 1. Organisme modificate genetic Avnd n vedere reacia consumatorilor privind introducerea pe pia a unor plante, dar i la adresa alimentelor i furajelor modificate genetic, este necesar cunoaterea noiunii de OMG , aa cum este cunoscut pe plan naional i internaional . In Germania organismele modificate genetic(OMG) sunt organisme al cror material genetic a fost modificat ntr-un mod care nu exist n natur n condiii naturale sau de recobinare natural. OMG trebuie s fie o unitate capabil de autoreplicare sau transmitere a materialului genetic . In SUA, OMG se refer la plante i animale care conin gene transferate de la alte specii, pentru a obine anumite caracter , precum rezistena la anumite pesticide i ierbicide. In Romnia, conform ordonanei de guvern OG nr.49/2000, OMG este un organism care conine o combinaie nou de material genetic, obinut prin tehnicile biotehnologiilor moderne care i confer noi caracteristici. 2. Ingineria genetic Ingineria genetic poate fi definit ca un ansamblu de metode i tehnici care permit introducerea n patrimonial genetic al unei celule a uneia sau a mai multor gene noi, numite de interes, fie modificarea unor gene prezente deja n celul. Genele trasferate sunt denumite transgene. Ingineria genetic mai este denumit i modificare genetic, transformare genetic sau transgenez, iar produsele produsele obinute poart numele de organisme modificate genetic sau organisme transgenice. Pentru modificarea genetic a plantelor este nevoie de : gene de interes metoda de integrare a transgenelor n nucleul celulei care va fi originea noii plante selectarea plantelor la care transgena se exprim la un nivel ridicat , adecvat scopului(rezisten la ierbicid, culoare, arom) Comparativ cu metoda clasic de ameliorare, transformarea prin inginerie genetic are cel puin dou avantaje: permite introducerea unui singur caracter la o varietate gena transferat poate proveni din orice surs, ceea ce extinde n mod nelimitat posibilitile de exploatare Cercetrile de inginerie genetic necesit laboratore scumpe, echipamente, reactivi speciali i specialiti vizionari. In aceste condiii este evident c cercetrile de inginerie genetic s-au dezvoltat prioritar n rile cu mai multe resurse financiare i umane. 3.Posibilele reacii adverse ale organismelor modificate genetic OMG sunt subiectul unor dezbateri aprinse, pe de o parte din motive etice, iar pe de alt parte din motive legate de riscul utilizrii i consumrii lor. Ca urmare a presiunii consumatorilor, consiliul Comunitii Europene a emis directive care se refer la
4

obinerea, utilizarea, eliberarea deliberat n mediu i comercializarea OMG-urilor i a alimentelor obinute din materii prime modificate genetic. In directive nr.18/2001/CEE sunt menionate potenialele efecte adverse ale eliberrii OMG-urilor n mediu: apariia unor boli umane prin efecte toxice i alergice apariia unor boli la plante i animale prin efecte toxice i alergice efecte negative asupra dinamicii i diversitii genetice a populaiilor de specii din mediu diminuarea rezistenei la patogeni compromiterarea tratamentelor profilactice sau terapeutice vegetale, veterinare sau umane, prin transferul de gene care confer rezisten la antibioticele utilizate n medicina uman i veterinar efecte asupra ciclului biogeochimic(ciclul compuilor n natur, n special ciclul C i N) Aceast directiv stabilete c introducerea alimentelor obinute din OMG-uri s se realizeze prin metoda pas cu pas. Etichetarea, care este obligatorie pentru toate produsele care conin OMG , asigur consumatorii c pot alege un produs modificat genetic sau unul tradiionale.

ENZIME UTILIZATE IN PROCESELE BIOTEHNOLOGICE DIN INDUSTRIA ALIMENTARA

1. GENERALITI ASUPRA ENZIMELOR

Enzimele definite drept componente de natur proteic, produse de celu lele vii care catalizeaz reacii de sintez i degradare din organismele animale, vegetale i microorganisme, prezint numeroase implicaii i aplicaii n in dustria alimentar. Fiind componente ale materiilor prime vegetale i animale utilizate n industria alimentar, a cror activitate nu nceteaz odat cu recoltarea, depozitarea, conservarea i prelucrarea tehnologic a acestora, enzimele pot manifesta aciuni favorabile, dorite, care conduc la mbun tirea calitilor naturale constituionale, gustative etc. sau nefavorabile i nedorite, determinnd degradarea i pierderea valorilor nutritive. Dac n acest sens se are n vedere activitatea enzimelor proprii materiilor prime vegetale i animale, enzimele ca atare sub form de preparate enzimatice, obinute din diferite surse bogate n enzime, i gsesc multiple aplicaii ca adaosuri, fiind folosite nc din cele mai vechi timpuri ca de exemplu cheagul la prepararea brnzeturilor, Koji" (kabi-taki = floare de mucegai", prepa rat enzimatic obinut prin cultivarea lui Aspergillus oryzae pe un decoct de orez sau alte cereale), la prepararea unor produse tradiionale-fermentate, larg rspndite n Asia de Sud-Est. In ultimele decenii, preparatele enzi matice i-au gsit numeroase utilizri n diferite sectoare ale industriei alimentare. Aceast cretere spectaculoas a gradului de utilizare a preparatelor enzimatice n industria alimentar (dar i nealimentar) este explicat prin eficiena i precizia, versatilitatea i economicitatea cu care acioneaz aceste preparate enzimatice. Se postuleaz existena n materia vie a circa 10 000 de enzime diferite, dintre care circa 2 000 au fost izolate, n stare mai puin sau mai mult puri ficat i a cror intervenie i aciune n diferitele procese metabolice este mai mult sau mai puin cunoscut. Cataliznd reaciile biochimice din organismele vegetale i animale, enzimele condiioneaz desfurarea, coordonarea i autoreglarea acestor reacii prin care se realizeaz procesele metabolice (anabolice i catabolice) ale creterii, dezvoltrii, reproducerii i tuturor activitilor celulare. In industria alimentar, prelucrtoare de materii prime vegetale i animale, practic nu exist procese tehnologice n care s nu fie implicate enzimele endogene, proprii materiilor biologice folosite sau ale microorganismelor utilizate n prelucrarea acestora; n plus, n multe cazuri, n prezent, se recurge la suplimentarea acestor activiti enzimatice cu enzime exogene, cu preparate enzimatice obinute din diverse surse bogate n enzime, esuturi vegetale, animale i mai ales n ultimii ani din culturile diverselor microorganisme. Indiferent c se au n vedere enzimele endogene, proprii materiilor prime sau cele adugate acestora, ele se caracterizeaz prin urmtoarele proprieti generale: sunt cei mai eficieni catalizatori cunoscui astzi; n concentraii extrem de mici ( 10 -6 M sau chiar i 10-9 M) determin realizarea reaciilor cu viteze extrem de mari; reaciile catalizate enzimatic se produc n condiii compatibile cu viaa, la temperatur i presiune obinuit, n mediu slab acid, neutru sau slab alcalin ; manifest specificitate de aciune (determin producerea unui anumit tip de reacii, de exemplu de oxidorcducere, de hidroliz, de sintez etc.) i de substrat (recunoate numai un anumit reactant, sau un grup limitat de reactani);

 asigur coordonarea, reglarea i controlul proceselor biochimice la care particip i care stau la baza metabolismului celular. 1.1. Constituia enzimelor Determinant pentru funcia catalitic a enzimelor este configuraia lor, respectiv structura i organizarea spaial a moleculei proteice care manifest activitatea enzimatic. Din punct de vedere structural, enzimele se mpart n dou categorii: enzime de natur exclusiv proteic, constituite n ntregime din proteine (de exemplu: pepsina, tripsina, papaina etc.) ; enzime de natur heteroproteic formate dintr-o parte proteic (apo-enzim) i una neproteic denumit cofactor enzimatic. Cele dou pri separate snt inactive catalitic; mpreun formeaz complexul molecular apo-enzim:cofactor, respectiv holoenzima care manifest activitate catalitic. n structura holoenzimei, cofactorul imprim specificitate de aciune, respectiv tipul i viteza de reacie catalitic, n timp ce apoenzima imprim specificitatea de substrat, deci determin substana asupra creia acioneaz enzima. Apoenzima, fiind de natur proteic, va manifesta proprietile generale ale proteinelor: este termolabil i nedializabil; stabilete legtura enzimei cu substratul; manifest grade diferite de afinitate pentru cofactor; este susceptibil de modificri conformaionale n anumite limite. Cofactorul enzimatic reprezint componente neproteice, de natur chimic foarte diferit, care sunt indispensabile pentru manifestrile activitii catalitice a numeroase enzime. Dup natura chimic i modul lor de legare la apoenzim, cofactorii se clasific: coenzim; grupri prostetice; ioni metalici. Coenzimele sunt compui organici, derivai din vitamine, care se ataeaz temporar la apoenzim i care sunt uor disociabili de acestea. Ele trec uor de la o apoenzim la alta, putnd s participe la transformarea altor molecule de substrat dup terminarea unei anumite reacii. Din ei fac parte: NAD+, NADP+, FMN, FAD, ATP, CTP, acidul lipoic etc. Gruprile prostetice sunt substane organice fixate pe apoenzim, care disociaz greu, deoarece sunt legate prin legturi covalente. Aceste grupri sunt: TPP, piridoxalfosfatul, hemul. Gruparea prostetic imprim mecanismul unor procese enzimatice: transportul de electroni, de grupri NH2, acetic etc. Ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funciei catalitice a unor enzime, participnd n calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Ele se mai numesc metal-enzime, iar printre ionii care ndeplinesc rol de cofactor se pot meniona: Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Mo2+. Unele enzime pot conine chiar doi ioni metalici. Exercitarea proprietilor catalitice ale enzimelor se realizeaz prin intermediul situsurilor catalitice centrilor sau zonelor active care reprezint ansamblul gruprilor chimice din structura enzimei ce particip efectiv n manifestarea activitii enzimatice (de exemplu, anumite resturi din aminoacizii constitueni ai lanurilor polipeptidice i cofactorii enzimatici, care vin n contact direct cu substratul). n funcie de organizarea lor structural se disting: enzime monomerice, constituite dintr-un lan polipeptidic care nu poate fi disociat n subuniti fr pierderea activitii lor catalitice i enzime oligomerice care sunt agregate moleculare constituite din doi sau mai muli protomeri,

respectiv lanuri polipeptidice similare sau diferite, care prin disociere sau din contr prin asociere devin catalitic-active. Pentru o serie de enzime s-au stabilit existenta unor forme moleculare multiple sau izoenzime, care catalizeaz realizarea aceleiai reacii biochimice, dar care difer ntre ele prin configuraii spaiale diferite (compoziie n aminoacizi constitueni), prin proprietile lor fizicochimice (pH sau temperatur optim, cinetic de reacie, comportare fa de inhibitori sau activatori etc.). imunologice etc. Se cunosc, de asemenea, aa-numitele sisteme sau complexe multienzimatice constituite din enzime intim legate prin interaciuni necovalente, care particip la realizarea unor secvene de reacii biochimice consecutive i nlnuite, n care produsul de reacie al primei enzime devine substrat pentru cea de a doua enzim, al crui produs de reacie devine substrat pentru a treia enzim etc., pn la realizarea ntregului ir de reacii prin care se metabolizeaz n celule un component biochimic. Astfel de sisteme sau complexe multi-enzimatice sunt, n general, localizate n celule la nivelul diferitelor formaiuni sau organite subcelulare.

1.2. Cinetica reaciilor i factorii care influeneaz activitatea enzimelor Enzimele catalizeaz producerea reaciilor chimice, termodinamic posibile, fr schimbarea echilibrului de reacie, prin scderea energiei de reacie a reactanilor i prin creterea vitezei de reacie a reactanilor (in vivo ele condiioneaz desfurarea, coordonarea i autoreglarea reaciilor biochimice ale materiei vii, prin care se realizeaz procesele metabolice ale creterii, dezvoltrii, reproducerii i tuturor activitilor celulare). ntr-o reacie catalizat enzimatic, enzim (E) formeaz cu substratul (S) un complex intermediar de tranziie (ES) foarte reactiv i instabil, care se transform rapid, conducnd la eliberarea produsului sau produilor de reacie (P) i a enzimei ce poate relua reacia, dup schema general: E+S ES EP P+E

O serie de enzime catalizeaz reacii n care pot interaciona dou sau chiar mai multe substraturi. Aa, de exemplu, sunt transferazele care catalizeaz transferul unei grupri chimice funcionale de pe un substrat (donor) pe alt substrat (acceptor), realizndu-se reacii de simpl sau dubl deplasare.

Mecanismul catalizei enzimatice, sub raportul interaciunii dintre enzim si substrat, al formrii complexului reactiv enzim substrat i transformarea acestuia n produi de reacie, se bazeaz pe diferite interpretri, explicndu-se prin ipotezele broasc-cheie", potrivirii induse, catalizei covalente i catalizei generale prin acizi i baze. Viteza reaciilor catalizate enzimatic este dependent de: concentraia enzimei i a substratului, afinitatea enzimei fa de substrat, temperatur, pH, efectori (activatori sau inhibitori), potenial redox, radiaii etc.

In anumite limite, viteza reaciilor catalizate enzimatic este direct proporional cu concentraia enzimei, pentru ca, la concentraii crescute ale enzimei, s devin aproape constant. Creterea concentraiei substratului determin iniial o cretere rapid a vitezei de reacie, pentru ca ulterior viteza de reacie s creasc lent, iar la concentraii mari de substrat s devin maxim, cptnd o valoare constant (fig. 1). Expresia matematic care definete relaia dintre viteza de reacie catalizat enzimatic i concentraia substratului este dat de ecuaia Michaelis-Menten : vmax*[S] V = ----------------KM+[S] n care: v- este viteza de reacie la un moment dat; vmax viteza maxim de reacie, corespunztoare concentraiei mari de substrat, cnd enzima este saturat cu substrat ; [S] concentraia substratului ; kM constanta Michaelis-Menten, moli/1. Din punct de vedere grafic, ecuaia Michaelis-Menten reprezint o hiperbol, indicnd o tranziie de la o faz n care viteza de reacie este dependent de concentraia substratului (faz n care reacia este de ordinul 1) la o faz independent de concentraia substratului (faz n care reacia este de ordinul zero), n care viteza de reacie devine maxim, enzima fiind saturat cu substrat. La o vitez egal cu 1/2 din viteza maxim corespunde o valoare determinat a concentraiei substratului denumit kM sau constanta Michaelis-Menten, care se exprim n moli/1 i care indic afinitatea

enzimei fa de substrat; cu ct kM are o valoare mai mic, cu att afinitatea enzimei pentru substrat este mai mare i invers, cu ct kM are o valoare mai mare cu att afinitatea enzimei pentru substrat va fi mai mic. n anumite limite (pn la circa 60 ... 80C), viteza reaciilor enzimatice crete o dat cu temperatura (temperatura la care viteza de reacie este maxim corespunde temperaturii optime de aciune a enzimei). La temperaturi mai mari dect temperatura optim, viteza de reacie scade rapid, avnd loc un proces de denaturare termic a enzimei (fig. 2). Temperatura optim a enzimelor este influenat i condiionat de structura chimic a enzimei, a substratului, i de concentraia acestora n sistemul de reacie. In general, activitatea enzimelor scade la temperaturi peste 50 ... 60C; totui exist enzime care i pstreaz nc n mare msur activitatea i la temperaturi de peste 60C, ca de exemplu: papaina, o proteaz vegetal activ la 80C; peroxidaza din hrean care rmne activ i dup o nclzire la 100C. Activitatea enzimelor este dependent de pH-ul mediului n care i exercit aciunea. pH-ul la care activitatea este maxim este denumit pH optim al enzimei, iar pH-ul la care enzima i menine activitatea n cele mai bune condiiuni se numete pH optim de stabilitate. Cele dou pH-uri optime ale unei enzime, de activitate i de stabilitate, pot avea valori apropiate, pot s coincid sau pot s fie diferite (fig. 3). Activitatea enzimelor este, de asemenea, influenat de prezena unor efectori (diferite substane chimice) n mediul de exercitare a activitii lor; activatorii influeneaz pozitiv, iar inhibitorii negativ activitatea enzimelor. In funcie de natura i modul de aciune al inhibitorilor, inhibiia enzimatic este de mai multe tipuri: ireversibil, reversibil (competitiv i necompetitiv), i alosteric.

1.3. Clasificarea enzimelor Recenta clasificare i nomenclatur a enzimelor se bazeaz pe principiile i regulile stabilite i publicate n anul 1964, revizuite i republicate n 1973 de Comisia de Enzime a Uniunii Internaionale de Biochimie (I.U.B.) i a Uniunii Internaionale de Chimie Pur i Aplicat (I.U.P.A.C.). In acest sens, enzimele au fost clasificate n 6 clase (numeroase subclase i subsubclase) i anume: oxidoreductaze catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin transfer de hidrogen sau electroni, sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular ;

10

 transferaze catalizeaz transferul diferitelor grupri chimice de la un substrat donator la un alt substrat acceptor; hidrolaze catalizeaz scindarea hidrolitic a diferitelor substraturi, prin adiia apei la nivelul diferitelor grupri chimice; liaze catalizeaz adiia sau ndeprtarea unor grupri chimice din substraturi, prin mecanisme diferite fa de hidroliz; izomerazecatalizeaz rearanjri intramoleculare ; ligaze sau sintetaze catalizeaz sinteza unor noi legturi prin unirea a doi compui ntr-unul singur, folosind ca surs energetic nucleozidtrifosfaii. Clasele de enzime se mpart n subclase i sub-subclase, n funcie de o serie de detalii privind gruprile supuse transformrii i natura cofactorilor implicai n reacia catalizat enzimatic. Pentru nomenclatura enzimelor se folosesc nume uzuale sau tradiionale, care snt de obicei formate din numele substratului asupra cruia acioneaz enzima, urmat de terminaia -az i nume sistemice (recomandate de Comisia de Enzime) formate din numele substratului sau substraturilor i tipul de reacie catalizat, urmat de terminaia az, nsoite de un cod (alctuit din patru cifre care reprezint clasa, subclasa, sub-subclasa i numrul de ordine), precedat de EC (Enzyme Commission). Cteva exemple, privind numele unor enzime importante pentru industria alimentar: E.C. 3.2.1.2 -1-4-Glucan maltohidrolaza ( -amilaza) E.C. 3.1.1.3. Glicerol ester hidrolaza (lipaza) 1.4. Uniti de msur ale activitii enzimelor In principiu, determinarea activitii enzimelor se efectueaz prin : msurarea gradului de transformare a substratului, msurarea concentraiei produsului de reacie sau msurarea cineticii de reacie, urmrite ntr-un anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate. Activitatea enzimelor se exprim cantitativ n unitile propuse de Comisia de Enzime (CE) i anume: Unitatea de activitate enzimatic (U) reprezint cantitatea de enzima care catalizeaz transformarea a l mol substrat/min n condiii standard (25C, pH i concentraie de substrat optime). Aceast unitate de msur recomandat de CE n 1961 se folosete nc n prezent; CE recomand renunarea sau abandonarea progresiv a folosirii unitii U i trecerea la Kat. Katalul (Kat) reprezint cantitatea de enzim care catalizeaz transferarea a l mol substrat/s n condiii standard. (Prin definiie aceast unitate de msur se apropie mai mult de dimensiunile constantelor de vitez folosite n cinetica chimic respectiv mol/s.) Se folosete i multiplul kilokatal (K Kat) i respectiv submultiplii milikatul (mKat), microkatul ( Kat), nanokatul (nKat) i picokatul (pKat). Activitatea specific reprezint numrul de uniti enzimatice/mg protein (respectiv Kat/kg protein i Kat/kg protein). Activitatea enzimatic molar (numr de transfer = turnover number) reprezint numrul de molecule de substrat transformate de ctre o molecul de enzim n timp de l min sau l s (Kat/mol enzim). Cu toate aceste recomandri ale Comisiei de Enzime, n lucrri mai vechi sau chiar i n prezent se folosesc i alte moduri, arbitrare, de exprimare a activitii enzimelor, care de obicei snt definite de cei ce le utilizeaz.

11

2. PREPARATE ENZIMATICE I ENZIME IMOBILIZATE Preparatele enzimatice i de enzime imobilizate folosite n realizarea diferitelor procese biotehnologice din industria alimentar sunt considerate ca adjuvani de transformare. In anul 1982, Comitetul mixt FAO/OMS de experi n aditivi alimentari a stabilit o serie de norme generale pentru preparatele enzimatice utilizate n prepararea alimentelor". Conform acestui comitet, preparatele enzimatice, folosite ca aditivi n industria alimentar, sunt obinute din materii prime de origine animal, vegetal sau microbian, fiind constituite din celule ntregi, din pri de celule sau extracte complet lipsite de celule. Pot conine una sau mai multe componente enzimatice active, suporturi, solveni, ageni de conservare, antioxidani i alte substane necesare i conforme unei bune practici de fabricare. Ele se pot prezenta sub form lichid, semilichid, uscate sau imobilizate, avnd o culoare care poate s varieze de la qvasi incolor la brun nchis. In ceea ce privete materiile prime din care snt obinute preparatele enzimatice, normele Comitetului mixt FAO/OMS prevd ca: esuturile de origine animal s rspund normelor veterinare aplicate crnii i manipularea lor s satisfac exigenele unei bune practici igienice; materialele de origine vegetal, folosite ca surse de enzime sau ca ingrediente n prepararea mediilor de cultur pentru microorganismele productoare de enzime, trebuie s nu elibereze nici un reziduu nociv pentru sntate, n condiii normale de utilizare; preparatele enzimatice de origine microbian trebuie produse prin folosirea controlat fr penetrare de microorganisme susceptibile de a conduce la apariia de substane toxice sau alte produse nedorite. n cazul preparatelor de enzime imobilizate, n care insolubilizarea enzimei se realizeaz prin procedee fizice i/sau chimice, suportul i n special agentul de imobilizare folosit trebuie s fie inert sau admis de a fi utilizat n produsele alimentare, iar orice eliberare de enzim de pe suport, i mai ales eliberarea de agent de imobilizare, trebuie s rmn n limitele acceptabile care vor fi precizate pentru fiecare preparat enzimatic imobilizat. Aditivii (inclusiv adjuvanii de transformare) i ingredientele care intervin n producerea preparatelor enzimatice trebuie s fie substane acceptate pentru a fi utilizate n produsele alimentare ca: apa, substane insolubile care pot fi ndeprtate o dat ce s-a produs procesul de transformare. Limitele i metodele de determinare a componentelor contaminante ale preparatelor enzimatice folosite n industria alimentar snt artate n tabelul 2. Limite i metode de determinare pentru componentele contaminante, recomandate de Comitetul mixt FAO/OMS (Etude FAO: Alimentations et Nutrion, 19/1982)
Componente contaminante ale preparatelor enzimatice Arsen Plumb Metale grele Limite admisibile Metodele de determinare recomandate snt publicate n:

Maximum 3 mg/kg Me"thodes Generales (Directives Generales pour l'usage Maximum 10 mg/kg des normes IECFA d'identite et de purete) Maximum 40 mg/kg (exprimate ca plumb) Microbiologic Directives denombrement de microorganisme generales pour le

Numr total de Maximum 5. 1O4 /g germeni viabili

12

Coliformi Escherichia coli Salmonclla

Maximum 30/g Absent pe o prob de 25 g Absent pe o prob de 25 g

Directives generales pour le denombrement des coliformes Methode par le comptage de colonies obtenues 30C. ISO. Norme internaionale Ref. nr. ISO 4833, Premier Edition (1978-02-01) FDA Bacteriogical Analvtical Manual - Fifth Edition ( 1978) Cap. X. Enteropathogenic Escherichia coli ; Cap. XII. Isolaion and identification of Salmonella Etude FAO: Alimentation et Nutrition, 19/1982; Appendice A

Activitatea Absent antibiotic de origine bacterian

2.1. Preparate enzimatice Preparatele enzimatice folosite n industria alimentar trebuie produse n condiii similare unei bune practici de fabricare a produselor alimentare, iar prin utilizarea lor s nu se ajung la o cretere a numrului total de germeni (NTG) i la creterea coninutului n sruri peste limitele admise pentru un anumit produs alimentar luat n considerare. Pentru obinerea preparatelor enzimatice sunt folosite de obicei surse bogate n enzimele dorite, care sunt ieftine, uor accesibile i care se prelucreaz uor. Aceste surse pot fi de origine vegetal, animal sau microbian. In plante, concentraii mari de enzime se pot ntlni n semine, cereale germinate sau negerminate, rdcini, sev i latexuri, frunze i n unele cazuri chiar n coaj. La animale, concentraii mari de enzime se gsesc n special n ficat, pancreas, mucoasa stomacal sau intestinal, inim, rinichi, creier etc. In scopuri practice sunt folosite mai ales pancreasul, mucoasa stomacal i intestinal. O surs foarte important de enzime, pentru producerea preparatelor enzimatice, o constituie diferitele microorganisme ca: bacteriile, drojdiile i microciupercile (mucegaiurile). Fa de sursele de enzime de origine vegetal sau animal, culturile diferitelor microorganisme prezint o serie de avantaje care explic n mare msur tendina manifestat n ultimele 23 decenii de a fi folosite din ce n ce mai mult pentru obinerea de preparate enzimatice. Microorganismele pot fi obinute n cantiti mari, prin nmulire n instalaii speciale, pe medii de cultur ieftine (de obicei subproduse ale industriei alimentare ca: tre de gru, extract de porumb obinut prin concentrarea apelor de nmuiere de la fabricarea amidonului, melas, roturi de soia i de floarea-soarelui etc.). Ciclul de cretere i dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt fa de cel al plantelor i animalelor, iar obinerea microorganismelor n cantiti mari nu necesit angajarea de terenuri cultivabile, cum este cazul la materiile prime vegetale. In plus, microorganismele prezint i avantajul c producia lor de enzime poate fi mult mrit prin selectarea i utilizarea de tulpini i mutante nalt productive precum i prin stabilirea condiiilor fizice i chimice optime (medii de cultur i condiii optime de cultivare) pentru producerea de enzime. In cazul utilizrii microorganismelor ca surse de enzime pentru industria alimentar, selectarea acestora se va face lundu-se n considerare o serie de criterii cum snt urmtoarele: s nu manifeste putere patogen i s nu produc toxine (endo-, exotoxine sau micotoxine), s nu manifeste activitate antibiotic sau potenial alergen i s produc cu precdere i n cantiti mari enzima sau complexul enzimatic dorit, pe medii de cultur ieftine i n condiii avantajoase. Indiferent de sursa de materii prime, prelucrarea lor pentru obinerea de preparate enzimatice de uz alimentar este n linii generale aceeai (fig. 4).

13

Enzimele obinute ca preparate brute sau parial purificate, sub form lichid, semilichid sau uscat sunt utilizate n industria alimentar ca atare, fiind adugate i acionnd n mediile pe care urmeaz s le transforme ca enzime libere", respectiv solubilizate n medii apoase i fr a mai putea fi ulterior recuperate. Activitatea lor, dup ce au realizat transformrile dorite, este de obicei oprit prin diferite tratamente, mai ales pe cale termic, prin acidulare sau alcalinizare. In unele cazuri ele mai rmn active i n produsul finit. 2.2. Preparate enzimatice imobilizate Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor const n legarea sau fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil n ap, n condiiile pstrrii proprietilor catalitice, respectiv specificitatea de aciune i posibilitatea de a aciona la pH i temperatur asemntoare enzimelor libere (neimobilizate).

14

Suporturile sau matricile utilizate n imobilizarea enzimelor pot fi de natur anorganic: silicea coloidal, caolinita, particule sau perle de sticl cu grad de porozitate controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, crbune etc.), i de natur organic: celuloza i derivaii acesteia, agaroz, amidon, dextran, colagen, polimeri obinui prin polimerizarea unor monomeri de tipul acrilamid, acid metacrilic .a., rini formaldehidice etc. In funcie de natura legturilor care se stabilesc ntre enzime i suportul de imobilizare, procedeul sau metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice. Procedeele fizice se bazeaz pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legturilor fizice ca de exemplu, interaciuni electrostatice, formarea de legaturi ionice, formarea de legturi de hidrogen, interaciuni protein-protein etc., difereniindu-se n acest sens (fig. 5.): adsorbia pe suporturi insolubile n ap (crbune, clei, rini schimbtoare de ioni, celuloz, sticl etc.) ; includerea n structuri macromoleculare (aceast incluziune se realizeaz prin polimerizarea unor materiale ca poliacrilamid n silicagel, amidon, n prezena moleculelor de enzim, astfel nct se formeaz o matrice de polimer n care snt incluse moleculele de enzim i n care att substratul ct i produsul poate s difuzeze) ; microncapsulare n membrane semipermeabile ; imobilizarea n celule de ultrafiltrare.

Procedeele chimice de imobilizare a enzimelor se refer la cele care conduc la formarea de legturi covalente sau parial covalente, ntre gruprile funcionale, care ns nu snt eseniale pentru manifestarea activitii catalitice (nu snt implicate n situsul catalitic al enzimei), i un suport activat chimic, insolubil n ap. In cadrul acestor procedee se pot evidenia (fig. 6): legarea covalent a enzimelor de suporturi insolubile, care posed grupri reactive sau care pot fi activate prin diferite reacii chimice; copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv i legarea ncruciat (cross-linking) sau reticular intra- i intermolecular a enzimelor legate de un suport cu un reactiv multifuncional. La imobilizarea enzimelor trebuie s se aib n vedere urmtoarele: conformaia spaial a moleculelor de enzim n sistemul imobilizat este diferit de cea a mediului natural din care s-a extras enzim. Pe de alt parte, structura tridimensional a moleculei de enzim este distorsionat de legturile sale cu suportul; micromediul moleculei de enzim imobilizat este diferit de cel al enzimei aflate n soluie, afectndu-se viteza de difuzie a substratului i a produilor de reacie. Inhibiia de

15

substrat i de produs poate, de asemenea juca un rol important; procesul de transport al substanelor este un proces pasiv, n comparaie cu situaia enzimei din celula vie, iar aceasta va avea desigur influen i asupra vitezei de reacie. Imobilizarea enzimelor pe un suport anorganic sau organic provoac schimbri n comportamentul acestora i n cinetica reaciilor: se mrete stabilitatea enzimei (stabilitatea enzimei att n stare static ct i n stare dinamic fiind influenat de procedeul de imobilizare, msura acestei stabiliti fiind 1/2 din durata de via a enzimei); se schimb afinitatea enzimei fa de substrat, aceasta fiind influenat de durata lor de contact care, la rndul ei, este determinat de viteza fluxului sau viteza de agitare a substratului n contact cu sistemul suport-enzim, de viteza de difuzie a substratului la enzim imobilizat; se modific caracterul catalizei prin trecere de la cataliza omogen la cea eterogen. La folosirea enzimelor imobilizate poate avea loc o variaie a pH-ului optim iar randamentul n produsul de transformare este micorat. De exemplu, prin folosirea amiloglucozidazei n soluie, plecnd de la o suspensie de amidon cu 33% s.u., se ajunge la un randament de transformare n glucoza de 95,5 96%, n timp ce la folosirea amiloglucozidazei imobilizate, randamentul este de 9293%. In orice caz, preparatele de enzime imobilizate, fa de cele libere sau solubile, prezint o serie de avantaje printre care se amintesc urmtoarele: refolosirea repetat a enzimei, cu aceeai cantitate de enzim putndu-se transforma cantiti mai mari de substrat; se poate lucra n sistem semicontinuu sau continuu, cu automatizarea procesului, ceea ce asigur un control precis al parametrilor de lucru ; are loc o cretere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat i al concentraiei acestuia; se poate stopa reacia enzimatic la momentul dorit i se evit trecerea enzimei n produsul transformat ; costurile globale de producie sunt mai mici n comparaie cu procedeele de folosire .a enzimelor libere ; se pot utiliza i enzime care nu sunt trecute pe lista GRAS (Generally Recognised as Safe). Factorii critici ce trebuie luai n considerare la folosirea enzimelor imobilizate snt urmtorii: eficiena economic a imobilizrii determinat de costul enzimei, suportului i metoda de imobilizare; activitatea enzimei imobilizat care este n funcie de tehnica de imobilizare, caracteristicile materialului de suport, viteza de difuzie a substratului la enzim i a produsului de transformare. caracteristicile substratului ce trebuie transformat ; stabilitatea enzimei care trebuie meninut un timp ct mai ndelungat ; contaminarea microbiologic a sistemului enzim-suport n timpul utilizrii reactorului respectiv. Cu toate avantajele pe care le prezint enzimele imobilizate, pn n prezent, industria alimentar utilizeaz la nivel industrial numai glucozizomeraza imobilizat pentru izomerizarea glucozei n fructoz i lactaza imobilizat pentru hidroliza lactozei din lapte sau zer. Sunt efectuate ns o serie de cercetri la nivel de laborator i chiar la nivel pilot, care permit s se ntrevad n viitor extinderea folosirii preparatelor de enzime imobilizate i n alte sectoare ale industriei alimentare; n acest sens, sunt ns necesare cercetri care s conduc, probabil, la modificarea sau adoptarea unor tehnologii clasice" de obinere a diferitelor produse alimentare, la utilizarea preparatelor de enzime imobilizate sau la stabilirea de noi tipuri de bioreactoare i eventual noi moduri de folosire a enzimelor imobilizate n medii eterogene, consistente i vscoase de felul celor prelucrate ntr-o serie de sectoare ale industriei alimentare.

16

2.3 Enzime de fermentaie Cea mai important problem care trebuie rezolvat la obinerea de preparate enzimatice cu ajutorul microorganismelor este gasirea unui microorganism care s produc n cantitate mare enzima sau sistemul enzimatic dorit. In acest caz un interes practic l reprezint microorganismele heterotrofe. Pentru ca un organism s poat ataca un substrat i s-l metabolizeze, el trebuie s posede enzimele necesare care s catabolizeze reaciile de metabolism n condiiile de mediu proprii pentru dezvoltare. Totalitatea enzimelor pe care un organism le posed n permanen sau pe care poate s le elaboreze la nevoie formeaz echipamentul enzimatic potenial al microorganismului. Echipamentul enzimatic este determinat la rndul lui de genetica microorganismului. Zestrea ereditar constituit din gene care sintetizez enzimele microorganismelor variaz de la o specie la alta. Majoritatea enzimelor care alctuiesc echipamentul enzimatic sunt enzime intracelulare. Aceasta nseamn c enzimele sintetizate de gene, dup formare, rmn n celul, nefiind secretate n mediul nconjurtor n care microorganismele se dezvolt. Activitatea lor se desfoar n interiorul celulei. Unele microorganisme cum sunt drojdiile, bacteriile lactice, nu conin dect enzime intracelulare. La astfel de microorganisme eliberarea enzimelor n mediul nconjurtor are loc dup moartea celulelor, n urma proceselor de autoliz. Din acest cauz, astfel de microorganisme nu metabolizeaz dect substraturi nutritive solubile i permeabile prin membranele lor celulare. Alte microorganisme, aa cum sunt bacteriile din genul Baccillus sau fungii din genul Aspergillus, elaboreaz pe lng un mare numr de enzime intracelulare i enzime extracelulare, pe care le secret n mediul nconjurtor. Enzimele extracelulare sunt, n general hidrolaze i sunt secretate de microorganisme cu scopul de a degrada substraturile insolubile i solubile cu molecule mari la compui solubili uor asimilabili. Enzime intracelulare de fermentaie In categoria enzimelor intracelulare sunt incluse toate enzimele care rmn cu biomasa dup separarea lichidului de fermentaie. Unele enzime se acumuleaz probabil n periplasm, astfel nct n mediul de cultur se afl cantiti mici de enzime rezultate din ruperea pereilor unui numr mic de celule. Principalele tipuri de enzime intracelulare sunt prezentate n tabelul urmtor:
Microorganismul Enzima Penicillinacilaz - Galactozidaz Glucozizomeraz Glucozoxidaz Pullulanaz Lactaz productor Escherichia coli Mortierella vinacea Saccaromyces cerevisiae Streptomyces albus Streptomyces sp. Pergillus niger Klebsiella aerogenes Candida pseudotropicalis Durata Fermentaiei, h 48 72 48 53 72 20 23 24 Nivelul de producie Laborator 100 l Laborator Laborator Laborator Laborator 500l 15 l Laborator

17

Majoritatea acestor enzime acioneaz asupra unor substraturi cu mas molecular mic. Aceasta se explic prin faptul c substraturile mici pot ptrunde n celule i funcioneaz astfel ca inductori ai enzimelor care le degradeaz. Spre deosebire de acestea, enzimele extracelulare acioneaz asupra substraturilor cu mas molecular mare. Enzimele intracelulare se mpart n dou mari categorii: unele au o poziie central n metabolismul organismului n cretere i se produc n cantiti mari in biomas, altele au un rol secundar, minor i se produc n cantiti mici. Pentru utilizarea acestora din urm n scopuri industriale este necesar imobilizarea lor, astfel nct s fie economic i justificat folosirea lor. In ceea ce privete activitatea enzimatic a acestor preparate, de cele mai multe ori constituie un secret de serviciu, deoarece poate face oricnd obiectul unui brevet de invenie. Pentru ca o enzim s fie economic, ea trebuie s aib o activitate enzimatic minim( 100 UE/ml). De aceea majoritatea enzimelor intracelulare la care nu se atinge acest valoare se imobilizeaz. Alteori, aceste enzime se utilizeaz pentru atacul unor impuriti care incomodeaz procesul principal, dar fr atacul componentului principal. De exemplu, hidroliza enzimatic complet a amidonului presupune i hidroliza legturilor 1,6 glucozidice, aflate n numr mic n structura amilopectinei. Pullulanazaeste folosit n acest caz pentru hidroliza legaturilor 1,6 facilitnd n acest fel aciunea amiloglucozidazei i - amilazei. Glucozoxidaza este folosit pentru ndeprtarea urmelor de glucoz din praful de ou folosit la obinerea maionezei i n acest caz nu trebuie s aib o activitate enzimatic mare. Producerea enzimelor intracelulare ridic probleme specifice. Bioprocesul trebuie astfel condus nct pe parcursul biosintezei s se evite spargerea celulelor. Un alt aspect se refer la stabilitatea enzimelor; unele enzime sunt stabile n mediul intracelular i devin instabile n afara celulei. Unul dintre dezavantajele procedeelor de obinere prin biosintez a enzimelor intracelulare l constituie necesitatea eliberrii acestora din celule, prin distrugerea membranei celulare, extracie i ulterior separarea extractului de resturile celulare. In plus enzimele sunt impurificate cu toate proteinele intracelulare, chiar dac enzime dorit se afl n properie mare n totalul proteinelor extrase din celule. Un avantaj tehnologic al enzimelor intracelulare l constituie faptul c extracia se poate efectua cu un volum mic de soluie tampon, ceea ce conduce la obinerea unui extract brut cu coninut mare de enzim i nu mai este necesar concentrarea ulterioar a acestuia. Enzime extracelulare de fermentaie Cele mai importante enzime microbiene extracelulare sunt, n general hidrolazele( proteinaze, amilaze, celulaze) care actioneaz asupra substraturilor cu mas molecular mare. Pentru microorganisme, este normal, din punct de vedere fziologic, s produc nutrieni din polimeri biologici disponibili n mediul nconjurtor celular. Pentru a ataca mai uor substraturile, microorganismele i produc singure enzimele necesare hidrolizei acestora i uneori aceast producie de enzim este optim chiar la tulpinile slbatice. Enzimele hidrolitice produse prin fermentaie i utilizate n cantiti mari n industrie sunt proteazele, amilazele, celulazele. Acestea sunt comercializate i utilizate n industria alimentar, textil, detergenilor. Pentru c productia unei enzime extracelulare utilizeaz n cea mai mare parte resursele diponibile ale celulei, biosinteza i secreia unei astfel de enzime sunt supuse unui complex de factori regulatori. In general, producia acestor enzime este indus de niveluri reduse ale polimerilor, iar uneori polimerii nii funcioneaz ca inductori. Alteori, compuii care nu sunt substraturi pentru

18

enzime, dar sunt nrudii ca structur cu acestea, pot funciona ca inductori. De exemplu, producia de celulaze este indus att de lactoz, ct i de celobioz. Producia acestor enzime este de asemenea supus represiei prin catabolii. Atta timp ct nutrienii cu mas molecular mic sunt diponibili, celulele cresc fr s produc hidrolaze i abia la epuizarea nutrienilor ncepe biosinteza enzimelor hidrolitice extracelulare. Astfel, inducia i represia biosintezei enzimelor sunt fenomene complexe ce au loc n concordan cu condiiile de mediu n care se gsesc celulele. Trebuie reinut faptul c factorii care determin nmulire i dezvoltarea celulei vor determina i declanarea biosintezei enzimelor. Un rol important n formarea enzimei l are existena n mediul de cultur a substratului care induce formarea enzimei specifice degradrii respectivului substrat. El constituie inductorul operonului enzimei. Primul studiu sistematic efectuat n aceast direcie a fost efectuat de Karstrm, care mparte enzimele n dou grupe: enzimele constitutive i enzimele adaptative. Enzimele constitutive se sintetizeaz n celule n mod permanent. Concentraia lor este ns influenat de prezena sau absena n mediul de cultur a substraturilor pe care ele le metabilizeaz. Concentraia aceastor enzime poate s varieze i sub influena altor factori: sursa de azot, sursa de carbon, factorii de cretere, srurile minerale, temperatura, pH-ul. In schimb, sinteza enzimelor adaptative este declanat numai de prezena substraturilor specifice n mediul de cultur sau atunci cnd este nevoie de prezena lor n procesele metabolice. Pe baza unor studii ndelungate i de profunzime cu privire la biosinteza enzimelor induse de substrat s-a ajuns la urmtoarele concluzii:
-

Elaborarea de ctre un organism a unei enzime induse are loc numai n prezena inductorului; ca inductor funcionez, de obicei, substratul care trebuie metabolizat; funcia de inductor poate s o ndeplinesc i substanele nrudite structural cu acesta, dar care nu poate ndeplini funcia de substrat; Biosinteza are loc pornind ntotdeauna de la substane cu structur simpl; Procesul de biosintez decurge cu consum de energie i din acest motiv, pe lng substanele necesare sintezei(aminoacizi, vitamine, diferii cationi) este nevoie n mediu i de o surs de carbon, de obicei un glucid; Sinteza enzimelor induse are loc, de regul, n timpul nmulirii microorganismului; ea poate sa aib loc n faza staionar, dac sunt prezente inductorul i substraturile de sintez; Procesul de biosintez al enzimelor este inhibat de toate substanele care inhib biosinteza substanelor proteice, de exemplu cloramfenicolul; Biosinteza enzimelor induse este inhibat ori de cte ori n mediul de cultur este prezent un substrat uor metabolizabil de ctre enzimele constitutive ale microorgamismului; Biosinteza unei enzime induse este inhibat selectiv i de metaboliii rezultai din reaciile de transformare ale inductorului, datorit activitii acestuia; fenomenul se numete represie;

2.4 Enzime microbiene cu aplicaii industriale. Domenii de utilizare Principalele aplicaii ale enzimelor utilizate pe scar larg n ultimele 2 decenii sunt prezentate n tabelul urmtor(Frost i Moss,1985):

19

Denumirea enzimei 1

Industriile utilizatoare 2

Tipul de fermentaie 3 1.Enzime proteolitice 4

I Felul enzimei

Forma de condiionare 5

Enzime proteolitice alcaline bacteriene

Detergeni Procese alimentare Pielrie Industria alimentar Panificatie Industria brnzeturilor Submers Submers Submers Submers n culturi de suprafat 2.Enzime amilolitice Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex)

Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Lichid(L) Solid(S)

Enzime proteolitice bacteriene neutre Enzime proteolitice fungice

amilaze bacteriene amilaze fungice Amiloglucozidaze Pullulanaze

Amidon, bere Detergeni, textile Amidon Panificaie Amidon Bere Amidon

Submers Submers Submers Submers n culturi de suprafa 3. Alte glucozidaze

Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Extracelulare(Ex) Intracelulare(In)

Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S)

Lactaz(galactozidaz) Invertaz Rafinaz( -galactozidaz) Celulaze -1,3(4)-Glucanaze Lipaze Pectinaze

Industria laptelui Industria textil Rafinarea zahrului Industria alimentar(sucuri) Industria berii Industria alimentar Teste de diagnostic Industria sucurilor i buturilor alcoolice

Submers in culturi de suprafa Submers Submers Submers Submers Submers Submers in culturi de suprafa 4. Alte enzime

Extracelulare(Ex) Intracelulare(In) Intracelulare(In) Intracelulare(In) Extracelular(Ex) Extracelular(Ex) Extracelular(Ex) Extracelular(Ex)

Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Imobilizat(Im) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S) Lichid(L) Solid(S)

Glucozizomeraza Glucozoxidaza

Amidon Industria sucurilor i buturilor alcoolice

Submers Submers

Intracelulare(In) Intracelulare(In)

Imobilizat(Im) Lichid(L) Solid(S)

20

Teste de diagnostic Catalaza Penicilinacilaza Industria sucurilor Antibiotice Submers Submers Intracelulare(In) Intracelulare(In) Lichid(L) Solid(S) Imobilizat(Im)

O analiz a pieei comerciale arat c enzimele obinute prin procese fermentative microbiene reprezint aproximativ 80% din totalul produciei de enzime produse astzi n lume. Dintre celelelte enzime, obinute prin extracie, necesittile sunt acoperite de urmtoarele preparate: cheag de viel, -amilaz din orz, proteinaz pancreatic, etc. Dintre enzimele de fermentatie cea mai mare cantitate o reprezint proteinazele alcaline bacteriene utilizate n industria detergenilor.

3. OXIDOREDUCTAZE IMPORTANTE N BIOTEHNOLOGIILE ALIMENTARE Oxidoreductazele sunt enzimele participante n procesele de oxidare biologic, care catalizeaz reaciile de oxidoreducere printr-o serie de mecanisme: transfer de hidrogen (transhidrogenaze sau dehidrogenaze), transfer de electroni (transelectronaze), combinarea direct a unui substrat cu oxigenul molecular (oxidare) etc. Ele acioneaz asupra unei perechi de substraturi, A i B, dintre care cel redus se va oxida, iar cel oxidat se va reduce, dup schema general: Ared + Boxid Aoxid + Bred

In funcie de gruprile chimice de substanele donatoare de hidrogen asupra crora acioneaz, sau de substanele care ncorporeaz oxigenul etc., se mpart n 17 subclase, n cadrul crora se difereniaz diferitele sub-subclase de oxidoreductaze. Aceste enzime i exercit aciunea lor catalizatoare prin intermediul unor coenzime (nicotin-adenindinucleotidice NAD+, NADP+; flavinice ca "flavinmononucleotidul FMN sau flavinadenindinucleotidul FAD, heminice, etc.), care se comport ca acceptori intermediari ntre substratul donor, iniial, i cel acceptor, final . Numeroase oxidoreductaze intervin n procesele metabolice, att anaerobe ct i aerobe, ca, de exemplu, glicoliza i diferitele fermentaii, ciclul acizilor tricarboxilici, catena de respiraie celular etc., care se desfoar n diversele materii prime alimentare i n procesele fermentative de obinere a unor pro duse alimentare. Unele oxidoreductaze proprii materiilor prime, n special vegetale, folosite n industria alimentar sunt implicate n procese degradative ca, de exemplu: n mbrunarea enzimatic (polifenoloxidaze, peroxidaze etc.), n procesele de albire sau decolorare (lipooxigenaza), n degradarea acidului ascorbic (acid ascorbic oxidaza), deteriorarea oxidativ a unor produse (peroxidaze, catalaze) etc. De asemenea, unele preparate enzimatice cu activitate oxidoreductazic sunt folosite n diferite scopuri n industria alimentar ca, de exemplu- glucozoxidaza pentru protejarea unor alimente mpotriva deteriorrilor oxidative i mbrunarea Maillard, sau catalaza pentru eliminarea H2O2 reziduale n pasteurizarea" la rece a laptelui.

21

3.1. Oxidoreductaze NAD+ sau NADP+ dependente Aceste enzime catalizeaz procesele reversibile de oxidoreducere caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un substrat donor pe altul acceptor i au caracter anaerob, deoarece acceptorul de hidrogen este altul dect oxigenul. Sunt denumite adesea dehidrogenaze, transhidrogenaze i dehidraze. Coenzimele lor, NAD+ sau NADP+, care se comport ca acceptori sau donori intermediari de hidrogen ntre substraturile participante n reacie, se detaeaz uor de apoenzim, puind s-i exercite acest rol pentru mai multe enzime. Oxidoreductazele NAD+ dependente intervin n numeroase procese catabolice oxidative ale alcoolilor, aldehidelor, aminoacizilor, iar cele NADP+ dependente catalizeaz mai ales procese anabolice reductive. Ele snt foarte rspndite n diverse organe i esuturi animale i vegetale, precum i n diferite microorganisme. Dehidrogenazele prezint deci importan i n numeroase procese fermentative i n procesul de respiraie care se desfoar n diverse materii prime sau n procesele fermentative de obinere a unor produse alimentare. Alcool dehidrogenaza (alcool: NAD+oxidoreductaza). Catalizeaz transformarea acetaldehidei, rezultat din decarboxilarea acidului piruvic, n alcool etilic, dup reacia: Glucide Acid piruvic Aldehid acetic Alcool etilic

Reacia prezint importan deosebit n procesul de fermentaie alcoolic; n condiii aerobe, enzima poate s catalizeze reacia de oxidare a alcoolului etilic n aldehid acetic. Enzima are masa molecular 150000 i conine Zn2+ n structura ei. Lactat dehidrogenaza (L-lactat: NAD-oxidoreductaza). Catalizeaz (n condiii anaerobe) reducerea acidului piruvic cu formare de acid lactic n prezen de NADH + H+ conform reaciei:

Acidul lactic constituie etapa final a glicolizei i a fermentaiei lactice. Lactat dehidrogenaza izolat din inima i muchii mamiferelor sau din unele bacterii ca, de exemplu, Bacillus subtilis, conduce la formarea de acid L-lactic, deosebindu-se de lactat dehidrogenaz obinut din Lactobacillus plantarum care duce la formarea de acid D-lactic. In general, microorganismele care realizeaz fermentaia lactic produc acid lactic racemic, deoarece acidul Llactic rezultat este parial izomerizat la acid D-lactic, prin intervenia unei izomeraze.

22

Malicdehidrogenaza (L-malat: NAD+ -oxidoreductaza). Catalizeaz reacia de oxidare a acidului malic n acid oxalilacetic, care mai departe este transformat n acid lactic. Malatoxidaza. Denumit i enzim malic (malat: NADoxidoreductaza), malatoxidaza catalizeaz reacia de transformare a acidului malic n acid piruvic, acesta fiind apoi transformat n acid lactic.

Aceste dou enzime intervin n fermentaia malolactic a vinurilor. Alturi de aceste dou oxidoreductaze, n fermentaia lactic a vinurilor intervine i enzim malolactic (L-malat: NADcarboxiliaza) care catalizeaz reacia:

Acetaldehiddehidrogenaza (Acetaldehida: NAD-oxidoreductaza). Catalizeaz oxidarea aldehidei acetice n acid acetic, mai ales n procesul de oetire a vinurilor.In condiii aerobe, alcoolul etilic din vin, sub influena alcooldehidrogenazei, este transformat n aldehid acetic iar aceasta sub influena acetaldehiddehidrogenazei se oxideaz n acid acetic. 3.2. Oxidoreductaze FAD sau FMN dependente Aceste enzime cunoscute i sub denumirea de flavinenzime au drept coenzime FAD-ul sau FMN-ul care snt derivai ai riboflavinei (vitamina B 2). Unele flavinenzime conin n molecula lor i ioni metalici ( MO, Fe), care le confer uneori i funcia de a transporta electroni. In general coenzimele flavinenzimelor snt strns asociate moleculelor de apoenzim (deosebindu-se din acest punct de vedere de NAD + i NADP + care se pot detaa de apoenzim). Unele flavinenzime acioneaz ca dehidrogenaze anaerobe, iar altele au caracter aerob, putnd transfera hidrogenul direct de la substratul donor ctre oxigenul molecular cu formare de ap oxigenat. In cadrul acestor din urm enzime se ncadreaz glucozoxidaza, care i gsete multiple utilizri n industria alimentar. Glucozoxidaza (Notatina, -D-glucozo-O 2-transhidrogenaza, -D-gluco-oxigenoxidoreductaza, EC 1.1.3.4). Este o flavoenzim care conine 2 moli de flavinadenindinucleotid (FAD) ca grupare prostetic/mol enzim. Se obine din Aspergillus niger (S.U.A.), Penicillium amagasakiense (Japonia) i Penicillium vitale (Rusia). Glucozoxidaza din Aspergillus este considerat enzim intracelular implicat n mecanismul metabolis mului energetic In practic, tulpinile de Aspergillus niger snt cultivate submers i miceliul respectiv este separat de mediul de cultur; miceliul, care conine enzim, este dezintegrat i glucozoxidaza trece n soluie care este centrifugat pentru separarea pereilor celulari. Dup purificri repetate, enzima este precipitat cu aceton sau alcool etilic, precipitatul fiind separat prin filtrare sau centrifugare,

23

uscat, apoi extras cu soluie tampon. Enzim n soluie este standardizat i stabilizat, putnd fi pstrat civa ani la tempe ratura de refrigerare. Glocozoxidaza din Penicillium este purificat direct din mediul de cultur, fiind considerat o enzim extracelular, fapt care este n neconcordant cu funcia sa n procesele bioenergetice ale celulei. De fapt, miceliul de Penici llium se autolizeaz rapid, n comparaie cu Aspergillus, i enzima este trecut n mediul de biosintez. Prin urmare, glucozoxidaza din Penicillium este tot o enzim intracelular. Activi tatea acestor enzime rmne neschimbat n intervalul de temperatur 30...60C. Enzim posed o specificitate de substrat foarte ridicat, glucoza fiind oxidat de 160 ori mai repede dect -glucoza, dar aceasta nu are o semnifi caie practic deoarece mutarotaza (aldozmutarotaza, EC 5.1.3.3.) restabilete permanent echilibrul ntre i -Dglucoz. 3.3. Transelectronaze Sunt enzime care catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin transfer de electroni de pe un donor ctre un acceptor. In funcie de natura acceptorului, transelectronazele pot fi: anaerobe, cnd acceptorul este o alt substan diferit fa de oxigenul molecular, i aerobe, cnd acceptorul este oxigenul. Transelectronazele anaerobe snt cunoscute i sub denumirea de citocromi, care snt localizai la nivelul mitocondriilor, unde particip ca transportori de electroni n catena de respiraie celular. 3.4. Oxidaze Sunt oxidoreductaze care catalizeaz reaciile unor substraturi cu oxigen molecular sau al peroxizilor, fiind caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un donator pe un acceptor care este oxigenul molecular. Ca produs de reacie se formeaz H2O2. n funcie de mecanismele de aciune oxidazele pot fi: oxigenaze: dioxigenaze i monooxigenaze; oxidaze transportoare de electroni: citocromoxidaza, cupruoxidazele (tirozinaze, polifenoloxidazele, cateholoxidaza, ascorbatoxidaza etc.); hidroxiperoxidaze (peroxidaze i catalaze). Lipoxigenaza este o dioxigenaz (lipoxidaza linoleat: oxigenoxidoreductaza, EC 1.13.1.13), fiind cunoscut i sub denumirea de carotenoxidaz. Catalizeaz oxidarea acizilor grai polinesaturai care conin legturile cis, cis- 1,4 pentadienice cu ajutorul O2. Acizii grai polinesaturai oxidai sunt acidul linoleic (9, 12 octadecadienoic), linolenic (9, 12, 15 octadecatrienoic) i arahidonic (5,8, 11, 14 eicosatetraenoic). Aceti acizi grai snt denumii eseniali. Snt oxidate i gliceridele i metilesterii acizilor grai menionai. Se formeaz peroxizii respectivi . Lipoxigenaza se gsete n mazre, fasole, arahide, cartofi, ridichi, dar activitate lipoxigenazic extrem de mare o au boabele de soia. Enzima este activ si la temperaturi sczute i prin aciunea ei se formeaz mirosuri nedorite n produsele vegetale respective. Boabele de soia conin dou tipuri de lipoxigenaz, una activat de Ca2+ iar cealalt inhibat de Ca2+, vrful de activitate fiind suma efectelor pozitive i negative, funcie de modificrile concentraiei de calciu. Lipoxigenaza din soia nu necesit activare cu metale sau grupare prostetic. Antioxidanii obinuit folosii sunt inhibitori slabi ai lipoxigenazei iar acidul ascorbic i tocoferolii accelereaz reaciile de oxidare. Lipoxigenaza din soia se utilizeaz pentru albirea finii de gru prin distrugerea carotenilor.

24

Polifenoloxidazele (denumite cresolaze, catecholoxidaze, cateholaze, tirozinaza, fenolaza; denumire sistemic O-difenol: oxigenoxidoreductaza, EC 1.10.3.1) sunt enzime care transport electronii direct pe oxigen. Catalizeaz hidroxilarea monofenolilor cu formare de O-difenoli, care sunt transformai n O-chinone. Sunt larg rspndite n plante, gsindu-se n cantitate mai mare n special n ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai i tutun, boabe de cafea i n diferite fructe ca mere, piersici, caise, banane etc. Polifenoloxidazele din plante nu prezint o specificitate deosebit, puind s acioneze asupra unor mari varieti de compui monofenolici i O-difenolici. In schimb, polifenoloxidazele din esuturile mamiferelor au o specificitate mult mai restrns, acioneaz doar asupra tirozinei i dihidroxifeni-Lalaninei. mbrunarea materialelor vegetale (legume, fructe proaspete tiate) n contact cu oxigenul din aer este datorat polimerizrii sau polimerizrii oxidative a chinonelor formate din mono- i difenoli, asupra crora au acionat polifenoloxidazele. Prin folosirea unor tratamente termice ca, de exemplu: n cazul blanrii legumelor i fructelor, are loc inactivarea polifenoloxidazelor. De asemenea, concentraii relativ mici de clorur de sodiu, de ageni de complexare a cuprului, de acid ascorbic, S02 pot preveni sau minimaliza procesele de mbrunare enzimatic a legumelor i fructelor cauzate de polifenoloxidaze. Peroxidazele snt enzime care catalizeaz reacii de oxidoreducere dup reacia general: ROOH + AH2 H2 + ROH + A n care: ROOH poate fi peroxidul de hidrogen (H202) sau un alt peroxid organic. Aceste enzime snt larg distribuite n microorganisme (bacterii, drojdii), n plante ca, de exemplu, napi, gulii, cartofi, smochine i diferite alte legume i fructe, n esuturi i lichide biologice animale ca, de exemplu, ficat, lapte, saliv, n leucocite etc. Din punct de vedere structural pot fi grupate n: peroxidaze feriprotoporfirice (cu grupare prostetic feriprotoporfirina III) prezente n plantele superioare (legume i fructe), n animale (ca, de exemplu, triptofan-pirolaza, tiroid-iodin-peroxidaza) i n microorganisme (citocrom c-peroxidaza din drojdii); verdo-peroxidaze (cu grupare prostetic porfirinic diferit de feri-porfirina III) de culoare verzuie, cum este lactoperoxidaza din lapte i flavo-protein-peroxidaza (cu FAD ca grupare prostetic) de felul celor gsite n diferii streptococi dar i n unele esuturi animale. n general, peroxidazele prezint o mare stabilitate termic. De exemplu, pentru unele peroxidaze s-a constatat pstrarea a circa 50% din activitatea iniial dup un tratament termic de 32 min la 85C, 12 min la 100C, 2,5 min la 116C i 0,4 min la 145C. Datorit termostabilitii lor, determinarea activitii peroxidazice din diferite legume i fructe este folosit ca un indice al eficienei tratamentelor termice aplicate n procesele de blanare, sterilizare etc. Determinarea activitii lactoperoxidazei este folosit la urmrirea eficienei pasteurizrii n industria laptelui. Diferitele peroxidaze intervin n degradarea fructelor i legumelor, fiind implicate n modificarea mirosului i gustului (mai ales la mazre, fasole etc.) n procesele de mbrunare enzimatic. Sub form de preparate enzimatice, n special peroxidaza obinut din hrean, snt folosite, alturi de glucozoxidaz, n determinarea specific a glucozei din diferite materiale biologice. 4. HIDROLAZE IMPORTANTE N INDUSTRIA ALIMENTAR Hidrolazele sunt enzime care catalizeaz scindarea hidrolitic a substraturilor, determinnd desfacerea legturilor dintre atomii de carbon i ali atomi prin introducerea elementelor apei. Principalele legturi scindate la hidrolaze sunt legturile: ester glicozidazic i peptidic. 4.1. Lipaze i esteraze

25

Enzimele lipolitice snt importante n metabolismul i degradarea lipidelor. Importana lor fiziologic const n aceea c hidrolizeaz grsimile alimentare cu formare de di-, monogliceride i acizi grai, produi care snt transportai, oxidai i sintetizai n gliceride i fosfolipide proprii organismului. Importana lor tehnologic const n faptul c realizeaz hidroliza controlat a lipidelor, n vederea formrii de arome n cadrul alimentelor (de exemplu,, n cazul brnzeturilor) sau n sisteme pregtite special pentru obinerea de aromatizani. Enzimele lipolitice sunt implicate ns i n degradarea unor produse alimentare cu coninut ridicat n lipide (lapte i produse lactate, carne, pete, produse vegetale bogate n lipide, cum ar fi arahidele, semine de floarea soarelui, soia, germeni de gru i porumb etc.). Lipazele se difereniaz de esteraze prin afinitatea lor mai mare pentru acizii grai cu lan lung din structura gliceridelor. Pe de alt parte, pe plan structural, lipazele prezint o poriune hidrofil i alta lipofil, fapt ce le permite plasarea lor la interfaa ulei/ap, aciunea lor fiind favorizat de calitatea emulsiilor de tipul ulei/ap. Srurile de calciu i proteinele sunt activatori (efectori) ai lipazelor. In cazul lipazelor din sucul pancreatic, rol de activator l au i srurile acizilor biliari. Enzimele lipolitice de tipul lipazelor i fosfolipazelor sunt prezente ca enzime endogene n diferite esuturi animale, lapte, produse vegetale. Laptele conine o lipaza (cea mai important) care are pH optim la 8,59 i alte 23 lipaze care includ i o lipaza acid. Proteinele din lapte au aciune inhibitoare fa de lipaze. Clorura de calciu (CaCl2) inhib semnificativ lipazele din lapte. Lipazele din lapte hidrolizeaz rapid trigliceridele simple, viteza de hidroliz micorndu-se o data cu creterea lanului de acid gras din structura trigliceridei. Lipazele din lapte posed si activitate de sintez: glicerol + acid gras gliceride + ap Sinteza gliceridelor este influenat de concentraia enzimei, concentraia glicerolului, temperatura i durata incubrii. Fructele i legumele, dar n special seminele de gru, ovz, secar, soia etc., conin lipaze care provoac deteriorri ale acestora n condiii nefavorabile de umiditate relativ mare a aerului, coninut mare de umiditate al cerealelor, temperatur ridicat. Datorit creterii coninutului de acizi grai liberi scad proprietile de panificare a finurilor de gru. Germenii de gru, secar, orz au o activitate lipolitic mai mare dect endospermul, deci sunt mai bogai n lipaze. Scutelum i stratul aleuronic, de asemenea, conin mai multe lipaze dect endospermul. Lipazele produse de microorganisme snt produse de drojdii (Candida, Torulopsis) , mucegaiuri (Rhizopus, Penicillimmi, Aspergillus, Geotrichum, Mucor), bacterii (Pseudomonas, Achromobacter, Staphylococcus). Lipazele din microorganisme difer ntre ele prin pH i temperatura optim de activitate, durata/temperatura de inactivitare, respectiv stabilitatea termic. Lipazele produse de microorganisme snt considerate ca lipaze adevrate care hidrolizeaz grsimile i uleiurile naturale ca i gliceridele sintetice. Concentraii sczute de sruri de Ca, Na, K, Mg activeaz lipazele, dar metalele grele snt inhibitori puternici. Avnd n vedere aciunea negativ a lipazelor asupra caracteristicilor senzoriale ale produselor alimentare, este necesar s se ia urmtoarele msuri: s se reduc coninutul n ap liber al produsul alimentar (acolo unde este posibil), pentru a micora activitatea apei (aw), deci pentru micorarea vitezei reaciilor enzimatice; s se pstreze produsele alimentare la temperaturi ct mai sczute (de refrigerare sau congelare) sau s se inactiveze lipazele prin tratament termic ; s se reduc timpul de depozitare al materiilor prime ; s se elimine factorii care concur la dezvoltarea microflorei lipolitice. 4.2. Enzime oligozidazice

26

Dintre oligozidaze, mai importante pentru industria alimentar sunt -glucozidaza (EC 3.2.1.21), -D-galactozidaza (EC 3.2.1.22), -D-galactozidaza (EC 3.2.2.23), -Dfructofuranozidaza (EC 3.2.1.26).

-Glucozidaza (EC 3.2.1.21), denumit i emulsin, scindeaz legtura -glucozidic din -glucozii rspndii n plante cum ar fi amigdalin, prunazin, naringin, dar i din celobioz i gentiobioz. Aceast enzim este produsa i de unele microorganisme: Alcaligenes faecalis, Botryodiplodia theobromae, Phoma strasseri, Septoria licopersici, Aspergillus niger, Myrothecium verucaris, Trichoderma viride, Saccharomyces lactis etc. -D-Galactozidaza (EC 3.2.1.32) este prodsu de B. stearothermophilus, Penicillium duponti, Absidia griseola, Mortierella vinaceae, Aspergillus awamori. Substratul natural al acestei enzime este rafinoza, trizaharid format din galactoz, glucoza i fructoz. Enzima desface rafinoza n galactoz i zaharoz i are aplicaii n industria zahrului i industria derivatelor proteice vegetale.

-D-Galactozidaza (EC 3.2.2.23), cunoscut i sub numele de lactaz hidrolizez lactoza la glucoza i galactoz (fig. 13). Este gsit n unele plante, microorganisme i n mucoasa intestinal a mamiferelor. Este obinut din tulpini de mucegaiuri (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus foetidis), din drojdii (Kluyveromyces fragilis, Kluyveromices lactis, Candida pseudotropicalis, Torulopsis lactis) i bacterii (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Escherichia coli). Preparatele lactazice din drojdii acioneaz bine la pH 6 i la temperatura de 35 ... 40C, deci la pH-ul substratului natural (lapte degresat, lapte concentrat), cele de origine fungic au activitate maxim la pH 5 i la temperatura de 50 ... 60 "C, fiind recomandate pentru hidroliza lactozei din zer. Din Aspcrgillus oryzae i Aspergillus niger se obin lactaze acidoactive i acidostabile, folosite la hidroliza lactozei n mediu acid. Lactaza de origine bacterian (E. coli)

27

acioneaz bine la pH ~ 7,3 i la 46 C. Ionii de sodiu i potasiu snt activatori ai lactazei din E. coli i din drojdii. Preparatele enzimatice de lactaz se utilizeaz pentru obinerea de produse lactate destinate i adulilor care prezint intoleran la lactoz (deficient congenital, primar sau secundar de lactaz), pentru obinerea siropului'de lactoz ce are multiple aplicaii n industria alimentar, pentru mpiedicarea apariiei unor defecte n produsele lactate concentrate i congelate. Se utilizeaz i n panificaie, n cazul utilizrii zerului pulbere la fabricarea pinii. 4.3. Amilaze Amidonul, cel mai important homoglucid de rezerv din regnul vegetal, se gsete n diferite materii prime folosite n industria alimentar, de obicei sub form de granule, n cele dou componente principale, amiloza i amilopectina, care snt dispuse n straturi concentrice, fiind nsoite de mici cantiti de alte substane organice (protide, lipide) i substane anorganice (H3PO4, Si03, H2O). Amiloza care reprezint 2025% din amidon, este alctuit din uniti de glucoza legate ntre ele prin legturi l-4 glucozidice, gradul de polimerizare fiind de 2006000 (n medie 10 3). Amilopectina care reprezint 7580% din amidon este format din lanuri liniare de glucoza legate l-4 glucozidic, lanuri care se grefeaz unele pe altele prin legturi l-6 glucozidice. Numrul legturilor l -6 glucozidice reprezint 56% din ansamblul de legturi din amilopectin, gradul de polimerizare al acesteia fiind de 105109 resturi de glucoza. Sub form de granule, amidonul este rezistent la aciunea enzimelor amilolitice. In general, enzimele amilolitice acioneaz numai n condiiile n care granulele de amidon sunt cel puin lezate (de exemplu n cazul amidonului din cereale supuse mcinrii) i mai ales cnd amidonul a fost gelificat prin nclzire n prezen de ap, realizndu-se pe aceast cale o hidratare, o umflare i deci o spargere a granulelor de amidon. Sub aceast form amidonul devine uor atacabil de enzimele amilolitice care, acionnd asupra amilozei i amilo-pectinei, produc desfacerea hidrolitic a legturilor l-4 glucozidice, determinnd depolimerizarea acestora i formarea de dextrine de diferite mrimi, maltoz, glucoza. Enzimele implicate n degradarea amidonului pot fi endogene, care se gsesc n cantitate mai mare n cereale ncolite, importante n cazul orzului ce este transformat n mal, i exogene, care n cea mai mare parte sunt de natur bacterian sau fungic. Amilazele sunt bine caracterizate i difereniate pe baza tipului de legtur hidrolizat, modul lor de atac (endo sau exo), natura substratului limit i produii de degradare. Enzimele care atac amidonul snt glucozilhidrolaze i aparin urmtoarelor grupe: a) Enzime care hidrolizeaz legturile l-4 glucozidice .-Amilaza, cunoscut i sub denumirea de amilaz dextrinogenic, diastaza, ptialin, glucogenaz, -l,4-glucon 4-glucanohidroxilaz (EC 3.2.1.1.), este o metalprotein care conine calciu n proporie de l atom gram/molecul, strns legat de enzim. Prin ndeprtarea calciului, enzim devine inactiv i instabil la cldur. Calciul nu particip direct la formarea complexului enzim-substrat, dar menine molecula de enzim n configuraia optim pentru un maxim de activitate i stabilitate, (n practica de hidroliza a amidonului se adaug calciu sub form de sruri). Enzim are activitate la pH cuprins ntre 4,5 i 7,0, pH-ul optim depinznd de originea enzimei. Stabilitatea la cldur este de asemenea diferit n funcie de originea enzimei. -Amilaza hidrolizeaz mai mult sau mai puin la ntmplare legturile l-4 glucozidice din interiorul moleculelor de amiloz i amilopectin, conducnd la dextrine de diferite mrimi, respectiv la lichefierea amidonului i la o hidroliza prelungit i la maltoz i maltotrioze. -Amilazele pot fi de origine animal (amilaz produs de glanda salivar i pancreas), de origine vegetal (cereale ncolite n special mal) cu importan n industria berii, spirtului i panificaiei i de origine microbian (bacterii, mucegaiuri i mai puin drojdii), cele de origine bacterian fiind mai stabile la cldur dect cele de origine fungic.

28

 -Amilaza, denumit i amilaz zaharigenic, l-4 glucano-maltohidrolaza (EC 3.3.1.2) hidrolizeaz legturile l-4 glucozidice ale amidonului de la capetele nereductoare ale lanurilor poliglucidice (este exoenzim). Amiloza cu numr impar de uniti de glucoza este transformat n maltoz n proporie de 90% i n maltotrioze. La concentraii mari ale enzimei i la hidroliz prelungit, maltotrioza este degradat lent la glucoza i maltoz. Amilopectina este degradat i ea n maltoz dar hidroliz se oprete la legturile l6 glucozidice care nu pot fi hidrolizate i nici by-passate. Se formeaz n acest fel 6070% maltoz, restul fiind dextrine limit. -amilaza are pH-ul optim ntre 5 i 6 iar temperatura optim ~55 ... 63 C. Pentru activitatea enzimatic snt necesare gruprile SH. Surse importante de -amilaz sunt orzul, grul, secara, cartofii dulci i soia. Recent s-a dovedit c este produs i de unele microorganisme (Bacillus, Streptomyces ), avnd pH-ul optim la 56 i temperatura optim la 60 C. b) Enzime care hidrolizeaz legturile l-6 glucozidice. Sunt cunoscute i sub denumirea de enzime de debranare (deramificare) ce acioneaz asupra arnilopectinei din amidon, n cadrul acestora snt mai bine cunoscute urmtoarele enzime: pullulanaza (EC 3.2.1.41), care hidrolizeaz poliglucidul pullulan, conducnd la eliberarea de maltotrioza. Acioneaz, de asemenea, i asupra legturilor l -6 glucozidice din amilopectin i n mai mic msur asupra celor din structura glicogenului. Este produs de numeroase microorganisme, dar se extrage, n principal, din Klebsiella aerogenes. izoamilaza (EC 3.2.1.68) poate deramifica att amilopectin cit i glicogenul. Acioneaz foarte slab asupra pullulanului. Este produs de specii dePseudomonas i Citophaga. Aceste dou enzime de deramificare pot completa 100% aciunea de dextrinizare i zaharificare a amidonului produs de i amilaze. Ca i -amilaza, enzimele de deramificare nu acioneaz asupra amidonului negelificat. c) Enzime care hidrolizeaz att legturile l-4ct i l-6 glucozizidice. n cadrul acestora o deosebit importan o prezint: glucoamilaza ce hidrolizeaz mai repede legturile l-4 dar i cele l-6 de la capetele nereductoare ale lanurilor poliglucidice din amidon, conducnd la glucoza. Randamentul de transformare a amidonului n glucoza este afectat de capacitatea enzimei de a polimeriza glucoza la maltoz i maltotrioza, reacie care este dependent de concentraia ridicat a substratului. Preparatele comerciale de amiloglucozidaza snt de origine fungic (Aspergillus, Rhizopus), fiind impurificate cu lipaze, tanaze, celulaze, hemicelulaze, proteaze.
4.4. Enzime pectolitice : Enzimele care acioneaz asupra substanelor pectice pot fi clasificate n dou grupe: enzime saponifiante sau pectinesteraze i enzime depolimerizante sau pectinglicozidaze. Pectinesterazele (pectinmetilesteraza pectindemetoxilaza, pectinpectilhidrolaze, EC 3.1.1.11), notate PME sau PE, hidrolizeaz esterul metilic al acidului galacturonic. Pectinesterazele se gsesc n diferite produse vegetale (tomate, ceap, pepeni, mere, pere etc.) i au un optim de pH aproape de neutralitate. De exemplu, pectinesterazele din tomate i citrice au pH-ul optim la 7,5, cele din mere la 6,6 i cele din struguri la 5,6. Snt relativ stabile la cldur. Pectinglicozidazele sunt enzime depolimerizante. Preparatele enzimatice pectolitice snt utilizate n mare msur pentru ameliorarea extraciei sucului celular din fructe i legume (prin degradarea pereilor celulari), pentru macerarea fructelor i legumelor n vederea obinerii de nectaruri (prin degradarea substanelor pectice ale lamelelor mijlocii care asigur legtura dintre celule, fr a se distruge pereii celulelor parenchimatoase) i pentru limpezirea (clarificarea) diferitelor categorii de sucuri. In cazul preparatelor enzimatice pectolitice folosite pentru macerare, este necesar ca acestea s posede i activitate celulazic, hemicelulazic, proteazic i amilazic.

29

4.5. Peptidhidrolaze (proteinaze i peptidaze) Peptidhidrolazele proteinazele i peptidazele cunoscute i sub denumirea general de enzime proteolitice catalizeaz scindarea hidrolitic a legturilor peptidice, din moleculele proteidelor, polipeptidelor i oligopeptidelor, conducnd la eliberarea de peptide de diferite mase moleculare, sau chiar la aminoacizi, dup urmtoarea reacie general:

n funcie de regiunea din molecula proteidelor sau polipeptidelor la nivelul creia acioneaz, acestea se subdivid n endo- i exopeptidhidrolaze ; endo-peptidhidrolazele, denumite i proteinaze sau peptidilpeptidhidrolaze, scindeaz hidrolitic legturile peptidice din interiorul catenelor polipeptidice ale proteidelor i proteinelor cu masa molecular mare, producnd catene polipeptidice de mas molecular mai mic, iar exo-peptidhidrolazele, peptidazele sau exopeptidazele catalizeaz desfacerea hidrolitic a legturilor peptidice de la extremitile catenelor polipeptidice sau oligopeptidice, conducnd, n general, la eliberarea de aminoacizi. Exo-peptidazele pot aciona att asupra produilor de hidroliz a endo-peptidhidrolazelor ct i asupra unor proteine nehidrolizate. La rndul lor, exopeptidazele, se subdivid n aminopeptidaze, care desfac hidrolitic aminoacizii de la capetele N terminale ale catenelor peptidice (corespunztoare resturilor de aminoacizi cu gruparea NH2 liber) i carboxipeptidaze ce scindeaz hidrolitic aminoacizii de la capetele C terminale (corespunztoare resturilor de aminoacizi cu gruparea COOH liber). n cadrul exo-peptidazelor se grupeaz i dipeptidazele, care desfac legturile peptidice din dipeptide, precum i dipeptidil-peptidhidrolazele, care scindeaz dipeptide de la captul N terminal al lanului polipeptidic i peptidil-dipeptidhidrolazele ce elibereaz dipeptide din captul C terminal. In cazul endo-peptidhidrolazelor, lundu-se n considerare unele grupri funcionale din centrii activi ai enzimelor, comportarea fa de unii inhibitori sau activatori i efectul pH-ului, se pot distinge: proteinaze serinice, care au n centrul activ un rest de serin i care sunt inhibate de unii compui organofosforici; acestui grup i aparin: tripsina, chimotripsina, elastaza, subtilizina (din Bacillus sp.), proteinaza alcalin din Aspergillus sp. etc.; proteinaze tiolice sau SH-dependente, care au n centrul activ grupri SH libere, corespunztoare resturilor de cistein i care pot fi inactivate prin blocarea acestora cu metale grele, cu ageni alchilani sau oxidani; din cadrul acestora fac parte: papaina, ficina i bromelina; proteinaze carboxilice (acide) al cror centru activ cuprinde grupri carboxilice ionizate i care sunt active n domeniu de pH acid; din acest grup fac parte proteinazele care coaguleaz laptele, chimozina, pepsina, proteinazele produse de Mucor sp., precum i proteinazele acide produse de Aspergillus sp. ; metal-proteinaze, care sunt activate de ioni metalici legai de centrul activ (ca, de exemplu, Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe2+); din grupul acestora fac parte: colagenazele, proteinaza neutr produs de Bacillus subtilis, sau Aspergillus oryzae etc. Dintre peptidhidrolazele vegetale : Papaina. Sub denumirea de papain se nelege preparatul brut ce se colecteaz din fructele de Caryca papaia, cu puin nainte de coacerea acestora. Latexul colectat n contact cu aerul se coaguleaz, dup care se usuc sub vid, se macin i se cerne. Preparatul brut de papaia conine de fapt trei fraciuni: papain propriu-zis (10%), chimio-papain (45%) i lizozim (20%), ultima fraciune fiind denumit i papain-peptidaz. Aceste fraciuni difer ntre ele prin masa molecular i punctul izoelectric.

30

Papaina propriu-zis este o proteinaz tiolic constituit dintr-un lan polipeptidic format din 212 resturi aminoacizi. Papaina are o activitate specific larg hidroliznd att peptidele mici ct i proteinele. Este foarte activ n hidroliza amidelor i esterilor. Are pH-ul optim n jur de 6. Papaina are o stabilitate bun. Chimopapaina. A fost obinut n stare cristalizat din latexul de papaya i este format din chimopapaina A i B. Are aciune asemntoare cu papain, ns este mai puin eficace asupra hemoglobinei i este mai stabil dect papaina. Chimopapaina i pierde 50% din activitatea sa dac este meninut 75 min la 75C (pH = 7,2), fa de 56 min pentru papain. Preparatul brut de papain atac relativ bine fibrele musculare i pe cele elastice dar mai puin pe cele de colagen. Bromelina. Este o enzim proteolitica cu aciune energic care se gsete n sucul de ananas. Ca i papain i ficin, bromelina este o sulfhidril-proteaz, ns are structura unei glicoproteine. Optimul de activitate este la pH = 6,3 i la 55C. Are o aciune bun asupra fibrelor de colagen, dar o aciune slab asupra celor elastice. Aciunea asupra fibrelor musculare este foarte redus. Peptidhidrolazele de origine animal mai bine cunoscute i mai des folosite snt: chimozina, pepsina i tripsina, crora li se adaug chimotripsina, elastaza i carboxipeptidazele, aminopeptidazele i dipeptidazele, produse de diferite glande digestive. Cu excepia ultimelor dou tipuri de exo-peptidaze, celelalte peptidhidrolaze sunt produse de glandele digestive sub form de pro-enzime (preenzime sau zimogene) inactive, care devin active numai n urma scindrii hidrolitice a unor poriuni din structura lor, ce blocheaz activitatea lor enzimatic. Conversia proenzimelor n enzime active se realizeaz pe cale autocatalitic, care conduc la enzim activ i fragmente polipeptidice inactive enzimatic. Chimozina. Cunoscut i sub denumirea de cheag, rennin, presur sau labferment, chimozina constituie un preparat enzimatic cu aciune coagulant (asupra laptelui) i proteolitica, asemntor pepsinei, obinut din stomacuri de viel, miel sau ied, folosit n special la prepararea brnzeturilor. Chimozina rezult din precursorul inactiv prochimozina produs de mucoasa stomacului glandular (al patrulea stomac al vieilor) prin hidroliza parial, proces influenat de pH i concentraia n sruri. Chimozina este o preteaz serinic, cu specificitate de aciune similar pepsinei, acionnd mai ales la nivelul legturilor peptidice n care sunt implicate resturi de triptofan, fenilalanina, tirozin, metionin i leucin; manifest activitate coagulant i proteolitic. Pepsina. Endo-peptizad produs sub form de pepsinogen de glandele stomacale ale mamiferelor inclusiv ale omului i care se gsete i n sucul gastric al psrilor, reptilelor i petilor, pepsina scindeaz hidrolitic legturile peptidice din interiorul catenelor polipeptidice ale proteinelor, acionnd de preferin la nivelul legturilor peptidice n care sunt implicai aminoacizi aromatici (fenilalanin, tirozin sau triptofan) i dicarboxilici (acizii glutamic i aspartic). Transformarea pepsinogenului n pepsina catalitic activ se realizeaz la pH mai mic decit 5, n prezena ionilor H+ sau a unor mici cantiti de pepsina, activarea fiind nsoit de eliberarea unui polipeptid alctuit din 29 de resturi de aminoacizi, care acioneaz ca inhibitor al pepsinei, i cinci peptide mici. Pepsina este constituit dintr-un singur lan polipeptidic cu un rest izoleucinic la captul N terminal i un rest de valin la captul C terminal. pH-ul optim de aciune este 1,52,5. Este folosit la precipitarea cazeinei, obinerea de peptone, n unele ri pentru limpezirea berii la rece, ca adjuvant digestiv i este inclus n reeta de preparare a unor buturi tonice i a chewinggum-ului. Tripsina. Este tot o endo-peptidaz, care desface hidrolitic legturile peptidice n interiorul catenelor polipeptidice, de preferin cele constituite ntre gruparea carboxil a unui aminoacid diaminic (arginin, lizin) i gruparea aminic a altui rest de aminoacid. Este produs de pancreas sub form de tripsinogen, forma inactiv, care se transform n tripsin activ n intestinul subire sub aciunea enterochinazei (o enzim intestinal) sau pe cale autocatalitic, n prezena unor mici

31

cantiti de tripsin. Tripsina este constituit din 223 resturi de aminoacizi a cror secveniabilitate este cunoscut. Acioneaz la pH neutru, slab alcalin, pH-ul optim fiind 8,5. n ultimele decenii, datorit dezvoltrii impetuoase a proceselor i instalaiilor de cultivare a microorganismelor la nivel industrial, pentru realizarea de diferite produse (antibiotice, vitamine, preparate enzimaticc etc.) pe cale biosintetic, s-a nregistrat un interes deosebit i pentru cercetarea i obinerea de preparate peptidhidrolazice din microorganisme, n special din bacterii i fungi. Interesul pentru astfel de preparate proteolitice a crescut i mai mult dup anul 1965, cnd s-au folosit astfel de preparate pentru obinerea de detergeni cu enzime, de tip Biotex, care conin proteaze produse de Bacillus licheniformis. Multe din microorganismele folosite la producerea de preparate proteolitice produc aceste enzime extracelular, secretndu-le n lichidele de cultur, ceea ce uureaz foarte mult condiiile de prelucrare industrial pentru obinerea de preparate enzimatice. Datorit acestor fapte, exist n prezent tendina ca o serie de preparate proteolitice de natur vegetal sau animal s fie nlocuite din ce n ce mai mult cu preparate proteolitice microbiene, care sunt n general mai ieftine i de o mai mare diversitate. n prezent snt cunoscute numeroase tulpini de microorganisme care secret n mediile lor de cultur cantiti apreciabile de enzime proteolitice; dintre acestea, ns, sunt folosite pentru obinerea de preparate proteazice numai tulpinile nepatogene i care nu produc toxine. De mai muli ani, n diferitele sectoare ale industriei alimentare, se folosesc proteaze obinute mai ales prin cultivarea unor microorganisme ca: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Streptomyces sp., Rhizopus sp., Byssoclamys fulva, Endothia parasiiica, Mucor niiehei, Mucor pusillus etc. Proteinazele microbiene nu sunt, n general, foarte diferite de cele vegetale sau animale; aparin i ele serin - sulfhidril- i carboxil-proteinazelor, precum i metalo-proteinazelor.

MICROORGANISME FOLOSITE IN PROCESELE BIOTEHNOLOGICE Viaa Terrei nu ar fi posibil fr existena microorganismelor, pentru c acestea stabilesc echilibrul ntre substanele organice i cele anorganice, ntre materia vie i materia nevie. Industria alimentar, n mare parte, este de neconceput fr existena microorganismelor care snt folosite pentru conservare, obinerea de produse alimentare datorit aciunii lor fermentative (produse lactate acide, unt, brnzeturi, bere, vin, pine, alimente fermentate din cereale i leguminoase etc.). In general, produsele rezultate n urma aciunii microorganismelor pot fi clasificate n celule i biomas, metabolii primari, metabolii secundari i enzime. Celule i biomas. Numeroase produse alimentare sunt consumate mpreun cu celulele microorganismelor folosite pentru fermentare (produse lactate fermentate, produse de carne i pete fermentate, produse tradiionale fermentate de origine vegetal, pine) sau se consum numai mediul fermentat, celulele fiind ndeprtate, cum este cazul buturilor alcoolice de tipul berii, cidrului, vinului etc. In cazul biomasei, aceasta poate fi utilizat ca aditiv de fermentare (drojdie de panificaie) sau aditiv de mbogire a produselor alimentare cu proteine, respectiv ca furaje pentru psri, animale, peti. O serie de microorganisme sunt folosite sub forma de inocul de celule ca bioinsecticide, micoerbicide, vaccinuri. Metaboliii primari. Sunt molecule mici, vitale pentru celulele vii n vederea producerii de macromolecule sau pentru convertire n coenzime (nucleotide, vitamine). Metaboliii primari de importan pentru industria alimentar sunt alcoolul etilic, poliolii (manitolul, sorbitolul, xilitolul), conservani (acidul acetic, acidul lactic, acidul citric, acidul propionic), antioxidani i sechestrani (acidul ascorbic, acidul citric etc.), poteniatori de arom (glutamatul monosodic, 5'IMP, 5'

32

GMP), acidulani (acidul acetic, acidul citric, acidul malic, acidul gluconic, acidul lactic, acidul tartric, acidul fumrie etc.), aminoacizi (L-lizina, L-triptofanul, L-fenilalanin etc.), vitamine (riboflavina, ciancobalamine, vitamina C, vitamine D), gaze (CO2). Metaboliii secundari. Sunt produi de un spectru larg de microorganisme i pot fi folosii ca aditivi de stimulare (giberelinele) n producia de mal, de conservare (nizina) sau ca: coccidiostate, pesticide, bioinsecticide, inocul pentru semine, vaccinuri, antihelmintici etc., n producia vegetal sau animal pentru a mri producia de alimente necesare omului . De remarcat c, printre metaboliii secundari se numr i micotoxiele, n special aflatoxinele cu aciune duntoare omului i animalelor. Producia de metabolii secundari este afectat de mecanismele determinate genetic ca: derepresia (inducia), reglarea catabolic, reglarea feed-back la care trebuie adugat reglarea de bypass. Reaciile de producere a celulelor, biomasei i a metaboliilor pot fi paralele, perfect consecutive (sau decuplate) sau parial cuplate In funcie de tipul de reacie se conduce i fermentaia respectiv. Fermentaiile pot fi conduse discontinuu sau continuu, impunndu-se optimizarea lor. n aceast direcie, n cazul fermentaiei discontinue, optimizarea trebuie s rezolve dou situaii: cnd substratul este inhibitor pentru producia de metabolit (sau biomas) cnd produsul este inhibitor (biomas sau metabolitul). Prima situaie se ntlnete, de exemplu, la obinerea biomasei de drojdie de panificaie, unde represiunea catabolic de ctre glucide antreneaz o producie de alcool etilic care trebuie evitat, cele dou soluii posibile fiind evitarea excesului de substrat, lucrndu-se cu cultura in pat" i, respectiv, plasarea unui detector de alcool n efluentul de gaz (CO2), care permite s se cunoasc aportul de substrat ce trebuie furnizat. A doua situaie se ntlnete, de exemplu, la producia de culturi lactice, a cror dezvoltare este nsoit de formarea de acid lactic (bacterii homofermentative) sau alcool etilic/acid lactic (bacterii heterofermentative). Pentru a obine celule de bacterii n cantitate de 60 g/1, este necesar o dializ a culturii, tehnic ce se poate aplica i la fabricarea drojdiei de panificaie, n care caz celulele de drojdie se separ prin centrifugare iar laptele" de drojdie este reciclat. In acest fel se obin 130 g drojdie/1. Sistemele de fermentaie continu se pot clasifica dup natura biocatalizatorului (imobilizat sau nu, sistem eterogen sau nu, celule incluse, adsorbite, grefate prin covalen), gradul de reciclare al celulelor, gradul de amestecare a fluidelor reacionabile n reactorul continuu . Producia de enzime. Microorganismele produc o serie de enzime folositoare pentru industria alimentar i alte industrii, constituind deci surse de enzime. Producia de enzime va depinde de tipul de microorganism folosit i de condiiile de dezvoltare: compoziia chimic a mediului de cultur, pH, temperatur, adaosul de substane de inducere sau scderea cantitii de substane represoare n mediu. Enzimele produse de microorganisme sunt utilizate n industria alimentar pentru bioconversia unor substane n altele, dar i n alte scopuri (mbuntirea calitii produselor alimentare, creterea capacitii de conservare, creterea digestibilitii prin hidroliza enzimatic, ndeprtarea compuilor nedorii din materiile prime sau produse alimentare, mbuntirea tehnologiilor de prelucrare a produselor alimentare n sensul simplificrii, scurtrii procesului tehnologic i micorarea costurilor energetice etc Microorganismele intervin ns i n sens negativ: datorit capacitii lor patogene manifestat prin nsuirea de a ptrunde n organismul viu, se nmulesc n acest organism, secret toxine i anihilaz sistemele de aprare ale organismului viu. Nu trebuie neglijat nici capacitatea unor microorganisme de a elibera toxine (exotoxine) n mediul n care se dezvolt, inclusiv n produse alimentare - prin al cror consum se produc toxiinfecii alimentare.

33

1. BACTERIILE Dintre bacterii, cele mai importante, care se utilizeaz n industria alimentar, aparin urmtoarelor genuri: 1.1. Genul Streptococcus Gilliland mparte streptococii n patru grupe: Pyogenic (Str. aglactiae, Str. pyogenes), Viridans (Str. salivarum, Str. bovis, Str. thermophilus), Enterococous (Str. faecalis, Str. faecium, Str. durans), Lactic (Str. lactis, Str. cremons, Str. diacetilactis). Ali cercettori consider c grupul streptococilor lactici cuprinde doar specia Str. lactis cu 3 subspecii: Str. lactis subspecia lactis, Str. lactis, subspecia cremoris, numit uzual Str. cremoris i Str. lactis, subspecia diacetilactis (Str. diacetilactis). Streptococii lactici fermenteaz lactoza, zaharoza, maltoza la acid lactic, dezvoltndu-se bine pe un substrat proteic nutritiv care trebuie s conin peptide, aminoacizi i vitamine din grupul B. Toate speciile sunt homo-fermentative. Streptococii lactici se grupeaz n diplo sau sub form de lanuri, mai lungi la dezvoltarea n bulion i mai scurte la dezvoltarea n lapte. Habitatul obinuit l constituie laptele i produsele lactate. Str. lactis i Str. diacetilactis se izoleaz din laptele crud, iar Str. cremoris din produsele lactate acide. Str. thermophilus, inclus n grupa streptococilor Viridans de ctre Gilliland, este totui cooptat n grupa streptococilor lactici, dei nu se ncadreaz din punct de vedere serologic. Acesta este termofil (temperatura optim de dezvoltare 37 ... 45C), fapt care pledeaz pentru originea sa intestinal. Se poate dezvolta pn la 50C, dar nu i la 20C. Este sensibil la o concentraie de 2% NaCl n mediu, fermenteaz un numr redus de zaharuri (zaharoza, lactoza, glucoza). Nu fermenteaz maltoza. Pentru dezvoltare are nevoie de vitamine din grupul B dar nu i de purine i pirimidine. Metabolismul glucidelor cu producere de acid lactic ca produs final principal. Streptococii lactici fermenteaz lactoza prin transformare mai nti n glucoza i galactoz-6-P. Streptococii lactici dei sunt homofermentativi, n condiiile n care glucidele din substrat sunt limitate, formeaz produi finali de heterofermentaie. Activitatea proteolitic. Activitatea proteolitic a streptococilor este apreciat ca fiind mai slab dect a lactobacililor, fapt constatat prin determinarea azotului neproteic n laptele degresat inoculat cu Str. lactis. Se consider c diferitele tulpini de streptococi degradeaz foarte puin (sau chiar de loc) cazeina, dei anumii streptococi (Str. cremoris) produc att peptidaze extra-celulare ct i intracelulare. Enterococii. Grupul enterococilor cuprinde speciile Streptococus faecalis, Streptocccus faecium i Streptococcus durans. Se dezvolt la 10C dar i la 45C. Str. durans i Str. faecium se gsesc n brnzeturile fabricate din lapte crud, ultimul posednd i o bun activitate acidifiant. Prin proteoliza cazeinei stimuleaz dezvoltarea bacteriilor din genul Leuconostoc. Str. faecium i Str. durans se utilizeaz la fabricarea brnzei Cheddar n S.U.A. n scopul accelerrii maturrii. 1.2. Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu form sferic, lenticular, grupate n perechi sau lanuri, imobile, asporogene, gram negative, facultativ anaerobe, catalazo-negative, heterofermentative. Au nevoie pentru dezvoltare de vitamine (acid nicotinic, acid pantotenic, tiamin, biotin) i zaharuri fermentescibile. Specii de leuconostoc formeaz polimeri glucidici (dextran). Nu snt proteolitici, nu reduc azotaii. Se dezvolt bine la temperaturi cuprinse ntre 20 i 30C. Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc lactis, Leuconostoc paramezenteroides i Leuconostoc mezenteroides, acesta din urm cuprinznd subspeciile Leuconostoc citrovonim (Leuconostoc cremoris) i Leconostoc dextranicum. Intre specii exist diferene n ceea ce privete

34

zaharurile fermentate, datorit prezenei sau absenei unor enzime implicate n metabolismul glucidic. Leuconostoc citrovonim fermenteaz lactoza, galactoza i glucoza. Cu excepia lui Leuconostoc lactis, cele mai multe specii se dezvolt greu n laptele fr adaos de substane stimulatoare Intr-un mediu nutritiv complex, muli leuconostoci se dezvolt bine la o incubare de 1012 ore, la 30C. Leuconostoc citrovorum constituind o excepie, deoarece multe tulpini necesit 23 zile de incubare la 30C. Adugarea de cistein n mediu i intensific dezvoltarea. Toi leuconostocii au nevoie pentru cretere de valin i glutamat, muli au nevoie de alanin, metionina fiind stimulatorie pentru alte multe specii. Metabolismul glucidelor. Fermentarea glucidelor de ctre leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoz, rezultnd cte un mol de lactat, alcool etilic i CO2. Metabolismul citratului. Metabolismul citratului la Leuconostoc este acelai ca i la Str. diacetilactis, cu meniunea c leuconostocii produc acetoin i diacetil la pH sczut. Calea de metabolizare a citratului este artat n figura urmatore. Acetoina se poate forma pe dou ci: prin decarboxilarea acetolactatului i din diacetil prin intermediul diacetilreductazei. Aceast ultim cale este redus sau lipsete la Str. diacetilactis, din cauza capacitii limitate a acestuia de a produce acetil-CoA, unul din precursorii diacetilului. Leuconostocii se utilizeaz la fermentarea unor produse vegetale (varz, castravei msline), intervenind n cadrul microflorei spontane sau ca culturi starter, la fermentarea malo-lactic a vinurilor, pentru producerea de dextran etc. O utilizare mai mare a leuconostocilor are loc in industria laptelui pentru fabricarea unor produse lactate fermentate (lapte acru, smntn fermentat pentru consum sau destinat fabricrii untului, brnzeturilor). In acest caz se folosesc culturi lactice care pe lng streptococi acidifiani (St. lactis, Str. cremoris) conin i bacterii productoare de arom i anume specii de Leuconostoc, inclusiv Str. diacetilactis care este deopotriv aromatizant i acidifiant. Bacteriile aromatizante ndeplinesc dou funcii majore: formeaz compui de arom (diacetil, acetoina, acetat etc.) i produc CO2 care determin apariia aa-numitelor ochiuri" n unele tipuri de brnzeturi (Edam, Gouda, Tilsit etc.). Ambele funcii sunt consecina metabolizrii citratului ns sunt specii de Leuconostoc care produc CO2 i din lactoz. Leuconostocii ca i lactobacilii, pot produce uneori defecte la brnzeturi: crparea pastei la brnza Cheddar (defect numit Blit openness"), apariia timpurie de gaze la brnza Gouda. Str. diacetilactis poate produce defectul de plutire a coagulului" la brnza cottage. Toate aceste defecte se datoresc formrii de CO2. Pentru a preveni defectul de plutire a coagulului", brnza cottage se fabric cu o cultur care nu conine bacterii aromatizante, adugndu-se apoi, n brnza obinut, o cultur de Leuconostoc citrovorum cultivat pe lapte cu adaos de citrat, sau o cultur concentrat de Leuconostoc citrovorum. 1.3. Genul Pediococcus Aparine familiei Streptococaceae i cuprinde bacterii sub form de coci perechi sau tetrade, ca rezultat al diviziunii alternative pe cele dou planuri perpendiculare. Sunt imobile, asporogene. Metabolismul lor este predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid lactic racemic (DL) din glucoza, fructoz i manoz, sorbitolul i amidonul nefiind fermentate. Nu lichefiaz gelatina i nu reduc azotaii la azotii. Sunt anaerobi microaerofili i au necesiti nutritive complexe. Multe specii sunt catalazo-negative. P. acidilacti este utilizat pentru produsele de carne fermentate la temperaturi mai ridicate, deoarece are dezvoltare bun la 40 ... 52C, producnd rapid acid lactic i deci scade efectiv pH-ul, produsul obinut avnd gust acrior. Atunci cnd se utilizeaz la fermentarea unor produse ce se menin la temperaturi mai sczute (15 ... 27C), producia de acid lactic este mai lent. Avnd n vedere c pediococii produc acid lactic, antibiotice i/sau bacteriocine, ei exercit i o aciune inhibitoare fa de microorganismele patogene i cele de alterare. 1.4. Genul Lactobacillus

35

Aparine familiei Lactobacilaceae conform manualului lui Bergey. Aceast familie cuprinde bacterii sub forma de bastonae de lungimi i grosimi variabile precum i cocobacili scuri, aezai obinuit n lanuri n faza de nmulire logaritmic. Sunt asporogene, imobile, gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. n general sunt catalazo-negative, citocrom oxidazonegative, nu reduc azotaii, nu lichefiaz gelatina. Au activitate proteolitic i lipolitic redus. Glucidele cele mai bine fermentate snt lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales n faza de dezvoltare), apoi hexozele (glucoza fructoza, galactoza). Pentru dezvoltare necesit substane minerale i toate vitaminele din grupul B. Se dezvolt bine n medii cu pH = 5,5 5,8 dar i la pH < 5. Se pot dezvolta n limite largi de temperatur (5 ... 53C), dar temperatura optim este cuprins ntre 30 i 45C. n funcie de temperatura optim de dezvoltare, lactobacilii pot fi termofili (L. lactis, L. helveticius, L. acidophilus), temperatura optim fiind 37...45C i mezofili (L. casei, L. plantarum), temperatura optim fiind 28...30C. Ambele grupe de lactobacili snt homofermentative. Unii autori au clasificat streptobacteriile n acidorezistente i neacidorezistente. Lactobacilii neacidorezisteni produc compui aromatici (diacetil, aceton), ceea ce nseamn metabolizarea divers a acidului piruvic. Produc de dou ori mai mult diacetil i acetoin dect cei acidorezisteni. Se prezint sub form de bastonae cu lungime variabil. Rar formeaz lanuri. Se pot dezvolta la 2...15C. Nu se dezvolt la pH 5,6. Se utilizeaz la fermentaia salamurilor crude cu pH = 5,9 6,1, produsele obinute avnd durata mare de maturare, iar gustul final este dulceag. Streptobacteriile acidorezistente au forma de bastonae care formeaz lanuri. Se dezvolt bine la pH < 5 i din aceast cauz se utilizeaz la fabricarea salamurilor crude cu maturare scurt. Metabolismul lactozei. Lactobacilii hidrolizeaz lactoza cu ajutorul -galactozidazei i fosfo- -galactozidazei . Dac Lactobacillus casei folosete pentru hidroliz lactozei fosfo- galactozidaza, majoritatea lactobacililor (Lactobacillus bulgaricus, lactis, helveticus) folosesc mai mult -galacto-zidaza. Aceast enzim, n cazul lui Lactobacillus bulgaricus, are optimul de pH l= 7 i este activat de Mg, Mn, Fe. In cele mai multe cazuri, lactobacilii prefer glucoza ca surs de energie n comparaie cu lactoza sau galactoza. Unii lactobacili elibereaz din celul galactoz obinut din lactoza, ceea ce conduce la acumularea galactozei n mediul de cultur. Pentru a fi fermentat galactoz este transformat n glucozo-6-P iar aceasta este metabolizat n continuare pe cale homo- sau heterofermentativ. Activitatea proteolitic a lactobacililor. Dei lactobacilii nu snt considerai proteolitici", ei i pot obine azotul necesar dezvoltrii din proteinele laptelui. Se consider c activitatea endopeptidazic a lactobacililor este asociat cu peretele celular iar activitatea exopeptidazica este localizat intracelular. Enzimele de suprafa produc hidroliz parial a moleculelor mari de proteine din care se formeaz peptide suficient de mici pentru a putea fi transportate n interiorul celulei unde exopeptidazele continu degradarea lor pn la aminoacizii necesari creterii. Activitatea proteolitic a lactobacililor este optim la 45...50C i la pH = 5,25,8. Enzimele snt complet inactivate prin nclzirea culturii la 70C, timp de l min. In industria laptelui se utilizeaz Lactobacillus bulgaricus i Lactobacillus lactis, singuri sau n amestec, la fabricarea iaurtului, chefirului, brnzei Emmenthal, brnzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus este i el implicat n unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat i a altor produse acidofile. Lactobacillus casei se utilizeaz pentru obinerea produsului japonez denumit yakult. Pentru industria crnii intereseaz L. sake, L. curvatus dar n special L plantantm care se difereniaz de celelalte specii ale genului Lactobactllus (29 specii), prin faptul c nu produce CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat. Alte utilizri. Lactobacilii intereseaz i n fermentarea mslinelor, n fermentaia produselor vegetale (varz, castravei), n producia spirtului si a drojdiei presate n vederea acidificrii plmezilor, la fabricarea unor produse de cereale (braga, cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare.

36

1.5. Genurile Micrococcus i Staphylococcus Aparin familiei Micrococcaceae care cuprinde bacterii sub form de coci cu = 0,30,5 ., cu diviziune n mai multe planuri, formnd grmezi sau pachete. Pot fi mobile sau imobile, asporogene, gram-pozitive, cu metabolism respirator sau fermentativ, catalazo-pozitive, aerobe sau facultativ anaerobe. Se pot dezvolta n medii coninnd 15% NaCl. Produc acizi din glucoza fr a produce gaze. Pentru industria crnii intereseaz anumite specii de micrococi i stafilococi care snt folosite pentru capacitatea lor de a reduce azotaii i azotiii (contribuie la formarea culorii), pentru activitatea lor catalazic, de acidificare, proteolitic i lipolitic. Dintre speciile de micrococi, mai des utilizate snt Micrococcus aurantiacus i Micrococcus varians. n industria laptelui, micrococii formeaz partea principal a populaiei nelactice din lapte i brnzeturi, tulpini aparinnd genului Micrococcus utilizndu-se pentru maturarea laptelui destinat brnzeturilor. Micrococcus freudenreichii, izolat din brinza Cheddar fabricat din lapte crud, a fost ulterior folosit n scopul accelerrii formrii aromei brnzei fabricate din laptele pasteurizat, datorit activitii proteolitice i lipolitice. In scopul accelerrii maturrii unor brinzeturi cu past presat s-a ncercat adugarea n lapte a proteazelor produse de micrococi (s-a folosit Rulactina, o metaloproteaz cu activitate strict endopeptidazic, produs de o tulpin de Micrococcus caseolyticus). Combinaiile de micrococi i stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazic i catalazic. Staphylococcus carnosus acioneaz mai bine dect micrococii n formarea culorii crnii, reducnd azotaii la azotii si respectiv azotiii la oxid de azot, chiar n condiii de aciditate ridicat a substratului. Aroma produselor la care este utilizat cultura starter de Staphylococcus carnosus este superioar. Combinaia L. pentosus + Staphylococcus carnosus se comport mai bine dect combinaia L. plantarum + Staphylococcus carnosus, deoarece L. pentosus produce mai rapid i mai intens acid lactic n comparaie cu L. plantarum. 1.6. Genul Propionibacterium La fabricarea unor tipuri de brnzeturi (Emmenthal, Swiss, Gruyere) caracterizate prin prezena ochiurilor" n past i printr-o anumit arom se folosesc bacterii din genul Propionibacterium, alturi de bacterii lactice. Acestea sunt folosite i pentru producia de vitamin B12, a acidului propionic, a unor buturi lactate. Sunt gram-pozitive, nesporulate sub form de bastonae imobile, cu un capt rotunjit i cellalt ascuit i colorat mai slab. Celulele unor culturi pot fi sub form de coci, elongate, bifurcate sau chiar ramificate. De obicei, celulele snt singure, perechi, sau se aranjeaz n configuraii V, Y, lanuri scurte sau ngrmdiri.

2 . DROJDIILE
Drojdiile, ciuperci unicelulare care se nmulesc prin nmugurire, mai rar prin sciziparitate i care formeaz ascospori (sunt i drojdii care nu fac spori, acestea denumindu-se drojdii false-torule i micoderme) sunt ageni tipici ai fermentaiei alcoolice. Se prezint sub form de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces ellipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei lmi (Saccharomyces apculatus), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub form de cilindru (Pichia). La unele specii, ca rezultat al procesului de nmugurire, celulele de nmugurire rmn ataate de celula mam i, nmugurind la rndul lor, formeaz un pseudomiceliu, asemntor n structur cu cea a amilopectinei, component a amidonului. Desigur, forma drojdiilor este n funcie de vrsta i condiiile de cultur. Pe medii solide, drojdiile formeaz colonii caracteristice speciei. Dintre drojdii intereseaz (n sens util) cele aparinnd familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite n industria berii, vinului i pinii, genul

37

Kluyveromyces care fermenteaz lactoza (levuri ale laptelui), genul Debaryomices care se utilizeaz n industria crnii. Mai intereseaz drojdiile aparinnd familiei Criptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca ageni de fermentaie i ca productori de biomas. Cea mai larg utilizare a drojdiilor este cea de a produce fermentaie alcoolic. Acestea snt de fapt drojdiile adevrate" care aparin genului Saccharomyces (Meyen) Rees i care se caracterizeaz prin aceea c nu formeaz miceliu tipic, produc l-4 spori, iar puterea de fermentare depete puterea de respiraie. Sunt adaptate la condiii de anaerobioz i, prin urmare, nu formeaz voaluri la suprafaa lichidelor. Acestea sunt de fapt drojdii cultivate, izolate i selecionate prin culturi n scopuri utile-industriale i se deosebesc de cele care i-au pstrat caracterele primitive, fiind cunoscute sub denumirea de drojdii slbatice. Drojdiile, dup modul lor de comportare n timpul fermentaiei, pot fi grupate n drojdii de fermentaie superioar i drojdii de fermentaie inferioar. Cele de fermentaie superioar se ridic n cantitate mare la suprafa n spuma care acoper lichidul de fermentare, au optimul de temperatur la 28 ... 30C i fermenteaz numai la 1/3 din rafinoz. Drojdiile de fermentaie inferioar nu se ridic la suprafa dect n cantitate mic, au optimul de temperatur la 8 ... 12C i fermenteaz complet rafinoz. Zaharurile fermentate de drojdii sunt triozele (aldehida gliceric i dioxiacetona), aldohexozele (D-glucoza, D-manoza i D-galactoza), cetohexozele (D-fructoza). Dii trizaharidele sunt fermentate n msura n care drojdiile respective conin enzimele necesare transformrii acestora n zaharuri simple. Poliglucidele nu sunt transformate de drojdii. Excepie fac Saccharomyces fragilis care fermenteaz inulina i Endomycopsis fbuligerea care fermenteaz amidonul. Fermentaia alcoolic produs de drojdii este influenat de concentraia zaharului fermentescibil n must sau plmad, temperatur, coninutul n alcool i felul drojdiei. Concentraia favorabil de zahr fermentescibil n must sau plmad este de 1015%. Fermentaia alcoolic se desfoar bine la pH = 44,5, n mediu alcalin sensul fermentaiei fiind schimbat. Viteza maxim a fermentaiei este la 30C, dar n practic aceasta se realizeaz la temperaturi cuprinse ntre 4 i 28C. Alcoolul, pe msura acumulrii n mediu, devine toxic pentru drojdii. Exist rase de drojdii care se dezvolt la 1618% alcool, ns n cele mai multe cazuri fermentaia se oprete la 1214% alcool. O dat cu creterea temperaturii de fermentare se mrete toxicitatea alcoolului. Fermentaia alcoolic este un proces anaerob. Dac drojdiile se cultiv n aerobioz pe substraturi adecvate, ele se nmulesc foarte mult i deci produc biomas. Fermentaia alcoolic nu este o fermentaie absolut pur. Chiar n cazul unei fermentaii alcoolice normale, n afar de alcoolul etilic iau natere glicerina (produs secundar predominant care se formeaz din ~ 8% din totalul zaharurilor existente in mediu), acid lactic, acid acetic, substane acetoinice (acetil metil carbinol = acetoin i diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic, amilic, care provin din aminoacizi rezultai la degradarea substanelor proteice din plmezi i musturi. Aceti alcooli superiori se formeaz prin reacii de dezaminare i decarboxilare ale aminoacizilor leucin, izoleucin i valin. De remarcat c n funcie de modul de dirijare al fermentaiei alcoolice, (pH, substane adugate), fermentaia alcoolic poate fi deviat substanial de la cursul normal". De exemplu, n prezen de acid sulfuros sau bisulfit se produce mult glicerina. Acelai lucru se ntmpl dac pHul este alcalin. Fermentaia alcoolic se aplic n mod deosebit la fabricarea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secar), produse care conin zaharoz (sfecl, melas), lactoza (zer), glucoza (hidrolizate celulozice, leii sulfitice). Fermentaia alcoolic st la baza fabricrii vinului i berii.

38

Drojdiile sunt folosite pentru obinerea de biomas (inclusiv drojdia de panificaie), pentru producere de glicerina, grsimi, buturi fermentate lactate i pe baz de cereale i leguminoase, ct i pentru producia unor enzime (lactaz, invertaz). Dintre drojdii, n industria crnii se folosete Debaromyces hansenii care este tolerant la clorur de sodiu, nu reduce azotatul i necesit oxigen atmosferic pentru multiplicare. Se dezvolt bine n straturile periferice ale salamului neafumat sau puin afumat. Are capacitatea de a consuma oxigenul din past i de a distruge peroxizii formai de unele bacterii lactice. In cazul brnzeturilor, drojdiile se dezvolt rapid la suprafaa brnzeturilor i n interiorul brnzeturilor cu pasta moale sau cu mucegai n past, n timpul presrii, zvntrii i maturrii, avnd urmtoarele aciuni pozitive: consum lactatul i n acest fel contribuie la neutralizarea pastei, mbuntind prin aceasta consistena i favoriznd implantarea bacteriilor; produc factori de cretere pentru dezvoltarea bacteriilor ; produc o acoperire" la anumite tipuri de brnzeturi (Roquefort); produc proteoliz i lipoliz i prin urmare contribuie la consistena i aroma brnzei ; produc compui volatili de arom. Dintre drojdii, Candida kansei a fost cultivat n asociaie cu lactobacili i Str. thermophilus, favoriznd prin oxidarea lactatului scderea potenialului de oxidoreducere i producerea de factori de cretere, dezvoltarea culturilor starter n care este asociat. Drojdia Candida lipolitic este uneori folosit la fabricarea brnzeturilor cu mucegai n past, datorit faptului c prin lipazele coninute realizeaz o hidroliz a grsimilor din brnz, fapt ce favorizeaz utilizarea acestora de ctre Penicillium. 3. MUCEGAIURILE Mucegaiurile snt cuprinse n patru clase mari din care, pentru industria alimentar, intereseaz Phycmycetes. Din clasa Phycomycetes, intereseaz (n sens pozitiv), genurile Mucor i Rhizopus, aparinnd familiei Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se ntlnesc pe diferite produse vegetale i alimentare, sub form de colonii pufoase, au o aciune fcrmentativ net. In afar de faptul c unele specii de Mucor i Rhizopus se folosesc la obinerea unor produse alimentare fermentate, mucegaiurile aparinnd acestor genuri sunt surse importante de enzime, n principal, amilolitice i proteolitice. Din clasa Ascomycetes genurile Aspergillus i Penicillium. Dac mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizeaz mai puin la fabricarea unor produse alimentare (de exemplu unc S.U.A. i Spania), obinerea de produse fermentate tradiionale din Orientul ndeprtat, aceste mucegaiuri au o larg utilizare n obinerea de preparate enzimate amilazice, proteazice, pectolitice. Mucegaiurile din genul Penicillium sunt mult utilizate n industria laptelui (brnzeturilor), crnii (salamurilor crude), dar i ca surse de enzime amilolitice, proteolitice i pectolitice. Genul Mucor cuprinde specii cu aparatul vegetativ dintr-o singur celul puternic ramificat, cu numeroase nuclee. Majoritatea speciilor sunt saprofite, prefernd ns medii uor acide, bogate n zahr. Se nmulesc pe dou ci: asexuat i sexuat. In primul caz sporii se formeaz n sporangi rotunzi sau piriformi lipsii de apofize, aflai la extremitatea unor prelungiri simple sau ramificate numite sporangiofori. Genul Rhizopus se deosebete de Mucor prin faptul c sporangioforii simpli neramificai, pornesc mai muli din acelai loc iar sporangii au apofize. Genul Aspergillus cuprinde specii pluricelulare care produc pe suprafaa substraturilor psle colorate. Speciile acestui gen au conidiofori unicelulari cu extremitatea aproape sferic, pe suprafaa crora se afl prelungiri sterigme ce produc iraguri de conidii. Genul Penicillium se deosebete de Aspergillus prin conidiofori pluricelulari ramificai n form de penson.

39

n industria crnii, culturile starter de spori de mucegai se utilizeaz la maturarea unor tipuri de unc i a unor tipuri de salamuri crude fabricate n Romnia, Italia, Ungaria, Elveia, Spania, Frana, Bulgaria, Austria, Belgia, R.F.G. (i mai puin n S.U.A., Israel, Iugoslavia, Polonia) In cazul salamurilor crude afumate sau neafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la reglarea eliminrii apei din produs i a schimbului de gaze, la formarea aromei i la aspectul comercial al produsului. Aroma este, n general, mai evident la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de acoperire intact sau dup periere". Culoarea miceliului rmas este dependent de varietatea mucegaiului folosit, n Italia se prefer o culoare alb-ivorie, n Ungaria o culoare gri, n Romnia o culoare alb-mat. Prin utilizarea culturilor starter de spori de mucegai, se suprim apariia pe salamuri a mucegaiurilor toxicogene , precum i a mucegaiurilor de ptare" (care produc spoturi de culoare verde sau neagr), n special a mucegaiului Penicillium stoloniferum . 3.1. Penicillium nalgiovensis Tulpina selecionat de Penicillium nalgiovensis este cea mai frecvent utilizat pentru nsmnarea de suprafa a salamurilor crude, deoarece acoper n mod uniform si rapid produsul cu miceliu de culoare alb din care se dezvolt condiofori purttori de conidii (spori). Acoperirea cu miceliu a produsului are loc dup 34 zile de la nsmnare cu spori, iar corpii de fructificaie cu condii apar dup 56 zile de la nsmnare. Temperatura optim de dezvoltare a acestui mucegai este de 22 ... 23C. 3.2. Penicillium expansum Penicillium expansum se dezvolt bine la 22C, umiditatea relativ pentru sporulare fiind de 82%, pentru germinare 88%, iar pentru dezvoltare 9295%. Dup nsmnarea batoanelor cu spori, produsul depozitat n ncperi cu ~ 90% umiditate se acoper cu un strat compact i pufos de miceliu, dup aproximativ 8 zile; maturizarea deplin a mucegaiului (produs gata pentru periere) are loc dup 30 zile de la nsmnare. Penicillium expansum nu produce micotoxine, dac substratul conine proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude). In industria laptelui culturile fungice sunt necesare att n fabricarea brnzeturilor cu mucegai n past ct i cu mucegai la suprafa. Pentru brnzeturile cu mucegai n past (brnza Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Gammelost etc.) se utilizeaz tulpini de Penicillium roqueforti. Pentru brnza de tip Camembert, cu mucegai la suprafa, se folosesc dou specii de Penicillium: P. camemberti i P. caseicolum. Aceste mucegaiuri au un rol fundamental n formarea aromei, consistenei i aspectului brnzeturilor respective, prin procesele de proteoliz i lipoliz pe care le realizeaz. 3.3. Penicillium roqueforti Thom Acest mucegai crete n colonii cu aspect pufos, catifelat, azonate, n general subiri, cu conidiofori scuri i abundeni, cu marginea cu aspect arhnoid, stelat sau ca o reea. Conidiile sunt lungi, de culoare galben-verzui nchis, adesea verzui, pn aproape de negru pe spatele coloniei. Tolereaz cantiti mari de NaCl (58%) n mediu acid i se poate dezvolta ntr-o atmosfer coninnd doar 5% oxigen. Se dezvolt bine la temperaturi de 20 ... 25C (dar nu i la temperaturi > 35C), pe medii cu umiditate ridicat. Dezvoltarea abundent a miceliului are loc la pH = 4,57,5. Mucegaiul poate folosi sulfatul de amoniu ca singura surs de azot. Nu utilizeaz aminoacizii leucin, cistein i metionin. Produce enzime proteolitice i lipolitice, substratul avnd o deosebit influen asupra activitii enzimatice. Prin cultivarea pe medii mbogite n grsime se obine o cultur cu puternic activitate proteolitic i lipolitic, acizii grai eliberai fiind transformai n compui carbonilici i n special metilcetonele rezultate prin -oxidarea acizilor grai. Datorit echipamentului enzimatic proteolitic, coninutul n aminoacizi liberi din brnzeturi crete simitor. P. roqueforti se dezvolt n canalele i golurile practicate n pasta brnzeturilor moi, producnd spori de culoare verde-nchis i astfel confer brnzei respective aspect marmorat.

40

Cercetrile efectuate la Universitatea din Wisconsin, asupra toxinogenezei lui Penicillium roqueforti, au pus n eviden faptul c acest mucegai produce PR-toxina, nociv pentru obolani la care induce modificri histologice la nivelul ficatului, rinichiului precum i hemoragii, fenomene tremorgene, avorturi i retenia placentei la mamifere. Pe ling PR-toxin, n miceliul de Penicilliiim roqueforti, s-au pus n eviden i doi alcaloizi asemntori cu cei produi de ctre ergot: roquefortina i izofumigaclavina. Aceti doi alcaloizi au fost pui n eviden i n brnzeturile fabricate cu Penicillium roqueforti, n proporie de 0,666,8 mg/kg produs. Ambele substane posed aciune neurotoxic. Roquefortina are DL50 = 1520 mg/kilocorp la oareci (administrare prin injectare intraperitoneal). 3.4. Penicillium camemberti i Penicillium caseicolum Aceste dou specii de mucegai sunt strns nrudite i sunt utilizate n producia brnzeturilor de tip Camembert, incluznd Camembert, Brie, Neufchtel, Coulommier, Garre de l'Est, Olivet. Tulpinile au fost izolate de pe brnzeturi sau din camerele (pivniele) de maturare a brnzeturilor. Dei strns nrudite, cele dou specii P. camemberti Thom i P. caseicolum Bainer se deosebesc ntre ele prin caracteristicile fiziologice i biochimice. Penicillium camemberti Thom denumit i Penicillium album se utilizeaz pentru obinerea de brnz tip Camembert cu textur mai untoas, mai parfumat, dar de culoare gri-alburie. Penicillium caseicolum Bainer, denumit i Penicillium candidum, se utilizeaz pentru obinerea de brnz tip Camembert cu o textur mai compact, arom mai delicat i o culoare albimaculat.

CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

DEFINITIE Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obin plecnd de la cultur pur stoc i care prin trecere prin culturi intermediare devin apte de a fi folosite pentru producia unor alimente fermentate.Culturile starter pot fi formate dintru-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme. Culturile starter sunt utilizate n vederea: dirijrii unor procese biochimice prin care se asigur produsului un anumit grad de inocuitate(inclusive capacitatea de conservare) asigurrii unor nsuiri senzoriale asigurrii unor nsuiri nutritive La folosirea culturilor starter n industria alimentar trebuie s se aib n vedere urmtoarele : s aib o anumit concentraie de microorganisme pe unitatea de produs i un numr ct mai redus de germeni nedorii. produii de metabolism primari i secundari s nu prezinte pericol pentru sntatea oamenilor. s nu conin i s nu produc antibiotice care se utilizeaz n scop terapeutic la om. s aib anumite activiti specifice:producerea alcoolului, acidului lactic, reducerea azotului. microorganismele existente s fie declarate cu numele tiinific ntreg

41

speciile(suele) noi, care se introduce n producie, trebuie s fie nregistrate la Ministerul Sntii i s fie depozitate n colecii cu nomenclator; nainte de introducerea n producie s fie testate din punct de vedere al inocuitii, n conformitate cu legislaia n vigoare. speciile care pe baza noilor cunotine tiinifice au fost recunoscute ca avnd potenial patogen sau toxicogen, trebuie s fie supuse unui control riguros pentru fiecare su, realizndu-se studii de de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate i mutagenitate. Toate cele menionate trebuie s constituie ca o obligativitate absolut , deoarece:

culturile starter se pot consuma odat cu produsul alimentar, n stare vie cum este cazul produselor lactate acide , brnzeturilor i salamurilor crude , unele sortimente de bere, unele produse vegetale fermentate(varz murat, castravei murai , msline); culturile starter se pot consuma dup distrugerea lor, rmnmd n produsul alimentar att ele ct i produii lor de metabolism , aa cum este cazul brnzei proaspete de vaci i a iaurturilor care au fost pasteurizate, produsele de panificaie;

produsele de metabolism se consum odat cu produsele alimentare , ns microorganismele sunt eliminate n cea mai mare parte, aa cum este cazul berii , vinului, alcoolului alimentar , oetului;

1. CULTURI STARTER DE BACTERII LACTICE Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite n diferite domenii: industria laptelui, industria crnii, a produselor vegetale murate, a vinului,a panificaiei,a sucurilor de fructe i legume fermentate. Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigur produselor alimentare n care se introduce un anumit grad de inocuitate , deoarece bacteriile lactice produc: acizi organici , n special acid lactic, acid acetic, alcool, CO2 substane bacteriocine eliberate n mediul de cultur peroxizi ( H 2O2) In plus, bacteriile lactice intr n competiie cu bacteriile patogene i cu cele de alterare n ceea ce privete consumul de substane nutritive, iar datorit acidifierii mediului, consecin a acumulrii acizilor organici, bacteriile patogene i de alterare sunt inhibate n dezvoltarea lor(stafilococi,salmonele, etc.). Datorit aciditii se inhib i dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitic i decarboxilazic, deci se formeaz cantiti mai mici de amine biogene, iar n cazul crnurilor srate mai puine nitrozamine. 1.1CULTURI STARTER UTILIZATE IN INDUSTRIA LAPTELUI La obinerea culturilor starter trebuie s se aib n vedere , n mod deosebit urmtoarele : - mediul de cultur - tratamentul termic aplicat laptelui - condiiile de incubare - interaciunile dintre speciile din cultura starter - eventualele infectari cu bacteriofagi - instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice 1.1.1 LAPTELE MEDIU DE CULTURA PENTRU CULTURI STARTER In ceea ce privete mediul de cultur laptele, se menioneaz faptul c,acesta nu este un mediu ideal pentru dezvoltarea bacteriilor lactice din dou motive:

42

Laptele crud nu are un coninut optim de substane nutritive azotate, vitamine i ali factori de cretere, indispensabili bacteriilor lactice . Exist diferene genetice ntre specii i sue n ceea ce privete utilizarea lactozei i galactozei. Astfel, culturile starter de iaurt (Lactobacillus bulgaricus i Str.thermophilus) produc mai rapid acid lactic, dac lactoza a fost n prealabil hidrolizat cu -galactozidaz. Din lapte, Lb.bulgaricus folosete numai glucoza. De asemenea, azotul neproteic din lapte nu este satisfctor cantitativ pentru bacteriile lactice care trebuie s posede activitate proteolitic pentru a hidroliza proteinele n scopul eliberrii aminoacizilor necesari pentru nutriia azotat. In aceast direcie exist diferene ntre specii i tulpini. Tulpinile lente utilizeaz azotul neproteic, dar se dezvolt greu.Tulpinile rapide, utilizeaz peptidele hidrolizate de ele, deoarece posed echipament proteolitic puternic. In fapt, diferenele dintre tulpinile lente i rapide, constau n absena i, respective prezena unor plasmide care conin gene ce codific sinteza de peptihidroloze (proteinaze i peptidase).Tulpinile lente au pierdut aceste plasmide cnd celulele s-au divizat n cursul dezvoltrii, iar cele rapide le-au pstrat.Aceast situaie poate aprea i n cazul utilizrii lactozei. Tipul de protein din lapte, are influen, de asemenea, asupra dezvoltrii bacteriilor lactice. Astfel, Lb.bulgaricus utilizeaz preferenial -cazeina ca surs de azot, n timp ce leuconostocii prefera azotul dintru-un extract de drojdie. Tipul de aminoacizi folosii este diferit n funcie de specie. Streptococii folosesc valina, glicina, histidina, izoleucina, n timp ce leuconostocii prefer valina i glutamatul. In general, laptele conine 20% din totalul aminoacizilor i peptidelor necesare dezvoltrii optime a leuconostocilor i streptococilor. Adaosul de substane stimulatoare sub form de extract de drojdie, extract din pancreas, sirop de porumb, suc de tomate, are drept scop mbogirea mediului de cultur, laptele, cu factori stimulatori: aminoacizi, vitamine, substane minerale sau enzime proteolitice necesare hidrolizei iniiale a proteinelor din lapte. In cazul bacteriilor lactice de aromatizare este necesar prezena n mediul de cultur a citratului i a ionilor de Mg2+ i Mn2+. b) Laptele crud conine o serie de inhibitori naturali, cum ar fi lactotransferina, care exercit actiune bacteriostatic asupra tulpinilor care necesit prezena fierului n mediul de reacie, lactoperoxidaza care manifest actiune bacteriostatic faa de strptococi, lizozimul care are aciune bactericid faa de toate bateriile lactice.
a)

1.1.2 TIPURI DE CULTURI STARTER UTILIZATE IN INDUSTRIA LAPTELUI Culturile starter utilizate n industria laptelui pot fi clasificate n: mezofile i termofile. Culturile starter mezofile pot fi singulare, multiple i mixte. Culturile starter singulare (single strain starter) conin numai Str.lactis subspecia lactis , respective Str.lactis subspecia cremoris, ambii homofermentativi, care produc acid lactic (L+) n proporie de 0.8%. Folosirea acestor culturi starter singulare a aprut ca o necesitate de a evita formarea ochiurilor de fermentare la unele brnzeturi. Culturile starter singulare prezint urmtoarele avantaje: Se poate utiliza continuu aceeai clutur cu activitate relativ constant i previzibil Nu este necesar alternarea culturilor, eliminndu-se riscul deprecierii acestora de bacteriofagi Se folosesc cantitti mici de inocul pentru obinerea de cultur primar i secundar Influenele sezoniere ale compoziiei laptelui sunt reduse Se creeaz condiiile unei producii standardizate de produse lactate (consistena calitii produsului)

43

 Cultura poate fi controlat i supravegheat din punct de vedere al caracteristicilor sale Culturile starter mezofile prezint, urmtoarele dezavantaje: Pot fi depreciate de tulpinile productoare de bacteriocine Pot suferi pierderi de plasmide, deci pot pierde una sau mai multe funcii metabolice Culturile starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazeaz pe folosirea a 5-6 tulpini selecionate, nenrudite pe plan fagic i cultivate separat pn la stadiul de cultur primar sau pn la stadiul de cultur starter de producie, cnd se amestec ntre ele. In aceste condiii, tulpinile nu se dezvolt mpreun dect cel mult 10 generaii, ceea ce face ca nici o tulpin s nu devin predominant. Culturile starter mezofile mixte sunt formate, de regul, din dou tipuri de bacterii lactice: Bacterii lactice acidifiante: Str.lactis sau Str. Cremoris Bacterii lactice productoare de arom: Str.diacetilactis sau specii de leuconostoci. Pentru a avea o arom corespunztore trebuie s se aib n vedere urmtoarele: - temperatura optima pentru leuconostoci este de 24-27oC , cu o durat a unei generaii de 3.2 ore la 26 oC i 3.5 ore la 22 oC. Str. cremoris are durata unei generaii de 1.5 ore la 22 oC, ceea ce nseamn c exist posibilitatea ca streptococii s domine leuconostocii n culturile starter mixte, de unde se impune condiia s existe un anumit raport ntre streptococci/leuconostoci. - dup producerea diacetilului, acesta se poate transforma n acetoin, respectiv 2,3 butilenglicol cu pierderea semnificativ a aromei Culturi starter termofile pot fi: acidulante: Lb.acidophilus acidulante aromatizante, care la rndul lor pot fi constituite din una sau mai multe specii de lactobacili i dintr-o specie de streptococci. Din aceast categorie se ntlnesc: -cultur starter termofil pentru iaurt : Lb. bulgaricus i Str.thermiphilus -cultur starter termofil pentru brnzeturi: Lb. bulgaricus +Lb.lactis+Lb.helveticus+ Str.thermophilus. Utilizarea culturilor starter temofile este benefic deoarece: produc acid lactic, deci scade pH-ul laptelui i determin coagularea acestuia (iaurt); la brnzeturi acidifierea favorizeaz eliminarea zerului din coagul au activitate proteolitic i contribuie la mbuntirea proprietilor reologice i la aroma produselor fermentate; produc aminoacizi prin proteoliz care stimuleaz dezvoltarea bacteriilor lactice produc compui de arom , aldehid acetic i urme de acetoin produc substane cu caracter filant care influeneaz vscozitatea produsului(Str.termophilus n cultura pentru iaurt) produc bacteriocine produc ap oxigenat (Lb.bulgaricus) 2. CULTURI STARTER CONCENTRATE DE MICROORGANISME

Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dezvoltate n condiii controlate, concentrate ntr-un volum mic i conservate prin congelare sau uscare n vederea depozitrii sau transportului. Culturile concentrate pot fi: bacterii, drojdii, spori de mucegai. In ceea ce privete culturile starter concentrate de bacterii, cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii lactice. Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru: obinerea culturilor starter de producie obinerea produselor fermentate prin utilizarea direct n lapte , compoziie crnai, etc.

44

2.1 OBTINEREA CULTURILOR STARTER CONCENTRATE Tehnologia de obinere a culturilor starter concentrate cuprinde urmatoarele operaii: 1. inocularea mediului de cultur cu microorganismul din cultura stoc 2. incubare pentru multiplicare 3. concentrarea mediului mpreun cu celulele sau separarea celulelor, de regul prin centrifugare i resuspendare ntr-un lichid adecvat 4. conservare prin congelare i uscare 5. depozitare n stare congelat sau uscat In tehnologia de obinere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu de cultur care s asigure toate substanele pentru dezvoltare, realizndu-se un control riguros al temperaturii i meninerea unui nivel optim de pH. Conservarea prin congelare a concentratului de microorganisme se face n urmtoarele moduri : sub form lichid, n care caz , concentratul de bacterii se suspend ntr-un antigel solubil n ap, care se utilizeaz n proporie de 40-50% faa de concentrat. Congelarea se realizeaz la -40oC(culturi subrcite). Acest gen de conservare prezint urmtoarele avantaje : -se mpiedic aciunea duntoare a gheii asupra celulelor de bacterii -manupularea concentratului este mai uoar -concentratul se poate nclzii pn la temperatura de utilizare congelarea n azot lichid (-196 oC), n care caz concentratul se amestec cu un concentrat crioprotector: 10% glicerol, 7.5% lactoz (n cazul bacteriilor lactice ) conservarea prin reducerea coninutului de ap, prin liofilizare, n care caz concentratul de bacterii se amestec cu un suport adecvat (lapte praf degresat,lactoproteine pulbere, lactoz, zaharoz) dup care se liofilizeaz. La liofilizare temperatura produsului nu trebuie s depeasc 40-45oC. Dup liofilizare se face ambalarea sub vid sau n atmosfer controlat de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate trebuie s se fac la temperaturi sczute (- 18oC). Culturile starter concentrate trebuie s conin 2.5*1010 i 5.5*1010 celule viabile active /g sau ml produs. 2.2 CULTURI STARTER CONCENTRATE PENTRU INDUSTRIA LAPTELUI Pentru industria laptelui se folosesc, n special culturi concentrate de bacterii lactice i propionice. Culturile concentrate de bacterii lactice se folosesc pentru: brnza Cheddar, brnzeturi de tip italian, elveian brnza de vaci, smntn, lapte btut, iaurt Culturile de bacterii concentrate propionice se adaug direct n laptele destinat fabricrii brnzeturilor (nu se mai folosesc culturi intermediare). 2.3 CULTURI STARTER CONCENTRATE PENTRU INDUSTRIA CARNII Culturile starter concentrate pentru industria crnii pot fi culturi singulare sau n amestec. Ele pot fi formate din bacterii lactice (Lb.Plantarum, Lb.sake, Lb.alimentarius), pediococi (P.acidilacti , P.pentosaceus), stafilococi(S.carnosus, S.xilosus), micrococi(M.varians), etc. Culturile starter de micrococi sau stafilococi sunt recomandate la maturarea lent a salamurilor crude, unde se realizeaz o scdere lent a pH-lui la o valoare de 5.6-6.1, conferind produselor un gust acrior iar realizarea consistenei se realizeaz n timp. Culturile mixte de micrococi-stafilococi-lactobacili se utilizeaz pentru maturarea rapid a salamurilor crude, n care caz realizarea consistenei merge paralel cu acidifierea.

45

Culturile starter concentrate utilizate n industria crnii se gasesc sub form lichid sau liofilizate.Adaosul n compoziie trebuie s asigure o concentraie de cel puin 106-107 microorganisme/g past. Modul de folosire al culturilor depinde de modul lor de conservare. Culturile conservate n antigel sunt folosite ca atare, cele liofilizate se suspend n ap pentru o distribuie mai uniform n compoziie. Culturile starter concentrate de bacterii lactice pentru industria crnii nu se amestec cu sare ,condimente, acid ascorbic, acizi alimentari deoarece se inactiveaz rapid. Culturile starter concentrate folosite n industria crnii trebuie s ndeplinesc urmatoarele condiii: s fie tolerante la NaCl (concentraie 2.5-3%) s se dezvolte bine n prezena de 80-100 mg NaNO3 /kg compoziie s produc numai acid lactic(specii homofermentive) s fie puin lipolitice i proteolitice s nu produc gusturi i mirosuri neplcute din cauza produilor secundari de reacie s fie nepatogene s fie inactivate la 57-60oC Folosirea culturilor starter concentrate de bacterii n industria crnii prezint urmatoarele avantaje: - micoreaz durata de maturare a produselor din carne - se mbuntesc proprietile senzoriale(gust, miros, consisten) - se asigur un grad nalt de inocuitate produsului alimentar (salamurile i crnaii cruzi) prin controlul dezvoltrii microorganismelor patogene i de alterare (Staphilococcus aureus , Salmonella, Cl.botulinum) 2.4 CULTURI STARTER CONCENTRATE DIN SPORI DE MUCEGAI Tehnologia de obinere include urmtoarele operaii: prepararea mediului de cultur, sterilizarea acestuia i repartizarea n eprubete (agar nclinat) nsmnarea mediului din eprubete cu spori de mucegai din cultura dorit termostatarea pentru germinarea sporilor cu organe purttoare de spori i sporularea preluarea sporilor cu 2 ml ser fiziologic 0.8% i nsmnarea mediilor de cultur Czapek, cu 2% agar, aflate n vase Roux recoltarea sporilor din vase Roux cu ser fiziologic 0.8% astfel nct s avem n suspensie 108-1010 spori/ml pstrarea suspensiei la 0...4oC Cultura de spori de mucegai concentrat poate fi livrata i sub form liofilizat .Culturile starter din spori de mucegai se utilizeaz n industria crnii i laptelui. 3. CULTURI STARTER PENTRU BIOTEHNOLOGII FERMENTATIVE ALE PRODUSELOR DE ORIGINE VEGETALA Ideea de a folosi ca maia(biomas de celule de drojdie) o anumit specie de levuri dateaz de la sfritul secolului XIX i apartine lui Christian Hansen. Ea are la baz teoriile lui Pasteur i rezultatele cercetrilor proprii care dovedeau c exist genuri de levuri utile i altele duntoare proceselor fermentative.Numele lui se leag de nceputurile unei etape cu totul noi n biologia levurilor (levur de la lat.levere=a ridica; fr.levain=aluat dospit, care desemneaz acele microorganisme care pot produce fermentaia), precum i o reforma fundamental a tehnicii fermentative. Niciunul dintre predecesorii si nu a lucrat cu culturi pure. El elaboreaz un procedeu pentru obinerea culturilor, plecnd de la o singur celul de levur i studiaza proprietile fiziologice ale tulpinilor pure obinute n felul acesta.

46

Folosirea culturilor pure de drojdii i a altor microorganisme (n special bacterii) a fost dezvoltat foarte rapid n special in industria berii, industria vinului, industria drojdiei de panificaiei, practic n toate domeniile n care cercettorii i productorii erau interesai de obinerea unor fermentaii controlate sau pentru obinerea unui anumit produs principal de reacie (fabricare oetului). Cele mai importante domenii n care folosirea culturilor pure este practic astzi de neconceput sunt industria vinului i berii. 3.1 UTILIZAREA CULTURILOR STARTER IN INDUSTRIA VINULUI Fermentaia spontan a mustului de struguri are loc sub influena drojdiilor care provin de pe struguri, deci nu are loc datorita unei singure specii, ci datorit unui ansamblu de specii a cror evoluie este dependent de concentraia n alcool. Fermentaia este declanat de drojdiile apiculate (n special Kloeckera apiculata)care produc ~4% volume alcool i al cror numr reprezint 70-80% din totalul drojdiilor aflate n mustul fermentat. Dup declanarea fermentaiei ncep s predomine drojdiile eliptice (Saccaromyces ellipsoideus) ce pot produce 16% volume alcool i care n plina fermentaie alcoolic reprezint 90% din totalul drojdiilor.La sfritul fermentatiei ncep s acioneze i drojdiile Saccaromyces oviformis, care formeaz n mustul fermentat pin la 18-20% volume alcool. Fermentaia mustului de struguri poate fi ns controlat i dirijat n dou moduri: prin folosirea de culturi de producie de drojdii indigene prin utilizarea de culturi starter de drojdii sub form de culturi starter de producie sau culturi starter concentrate Avantajele folosirii celor dou tipuri de culturi sunt urmtoarele : - pornirea rapid a fermentaiei mustului chiar n condiiile sulfitrii cu doze mari de SO2 impus de starea recoltei - se modific numeric i calitativ microflora levuric din must, ceea ce face ca fermentarea mustului s fie mai rapid i mai complet 3.1.1 CULTURI DE PRODUCIE DE DROJDII INDIGENE In scopul obinerii culturilor de producie din drojdii indigene cu cteva zile nainte de nceperarea campaniei de vinificare, se culege o cantitate de ~1500 kg struguri sntoi, copi din care se obine aproximativ 1200 l must.Circa 100 l se sulfiteaz la nivel de 5-10 g/hl SO2 i se las n repaus 10-120 ore , ntr-un loc racoros pentru depunerea suspensiilor. Mustul limpede este transvazat ntr-un vas i se depoziteaz la o temperatur care favorizeaz fermentaia alcoolic(1520 oC). Datorit procesului de selecie exercitat de anhidrida sulfuroas, procesul de fermentaie este realizat de drojdiile eliptice. In momentul n care fermentaia s-a declanat, se adug treptat restul de must (1100 l), care a fost sulfitat la obinere cu 30-40 g/hl. Dupa 2-3 zile se obine cultura primar(~ 12 hl), care este folosit pentru nsmnarea unei sarje mai mari de must sulfitat, din care dup 2-3 zile de fermentaie (cultur secundar) se folosesc cantiti corespunztoare pentru nsmnarea unei sarje mai mari de must(cultur de producie).Aceast cultur de producie este folosit pentru nsmnarea partidelor mari de must n vederea fermentaiei. 3.1.2 CULTURI STARTER DE DROJDII PENTRU VINIFICATIE Culturile starter se obin prin selecionarea celor mai valoroase drojdii din punct de vedere al nsuirilor de fermentare. Obinerea culturilor starter implic izolarea drojdiilor din habitatul lor natural i multiplicarea pe medii de cultur adecvate (must de struguri, must agarizat) Formele sub care se comercializeaz aceste culturi starter de drojdii sunt: culturi starter n mediul lichid

47

 culturi starter pe mediul solid de gelatin sau geloz culturi starter liofilizate (drojdiile se liofilizeaz mpreun cu mediul de protecie ) Principalele culturi starter de drojdii sunt: - cultur starter de Saccaromyces ellipsoideus - cultur starter de Saccaromyces oviformis - cultur starter de Saccaromyces pombe Cultura starter de Saccaromyces ellipsoideus se utilizeaz pentru prelucrarea strugurilor avariai, a celor provenii din podgorii noi la care nu s-au identificat specii de drojdii valoroase, la obinerea vinurilor spumante. Cultura starter de Saccaromyces oviformis este necesar pentru completarea fermentrii.Cultura de producie se adug chiar la nceputul fermentatiei, cu condiia ca raportul Saccaromyces oviformis: Saccaromyces ellipsoideus s fie de 10:1. Cultura starter de Saccaromyces pombe realizeaz o dezacidifiere biologic , fr ca zahrul rezidual s fie fermentat.Aceast metod se aplic pentru dezacidifierea musturilor care urmeaz s fie concentrate. Pentru a fi utilizate n producie culturile starter se pregtesc din inocul prin metoda pasajelor multiple. Se pot folosi i culturi starter concentrate, care se conserv prin congelare sau prin uscare. Cultura starter concentrat conine 3*1010 drojdii/g i este pstrat sub atmosfera de CO2 sau N2. Inainte de folosire aceste concentrate se rehidrateaz n amestec ap/must sau soluie 10% zahr.Culturile concentrate se utilizeaz direct n producie(fr pasaje). 4. ROLUL CULTURILOR STARTER N ASIGURAREA CALITATII PRODUSELOR ALIMENTARE 4.1. Asigurarea inocuitii produselor prin folosirea culturilor starter Dintre toate avantajele folosirii culturilor starter, cel mai important este cel care asigur un anumit grad de inocuitate produsului alimentar, datorit: acizilor organici (i n special acidului lactic) acumulai n mediu ; substanelor antibiotice i bacteriocine ; competiiei bacteriilor lactice cu microorganismele patogene i cele de alterare n ceea ce privete consumul de substane nutritive ; inhibrii produciei de amine biogene; inhibrii produciei de nitrozamine. Deosebit de important este asigurarea inocuitii microbiologice a produselor alimentare la care s-au folosit culturi starter de bacterii lactice. Alturi de materiile prime i auxiliare de calitate ireproabil sau igiena produciei i personalului, prin folosirea de culturi starter de bacterii lactice se asigur o dominare numeric a acestora fa de microflora natural (spontan), inclusiv cea patogen (salmonele, stafilococi, clostridii), care este mpiedicat n dezvoltarea ei datorit unui sistem antagonic complex. Sistemul antagonic include acizi organici (n special lactic i acetic), antibiotice, peroxizi i metabolii, nefiind exclus nici competivitatea dintre bacteriile lactice pe de o parte i cele de alterare i patogene, pe de alt parte, pentru substanele nutritive eseniale din mediul n care se dezvolt (produsul alimentar). Acidificarea mediului este intens i rapid mai ales n cazul n care substratul conine un glucid uor fermentescibil (lactozan cazul bacteriilor lactice tipice), datorit acumulrii de acid lactic. In funcie de tipul microflorei lactice, se pot acumula i ali acizi organici, n special acid acetic. Prin acumularea de acizi organici, pH-ul mediului (produsului alimentar) scade sub valoarea optim de dezvoltare a bacteriilor de alterare i a celor patogene.

48

2. Aciunea fa de stafilococi si salmonele n preparatele de carne care au suferit un tratament termic necorespunztor (substerilizare), n crnaii i salamurile crude semiuscate (aw > 0,92) sau n salamurile uscate (aw < 0,92), se poate dezvolta Staphylococcus aureus care elaboreaz enterotoxin, stabil la cldur. In general, stafilococii prolifereaz i produc enterotoxin n primele stadii ale fermentaiei salamurilor i crnailor cruzi, mai ales n stratul periferic. Inhibarea dezvoltrii stafilococilor este mrit dac raportul bacterii lactice/stafilococi este mare i dac temperatura de fermentare-maturare este mai sczut. S-a demonstrat experimental c, n prezen de cultur starter de bacterii lactice, numrul de stafilococi coagulazo-pozitivi din salamurile fermentate la 22 ... 24C este mai redus iar producerea de enterotoxin este inhibat i aceasta din cauz c, inocul de bacterii lactice (pediococi i lactobacili) va controla fermentaia, va accelera formarea de acid lactic i astfel, indirect, va ntrzia dezvoltarea stafilococilor. Prezena salmonelelor n crnaii i salamurile crude este mai rar. Bacteriile lactice componente ale culturilor starter au aciune inhibitoare fa de salmonele, efectul inhibitor fiind dependent de specie, su, raportul bacterii lactice/salmonele, temperatura de fermentare, intensitatea i viteza acumulrii acidului lactic. Stafilococii i salmonelele pot fi prezente i n diverse produse lactate (produse lactate acide, smntn, brnz proaspt de vaci, unt, brnzeturi fermentate cu past oprit sau neoprit, brnz telemea, ngheat, lapte praf). La produsele lactate la care se folosesc culturi starter de bacterii lactice, s-a dovedit c exist un antagonism evident ntre acestea, pe de o parte, i stafilococisalmonele, pe de alt parte In cazul culturilor starter de streptococi s-a dovedit c aciunea de inhibare nu este direct corelat cu viteza de acumulare a acidului lactic . In ceea ce privete formarea de toxine botulinice de ctre CI. botulinum tip A, B, E, F (toxine care sunt labile la cldur i care se deosebesc ntre ele prin faptul c sunt neutralizate specific de ctre anticorpii omologi), aceasta este dependent de condiiile n care se dezvolt microorganismul: potenial redox, pH, activitatea apei; concentraia NaCl i azotit, temperatur. Experimental, s-a dovedit c prin folosirea culturilor starter de bacterii lactice, n prezena unui glucid fermentescibil adecvat (glucoza, zaharoza) se inhib n mare msur formarea de toxin botulinic. Dac este prezent i azotitul n concentraie de 50150 mg/kg, aciunea de inhibare a formrii toxinei este total n crnaii cruzi fermentai-maturai la 27C. In cazul produselor vegetale murate (fermentate lactic), incidena formrii toxinei botulinice este extrem de rar, din cauza rapidei dezvoltri a bacteriilor productoare de acid lactic, bacterii care au o bun toleran la concentraii mai mari de NaCl (28%) i acid lactic. Ca rezultat al respiraiei esuturilor vegetale supuse murrii i a dezvoltrii bacteriilor se creeaz un mediu anaerob i prin urmare competiia ntre bacteriile productoare de toxine i cele productoare de acizi este ctigata de acestea din urm, care sunt tolerante la pH sczut i concentraie mare de NaCl. In produsele vegetale murate, dezvoltarea lui CI. botulinum i producerea de toxin este inhibat la un pH < 4,6 i la concentraiile de NaCl existente n produs. La conservarea prin murare a produselor vegetale trebuie s se aib ns n vedere c anumii compui pot aciona favorabil sau defavorabil asupra bacteriilor lactice. De exemplu, n varz exist substane care inhib dezvoltarea bacteriilor gram-negative duntoare, dar nu i pe cele lactice. Mslinele verzi tratate necorespunztor cu alcalii sau prin oc termic, nainte de a fi saramurate, pot avea substane inhibitoare fa de bacteriile lactice. Avnd n vedere c produsele vegetale conin azotai, acetia snt transformai n azotii, n timpul fermentaiei lactice, care inhib dezvoltarea microorganismelor formatoare de spori n produsele vegetale fermentate lactic. O contribuie nsemnat la capacitatea de conservare a produselor alimentare la care s-au folosit culturi starter o are i peroxidul de hidrogen (H2O2) care este bacteriostatic i bactericid, eficace n special fa de microorganismele ce nu secret catalaz. n acest context sunt mai sensibile la H2O2 bacteriile gram-negative (salmonele, bacteriile coliforme) n comparaie cu cele gram-pozitive (stafilococi, clostridii). Peroxidul de hidrogen poate

49

fi eficace prin el nsi sau datorit formrii unor compui inhibitori cu unele componente din produsul alimentar. De exemplu, n laptele crud, peroxidul de hidrogen reacioneaz cu tiocianatul i peroxidaza i formeaz o serie de compui care au aciune inhibitoare fa de microorganismele de alterare Avnd n vedere c anumite culturi starter pot forma H2O2 n condiii de refrigerare fr a se dezvolta numeric i fr a produce acid lactic, s-a ajuns la concluzia c aceste culturi starter pot fi utilizate pentru inhibarea microorganismelor psihrotrope n produsele alimentare depozitate n condiii de refrigerare. Astfel, se cunoate c aproape 90% din bacteriile psihrotrope care altereaz carnea snt gramnegative, grupul cel mai important constituindu-l Pseudomonas Achromobacter, att pentru carnea proaspt ct i pentru cea refrigerat. S-a constatat c prin utilizarea unei culturi starter de Streptococus lactic i Leuconostoc citrovorum n proporie de 10% fa de masa crnii de vit tocat se mpiedic dezvoltarea microorganismelor aerobe, fr a se ajunge la modificri de pH. De asemenea, prin folosirea de culturi starter de L. bulgaricus, L. lactis i Pediococcus cerevisiae n carnea mrunit la nivel de 5 IO8 celule/g carne tocat i pstrat n condiii de refrigerare, s-a ajuns la o inhibare a bacteriilor psihrotrope, inhibare pus pe seama H2 02 . Cercetrile au demonstrat c culturile starter lactice pot fi folosite i ca microflor de suplimentare n alimentaia animalelor tinere (viei, purcei) i aceasta pe motivul c la viei i purcei lactobacilii i streptococii joac un rol important n digestia glucidelor, n special a lactozei, care este transformat n acid lactic ce joac un dublu rol: aciditatea lactic favorizeaz aciunea pepsinei ce provoac coagularea cazeinei laptelui, care n continuare este atacat de tripsin ce elibereaz aminoacizii ; aciditatea mediului intestinal blocheaz dezvoltarea microorganismelor cu putere patogen, cum ar fi E. coli care se dezvolt n mediu alcalin sau uor acid. Prin schimbarea habitatului i datorit tratamentelor fizice, psihice, transportului sau nlocuirii laptelui matern cu lapte simulat, se modific flora lactic la viei i purcei. Acest lucru se realizeaz i prin tratament cu antibiotice. Datorit pierderii florei lactice, vieii i purceii pot cpta diferite afeciuni digestive care pot produce mortalitate de 310%. In condiiile n care vieii i purceii nu snt alptai normal, alimentele de alptare pot fi suplimentate cu culturi starter care trebuie s aib o concentraie mare de germeni viabili n condiii normale de depozitare ale alimentelor de alptare,. Se utilizeaz culturi starter de Str. lactis, Str. thermophilus, L. helveticus. L. acidophilus, mbogite cu aminoacizi i vitamine din grupul B. 3. Producerea de antibiotice i bacteriocine Anumii streptococi lactici i lactobacili produc antibiotice n mediul n care se dezvolt. De exemplu, Str. cremoris produce diplococcin strns asociat de celulele respective, antibiotic care este inhibitor fa de Staphylococcus aureus dar nu i fa de Eschcrichia coli. Streptococcus lactis produce nizin, stabil la cldur i la pH acid, care are aciune inhibitoare fa de bacteriile gram-pozitive. Nizina nu stopeaz germinarea sporilor, dar inhib dezvoltarea sporilor germinai. Lactobacillus plantarum produce lactolin, iar Lactobacillus brevis produce lactobrevin. Specii de Lactobacillus acidophilus produc lactocidin, acidofilin si acidolin. Acidofilina produs n timpul dezvoltrii lactobacililor n lapte este stabil la cldur i pH acid. Acidolin produs n aceleai condiii are aciune fa de bacteriile gram-pozitive i negative. Anumite specii de microorganisme produc bacteriocine care nu snt clasificate ca antibiotice dar care au aciune antibiotic. De exemplu, L. cremoris produce diacetil prin fermentarea citratului, care exercit aciune inhibitoare fa de bacteriile patogene i cele de alterare. Avnd n vedere concentraia relativ redus a diacetilului n produsele alimentare, nu se poate vorbi de o aciune inhibitoare a acestuia fa de grupele de microorganisme menionate. Efectul inhibitor al diacetilului este evident numai la o concentraie a acestuia de 170 mg/kg, ceea ce ar nsemna folosirea

50

diacetilului ca aditiv de conservare, fapt ce nu este permis de legislaia sanitar n vigoare, el fiind socotit un aditiv de aromatizare. 4. Producerea de amine biogene Dintre aminele biogene din produsele fermentate intereseaz n mod deosebit histamina i tiramina, care se formeaz n cantiti mai mari datorit aciunii histidin i tirozin-decarboxilazelor produse de microorganisme (bacterii i drojdii). S-a dovedit c n metabolismul normal al omului, tiramina este oxidat rapid de monoamina-acid-oxidaza (MAO), dar la persoanele tratate cu inhibitori MAO, tiramina se acumuleaz i exercit un efect vasotonic puternic. Printr-un mecanism diferit i histidina acioneaz ca un vasopresor, n prezena inhibitorilor MAO. In produsele de carne fermentate au fost gsite cantiti relativ mari de tiramina i histamina i cantiti mai mici de feniletilamin, triptamin, cadaverin, putrescein, n funcie de durata fermentrii. Produsele fermentate natural au un coninut ntre 184 i 534 mg tiramin/kg produs. Activitatea tirozin-decarboxilazic a microflorei naturale crete paralel cu creterea aciditii produsului, fiind un mecanism de protecie al bacteriilor fa de acidificarea mediului. Microflora spontan are activitate decarboxilazic mai mare, fiind adaptat la temperaturi mai ridicate, la o activitate a apei aw mai redus i la o concentraie de NaCl mai mare. Tirozindecarboxilaza din produsele de carne fermentate s-a dovedit a fi indus n prezena tirozinei disponibile. Prin folosirea de culturi starter de Lactobacillus i Pediococcus, se mpiedic dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitic (punerea n libertate de tirozin) i decarboxilazic i deci se mpiedic formarea unor cantiti mari de tiramina. (Acelai lucru se poate spune i despre acumularea celorlalte amine biogene.) i n cazul altor produse alimentare se nregistreaz nivele mai sczute de amine biogene dac s-au folosit culturi starter. n literatur snt indicate urmtoarele nivele de tiramina: 02,17 g/g n brnza fermentat; 611 g/ml n bere; 0,212 g /ml n vin; 95304 g/g n extract de drojdie; 0,913 mg/100 g n varz tocat i murat. 5. Inhibarea producerii de nitrozamine n cazul crnii, azotitul se adaug pentru formarea culorii crnii srate destinat preparatelor din carne, semiconservelor i salamurilor crude i pentru proprietile sale antimicrobiene. Azotitul rezidual poate ns reaciona cu aminele secundare, conducnd la formarea de nitrozamine care au aciune cancerigen. Prin reducerea cantitii de azotit rezidual se diminueaz producia de nitrozamine n produsele din carne dar, n acelai timp, se reduce i capacitatea acestuia de a inhiba dezvoltarea lui CI. botulinum i de formare a toxinei botulinice. Bacteriile lactice, avnd la dispoziie un substrat fermentescibil, sunt ageni eficace antibotulinici, deoarece produc acid lactic i deci scad pH-ul sub valoarea optim de dezvoltare a lui CI. botulinum, deci asigur stabilitatea produselor chiar n prezena unei cantiti mai mici de azotit rezidual. Realizarea unui pH sczut i existena unui nivel de azotit rezidual de asemenea sczut fac s scad producia de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun frigerii i coacerii (tabelul 40).
Coninutul de nitrozamine n bacon dup 25 zile de pstrare la 4C Specificaie Azotit rezidual, mg/kg 20-40 4-16 NTG pH Coninut de nitrozamine, ppb 10-30 2- 9

Fr adaos de cultur starter Cu adaos de cultur starter

104 -105 106- 107

6,0-6,4 5,2-5,6

Produsele vegetale conin azotai i azotii i anumite bacterii lactice, incluznd sue de L.plantarum care pot reduce azotaii la azotii. In aceast direcie, s-a gsit c azotitul din varza

51

murat crete de la un nivel iniial foarte redus pn la 108 mg/kg, dup 5 zile de fermentare, dup care se reduce aproape de nivelul iniial. Din aceast cauz, n produsele vegetale fermentate lactic nu s-au pus n eviden nitrozamine, chiar dac unul din partenerii de reacie este prezent (aminele). La produsele vegetale fermentate, datorit pH-ului sczut, azotitul rezidual este adus la nivele nepericuloase din punct de vedere al formrii nitrozaminelor.

52

ALIMENTE FUNCIONALE

CAP I. IMBUNATATIREA VALORII NUTRITIVE SI IGIENICE A PRODUSELOR ALIMENTARE Alimentaia i pune amprenta asupra ntregii existene umane, ncepnd cu dezvoltarea embrionar, determinnd starea de sntate i capacitatea de munc. Ea constituie un factor cu aciune permanent care influeneaz desfurarea proceselor metabolice, deoarece hrana reprezint izvorul i regulatorul proceselor de schimb. Dar ntre necesitile organismului i aportul alimentar nu exist totdeauna un echilibru optim, acesta fiind perturbat de numeroi factori sociali, economici, tehnologici, culturali, etc. Dintre factorii care contribuie la un dezechilibru metabolic, n primul rand trebuie menionat deficitul de substane nutritive, n special substane cu rol plastic, precum i deficitul energetic , care determin o scdere a intensitii proceselor metabolice , antreneaz un deficit n alte substane care, n final, se reflect asupra creterii i strii de sntate a populaiei. Manifestrile clinice ale deficitului de substane nutritive apar dup un timp ndelungat de la folosirea unui regim alimentar necorespunztor.Acest lucru se explic prin faptul c deficitul de substane din ratia alimentar, pe o perioad determinat de timp, poate fi compensate pe baza proceselor biochimice de adaptare. In timp mai ndelungat, alimentaia neechilibrat depete capacitatea de adaptare a organismului i apar dereglri metabolice profunde care afecteaz sntatea individului i a unor colectiviti. Pentru rile industrializate, creterea calitii i cantitii bunurilor alimentare puse la dispoziie, creterea nivelului de trai i a facilitilor de procurare, lipsa de cumptare faa de tentaiile provate de nsuirile foarte atrgtoare pe care le capat alimentele prin prelucrare, precum i tendina de utilizare excesiv a produselor concentrate i ultrarafinate, conduce , inevitabil, la un supraconsum. Toate acestea se asociaz cu mutaiile care s-au produs n viaa sociala datorit civilizaiei actuale, astfel: creterea gradului de urbanizare, a condiiilor de confort i diminuarea efortului fizic. Ca urmare, pentru multe segmente de populaie , asistm la o supralimentaie caracterizat prin aport mare energetic dar srac n biocatalizatori. Acest fenomen are loc pe fondul unei solicitri intelectuale mai intense, a creterii stresului neuropsihic, a polurii mediului i a alimentelor, procese care converg spre o mai mare solicitare de biocatalizatori: vitamine i biolemente, care au rol de protecie a organismului. In aceste condiii exist orientarea de a echilibra i mrii valoarea nutritiv a dietei alimentare. Pe plan mondial se dezvolt n acest moment proiecte biotehnologice de obinere a unor alimente speciale FoSHU (Food for specified used), cunoscute i sub denumirea de alimente funcionale sau nutraceutice. Impactul economico-social urmrit prin aceste proiect poate fi sintetizat n urmtoarele efecte: economice -selectarea ingredientelor dup principiul celui mai avantajos raport dintre pre/costuri/valoare nutritiv, n sensul minimizrii preului i costurilor, maximizrii valorii nutritive, pe baza unui model de calcul; -selectarea celor mai avantajoase ambalaje i modaliti de ambalare din punct de vedere al stabilitii la pstrare, al funcionalitii i al igienei alimentului, corespunztoare alimentelor funtionale realizate; -asigurarea celui mai convenabil echilibru al mesajului informaional al etichetei privind meniunile obligatorii;

53

-motivarea opiunii pentru alimentele de maxim siguran nutriional, utiliznd materii prime naturale, nepoluate sau cu substane antinutriionale; -posibilitatea de a obine cele mai potrivite produse alimentare/suplimente nutriionale, la costuri i preuri mai sczute fa de cele practicate pe plan internaional, n raport cu alocrile financiare. sociale -posibilitatea ca orice consumator s consume cu plcere i cu ncredere alimentele funcionale obinute, n toate fazele activitii sale ; -eliminarea suspiciunilor referitoare la prezena unor substane interzise n alimentele funcionale; Dei vechimea alimentaiei se confund cu nsi istoria umanitii, o alimentaie corect, adecvat diferitelor condiii de via i efort este o problem de actualitate, care preocup cercettorii din multe domenii nutriie, tehnologie alimentar, igiena alimentaiei, medicina muncii . Aceast preocupare a contribuit la mbogirea gamei produselor alimentare cu noi sortimente, suplimente alimentare, din dorina de a satisface ct mai complet necesitile nutritive ale diferitelor grupe de consumatori, n funcie de condiiile fiziologice speciale, vrst i efort. n acest sens, suplimentele alimentare semnific produsele alimentare al cror scop este s suplimenteze dieta normal i care reprezint surse concentrate de nutrieni sau alte substane cu efect nutriional sau fiziologic, singure sau n combinaii. I.1 SUPLIMENTELE NUTRITIONALE Concept i importan in alimentaie Suplimentele alimentare pot fi definite drept acele produse alimentare care conin un plus de nutrieni cu o biodisponibilitate ridicat, destinate a acoperi necesitile nutritive fiziologice specifice. Potrivit Ordonanei de urgen a Guvernului Romniei nr. 97/21 iunie 2001 privind reglementarea produciei, circulaiei i comercializrii alimentelor, nutrienii i/sau suplimentele alimentare reprezint substane nutritive, respective protide, lipide, glucide, vitamine, macro i microelemente minerale i/sau preparate prelucrate sub form de tablete, capsule, drajeuri, pulberi sau lichide care au n compoziia lor macro i micronutrieni i/sau alte substane comestibile, care sunt consumate n cantiti definite, n mod suplimentar fa de aportul alimentar obinuit. Este admis de ctre toi nutriionitii c funcia alimentatiei, reprezentnd schimbul permanent de informatie, energie i substan, este, alturi de respiraie, cea mai strns legtur a organismului uman cu mediul su de via. Analiznd cele trei apecte ale acestui schimb se observ urmtoarele : schimbul de informaie se refer n special la structura alimentului, care trebuie s fie ct mai apropiat de posibilitile organismului de a-l prelucra digestiv i metabolic, avnd o biodisponibilitate ridicat; schimbul de energie se refer, att la coninutul n nutrieni bogai energetic, ct i biodisponibili; schimbul de substan se refer la coninutul general de nutrieni i la echilibrul proporional dintre acetia. Analiznd n acest mod proprietile nutriionale ale suplimentelor alimentare, se pot identifica i substanele i produsele care nu pot fi utilizate, n aceste condiii n alimentaie. Acestea sunt produsele greu de digerat i/sau metabolizat, chiar dac sunt bogate n nutrieni. De asemenea, nu sunt indicate alimentele sau substanele pentru prelucrarea crora organismul uman consum o cantitate crescut de enzime sau vitamine.

54

Un exemplu n acest sens este consumului de alcool etilic, care, dei are un coninut caloric foarte mare (care nu se conserv ns n organismul uman), este metabolizat cu un consum ridicat de vitamina B1, implicat n metabolismului glucidic, att de necesar efortului neuromuscular. VitamiDe asemenea, o alt condiie este adaptarea alimentaiei la specificul activitii depuse de organismul uman, individualizarea alimentaiei, deoarece fiecare organism are o reactivitate biologic proprie, ce se evideniaz mai ales n condiii de efort sau boal. I.2 CLASIFICAREA SUPLIMENTELOR NUTRITIONALE n conformitate cu prevederile Ordinului MSF 282/2001 , suplimentele nutriionale sunt reprezentate de : vitamine i elemente minerale n cantiti care pe unitatea de consum (tablet, capsul, drajeu, linguri etc.) nu depesc de 3 ori dozele fiziologice zilnice recomandate pentru o persoan n cazul vitaminelor hidrosolubile i de 1,5 ori n cazul vitaminelor liposolubile i al elementelor minerale; proteine pure sau sub form de concentrate proteice, izolate proteice i hidrolizate proteice, aminoacizi i amestecuri ale acestora; uleiuri alimentare considerate dietetice (de exemplu: uleiuri din germeni de semine de cereale, uleiuri din ficat de pete) i acizi grai polinesaturai eseniali; fosfolipide( lecitine, cefaline, serinfosfatide, inozitolfosfatide) pn la cantiti ale coninutului de fosfor de 1 g/zi; fibre alimentare pn la cantitatea de 24 g/zi; lapte pentru copii, indiferent de vrsta de administrare, dar fr indicaii terapeutice; produse pentru copii: lapte cu cereale i/sau fructe, produse tip baby-food ndulcitori sintetici alimentari; produse pentru slbit i pentru meninerea greutii corporale, fr indicaii terapeutice; produse parabiotice: probiotice, prebiotice, simbiotice - alimente funcionale care regleaz flora microbian intestinal; produse pentru sportivi care conin vitamine, elemente minerale, proteine, hidrolizate proteice, aminoacizi, glucide uor asimilabile, acizi grai eseniali i ali nutrieni cu rol n susinerea efortului sportiv, n refacerea post-efort, n dezvoltarea i meninerea masei musculare. I.3 MODELAREA VALORII NUTRITIONALE SPECIALE NUTRITIVE A ALIMENTELOR CU UTILIZARI

Consumul de suplimente nutriionale genereaz o serie de beneficii: a.

b.

Efecte positive asupra sntii, performanelor fizice sau strii psihice : mbuntirea strii de sntate sau bunstare general i/sau reducerea riscului unor boli; mentinerea sntii i dezvoltarea optim a organismului; reglarea unor procese din organism, controlul unor funcii ale organismului, reducerea duratei convalescenei, reducerea efectelor mbtrnirii; Beneficiu fiziologic i/sau asigurarea proteciei mpotriva unor boli cronice; prevenirea deficitului de vitamine i de substane minerale; sunt considerate ca alimente pentru utilizare nutriional particular; sunt considerate ca alimente funcionale; evaluarea se face dup un protocol similar medicamentelor; pe etichet nu se admit revendicri referitoare la diagnosticarea, atenuarea, tratarea,

55

prevenirea sau vindecarea unor boli. Dintre efectele negative ale consumului de suplimente nutriionale, datorate n special toxicitii alimentelor funcionale i a nutraceuticelor, amintim: supradozarea principiilor active; interaciunea cu alte componente din produs; prezena unor substane utilizate la extracia sau formularea produsului de baz. Cile prin care un component poate afecta organismul uman sunt numeroase: reacii adverse sau interrelaii cu alte componente, care pot determina, fie distrugerea, fie reducerea disponibilitii nutrienilor; interferene cu utilizarea sau digestia nutrienilor; interferene sau interaciuni cu substane terapeutice farmacologice. n funcie de valoarea lor nutritiv, din punct de vedere al nutrienilor de baz, se poate realiza gruparea alimentelor cu utilizri nutriionale generale n: produse cu preponderen protidic, lipidic sau glucidic. Importana cunoaterii valorii nutritive a produselor alimentare este dictat i de segmentarea accentuat a necesitilor de consum alimentar, fcnd posibil realizarea de alimente cu utilizri nutriionale specifice, care s corespund nevoilor anumitor grupe de consumatori (produse hipoglucidice pentru persoanele diabetice, produse mbogite nutriional pentru copii, produse hipocalorice pentru anumite diete, produse energizante pentru sportivi .a.). La nivel macroeconomic, este neleas ca o component a cererii globale, iar situaia alimentar a unei populaii este adesea abordat numai la nivelul mediilor naionale obinute prin metoda bilanturilor alimentare sau a contabilitii naionale. Consumul alimentar pe locuitor este principalul indicator general disponibil pentru a urmri evolutia securitii alimentare mondiale, msurat la scar national de disponibilitile enegetice alimentare medii (DEA) exprimate n kilocalorii. Experiena internaional demonstreaz c n rile n care DEA se situeaz n jurul valorii de 2700 Kcal, proporia persoanelor subalimentate este mic. Diferena n consumul alimentar este marcat prin inegalitatea observat n capacitatea de consum. Aceast putere de consum este caracterizat esenial prin capacitile productive din economiile de subzisten i prin puterea de cumprare din economiile de pia. S-a constatat c pe msur ce crete produsul intern brut, crete i totalul de proteine din regimul alimentar (aceast relaie este valabil i pentru creterea gradului de urbanizare). Pentru niveluri sczute ale venitului, aproximativ 75% din kilocalorii provin din poliglucide, constatnduse un consum ridicat de porumb, orez, gru, cartofi. Pe msur ce venitul crete, dieta devine mai complex: crete cantitatea de grsimi (n special de natur animal), iar ponderea energiei provenite din poliglucide se reduce la 30%. Proporia energiei din zaharuri crete, iar contribuia proteinelor rmne relative constant, nregistrndu-se ns un salt calitativ, prin trecerea de la consumul de proteine vegetale la cel de proteine animale. n nelegerea inegalitilor din consumul alimentar trebuie plecat i de la premisa c alimentaia este un act social complex fondat pe satisfacerea cererii biologice, dar i pe plcerea de gust i consum de simbol, de semnificaie social. Nevoile de consum alimentar sunt nevoi reale, exprimate. De multe ori ns, cumprtorul de produse alimentare are nevoie i de satisfacie, att n procesul de achiziie, ct i n cel de consum. Marketerii, sociologii apreciaz c un potenial cumprtor nu specific ntotdeauna ceea ce dorete. El are nevoi neexprimate, care trebuie identificate. n plus, interesul unui cumprtor depinde i de veniturile alocate alimentaiei, de accesul la sortimentul de alimente oferit, de disponibilitatea i preul produselor nealimentare i al serviciilor. n general, cererea de mrfuri, este puternic nrurit de factori numeroi i diferii: economici (investiii, ofert, venituri, preuri); demografici (numrul i structura populaiei pe vrste i sexe, profesii, grad de cultur i instruire);

56

 sociologici (mod, mediul social, mobilitate socio-profesional); organizatorici(calitatea activitii comerciale, aciuni promoionale, etc.); sezonieri i conjuncturali. ntre obiectiv i subiectiv, comportamentul alimentar este rezultatul factorilor: de natur exogen constituii din alimente propriu-zise avnd valoare nutritiv i implicnd tonusul emotiv natur endogen de ordin fiziologic (senzaia de foame sau sete), sensorial (sensibilitatea tactil, cea termic, gustul) i psihologic (semnificaia simbolic a alimentelor, funcia social a zilelor festive). n tot acest complex, fenomene ca instinct, dorin, agreabil sau dezagreabil, obinuine difer de la un individ la altul i de la o populaie la alta. Produsele alimentare sunt incluse n categoria bunurilor de uz curent i se caracterizeaz, pe lng epuizarea lor continu n procesul de consum, prin existena unui anumit termen de valabilitate (sau termen limit de consum), prin anumite restricii privind condiiile de pstrare, conservare, ntrebuinare. Ele dein un loc bine determinat n cadrul consumului individual i o anumit stabilitate n consumul final. Fa de producie, care are un caracter sezonier, consumul produselor agricole (folosite n mare parte ca materii prime pentru industria alimentar i doar parial consumate n stare natural) este mult mai uniform, nregistrnd doar unele oscilaiii n perioada de constituire a ofertei. Ca expresie a nevoilor de consum, cererea reprezint un permanent stimulator pentru productie, pentru lrgirea gamei sortimentale i mbuntirea modului de satisfacere a consumului. Producia realizata n vederea satisfacerii nevoilor de consum se confrunt, n cadrul pietei, cu cerintele societii, sub forma ofertei de mrfuri. Oferta constituie un factor economic hotrtor, fiind implicat major n structurarea i volumul cererii. Prin amplificarea formelor de satisfacere a consumului, oferta de mrfuri este, de asemenea, generatoare de nevoi. Se consider c una din cele mi importante modaliti de care dispune o firm pentru a avea succes pe pia o constituie diferenierea eficient a ofertei (prin produs, servicii care nsoesc produsul, personal, imagine). Pentru produsele alimentare diferenierea este relativ dificil. Pentru cele prelucrate, proiectarea nutriional s-ar putea constitui ntr-o modalitate de difereniere, cu condiia declarrii reale a potenialului energetic i biologic, a aditivilor utilizai i a respectrii invariabilelor valene igienice. Mesajul informaional, cuprinznd acele elemente ce vizeaz nutriia, poate fi realizat numai de ctre firme care pot garanta valorile minime pentru datele comunicate prin e t i c h e t sau a m b a l a j . Eventuala neconcordan dintre valoarea nutritiv declarat a produsului i cea real, identificabil de ctre organismele de protecie a consumatorului, pune n cauz onestitatea, probitatea i deci, reputaia firmei productoare. Proiectarea nutriional modern a alimentelor trebuie s ia n considerare toate cele patru laturi inseparabile ale valorii nutritive : 1) valoarea psihosenzorial, 2) valoarea energetic, 3) valoarea biologic, 4) valoarea igienic iar modelarea si echilibrarea trebuie s le vizeze pe toate, ntruct ntre ele exist interdependen. Trebuie avut n vedere faptul c exist riscul ca modificnd n sens pozitiv una din laturi (de exemplu valoarea biologic prin adugarea de sruri solubile de fier) se poate modifica n sens negativ o alt latur (scade valoarea psihosenzorial, produsele cptnd un gust metalic sau astringent sau o culoare dezagreabil).

57

Un alt exemplu l constituie micorarea valorii igienice prin mbuntirea valorii psihosenzoriale, n cazul adugrii n exces a unor aditivi alimentari. Alimentele crora li s-a modelat valoarea nutritiv trebuie s fie omogene i stabile , s poat fi prelucrate i obtinute n condiii controlate. Prin control trebuie s se asigure constana dozelor indicate i omogenitatea produselor obinute, caracterul asimilabil al substanei nutritive introduse, nealterarea caracteristicilor produsului, evitarea mririi exagerate a costului. Eecul n realizarea unor produse echilibrate nutritiv i corect corelate cu necesitile segmentelor de populatie crora li se adreseaz are efecte grave asupra sntii consumatorilor, genernd situaii de dezechilibru nutriional, cu implicaii majore pe termen lung. Pentru evitarea unor asemenea situaii se impune un proces corect de asigurare a calitii noilor produse alimentare, a cror valoare nutritiv a fost modelat i echilibrat. Folosind previziunea tehnologic, firma dispune de un instrument adecvat n determinarea duratei i a volumului eforturilor necesare nnoirii gamei sale de produse. Ea obine totdeauna informaii asupra modalitilor de realizare a unor nivele calitative ale produselor n raport cu costurile acestora, cu strategiile de preuri, cu schimbrile n programul de distribuie, cu oscilaiile competitivitii lor pe pia. Esenial pentru obiectul previziunii tehnologice nu este produsul ca atare, ci funciile lui, nevoile pe care urmeaz s le satisfac. Este perimat practica de a avea reete pe baza oricror altor considerente dect cele nutriionale. Astfel, mrfurile alimentare actuale se caracterizeaz printr-un grad nalt de prelucrare , ncorpornd un volum din ce n ce mai mare de progres tehnico-tiinific. Biotehnologia alimentar modern se difereniaz net de cea clasic care urmrea prioritar meninerea sau ameliorarea calitii resurselor agroalimentare. Plecnd de la necesitile obiective i subiective de consum alimentar, se selecteaz materiile prime convenionale i neconvenionale ce urmeaz a fi ncorporate, aditivii alimentari corespunztori, tipurile de transformri tehnologice eficiente pentru a ajunge la un produs finit cu proprieti identice sau ct mai apropiate de cele ale produsului proiectat. Utilizarea modelrii n obinerea, fabricarea i monitorizarea continu a proprietilor produselor alimentare, att a celor de uz general, ct i a celor destinate unor segmente speciale de consumatori, reprezint nu numai un mijloc de validare a performanelor productorilor, ci i o modalitate sigur de a evita orice risc n nutriie.

I.4 INOCUITATEA PRODUSELOR NUTRITIONALE Alimentaia este o component indisolubil a existenei umane, omul ca organism heterotrof fiind nevoit s preia din mediu substanele nutritive necesare pentru desfurarea normal a proceselor metabolice. Cele cinci grupe de substante nutritive - glucidele, lipidele, protidele, substantele minerale i vitaminele - nu sunt primite ca atare, ci sub forma unui complex, alimentul, ceea ce determin i o relaie psihoafectiv cu acesta, relaie ce poate deveni chiar determinant n alegerea unui aliment din cele disponibile la un moment dat. Caracterul de ingerabil al oricrui aliment, contactul intern care se stabilete ntre acesta i organismul uman i, mai ales, prin aliment, ntre organism i mediul nconjurtor, impune respectarea de ctre productorii i comercianii acestor mrfuri a unor restricii, care s asigure inocuitatea produselor consumate. Caracteristic produselor alimentare este marea diversitate de factori care pot influena inocuitatea acestora.

58

Alimentul este legtura biologic fundamental a omului cu mediul nconjurtor. Orice perturbaie a mediului i gsete, n alimente, mijlocitorul ideal pentru a ajunge la om. Pentru a menine starea de sntate a populaiei, produsele alimentare trebuie s corespund, n primul rnd, sub aspectul calitii igienice (inocuitii) , deoarece nendeplinirea acestei condiii poate duce la mbolnviri mai mult sau mai puin grave. Factorii naturali de mediu acioneaz n mod inevitabil asupra mrfurilor alimentare pe ntreg circuitul materie prim - produs finit. n diferite momente, relaia aliment-mediu determin modificri care influeneaz compoziia i salubritatea produsului destinat consumului uman. Produsele au o capacitate receptiv datorit creia tot ceea ce mediul produce i descarc poate fi regsit n acestea. Prin urmare, cele cteva perturbaii ale mediului pot gsi n alimente mijlocul ideal pentru a ajunge la om. Produsele alimentare vor avea o ncrctur minim de poluani i contaminani n msura n care agenii de agresiune sunt cunoscui i controlai n obinerea, prelucrarea i distribuia fizic a bunurilor. Numeroasele substane toxice din alimente, care pot reduce sau chiar anihila inocuitatea acestora, pot fi sintetizate n urmtoarele grupe: substane antinutriionale; substane toxice; produi toxici; micotoxine; pesticide; metale i metaloizi toxici; aditivi alimentari; microorganisme patogene. Nominalizarea si poziionarea corect a tuturor poluanilor i contaminanilor, precum i a implicaiilor acestora asupra organismului uman, impune lrgirea orizontului valorii igienice a suplimentelor nutriionale dincolo de inocuitatea clasic (absena germenilor patogeni, a toxinelor bacteriene i fungice, a unor otrvuri i contaminani chimici) a acestora. n present, ea trebuie s aib un coninut complex care s vizeze: absena sau limitarea strict a unor poluani chimici generai de ctre progresul tehnico-tiinific (pesticide, aditivi, antibiotice), a unor substane antinutriionale sau perturbatoare ale metabolismului uman preexistente n diferite materii prime agroalimentare clasice, reconsiderarea poziiei unor trofine energetice n plan cantitativ i corelativ din punct de vedere igienic. Standardizarea de produs soluioneaz numai parial i indirect problema inocuitii alimentelor prin: admiterea ntr-un numr foarte redus a compuilor nocivi i a impuritilor minerale, interzicerea prezenei microorganismelor patogene i a toxinelor acestora, admiterea unor bacterii condiionat patogene ntr-un numr foarte redus, dar fr a lua n eviden toate formele de contaminani ce pot interveni n fluxul tehnologic i logistic normal. Avnd n vedere toate aceste aspecte, definirea conceptual a unor noiuni cum sunt : puritatea, securitatea, sigurana i protecia consumatorilor de suplimente nutriionale capt o importan deosebit. Puritatea suplimentelor nutriionale reprezint gradul n care acestea sunt conforme cu specificaiile de produs din punct de vedere al naturii i proporiei tuturor componentelor coninute i cu standardele n vigoare privind ncadrarea n nivelurile maxime admise de contaminare fizic, chimic, microbiologic, toxicologic, radiologic. Pentru aceasta este necesar ca pe tot fluxul tehnologic s se asigure un control strict din punct de vedere al apariiei unor riscuri, s se nregistreze valoarea parametrilor de lucru i s se pstreze documente de control pentru fiecare lot fabricat. De asemenea, se impune ca producia s se realizeze din materii prime de calitate, garantate de furnizorul acestora prin buletine de analiz

59

specifice, iar loturile de produse finite s fie analizate n laboratoare acreditate conform specificaiilor de produs i cerinelor normelor privind contaminarea microbiologic, chimic i, n caz de necesitate, radioactiv. Comercializarea suplimentelor nutriionale, n vederea asigurrii puritii lor, impune ca acestea s fie ambalate i etichetate conform legislaiei n vigoare, adic n ambalaje originale i cu eticheta n limba romn. Securitatea consumatorului de suplimente nutriionale se traduce prin cantitatea de alimente necesare unui individ, exprimate n uniti fizice, convenionale (kilocalorii) i n trofine (substane nutritive), pentru a-i asigura echilibrul fiziologic i a-i acoperi cele 3 raii de consum: raie de ntreinere; raie de cretere; raie de activitate. Dei i se confer o sfer de cuprindere foarte ampl, totui, securitatea consumatorului de suplimente nutriionale este, n primul rnd, o problem de nivel individual, a crei rezolvare este condiionat de disponibilitatea produselor, de posibilitatea de acces la acestea (determinat, n general, de puterea de cumprare) i de dorina de a avea o alimentaie sntoas. n acest sens, devine necesar intervenia autorittilor guvernamentale care, printr-o serie de msuri de politic alimentar i nutriional, pot contribui decisiv la realizarea securitii consumatorilor de suplimente nutriionale. Sigurana consumatorilor de suplimente nutriionale se refer la ansamblul msurilor necesare pentru a se asigura protecia, stabilitatea i salubritatea acestor produse, pornindu-se de la cultivare sau cretere, producie ori fabricaie i pn la consumul final. Aceasta nseamn c n compoziia suplimentelor nutriionale nu trebuie s se regseasc elemente de natur a afecta inocuitatea acestora: microorganisme patogene, substane chimice toxice (de exemplu, pesticide, metale grele, contaminani radioactivi), impuriti minerale neadmise sau a cror proporie se situeaz peste limitele maxime admise n standarde. n acest sens, productorii de alimente, trebuie s comercializeze numai suplimentele nutriionale care prezint siguran, sunt salubre i apte pentru consum, ei fiind obligai s respecte parametrii privind proprietile organoleptice, fizice, chimice, microbiologice i toxicologice ale alimentelor conform reglementrilor legale n vigoare. Astfel, productorii trebuie s organizeze i s aplice controlul calitii igienice a suplimentelor nutriionale, fabricate sau manipulate, n laboratoare proprii sau acreditate. Protecia consumatorilor de suplimente nutriionale reprezint ansamblul de msuri de ordin legislativ, administrativ i financiar prin care acestora li se ofer ncrederea c pot beneficia de produse sigure, sntoase i de bun calitate i c sunt protejai mpotriva practicilor frauduloase de producere i/sau comercializare a unor bunuri care nu respect prevederile legale referitoare la securitatea i sntatea lor. Altfel spus, o bun protecie a consumatorilor de suplimente nutriionale nu se poate realiza n afara reglementrii stricte a condiiilor privind autorizarea unitilor care produc, prelucreaz, depoziteaz, transport i comercializeaz suplimente nutriionale, a condiiilor privind avizarea acestor tipuri de produse n scopul declarrii lor ca fiind apte pentru consumul uman, respectiv a condiiilor privind controlul unitilor care produc, prelucreaz, depoziteaz, transport i comercializeaz suplimente nutriionale.

60

Cap.II PRODUSE PARABIOTICE II.1 INTRODUCERE Substanele active biologic, administrate pentru a mbunati funcionarea intestinal, pentru a regla compoziia microflorei ca un tratament profilactic i curativ al diferitelor afeciuni infecioase, pot fi clasificate n urmatoarele categorii: Prebiotice Probiotice Simbiotice

Activitatea substanelor probiotice si prebiotice const n creterea numrului bacteriilor productoare de acid lactic, care sunt foarte importante pentru funcionarea tractului gastrointestinal. Probioticele Probioticele sunt substane sau produse alimentare care conin microorganisme vii: bacterii productoare de acid lactic, bifido- i lactobacterii, uneori drojdii, care, deasemenea, exist n microflora intestinal normal a unei persoane sntoase. Probioticele, ca substane, sunt frecvent folosite ca aditivi alimentari, mai ales n iaurturi i alte produse lactate. Microorganismele existente n probiotice nu sunt patogene sau toxice, sunt n cantiti adecvate; trecerea lor prin tractul gastrointestinal nu le modific viabilitatea. Probioticele nu sunt vzute ca medicamente, ci ca substane benefice sntii. Probioticele pot fi adugate n produsele alimentare, sub forma aditivilor alimentari sau pot fi sub form de tablete, coninnd bifido - i lactobacterii sau combinaii ale acestora. Scopul lor este normalizarea florei intestinale i profilaxia mbolnvirilor. Prebioticele Prebioticele sunt mai ales alimente, care nu pot fi complet digerate, asigurnd buna funcionare a tubului digestiv i mbuntind starea general a organismului. Aceast lucru se obine prin creterea, la nivelul tractului gastrointestinal, a uneia sau a mai multor grupe de microorganisme. Pentru a putea fi clasificat ca prebiotic, un component alimentar trebuie s nu poat fi digerat de ctre enzimele digestive umane. Ele furnizeaz substane nutritive selectiv, doar pentru grupe specifice de bacterii benefice, care triesc n intestinul gros. Alimentele care ntrunesc aceste condiii sunt carbohidraii cu molecul mic, cum ar fi inulina, lactuloza i lactitol. Prebioticele sunt ntlnite n fulgii de porumb, terci, cicoare, pine, usturoi, fasole, mazre, anghinare, banane i multe alte produse. Studiile au artat o influen stimulatoare a carbohidrailor simplii, mai ales cei coninnd fructoz, asupra bifido i lactobacteriilor din intestinul gros. Inulina - un polizaharid care poate fi gasit n tulpina i rdcina de dalie, anghinare, etc. Hidroliza lui produce fructoz. Au fost demonstrate: stimularea bifido i lactobacteriilor, mbuntirea absorbiei de calciu care reduce riscul de osteoporoza, reglarea metabolismului lipidelor, reducerea riscului de arteroscleroz la nivelul sistemului cardiovascular.

61

Monozaharidele - incluznd glucoza, zaharoza, fructoza sau alte glicoproteine, care sunt principalele componente ale laptelui uman, sunt stimulani ai creterii bifidobacteriilor. Lactuloza - un dizaharid sintetic, care nu exist n natur, n structura cruia fiecare molecul de galactoz este legat de o molecula de fructoz. Lactuloza este transportat pn la nivelul intestinului gros fr a fi modificat (doar aproximativ 0,25-2,00% este absorbit n intestinul subire) i constituie hrana perfect pentru acele bacterii de care depinde funcionalitatea adecvat a tractului gastrointestinal. Lactuloza a fost utilizat de mai bine de 40 de ani n pediatrie, pentru stimularea creterii lactobacteriilor la nou-nascui. Metabolismul lactulozei produce acizi grai cu molecula mic (acid lactic, butiric i alii) care determin scaderea pH-ului la nivelul intestinului gros. Utilizarea lactulozei ca surs de carbohidrai i energie are ca efect creterea cantitativ, n tubul digestiv, a bacteriilor benefice organismului, ceea ce duce la creterea peristaltismului i la reducerea produselor toxice ale catabolismului proteic ( amoniacului si altor compui cu azot). Amestecul de prebiotice i probiotice formeaz grupul simbioticelor, substane benefice snttii, care stimuleaz n special creterea i activitatea lactobacteriilor i bifidobacteriilor. II.2 SCURT ISTORIC Originea probioticelor dateaz din 1903 cnd n studiile lui Metchinikoff se descriu efectele benefice ale folosirii lactobacililor din iaurt de ctre om. Termenul de probiotic a fost folosit pentru prima dat n anul 1965 de ctre Lilly i Stillwell, apoi de Parker n anul 1974 pentru a defini: organismele sau substanele care contribuie la echilibrul microbian al intestinului. (Vanbelle i colab., 1990) n prezent, majoritatea cercettorilor accept c probioticele sunt concentrate viabile i atent selecionate de bacterii acido lactice, compuse adesea din tipuri de Lactobacillus acidophilus i Streptococcus faecium, ori tipuri de Bacillus. Acestea sunt folosite pe scar larg n hran, cu scopul de a preveni tulburrile digestive sau pentru creterea performanelor zootehnice. n alte studii, probioticele sunt definite ca bacterii intestinale naturale care, dup administrarea oral a dozelor, sunt capabile s se stabileasc, eventual s se colonizeze n tractul digestiv i s pstreze sau s determine creterea florei naturale a tractului digestiv pentru a preveni colonizarea organismelor patogene i pentru asigurarea inocuitii hranei. n rile aparinnd CEE, n grupul produselor probiotice sunt incluse bacterii, drojdii, enzime i alte substane cu rol probiotic, avnd la baz microorganisme aparinnd genurilor: Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Enterococcus, Pediococcus, enzime (lactoperoxidaza, glucanaza) i extracte de rumen. II.3 MICROFLORA INTESTINAL Pe plan mondial, datorit interesului suscitat de problematica alimentelor probiotice, cercetrile privind microflora probiotic implicat n procesul de sanogenez au fost reluate i continuate n mod intensiv, cunoscnd noi direcii de dezvoltare. Cteva produse probiotice de uz veterinar comercializate pe piaa mondial sunt prezentate n Tabelul 2. rile productoare de microorganisme sau produse probiotice sunt listate n Tabelele 3 . Sistemul ecologic al microflorei intestinale a fost ilustrat de ctre Gedek n anul 1987 artnd c se gsesc circa 400-500 de tulpini microbiene care difer n funcie de specie , dar n general aceast microflor poate fi clasificat n trei grupe i anume 1 a. Grupul dominant (>90%, strict anaerob) ce nsoete flora subdominant i flora rezidual este compus din Bifidus bacteria, Lactobacili (Gram +) i Bacteroidea (Gram -); 2 b. Microflora nsoitoare (<1% facultativ anaerob) cuprinde alturi de Escherichia coli (Gram -) i Enterococi (Gram +);

62

c. Restul microflorei (<0,001%) este n principal compus din Clostridia, Staphylococcus, Pseudomonas, Proteus i drojdii ale genului Candida.

4 Studii la microscopul electronic au artat c aproximativ 20% din tipurile de bacterii sunt nc n faza de a fi identificate, obinerea culturilor pure fiind greu de realizat. Colonizarea intestinal ncepe cu Escherichia coli, urmat de Streptococi, iar dup cteva zile de Bifidobacterium, apoi Bacteroidea i, n final, Lactobacillus, dar exist mari diferene ntre unele specii de animale i de om. Starea de echilibru ntre diferitele specii bacteriene variaz ntre duoden, ileon, colon i cecum. Aceast variabilitate depinde de o mulime de factori diferii ca: secreiile digestive, pH gastric, secreiile srurilor biliare (motilitatea), integritatea mucoasei intestinale. Microbiota din tractul intestinal uman cuprinde de asemenea diferite specii de microorganisme care pot fi grupate astfel:
-

microbiota majoritar format din Bifidobacterium(Bifidobacterium longum, infantis, brevis, bifidum) i Bacteroides(Bact. Fragilis, vulgatus, distasonis, ovatus), care reprezint 99% din microbiota total. Bifodobacteriile sunt prezente n tractul digestiv de la natere pe tot parcursul vieii(Tabel 1) microbiota subdominant format din Lactobacillus (Lb. acidophilus , Lb. salivarius , Lb. fermenti), Enterococcus (Ec. Faecalis, Ec. Faecium) i Enterobacteriaceae(E. coli) microbiota contaminant care de fapt tranziteaz tractul digestiv format din specii de Bacillus , adesea sub form sporulat, Staphilococcos, enterobacterii aparinnd genurilor: Klebsiella,Citrobacter, Proteus.

63

Tabel 1 Distributia bifidobacteriilor la om n funie de vrsta Segmentul de populaie Sugari hrnii la sn Sugari hrnii cu biberonul Copii i adolesceni Aduli Persone n vrsta Bifidobacterium bifidum Specii minore Bifidobacterium bifidum Specii majore Bifidobacterium longum, infantis, breve Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium infantis, breve, bifidum, longum Bifidobacterium adolescentis,longum Bifidobacterium adolescentis,longum

La psri, unde tranzitul este foarte scurt (2 5 ore), ecologia microbian este direcionat ctre microflora din gu. Cele mai ntlnite bacterii din tractul digestiv al porcilor i psrilor sunt listate n Tabelele 4 i 5. (Vanbelle i colab., 1990) Tabelul 2. Produse probiotice comercializate pe piaa mondial. Produsul Conine Recomandrile productorului Specia/Categoria Efecte beneficiar

64

All Lac

Lactobacili

Tineret porcin Purcei Porci, psri

Lacto Lactobacili, Sacc Saccharomyces sp. Toyocerin Bacillus toyoi (spori)

Reduce mortalitatea, crete sporul mediu zilnic (smz) Crete smz, reduce incidena diareei i mortalitatea Reprim dezvoltarea germenilor patogeni, atenueaz stresul

Fralac Streptococcus faecium Toate speciile Profilactic pentru diaree, promotor de Lbc cretere Cocbactin Lactobacillus Tineret taurin Crete smz acidophilus Oralin Enterococcus faecium Taurine, porcine, mbuntete performanele productive psri Protexin Streptococcus Cabaline, ovine, mbuntete starea de sntate i faecium, porcine performanele productive Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei Probios Lactobacillus Viei, porcine Crete apetitul, producia de lapte, reduce acidophilus, mortalitatea Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei Acosil Orz ncolit, bacterii Vaci lapte, ovine i scroafe gestante F.3 lactice Tabelul 3. Produse probiotice comercializate n Frana. Produsul Microorganismele componente probiotic Paciflor Bacillus cereus CIP 5832 Adjulact Enterococcus sp., Lactobacillus helveticus, standard Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis Adjulact 1000 Lactobacillus helveticus, Enterococcus sp. Adjulact 2000 Lactobacillus plantarum, Enterococcus sp. Yea sacc Saccharomyces cerevisiae Fermacton Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Enterococcus faecium SF 368 Bio plus Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Enterococcus porc faecium SF 368 Lyobacter P1 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Enterococcus faecium Lyobacter SFL Enterococcus faecium SFL

Destinaia Toate animalele Viei, purcei Viei, purcei Viei, purcei Poligastrice Toate animalele Porci Toate animalele Toate animalele

65

Multigerm Biosaf SC 47 Bioplus 2B SF 68 Enteroferm Degefermenti Bacteriolact

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium Saccharomyces cerevisiae SC 47 Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis Enterococcus faecium SF 68 Trei sue de Lactobacillus, Enterococcus sp., Saccharomyces sp. Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis Lactobacillus casei, Streptomyces thermophilus

Porci Toate animalele i mai ales poligastrice Toate animalele Toate animalele Toate animalele Toate animalele, probiotic, medicament Probiotic, medicament, viei, porci

Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tabelul 4. Cele mai ntlnite bacterii din tractul digestiv al porcilor. Specia de microorganisme Nr. crt. Specia de microorganisme Bacteroides ruminicola Bacteroides uniformis Bacteroides succinogenes Butyrivibrio fibrisolvens Clostridium perfringens Escherichia coli Eubacterium aerofaciens Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Lactobacillus cellobiosus 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Lactobacillus salivarius Peptostreptococcus productus Proteus sp. Ruminococcus flavefaciens Selenomonas ruminantium Streptococcus bovis Streptococcus equinus Streptococcus salivarius Veillonellae sp. Lactobacillus fermentum

Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8

Tabelul 5. Cele mai ntlnite bacterii din tractul digestiv al psrilor. Specia de microorganisme Nr. crt. Specia de microorganisme Bacteroide sp. Bacteroides fragilis Bifidobacterium bifidus Clostridium perfringens Clostridium beijerinckii Clostridium sp. Eubacterium sp. Fusobacterium sp. 9 10 11 12 13 14 15 16 Gemmiger formicilius Lactobacillus acidophilus Lactobacillus fermentum Lactobacillus salivarius Micrococcus sp. Streptococcus faecium Streptococcus faecalis Ruminococcus obeum

66

II.3. MODUL DE ACTIUNE AL PROBIOTICELOR n anul 1989 Raibaud i Raynaud, au ncercat s fac un rezumat privind mecanismul de aciune al probioticelor, s explice creterea performanelor zootehnice i mbuntirea sntii la om i animale. Au fost emise o mulime de ipoteze, asupra modului de aciune a probioticelor, precum i mai multe speculaii dar, n principal trebuie avute n vedere urmtoarele: Probioticele inhib proliferarea bacteriilor patogene prin producerea de acizi organici i prin reducerea pH; Produc H2O2 i previn aderarea bacteriilor patogene la peretele intestinului; Produc metabolii capabili s neutralizeze toxinele bacteriene in situ ori s inhibe producia lor. Datorit atenurii catabolismului intradigestiv, apare o reorientare a microflorei intestinale cu scopul reducerii absorbiei substanelor toxice cum ar fi NH3, amine, indoli precum i diminuarea biotransformrilor srurilor biliare i ale acizilor grai, n produi toxici; Prin enzimele proprii probioticele cresc utilizarea digestiv a hranei precum i procesele de detoxifiere. Ameliorarea digestibilitii alimentelor ingerate se realizeaz prin: hidroliza lactozei de ctre - galactozidaz; degradarea - glucanilor de ctre anumite sue probiotice glucanolitice; stimularea activitii enzimatice a microorganismelor endogene care permite o mai bun asimilare a alimentelor; stimularea unor enzime propii celulelor epiteliale ale tractului digestiv (lactaz, invertaz, maltaz) Probioticele stimuleaz producia de vitamine aparinnd n general grupului B i determin creterea activitii lactazei, invertazei i maltazei; Se nmulesc n tubul digestiv i distrug bacteriile patogene; Reduc catabolismul microbilor, tinznd ctre un echilibru mult mai bun ntre lactobacili; Stimuleaz imunitatea gazdei prin aciune asupra celulelor implicate n imunitatea natural i n imunitatea specific. Se cunoate c fagocitoza este realizat, n principal, de macrofagi i aceasta se constituie ca un mecanism principal de aprare nespecific al organismului la ptrunderea unei substane strine. Probioticele stimuleaz deci activitatea macrofagilor. Probioticele pot influena imunitatea nespecific. Aceasta cuprinde dou sisteme: un sistem care acioneaz prin anticorpii secretai de limfocitele B (imunitate umoral) i un alt sistem care acioneaz prin intermediul direct al limfocitelor T (imunitate cu mediere celular). Cele dou sisteme comunic ntre ele prin intermediul substanelor chimice denumite interleukine. Creterea rspunsului imunitar specific se traduce printr-o activare a limfocitelor T i B ceea ce provoac o cretere a nivelului de interleukine i anticorpi circulani (imunoglobulinele M i imunoglobulinele G). Probioticele au i efect asupra produciei de anticorpi (n principal imunoglobulinele A) n lumenul intestinal. n contact cu antigenii prezeni n coninutul digestiv, imunoglobulinele A sunt foarte importante n tractul digestiv, constituindu-se ca o prim cale de aprare contra infeciei. Imunoglobulinele A pot inhiba adeziunea bacteriilor patogene la suprafaa mucoasei tractului digestiv prin: 1 - aglutinarea bacteriilor; 2 - fixarea pe proteinele adezive, prezente la suprafaa bacteriilor; 3 - interferarea n complexul substane adezive/receptori celulari. Este important de amintit faptul privitor la adeziunea microorganismelor la animalele terestre unde microbiologii deosebesc adeziunea nespecific de adeziunea specific. Cuvntul adeziune

67

definete suprafaa unei macromolecule, cunoscut a fi responsabil de aderena specific. Specificitatea adeziunii celulelor animale apare ca rezultat al compoziiei chimice a structurilor responsabile de activitatea adeziv. Adezivii bacterieni n majoritatea lor sunt de natur proteic, n special la bacteriile Gram negative i Gram pozitive. Aceste proteine de aderen, care difer semnificativ ntre ele prin greutatea molecular, compoziia n aminoacizi i structura cuaternar, se pare c recunosc i leag receptorii carbohidrani de suprafaa glicocalixului. O a doua activitate de adeziune este exercitat de acizii lipoteicoici ai Streptococcus pyrogenes care s-a presupus c se ataeaz pe membranele celulei gazd prin intermediul resturilor de acizi grai din acizi lipoteicoici prin interaciuni hidrofobe. Al treilea mecanism de adeziune specific rezult din depozitarea matricelor de polizaharide insolubile de ctre bacteria Streptococcus mutans, pe suprafaa dinilor, urmat de o lipire a polizaharidelor extracelulare la suprafaa componentelor bacteriene. In concluzie, multe activiti adezive nu sunt cunoscute nc. Numrul i puterea acestor interaciuni variaz de la caz la caz ca i nivelul aderrii unui microb la o varietate de suprafee. Toate acestea nu implic specificitate. Numeroase studii de microscopie electronic au demonstrat claritatea apariiei aderrii, colonizarii ori asocierii bacteriilor n diferite pri ale intestinului la o varietate de animale vertebrate, cum ar fi: obolani, oareci, porci, psri, rumegtoare i oameni. (Chan i colab., 1984) Referitor la colonizarea microbian, conceptul iniial a fost c probioticele trebuie s colonizeze mucoasa i s se multiplice in situ n scopul de a produce substane ori metabolii n beneficiu lor. Faptul c numrul microorganismelor probiotice viabile este constant n fazele respective nu este suficient pentru a ncheia colonizarea. ntr-adevr nmulirea bacteriilor probiotice n timpul tranzitului lor n tubul digestiv este cteodat foarte limitat i nu suficient. Muli autori pretind c bacteria acidului lactic folosit ca probiotic ader la celulele marginale cu cili intestinali. Aceast proprietate ar trebui s permit microorganismelor s prolifereze in situ. ns datele experimentale arat c nu este o condiie sine qua non. (Lee, 1980) La obolani i oareci holoxenici, dominantul Lactobacillus murinus nu ader la celulele stomacale. Cteva tipuri de lactobacili ader bine la celulele stomacale ale obolanilor i oarecilor holoxenici, dar nu ader la pereii celulari ai puilor. Probioticele inhib aderarea enterobacteriilor patogene (E. coli)care scad considerabil numrul celulelor ce conin imunoglobina A. Locurile de aderare pentru Lactobacili i E. coli nu sunt aceleai iar mecanismul exact de aciune se refer fie la controlul direct al microorganismelor, fie la aciunea indirect prin stimularea microflorei autohtone i a metabolismului lor. Imediat dup natere se pot implementa tipuri aparinnd microflorei autohtone normale. Este interesant a relata cercetrile franceze recente efectuate pe copii cu Bifidobacterium longum, o bacterie anaerob (Gram pozitiv) i care este un locuitor normal al intestinului copiilor, adulilor i animalelor. Laptele fermentat de Bifidobacterium longum a dat rezultate mult mai bune la copii mpotriva diareii, consecutiv folosirii antibioticului eritromicin dect iaurtul; mai mult dect att laptele fermentat este activ mpotriva infeciei cu Rotavirus. Cel mai relevant fapt al acestui experiment este n primul rnd acela c are o activitate pozitiv n reducerea Escherichia coli i Clostridium perfringens, prin metaboliii (glicoproteine) formai n timpul fermentrii laptelui cu Bifidobacterium longum. Ramond (1989) a relatat c tipurile de Bifidobacterium ader la mucoas i la receptorii de - glucosamin la fel ca i unele tipuri patogene de E. coli. Se pare c Bifidobacterium longum este dificil de implementat, dac numrul de germeni autohtoni este de 1011/g. Aceste experimente arat clar c importan au att viabilitatea i natura receptorilor, ct i unii metabolii formai din fraciunea de - cazein n timpul fermentrii laptelui, care pot aciona mpotriva bacteriilor patogene i a ctorva infecii virale. Lactobacili viabili din iaurt au ase proprieti (Antoine, 1989): 1 - supravieuiesc n timpul tranzitului digestiv;

68

2 3 4 5 6

- dezvolt activitatea antidiareic la copii i aduli; - diger lactoza; - desfoar o activitate probiotic la animale; - sunt capabili de a detoxifia prin reducerea activitii nitroreductazei glucoronidazei i azotoreductazei; - administrarea iaurtului i lactobacililor crete nivelul interferonului la oameni.

Cteva tipuri de Bacillus licheniformis produc un antibiotic la oriceii monoxenici care inhib puternic Clostridium perfringens. Nu a fost dovedit in situ, dac probioticele produc antitoxine. Exist o cretere a utilizrii digestive a hranei, care a fost verificat pe oricei i oameni n experimente cu iaurt i Saccharomyces boulardi. Aceasta nseamn c celulele vii de microorganisme, n timpul tranzitului intestinal pot modifica producia de enzime n celulele marginale cu cili. Probioticele stimuleaz sistemul imunitar nespecific al animalelor. Exist cteva indicaii clare c la oricei holoxenici ingerarea iaurtului proaspt crete nivelul imunoglobinei 2A sau crete activitatea fagocitar i limfolitic. La oameni, iaurtul induce de asemenea o cretere uoar de - interferoni. Concluzii: Referitor la modul de aciune a probioticelor, au fost emise o mulime de ipoteze, i mai multe speculaii dar, n principal trebuie avute n vedere urmtoarele: 1 - Probioticele inhib proliferarea bacteriilor patogene prin producerea de acizi organici i prin reducerea pH; 2 - Produc H2O2 i previn aderarea bacteriilor patogene la peretele intestinului; 3 - Prin enzimele proprii probioticele mresc utilizarea digestiv a hranei precum i procesele de detoxifiere; 4 - Probioticele stimuleaz producia sistemului imunologic ca barier de protecie a tubului digestiv, fiind demonstrat c administrarea de preparate cu Lactobacillus poate stimula producia de - globuline, - interferoni i intensific activitatea macrofagelor responsabile de ndeprtarea agenilor patogeni din organism; 5 - Probioticele stimuleaz producia de vitamine aparinnd n general grupului B i determin creterea activitii lactazei, sucrazei i maltazei; 6 - Prolifereaz n tractul digestiv fiind n competiie cu bacteriile patogene; Utilizarea probioticelor n hrana animalelor are efecte benefice n urmtoarele activiti: 1 - Tulburri ale microflorei indigene: 1 - disbacterioze neinfecioase dup doze mari cu antibiotice; 2 - stress (schimbri n alimentaie, transport); 2 - Dezvoltarea deficient a microflorei; 3 - Promovarea creterii; 1 - conversie mai nalt a hranei; 2 - sinteza vitaminelor; 3 - predigestia proteinelor. n plus, se pare c probioticele ar avea oarecare potenial n tratamentul i prevenirea bolilor coronariene i encefalopatiilor, fiind demonstrat c administrarea de probiotice poate reduce nivelul colesterolului plasmatic la pui. De asemenea s-a sugerat c probioticele pot fi eficiente n combaterea unor forme de cancer, att pe calea aciunii sistemului imunitar ct i prin inhibarea unor enzime ca - glucoronidaza, - glucozidaza i nitroreductaza, care sunt implicate n carcinogeneza intestinal.

69

CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR PROBIOTICE Pentru a putea fi ncadrate n categoria microorganismelor probiotice, acestea trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: 1 - s produc substane utile organismului; 2 - s fac parte sau s influeneze favorabil flora digestiv normal a organismului; 3 - s se regenereze i s se dezvolte ntr-un timp ct mai scurt; 4 - s colonizeze un timp ct mai ndelungat tractul digestiv; 5 - s aib stabilitate ridicat i s poat fi obinut cu uurin; 6 - ar fi de dorit ca stabilitatea microorganismelor probiotice s fie permanenta adic s rmn la concentraia corespunztoare dup prima administrare; n practic dac se ntrerupe pentru o anumit perioad de timp administrarea probioticului, efectul benefic dispare. Cele mai utilizate microorganisme pentru producerea probioticelor sunt: Lactobacillus: acidophilus, bulgaricus, casei, helveticus, lactis, salivarium, plantarum Streptococcus: termophylus, faecium, fecalis Dintre toate speciile amintite doar Streptococus termophylus i Lactobacillus bulgaricus nu fac parte dintre microorganismele tubului digestiv. II.4. BIOMASA DIN DROJDII CU ROL PROBIOTIC n prezent cea mai utilizat tulpin de drojdie sub form de produs probiotic este Saccharomyces cerevisiae. Sursa de carbon utilizat n procesul biotehnologic de obinere de biomas viabil este etanolul, deoarece este disoponibil ca materie prim pur, este acceptabil ca ingredient alimentar i este complet solubil n ap. Fiind un proces aerob, obinerea biomasei viabile din drojdii pe etanol se realizeaz n condiii aseptice, la concentraii limitative de substrat i la o rat nalt de cretere, care asigur un randament mare de bioconversie n biomas. Cercetrile au artat c ingestia de Saccaromyces cerevisiae are efect protector asupra florei microbiene intestinale, inhibnd dezvoltarea bacteriilor patogene, stimuleaz imunitatea organismului i echilibreaz flora saprofit intestinal, dup tratamentul cu antibiotice i chimioterapice. Episoadele uoare sau severe de diaree constituie principalul efect al tratamentului cu antibiotice. Forma cea mai frecvent a deranjamentelor intestinale este colita pseudomembranoas. Printre cile ecologice de control ale acestor diarei ce rezult din dezechilibrarea microflorei intestinale se numr mai multe microorganisme nepatogene care pot fi folosite pentru restabilirea echilibrului. Dintre microorganismele existente, Saccharomyces boulardii a fost cea mai studiat. (Bergogne-Brzin, 1995) Pe lng datele obinute din cercetri in vitro, experienele efectuate pe cobai (infectai cu Clostridium difficile) au confirmat potenialul lui S. boulardii n prevenirea efectelor patogene ale toxinelor A i B(secretate de Clostridium difficele) i n scderea numrului de colonii ale microorganismelor patogene. n mod similar n cazurile pacienilor cu manifestri grave de diaree, au fost administrate doze de S. boulardii, care au prevenit diaree i colita pseudomembranoas, determinnd decontaminarea selectiv a tractului digestiv. (Corbon i colab., 1995) Efectele nedorite ale antibioticelor sunt legate de toxicitatea direct a anumitor produse asupra unor organe (ex. nefrotoxicitate, neurotoxicitate, hepatotoxicitate), de efectele farmacologice i metabolice (interaciunea metabolic a macrofagelor cu teofilina) i de efectele imunologice (alergii la penicilin i alte antibiotice). Printre efectele secundare ale antibioterapiei cele mai frecvente sunt accidentele digestive (prin diverse tipuri de molecule) de tipul diareelor de intensitate i gravitate variabil, care cedeaz

70

n urma tratamentului. Unele forme mult mai severe necesit spitalizare, cum ar fi colitele pseudomembranoase asociate cu Clostridium difficile. Practic, toate familiile de antibiotice provoac, diarei de intensiti variabile, n funcie de modul de aciune i de spectrul de influen. Datorit stresului, al antibioterapiei sau al tratamentelor imunosupresoare, la pacienii cu disfuncii grave se constat anomalii profunde ale microflorei digestive. n acest context, o patologie sever asociat cu ingestia unor substane, este colita pseudomembranoas n timpul creia multiplicarea bacteriei Clostridium difficile este nsoit de producerea simultan a dou toxine o enterotoxin (A) i o citotoxin (B) responsabile de leziunile stomacale i de simptome severe. Tratamentele specifice pentru eradierea eventualilor ageni patogeni i msurile indispensabile de corecie a disfunciilor electrolitice s-au propus a se asocia cu aportul de microorganisme nepatogene pentru restabilirea cel puin parial a unui nou echilibru intestinal.

III ASPECTE ALE UTILIZRII PROBIOTICELOR LA FABRICAREA PRODUSELOR LACTATE ACIDE III.1 INTRODUCERE Timp de secole s-a considerat c prin consumul de produse lactate acide se mbuntete starea de sntate, ceea ce ar conduce la creterea longevitii umane. n secolul XX, Eli Metchnikoff, ctigtorul Premiului Nobelpentru biologie, a furnizat un suport tiinific pentru afirmaia anterioar. Studiul su a sugerat c lactobacilii ar putea contracara efectele putrefactive ale metabolismului gastrointestinal. De atunci, mai muli cercettori au abordat studiul efectelor consumului de produse lactate acide, i n special al metabolismului bacteriilor lactice. Termenul probiotic se refer la un grup de microorganisme cu aciune benefic asupra sntii umane. n S.U.A., bacteriile probiotice includ bacterii lactice din speciile Lactobacillus i Bifidobacterium i sunt definite ca organisme vii care, consumate ntr-o anumit cantitate, determin beneficii asupra sntii, alturi de beneficii nutriionale. Tendina consumatorilor a migrat de la alimente lipsite de grsimi, cu un coninut sczut de sare i colesterol, spre alimente funcionale fortifiante i suplimentate cu anumite ingrediente. Deoarece muli productori au ezitat s fabrice alimente funcionale datorit reglementrilor severe, cei mai muli consumatori au apelat la suplimente nutriionale. Traiectul gastrointestinal uman reprezint un ecosistem complex, care conine, n mod natural, circa 400 de specii de bacterii. Mecanismele care regleaz numrul, tipul i activitatea metabolic a acestor tipuri de bacterii sunt deosebit de complexe. Totui, unele bacterii (din genul Lactobacillus i Bifidobacterium) au o aciune de prevenire fa de bacteriile patogene. Ambele specii de bacterii Lactobacillus i Bifidobacterium se regsesc n cadrul florei ce populeaz traiectul gastrointestinal (cele din genul Bifidobacterium predomin n timpul copilriei), dar numrul acestora se diminueaz cu vrsta, consumul de alcool, administrarea de antibiotice, stresul i ali factori. Pentrua sprijini activitatea bacteriilor din flora normal, consumatorii pot introduce n traiectul gastrointestinal (prin consum oral) probioticele, ntrind lupta organismului asupra potenialelor bacterii duntoare. Activitatea metabolic a probioticelor poate influena pozitiv asupra raportului bacterii neduntoare/bacterii duntoare. S-a constatat o multitudine de efecte benefice asupra sntii umane n urma consumului de bacterii probiotice. mbuntirea digestiei lactozei la persoanele cu deficient de lactaz i prevenirea unor tipuri de boal diareic sunt dou dintre cele mai cunoscute efecte ale consumului de bacterii probiotice.

71

Pentru alte beneficii ale ingestiei de probiotice se ateapt confirmarea tiinific. Cercettorii au artat c efectele benefice asupra sntii variaz n funcie de cantitatea de probiotice ingerat i de durata de administrare. Mecanismele prin care probioticele influeneaz microbiota traiectului gastrointestinal sunt considerate nc insuficient elucidate, dar s-au observat cel puin patru mecanisme de aciune: 1. Agenii antibacterieni, incluznd acizii organici (cum ar fi acidul lactic i acidul acetic) i proteinele (bacteriocine), sunt produi de bacteriile probiotice i pot avea efect inhibitor asupra microflorei patogene din traiectul gastro-intestinal; 2. Laptele uman, care conine componente bioactivatoare stimuleaz creterea bifidobacteriilor din traiectul gastrointestinal al copiilor, poate modifica antagonismul bacterian i poate mpiedica creterea bacteriilor aerobe nedorite; 3. Modularea sistemului imunitar (anticorpi, celule T, interferon) poate suprima activitatea patogenilor sau carcinogenilor; 4. Bacteriile probiotice stimuleaz producia lactazei n intestinul subire, de aceea digestia lactozei este mbuntit i se previne utilizarea lactozei n colon. Totui, mecanismul de aciune al probioticelor nu este pe deplin elucidat, in condiiile in care o mic parte din cantitatea de probiotice ingerat rmne vie. Pentru a rmne n via, probioticele trebuie s reziste aciunii aciditii din stomac, s treac de intestinul subire ca, mai apoi s ajung n colon. Cercetrile au artat c bacteriile probiotice nu ader la peretele intestinal, ci ele se dezvolt pe parcursul traiectului gastrointestinal. De aceea, se consider c un consum zilnic de bacterii probiotice este, probabil, cea mai indicat cale de a menine activitatea benefic a acestora. III.2. CERCETRI ACTUALE ASUPRA MODULUI DE ACIUNE A PROBIOTICELOR DIN PRODUSELE LACTATE Cercettorii i-au concentrat eforturile pentru investigarea i caracterizarea componentelor produse de ctre culturile probiotice i modul n care condiiile de parcurgere a traiectului gastrointestinal afecteaz activitatea i dezvoltarea probioticelor. O serie de cercetri au vizat bacteriocinele, care sunt peptide cu mas molecular mic produse de ctre unele bacterii i care exercit un efect bactericid asupra altor specii de bacterii. Unii cercettori au studiat efectul consumului de iaurt fabricat cu ajutorul culturilor probiotice asupra traiectului gastrointestinal. S-a urmrit s se demonstreze modul n care este crescut rezistena la cancer i infecii dup consumul de iaurt cu specii de Bifidobacterium. Cercetrile au urmrit dou aspecte: izolarea limfocitelor de la cobaii hrnii cu iaurt, identificarea i urmrirea abilitii limfocitelor de a secreta hormoni care s produc anticorpi. Cel de al doilea aspect a vizat creterea limfocitelor direct pe culturile starter de iaurt i cuantificarea funciilor imune ale componentelor rezultate. Se consider c exist un efect sinergetic ntre componentele produselor lactate i culturile probiotice, iar produsele lactate reprezint un suport ideal pentru introducerea probioticelor n sistemul gastrointestinal. Cercetrile au confirmat abilitatea lactoferinei de a mbunti procesul de cretere al bifidobacteriilor, n mod direct prin mrirea numrului de celule vii i indirect, prin reducerea bacteriilor intestinale productoare de toxine. Un criteriu esenial n alegerea probioticelor pentru obinerea produselor alimentare este acela de abilitate a microorganismelor de a supravieui n timpul depozitrii, n aa fel nct s se asigure c vor ajunge n intestin celule viabile. Cel mai utilizat produs lactat cu probiotice este iaurtul care are un pH relativ sczut. Abilitatea de cretere i supravieuire a diferitelor specii de probiotice depinde n mare msur de nivelul de aciditate din mediu. n mod curent, au fost selectate pentru utilizare n produsele lactate acele specii de probiotice care s poat supravieui n condiiile de fabricare, depozitare i distribuie. Unii cercettori au dezvoltat o tehnic de

72

mbuntire a bifidobacteriilor n produsele lactate. Tehnologia implic capturarea bifidobacteriilor n gel de alginat de calciu. Dup stabilirea tiinific a efectelor consumului de culturi probiotice, utiliznd produsele lactate ca suport, este necesar s fie identificate care dintre beneficiile asupra sntii are un impact mai mare asupra consumatorilor. La nivel mondial s-a creat o baz de date n care sunt indicate performanele i funcionalitatea culturilor de probiotice n produsele lactate. Aceasta urmrete s furnizeze productorilor informaii despre culturile probiotice, n vederea selecionrii corecte a speciei de culturi indicate pentru un anumit produs lactat. Bacteriile probiotice se pot utiliza pentru o larg varietate de produse lactate, cum ar fi laptele, laptele acidofil, iaurtul i brnza Cottage. Dintre atributele ce pot fi selectate n baza de date, se pot enumera: activitatea lactazic, rezistena la antibiotice abilitatea de a crete n prezena fructo-oligozaharidelor rezistena la aciditate, producia inhibitorilor microbieni Este demn de remarcat faptul c orice probiotic selectat pentru efectele sale asupra sntii poate s nu fie un bun candidat pentru producia industrial. n general, productorii adaug cultura de probiotice dup pasteurizare i nainte de ambalare. Este necesar s fie asigurate condiii de sterilitate i prevenirea contaminrii produsului. Timpul i temperatura de depozitare pot afecta de asemenea viabilitatea celulelor probiotice. La crearea unor noi produse lactate probiotice trebuie s se in seama de consideraiile anterioare. Culturile de probiotice nu trebuie selectate doar pentru activitatea lor probiotic, ci i n funcie de adaptabilitatea la condiiile de fabricare i distribuie. III.3 PRODUSE DE TIP PROBIOTIC Probioticele pentru consum uman pot fi de mai multe tipuri i o parte dintre ele sunt prezentate n continuare. PRODUSE TIP BABY-FOOD Avnd n vedere c bifidobacteriile sunt sunt pseudodominante n tractul intestinal al sugarilor, utilizarea lor n produse probiotice este justificat de aspectele benefice aduse de acestea : -

competiia antagonic cu bacteriile patogene inhibarea reducerii NaNO3 la NaNO2 mbuntirea reteniei azotului i a creterii n greutate a sugarilor protecia fa de infeciile enterice i fa de efectele secundare ale antibioticelor ajutor n terapia tulburrilor intestinale

Produsele baby-food care folosesc bifodobacterii sunt: LACTANA B (Germania) sub form de pulbere , care conine Bifidobacterium bifidum, celule viabile i lactuloz(substan prebiotic0 FEMILACT (Cehia) care se obine prin fermentarea unei smntni slabe(12% grsime) cu o cultura mixt format din : Bifidobacterium bifidum , Lactobacillus acidophilus , Pediococcus acidilacti, n raport 1: 0.1 : 1 , la temperatura de 30 o C , pn la aciditatea dorit , urmat de racire. In continuare se adaug ulei vegetal , lactoz, proteine din zer i vitamine , apoi amestecul se omogenizeaz i se usuc prin pulverizare. Produsul finit , dup reconstituire, conine 0.25 % acid lactic, 10 8 - 10 9 bacterii viabile/ml .Dupa o depozitare timp de doua luni , numrul bacteriilor viabile se reduce cu un factor de 10.

73

PRODUSE LACTATE FERMENTATE DE TIP PROBIOTIC PENTRU COPII SI ADULTI LAPTELE ACIDOFIL PENTRU COPII Produsele care conin Lactobacillus acidophilus sunt importante pentru c microorganismul menine balana microbiotei intestinale, avnd capacitate de supravieuire n tractul intestinal.Trebuie avut n vedere c Lactobacillus acidophilus scade numeric dac pH-ul mediului este mai mic de 5. Laptele acidofil destinat copiilor se prepar din lapte pasteurizat la 95 o C/10 min , rcit la 37 o i meninut la aceast temperatur timp de 3-4 ore pentru germinarea sporilor, dup care urmeaz o nou pasteurizare /rcire i inocularea cu 2-5 % cultur de producie probiotic. Produsul are pH= 5.5-6.0 i conine un numr de aproximativ 3*10 9 bacterii viabile/ml. Dap fermentare produsul este rcit la 5-10 o C i este rapid distribuit pentru c la depozitare numrul de celule viabile de Lactobacillus acidophilus se reduce .

LAPTELE ACIDOFIL DULCE Se prepar din lapte pasteurizat i rcit, la care se adaug un concentrat de Lactobacillus acidophilus , astfel nct s se obina o concentraie de celule vii de 5-10 6/ml. Produsul se depoziteaz la 5 o C , la aceast temperatur neavond loc fermentarea deci produsul rmne dulce. LAPTELE BIFIDUS Laptele bifidus tip 1 Tehnologia de preparare include : - standardizarea laptelui la coninutul de grsime dorit - standardizarea la concentraia proteic dorit - omogenizarea - tratamentul termic la 85-120 o C timp de 5-30 min - inocularea cu 10 % cultur starter probiotic - termostatarea la 37 o C pna la coagulare - rcirea Cultura starter este format din Bifidobacterium bifidum. Produsul finit poate fi prezentat ca un coagul sau sub form de produs agitat(omogenizat0, anond pH-ul=4.3-4.7 i un numr de 10 8- 10 9 /ml. Acest numr scade dup o depozitare de 1-2 sptmni. Se poate obine i un lapte bifidus cu gust de iaurt , prin fermentarea zerului i a laptelui degresat mbogit cu proteine , cu o cultur de Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum i Bifidobacterium infantis. Produsul se obine dintr-un amestec rezultat la ultrafiltrarea zerului dulce (factor de concentrare =8) cu lapte degresat ultrafiltrat (factor de concentrare=20 , amestec care se pasteurizeaz la 80 o C/30 min, este racit la 37 o C, mbogit cu treonin 0.15, inoculat cu 2% cultur starter probiotic , apoi este termostatat la 37 o C/ 24 ore i rcit la 4 o C. Produsul finit are 15% substant uscat , incluznd 7.3 % protein i 1.3 % grsime , un pH= 4.7 , un nivel de acetaldehid de 29-39 ppm.Produsul conine de asemenea un numr de 10 9 celule viabile /ml. Acest numr scade dup o depozitare de 21 zile la 10 7 celule viabile /ml.

74

Bibilografie : 1. Banu, C.- Biotehnologii in industria alimentar, Editura Tehnic, Bucureti,1987 2. Banu, C.- Biotehnologii in industria alimentar, Editura Tehnic, Bucureti,2000

75