MICOTOXINE

Definiție și generalități

Micotoxinele sunt produși secundari ai fungilor ca și antibioticele doar că acestea sunt

toxice pentru animale și oameni. Toxicitatea lor este destul de mare și astfel cantități foarte mici
pot influența starea de sănătate a organismului.

Aproape toate micotoxinele sunt citotoxice și pot produce spargerea membranelor celulare
și să împiedice sau să influențeze sinteza ADN, ARN și a proteinelor.

Termenul micotoxine a fost dat în 1961 după ce lângă Londra (Anglia) aproximativ 100000
de curcani au murit din cauza unei boli misterioase numită “boala X a curcanilor”. Ulterior s-a
descoperit că cei 100000 de curcani au murit din cauza arahidelor cu care aceștia au fost hrăniți.
Arahidele erau contaminate cu metaboliți secundari ai Aspergillus flavus (aflatoxine).

Micotoxinele se găsesc în sporii și talul micetilor sau ca produși de secreție ai acestora în

substraturile care se dezvoltă. Există aproximativ 300 – 400 micotoxine ce aparțin la 24 de grupe
chimice de toxine care pot apărea în condiții diferite în producțiile agricole și in diferitele alimente
obținute din acestea.

Principalele familii de micotoxine

 CONTAMINAREA CEREALELOR CU MICOTOXINE
Pe tot parcursul lanțului alimentar, din câmp și terminând cu alimentația umană, există o
mare probabilitate ca una sau mai multe specii de mucegaiuri să se dezvolte și să producă
micotoxine, dacă există condiții favorabile de mediu. Plantele sunt mai susceptibile la atacul
fungilor în condiții de stres, cum ar fi irigarea excesivă, expunerea la pesticide, prezența insectelor
dăunătoare etc.

Cerealele reprezintă matrici vegetale care, prin structura si compozitia lor, favorizează, în
condiții de mediu prielnice, formarea unor metaboliți secundari, micotoxine, generate de fungi
care se dezvoltă pe aceste substraturi. Micotoxinele se pot dezvolta pe cereale in timpul cultivării,
transportului, depozitarii sau procesării, transferându-se produsului finit.

Dintre micotoxinele cu toxicitate si incidență ridicată în cereale, cele mai frecvente în

culturile din țara noastră dezvoltate ca urmare a condițiilor favorabile de mediu, sunt: aflatoxina,
ochratoxina A, deoxinivalenolul, zearalenona si fumonisinele. Cauzele și factorii care concură la
dezvoltarea fungiilor și elaborarea de micotoxine se referă la abilitatea genetică a unor fungii de a
elabora anumite micotoxine, natura substratului, umiditatea mediului și a substratului și
temperatura.

Având în vedere toxicitatea ridicată a acestor compuși și riscul de contaminare al cerealelor

cu micotoxine, îndeosebi în contextul practicării agriculturii organice unde aplicarea de fungicide
sintetice este interzisă, informarea producătorilor agricoli și a procesatorilor din industria
alimentară cu privire la posibilitățile de reducere a contaminării prezintă deosebit interes.

Metode de determinare a micotoxinelor din alimente

Tehnicile de determinare pentru micotoxine sunt laborioase şi necesită echipament sofisticat.

Determinarea micotoxinelor presupune eşantionare, extracţie cu solvenţi organici sau apă,
purificare pe coloane cromatografice şi detectare cantitativă. Metodele analitice cuprind:
  teste de screening;
 metode cantitative.

Prima categorie cuprinde tehnica cromatografiei în strat subţire pentru separare finală şi
detecţie, de asemenea, tehnica imunoenzimatică ELISA, dezvoltată pentru screening rapid şi
cuantificare a micotoxinelor din cereale.

Metodele cantitative cuprind următoarele etape: extracţie, curăţare, separare şi detecţie.

De exemplu, extracţia deoxinivalenolului din probă se poate realiza prin agitare mecanică sau
omogenizare cu soluţie de acetonitril sau metanol, timpii de extracţie influenţând gradul de
extracţie a toxinei din matrice. Curăţarea (separarea) nu este necesară în cazul metodelor
imunochimice, fizico-chimice. Aceasta se bazează pe o serie de metode, cum sunt: partiţie lichid-
lichid, extracţie pe faza solidă, separare pe coloana cromatografică, coloane de imunoafinitate şi
coloane multifuncţionale. Pentru determinare cantitativă a deoxinivalenolului şi ochratoxinei
A se utilizează metoda ELISA. Metoda kit-urilor test ELISA este o metoda rapidă ce permite
obţinerea de rezultate în timp scurt, domeniul de sensibilitate fiind de ordinul microgramelor.
Pentru investigaţii de mare precizie şi acurateţe (domeniul nanogramelor) şi confirmarea
rezultatelor obţinute prin ELISA este necesar a se aborda o metodă mai sensibilă.

ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) reprezintă un lanţ de reacţii în care primul
reactant (antigenul sau anticorpul, în funcţie de scopul urmărit) este imobilizat pe un suport solid.
Al doilea reactant al lanţului se leagă de elementul fix, în baza specificităţii dintre antigen şi
anticorp. Imunocomplexul format cuplează cel de-al treilea reactant marcat enzimatic tot printr-o
reacţie antigen-anticorp. Sfârşitul reacţiei are loc prin adăugarea de substanţe cu rol de stopare.

Metode de analiză pentru determinarea rapidă, sensibilă, şi corectă a acestor micotoxine din
cereale neprelucrate şi produsele pe bază de cereale sunt foarte necesare, în scopul de a evalua în
mod corect atât riscul de expunere relevante şi riscul relevant toxicologic pentru oameni şi animale,
precum şi pentru a se asigura că nivelurile de reglementare stabilite de UE sau de alte organizaţii
internaţionale sunt îndeplinite.
Printre metodele de detecţie se pot enumera:

 cromatografia în strat subţire (TLC);

 gaz cromatografia (GLC);
 . cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC);
 spectroscopia de masă (MS).

Metode cromatografice utilizate în mod obişnuit pentru a determina cantitatea de micotoxine

din cereale includ cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cuplată cu ultraviolete
(UV), de diode (DAD), fluorescentă(FD) sau spectrometrie de masă (MS) detectoare, şi gaz-
cromatografie (GC) cuplat cu captură de electroni (ECD), ionizare cu flacără (FID) sau detectore
MS imunoenzimatice (ELISA).

Metodologia de prelevare a probelor este esenţială. Metodele folosite trebuie validate şi trebuie
să răspundă criteriilor pentru selecţia metodelor de analiză pentru micotoxine publicate în 1999 de
European Commitee of Standardisation (CEN). Acestea includ repetabilitatea, reproductibilitatea
şi limitele minime de detecţie (Mencinicopschi, Gh., 2005). În prezent, detectarea micotoxinelor
implică proceduri laborioase precum extracţia, purificarea prin coloana cromatografică şi abia în
final detecţia propriu-zisă. Aceasta este realizată prin CCM, HPLC, GC-MS, electroforeza capilară
sau test imunologic (ELISA).

În funcţie de produsul analizat, etapa de purificare poate fi evitată. Limita de detecţie a acestor
metode este sub 0.05 mg/l sau kg de produs. Deşi numeroase tehnici sunt deja utilizabile pentru
detecţia micotoxinelor, acestea rămân inaccesibile ca preţ şi mari consumatoare de timp. Există şi
metode mai noi care utilizează biosenzorii pentru evaluarea purităţii toxicologice a produselor
alimentare (Nicolau, A.,2000).

Cele mai multe metode folosite pentru determinarea micotoxinelor trebuie să se bazează pe
extracţia corectă şi precisă, cu excepţia metodei ELISA care este probabilă şi nu poate solicita
refacerea. Aceste etape sunt vitale pentru un protocol de succes, deoarece acestea sunt
consumatoare de timp (proba preparată este factorul principal în timpul unei analize şi durează
aproximativ două treimi din total) şi vor afecta alegerea finală a probei de detectare. Metoda de
extracție utilizată pentru a elimina micotoxine din matricea biologică este dependentă de structura
de toxină.

Testele ELISA sau membrana pe baza de imunoteste, sunt frecvent ulterior utilizate în scopuri
de screening. Recent, o varietate de metode rapide, care sunt în curs de dezvoltare au fost propuse
pentru analizarea micotoxinelor.Ele se bazează pe tehnologii, inclusiv immunochromatography,
polarizare, fluorescenta spectroscopie în infraroşu, polimeri moleculari imprimaţi, şi biosenzori (S
elphard, 2008). Acest comentariu se ocupă cu metodologiile actuale analitice, tradiţionale şi
emergente, disponibile pentru detectarea micotoxinelor principale care se găsesc în cereale şi
produse pe bază de cereale.

Metode cromatografice de gaze în baza FID, ECD şi detectarea SM sunt metodele cele mai
utilizate pe scară largă pentru determinarea cantitativă şi simultană a trichothecenelor (tip A, în
principal), în cereale şi produse pe bază de cereale.

Teste imunologice, cum ar fi ELISA, au devenit foarte populare în screening-ul micotoxină la

sfârşitul anilor 1970. În general, ELISA nu are nevoie de alte proceduri, şi extracţia care conţine
micotoxină este analizată în mod direct. Chiar dacă de multe ori le lipsesc precizia la concentraţii
foarte scăzute şi sunt limitate în gama de matrice a examinat, imunităţi oferind teste rapide,
necostisitoare de screening. Mai multe kituri ELISA care utilizează anticorpi monoclonali sau
policlonali împotriva micotoxinelor au fost dezvoltate pentru analize calitative, semi-cantitative
sau cantitative ale principalele micotoxine cunoscute în matrice pe bază de cereale.

Simptome sau efecte ale micotoxinelor asupra organismului

Aceste simptome sunt simptome generale ale contaminării cu diferite micotoxine și nu

prezinta simptomele date de contaminarea cu mai multe micotoxine, aici putând să apară și alte
simptome din cauza sinergismului.
 Efecte asupra sistemului vascular
– fragilitatea crescută a vaselor de sânge;
– hemoragie internă – mucoase, plămâni.

Efecte asupra sistemului digestiv

– vomă;
– hemoragie intestinală;
– necroza ficatului;
– distrugerea mucoaselor.

Efecte asupra sistemului respirator

– respirație greoaie;
– sângerarea plămânilor.

Efecte asupra sistemului nervos

– tremurături;
– depresie;
– dureri de cap;
– lipsa coordonarii.

Efecte asupra pielii

– iritații;
– senzație de arsură la nivelul pielii;
– fotosensibilitate.

Efecte asupra sistemului reproducător și excretor

– infertilitate;
– nefrotoxicitate.

Efecte asupra sistemului imunitar

– distrugerea capacității de apărare a organismului și deci facilitarea infectării cu alte
microorganisme.
Dacă prezentați simptomele de mai sus trebuie să consultați un specialist.

Măsuri de prevenire a contaminării cu micotoxine și metode de

decontaminare

Prevenirea micotoxinelor cât mai mult posibil, este foarte importantă, deoarece odată
formate sunt foarte greu de îndepărtat din alimente. Sunt stabile la temperatura ambiantă şi
rezistente la scăderea temperaturii. Studiul comportamentului lor în timpul manipulării şi
procesării au arătat că micotoxinele sunt adesea concentrate în boabe sparte sau praf astfel încât în
timpul spălării poate avea loc o reducere a acestora.

Prevenirea trebuie să rămână primul obiectiv şi acesta poate fi însoţit de bune practici
agronomice, un standard ridicat de igienă a mijloacelor de transport a cerealelor, a spaţiilor de
depozitare şi monitorizarea permanentă a acestora privind umiditatea, temperatura şi infestarea cu
insecte. Este interzisă amestecarea unui lot ce prezintă un prag de contaminare superior pragului
admis cu scopul de a reduce concentraţia de micotoxine. Orice lot de cereale care are o concentraţie
mai mare decât cea admisă trebuie eliminat. Eşantionarea loturilor este foarte importantă pentru a
detecta loturile contaminate.

Ca masuri de prevenire se pot menţiona:

 înainte de recoltare – bune practici agricole;

 rotaţia culturilor;
 timp de irigare;
 plante cu rezistenţă la atacul fungilor toxigeni;
 culturi modificate genetic rezistente la penetrarea insectelor;
 excludere competitivă prin utilizarea unor tulpini netoxigene în câmp.
 îmbunătăţirea condiţiilor de producere şi depozitare a materiilor prime pentru a reduce
hazardul contaminării fungice şi producerea de micotoxine;
 introducerea de standarde pentru nivelurile de micotoxine în cereale (când sunt
contaminate cantităţi mari).
 La ora actuală, cea mai bună modalitate de a preveni efectele micotoxinelor legate de sănătate
este să prevenim expunerea – o sarcină la fel de axiomatica. În zona agriculturii controlul
răspândirii mucegaiurilor după recolta în depozite se face printr-o uscare şi depozitare
corespunzătoare a cerealelor.

Deşi utilizarea agenţilor antifungici sau a altor chimicale este potenţial reuşită, cercetătorii
investighează câteva strategii care nu se bazează pe aplicarea chimicalelor. Există şi câteva
companii ce încearcă să obţină hibrizi rezistenţi la infecţia cu Fusarium. Cercetătorii explorează şi
altă posibilitate, care are în centru potenţialul control biologic al creşterii fungilor şi producţiei de
toxine la plantele de orz. Ideea care stă la baza acestei strategii este folosirea unor specii de
mucegaiuri sau bacterii netoxigenice ca agenţi Soexclusivi, care vor concura fungii atât pe câmp
cât şi la depozitare. Această tehnică este deocamdată folosită la grâul destinat hranei animalelor,
dar cercetătorii anticipează şi unele aplicaţii comerciale în următorii ani.

În ţara noastră au existat preocupări în acest sens, fiind efectuate studii asupra incidenţei
micotoxinelor speciei Fusarium asupra culturilor de grâu şi obţinerea de hibrizi rezistenţi la atacul
mucegaiului (Ittu si colab,2000). De curând au fost semnalate preocupări în domeniul
managementului prevenirii contaminării plantelor de porumb în câmp cu aflatoxine (Oancea -şi
colab, 2005) şi de asemenea, a fost propus un studiu asupra incidenţei micotoxinelor genului
Fusarium asupra lanţului alimentar pornind de la nutreţurile pentru animale (Taranu şi colab,
2005). Se observă că studiile sunt axate preponderent asupra cerealelor în câmp sau asupra
nutreţurilor.

Proceduri de decontaminare/detoxifiere pentru îndepărtarea sau reducerea cantităţii de toxină:

la nivel de studiu experimental:

Fizice:

 separare pe baza densităţii;

 spălare (apă distilată, bicarbonat de sodiu);
 decojire (40 – 100 % reducere a DON-ului şi zearalenonei) – depinde de gradul de
penetrare a mucegaiului în bob;
 procesare termică: reduceri de până la 80 %;
  adsorbţie (aluminosilicaţi, carbon activat,bentonită).

Chimice:

 tratament cu bisulfit de sodiu;

 tratament cu ozon;
 glucide reducatoare;

Biologice:

 utilizarea bacteriilor şi drojdiilor (Flavobacterium, Saccharomyces cerevisiae);

 plante transgenice (rezistenţă la atacul de insecte – gena pentru producerea unei endotoxine
– donator Baciilus thuringiensis).

MATERIALE ŞI METODE

Principiul metodei pentru micotoxine. Testul utilizat este un test imunoenzimatic direct
competitiv. Micotoxinele se extrag din probe măcinate, cu metanol 70%. Extractul de probă şi
micotoxina conjugată cu enzima se amestecă şi se adaugă în godeurile căptuşite cu anticorpi.
Micotoxinele din probe sau standarde sunt în competiţie enzimatică cu micotoxina legată cu
enzima pentru situsurile de legare ale anticorpilor. După o perioadă de incubare de o oră, reagenţii
(marcaţi cu enzima) nelegaţi sunt îndepărtaţi în etapa de spălare. După etapa de spălare, se adaugă
substratul enzimatic (substrat cromogen) şi apare culoare albastră (datorită transformării
cromogenului de către enzima). Intensitatea culorii este invers proporţională cu concentraţia
micotoxinei din probă sau standard. Apoi se adaugă o soluţie de stopare care determină virarea
culorii de la albastru la galben. Intensitatea culorii se măsoară spectrofotometric cu ajutorul unui
cititor de microplăci avînd filtru de 450 nm. Densităţile optice ale probelor se compară cu cele ale
standardelor, aflându-se astfel concentraţiile probelor.
 BIBLIOGRAFIE
1. Metode de determinare a micotoxinelor din alimente. Online, disponibil la adresa:
http://proalimente.com/metode-determinare-micotoxinelor-alimente/. Data accesării:
08.02.2019.
2. Mucegaiuri și micotoxine. Online, disponibil la adresa:
https://www.scribd.com/presentation/203099264/Mucegaiuri-Si-Micotoxine-1. Data
accesării: 08.02.2019.
3. Micotoxinele și efectele lor asupra organismului. Online, disponibil la adresa:
http://cesamancam.ro/ce_sunt_micotoxinele.html. Data accesării: 08.02.2019.
4. Impactul micotoxinelor asupra lanţului alimentar. Online, disponibil la adresa:
https://www.innofoodsee.eu/downloads/constanta_prezentare_alina_dobre.pdf. Data
accesării: 08.02.2019.
5. Contaminarea cu micotoxine, o problemă mereu în actualitate. Online, disponibil la adresa:
https://www.lumeasatului.ro/articole-revista/cresterea-animalelor/3822-contaminarea-cu-
micotoxine-o-problema-mereu-in-actualitate.html. Data accesării: 08.02.2019.
6. Măsuri de prevenire a contaminării cu micotoxine și metode de decontaminare. Online,
disponibil la adresa: http://proalimente.com/masuri-prevenire-contaminarii-micotoxine-
metode-decontaminare/. Data accesării: 08.02.2019.