Proceduri de Expertizare Master

Proceduri de expertizare prin examene de laborator pentru produsele agricole i alimentare - Curs
Gheorghe PUCHIANU
PROCEDURI DE EXPERTIZARE
PRIN EXAMENE DE LBORATOR
PENTRU PRODUSELE
AGRICOLE I ALIMENTARE
2015
1
CUPRINS
Numrul Denumire Pag.

Laboratorului
1. Determinarea NTG aerobi din produsele alimentare. Metod 3
orizontal pentru enumerarea microorganismelor. Tehnic de
numrare a coloniilor la 30C - SR EN ISO 4833/2003
2. Determinarea Listeria monocytogenes n conformitate cu 13
prevederile EN ISO 11290-1,2
3. Determinarea Salmonella n conformitate cu prevederile EN ISO 23
6579
4. Metoda orizontal pentru numrarea stafilococilor coagulaz- 32
pozitivi - Tehnic pe mediu de gar Baird Parker - SR EN ISO
6888-1sau 2 /iunie 2002
5. Determinarea Escherichia coli glucuronidazo pozitiv n 40
conformitate cu prevederile ISO 16649-1,2
6. Determinarea Enterobacteriaceaelor n conformitate cu 46
prevederile ISO 21528-1,2
7. Determinarea germenilor din genul Campylobacter n conformitate 51
cu prevederile SR
8. Detectarea drogdiilor i mucegaiurilor - ISO 21527-1 58
9. Examenul microbiologic al apei utilizat n procesarea alimentelor 64
10. Identificarea speciilor de mamifere domestice din produse i 71
subproduse alimentare
11. Comportarea fa de antibiotice a unor microorganisme 76
care pot fi izolate din alimente
12. Examenul parazitologic al crnii 79
13. Metode alternative rapide de diagnostic microbiologic 84
14. Verificarea eficienei decontaminrilor 94
Reguli de procedur pentru transmiterea culturilor bacteriene la 105
IISPV n vederea confirmrii i tipizrii
Abrevieri 106
Definiii 107
Bibliografie 111
2
CURS NR. 1
DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI

DIN PRODUSELE ALIMENTARE
Metod orizontal pentru enumerarea microorganismelor.
Tehnic de numrare a coloniilor la 30C
SR EN ISO 4833/2003
Standardul stabilete o metod orizontal pentru enumerarea microorganismelor

prin numrarea coloniilor crescute pe unh mediu solid dup incubarea aerob la 30 C.
Microorganism - este o bacterie, drojdie sau colonie numrabil formatoare de mucegai.
Produse alimentare care se examineaz n vederea detectrii NTG : lapte
crud; lapte pentru consum, Lapte UHT; lapte praf, zer dulce praf, cazeinat i zer acid praf,
zar praf, lactoz, cazein ( acid, lactic, cheag); produse lactate praf pentru copii;
smntn dulce pentru fric i fric btut; lapte concentrat cu zahr; produse lactate
congelate inclusiv nghetat de consum; unt, brnz topit; carne zvntat, refrigerat,
congelat i organe de pasre, mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite
calde; preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr
alt prelucrare (piftii, pateuri din carne i organe, biftec); pete proaspt, decapitat i
eviscerat; prjituri cu crem , deserturi , creme; maionez; prafuri de budinci i creme
deshidratate, nlocuitori de fric; buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de
valabilitate mai mic de 14 zile; pulberi pentru sucuri; finuri alimentare altele dect finuri
pentru panificaie (fin de orez, orezin, fosfarin); specialiti din ciocolat umplute cu
crem gras sau de tip fondant; specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de
tip fondant;concentrate alimentare (supe, cuburi de carne); ceai (plant); melanj din ou
praf; produse din gru germinat; fructe de mare refrigerate; sandviciuri, mncruri tip fast-
food; etc.
Principiul metodei
Prepararea a dou plci turnate prin folosirea unui mediu de cultur specific i a
unei cantiti specificate de prob, dac produsul iniial este lichid sau a unei cantiti
specificate de suspensie niial n cazul altor produse. Prepararea n aceleai condiii, a
altei perechi de plci turnate, folosind diluiile decimale ale probei sau ale suspensiei
iniiale. Incubarea plcilor Petri n condiii de aerobioz timp de 72 de ore la temperatura
o
de 30 C. Calcularea numrului de microorganisme pe ml sau pe g de prob din numrul
de colonii obinute pe plcile selectate.
Medii de cultur i diluani
Medii de cultur
Compoziie - Agar pentru numrare - PCA.
3
Mediu de cultur PCA Pulbere deshidratat
Acesta conine: digest enzimatic pentru cazein 5,0g, extract de drojdie 2,5g,
glucoz anhidr (C6H12O6) 1,0g, agar 9 - 18g i ap 100 ml. La examinarea produselor
lactate se adaug 1,0g lapte praf degresat pe un litru de mediu de cultur. Laptele praf
degresat trebuie s nu conin substane inhibitoare;
Preparare - pentru preparare n caz c se utilizeaz mediu complet deshidratat
disponibil comercial se respect instruciunile productorului. Dup preparare se necesar
s se regleze pH-ul dac este necesar, n aa fel nct dup sterilizare s fie 7,00 la
o
25 C;
Mediu de cultur PCA determinare pH
Distribuie - se repartizeaz mediul n eprubete, n cantiti de 12 - 15 ml/ eprubet,

sau n flacoane sau sticle cu capacitatea de pn la 500 ml;
4
Mediu de cultur PCA
o
Sterilizare - se sterilizeaz la autoclav la 121 C timp de 15 minute;
Pstrare - dac mediul se folosete imediat, se rcete nainte de folosire pe o baie
o
de ap (apt de a opera de la 44 - 47 C). n caz contrar se pstreaz la ntuneric la
o
temperatura de 32 C pentru maxim 3 luni, n condiii care s nu provoace nici o
modificare a compoziiei sau proprietilor.
nainte de nceperea examenului microbiologic, pentru a evita orice ntrziere la
turnarea mediului, nainte de folosire, se topete complet mediul, apoi se rcete pe o baie
o
de ap ntre 44 - 47 C.
Pentru a verifica temperatura mediului se recomand s se pun un termometru
ntr-o poriune de soluie de control ce conine 15g/l agar, ntr-un container separat, identic
cu cel folosit pentru mediu. Soluia de control trebuie s fie supus la celeai operaii de
nclzire i rcire ca i mediul.
Aparatur i sticlrie
Aparat pentru sterilizare uscat (etuv) sau umed (autoclav);
o o
Incubator apt de a opera la 30 1 C;
Cutii Petri din sticl sau plastic, cu diametrul de 90 - 100 mm;
Pipete cu capacitate nominal de 1 ml;
o
Baie de ap, apt de a opera de la 44 - 47 C;
Echipament de numrare a coloniilor, costnd dintr-o baz luminat pe un
fond ntunecat, prevzut cu lentile de mrire cu putere corespunztoare de
circa 1,5x i un dispozitiv de numrare mecanic sau electronic digital;
o
pH- metru, avnd o acuratee a etalonrii de 0,1 uniti de pH la 25 C;
Eprubete, flacoane sau sticle de capacitate corespunztoare nu mai mare
de 500 ml.
Eantionare
Este important ca laboratorul s primeasc un eantion care este cu adevrat
reprezentativ i care s nu fi fost deteriorat sau modificat n timpul transportului sau
depozitrii.
5
Probe de lapte materie prim care urmeaz

s fie introduse n lucru
Pregtirea probei
Exemple:
Lapte i produse lactate se agit energic eantionul de analizat pentru a asigura
o repartizare uniform a microorganismelor rsturnnd rapid de 25 de ori recipientul cu
eantion. Trebuie evitat formarea spumei iar cea format trebuie dispersat. Intervalul
dintre omogenizarea eantionului i prelevarea probei necesare analizei nu trebuie s
depeasc 3 minute.
Lapte praf, zer dulce se amestec direct coninutul recipientului nchis, prin agitri
i rsturnri repetate..Se cntresc 10 g eantion ntr-un vas de sticl i se rstoarn
+ o
praful n sticl cu soluia de diluare (90 ml de soluie adecvat la 45 -1 C n baie de ap).
Se menin flacoanele n baia de ap timp de 5 minute agitnd din cnd n cnd. Se obine
-1
astfel o diluie de 10 .
Pregtirea eantionului pentru analiz i a diluiei iniiale

Cu o pipet steril se introduce 1 ml din soluia iniial ntr-o eprubet care conine
9 ml de soluie diluare steril. Pipeta se schimb pentru fiecare diluie.
6
9ml 9ml 9ml 9ml
X g produs +
1 ml 1 ml 1ml
Diluia 10-1 10-2 10-3 10-4
Prin operaia de diluie n tuburile cu diluii se vor obine cantitile de prob

ilustrate n tabel, din care reiese c ntre dou diluii consecutive, diferena de concentraie
este de 10 ori (diluii decimale):
Nr. tub 1 2 3 4
Diluia 1/10 x) 1/100 1/1000 1/10000
Cantitate (g) 0,1 0,01 0,001 0,0001
sau volum (ml)
Sau Sau Sau Sau
Din proba 10-1 10-2 10-3 10-4
iniial pe ml
diluie xx)
x) n cazul produselor solide sau semi-solide aceast diluie se afl n recipientul
omogenizatorului sau n mojar;
xx) n cazul nsmnrii a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-solide (10 ml
-1 -0
diluie 10 ) aceast cantitate se noteaz cu 10 .
Inoculare i incubare
Se iau dou cutii Petri sterile. Se transfer n fiecare cutie cu ajutorul unei
pipete sterile 1 ml prob, dac este lichid sau 1 ml suspensie niial n
-1
cazul altor produse (dfiluia 10 );
7
Se iau alte 2 cutii Petri sterile. Se transfer n fiecare cutie cu ajutorul altei
-1 -1
pipete sterile 1 ml din diluia10 (produse lichie) sau 1 ml din diluia10 (alte
produse). Dac este necesar se repet procedura cu diluiile urmtoare,
folosind o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal. Se selecteaz
numai etapele diluiilor critice (cel puin dou diluii decimale consecutive)
pentru inocularea plcilor Petri care vor da ntre 15 i 300 colonii pe plac;
o
Se toarn de la 12 - 15 ml agar pentru placa de numrare la 44 - 47 C n
fiecare plac Petri. Timpul scurs ntre sfritul preparrii suspensiei iniiale
-1
(sau a diluiei 10 dac produsul este lichid) i momentul cnd mediul este
turnat n plci nu trebuie s depeasc 45 min;
Se amestec atent inoculul cu mediul prin rotirea plcii Petri i se las

amestecul s se solidifice prin lsarea plcilor Petri pe o suprafa
orizontal rece;
Dup solidificare complet i numai n cazul n care se suspecteaz c
produsul examinat conine microorganisme ale cror colonii pot suprapopula
o
suprafaa mediului, se toarn circa 4 ml mediu de acoperire la 44 - 47 C pe
suprafaa mediului de inoculare. Se las s se solidifice pe o suprafa
orizontal rece;
o o
Se ntorc plcile pregtite cu faa n jos i se pun la incubator la 30 1 C
pentru 72h3h. Nu se suprapun mai mult de ase plci pe coloan.
Coloanele cu plci trebuie s fie separate unele de altele i de pereii i
partea superioar a incubatorului.
8
Introducerea plcilor n incubator
Numrarea coloniilor
Dup perioada de incubare (72h3h), se numr coloniile de pe plci, folosind
dac este necesar echipamentul pentru numrarea coloniilor. Se examineaz plcile n
lumin difuz. Este necesar ca coloniile mici s fie ncluse n numrare, dar este esenial
ca operatorul s evite confundarea particulelor neltoare de material nedizolvat sau
precipitat din plci cu colonii mici. Se examineaz atent obiectele neltoare, folosind o
mrire mai mare dac este necesar, pentru a distinge coloniile de materiale strine.
Coloniile extinse se vor considera o singur colonie. Dac mai puin de un sfert din
plac este acoperit de extinderi, se numr coloniile de pe partea neafectat a plcii i
se calculeaz numrul corespunztor pentru toat placa. Dac mai mult de un sfert este
acoperit cu colonii extinse nu se ia n considerare numrtoarea.
Colonii care s-au dezvoltat Numrtor de colonii
9
Exprimarea
rezultatelor Metoda de
calcul
Pentru numrtoare se utilizeaz cutiile ce conin cel mult 300 de colonii i cel
puin 15 colonii.
Numrul de microorganisme pe ml sau gram de produs, N, se calculeaz, ca
medie ponderat cu urmtoarea formul:
C
N = ------------------------
(n1 + 0,1 n2) x d
unde; C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute

n1 numrul cutiilor reinute la prima diluie
n2 - numrul cutiilor reinute la a doua diluie
d factorul de diluie corespunztor primei diluii
Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative. Ca rezultat se ia

numrul de microorganisme pe ml sau pe gram de eantion exprimat printr-un numr
x
cuprins ntre 1,0 i 9,9 x 10 unde x este puterea atribuit lui 10.
Exemplu:

O numrtoare de microorganisme obinute la 30 C a dat urmtoarele rezultate.
-2
la prima diluie reinut 10 : 168 i 215 colonii;
-3
la a doua diluie reinut 10 : 14 i 25 de colonii.
C 168 + 215 + 14+ 25 422

N = ---------------------------------- = _________________ =________=19.182
-2
(n1 + 0,1 n2 ) x d [2+(0,1x2)]x10 0,022
Se rotunjete la dou cifre semnificative adic 19.000
Estimarea numerelor mici
Dac cele dou cutii la nivelul eantionului de analizat (produse lichide) sau al
diluiei iniiale (alte produse) conin mai puin de 15 colonii se face media aritmetic, m a
coloniilor numrate n cele dou cutii. Rezultatul se d sub forma:
- numr de microorganisme estimat pe ml
NE = m(produse lichide)
- numr de microorganisme estimat pe gram:
-1
NE = m x d (alte produse), n care d este factorul de diluie al diluiei
iniiale.
Dac cele dou cutii corespunztoare eantionului de analizat (produse lichide)
sau diluiei iniiale (alte produse) nu conin nici o colonie rezultatul se d sub forma:
mai puin de 1 microorganism pe ml (produse lichide);
-1
mai puin de 1 x d microorganisme pe gram (alte produse) n care d este factorul
de diluie al diluiei iniiale.
10
Alte exemple de calcul
Cazul 1. Rezultate cu un numr de germeni sub 100.000/ml.
Nr.diluiei -1 -2 -3 -4
Nr.coloniilor >300 >300 72 8
>300 >300 87 8
Cazul 2. Rezultate cu un numr de germeni peste 300.000/ml

Nr. coloniilor >300 >300 310 38
>300 >300 290 36

Nr. coloniilor >300 >300 560 58
>300 >300 490 52
560 490 58 52 1160

N 527272, (72) 500.000,00
3
2 0,1* 2 *10 0,0022

Nr. coloniilor >300 >300 760 77
>300 >300 700 68
760 700 77 68 1605

N 729545(45) 700.000,00
3
2 0,1* 2 *10 0,0022
Cazul 5. Rezultate cu un numr de germeni peste 1.000.000/ml

Nr.diluiei -1 -2 -3 -4 -5
Nr.coloniilor >300 >300 >300 320 38
>300 >300 >300 260 44
11
Buletinul de analiz
Buletinele de analiz sunt ntocmite de responsabilii de ncercare i verificate de
responsabilii de compartiment n trei sau patru exemplare ( n funcie de situaie) dintre
care unul se pstreaz n laborator iar celelalte sunt preluate de la Biroul recepie probe
de ctre medicul veterinar care a ntocmit procesul verbal de recoltare, procesator ( n
cazul probelor recoltate n cadrul programului de autocontrol) iar un exemplar se dirijeaz
ctre serviciul de igien i sntate public din cadrul D.S.V.
Buletinul de analiz trebuie s cuprind; toate informaiile necesare pentru
identificarea complet a probei; metoda de eantionare folosit (dac se cunoate);
metoda de analiz folosit, cu referire la standardul internaional; toate condiiile de
operare nespecificate n standard, sau privite ca opionale, mpreun cu detalii ale cror
incidente pot influena rezultatul; rezultatele obinute n analiz.
12
CURS NR. 3
DETERMINAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES

DIN PRODUSELE ALIMENTARE
Listeria monocytogenes, reprezint specia de interes pentru microbiologia

alimentelor, fiind patogen pentru om i pentru animale. Se prezint ca un bacil drept sau
cocobacil, lung de 0,5 2 microni i gros de 0,3 0,5 microni, cu capetele rotunjite, mobil,
gram pozitiv,aezat n lanuri scurte, n palisad,V sau Y. Este asporogen, ciliat,deci
mobil, aerob i microaerofil. Listeria monocytogenes se deosebete de celelalte specii
prin faptul c produce hemoliz, fermenteaz glucoza i ramnoza, nu fermenteaz xiloza
i manita, nu reduce nitratul, testul CAMP pozitiv cu Staphylococcus aureus.
Metoda de diagnostic stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene
cu L. monocytogenes n produsele alimentare.
Metoda se aplic urmtoarelor produse: lapte pentru consum i produse lactate;
carne tocat i semipreparate din carne tocat (hamburger, past de mititei, crnai
proaspei etc.) ; preparate din carne srate i/sau afumate; mezeluri (prospturi, salamuri
semiafumate); mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde; preparate din
carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr alt prelucrare (piftii,
pateuri din carne i organe, biftec); produse crude (niel, cacava pane); prjituri cu
crem; torturi cu diferite creme, fric, fructe; concentrate alimentare (supe, cuburi de
carne); fructe de mare refrigerate; sandviciuri, mncruri tip fast-food, etc.
Documente de referin
Detectarea Listeria monocytogenes se efectueaz n conformitate cu versiunea
modificat a standardului EN ISO 11290-1:1996 Microbiologia alimentelor i furajelor -
Metoda orizontal de detectare i enumerare a Listeria monocytogenes - Partea 1:
Metoda de detectare.
Enumerarea Listeria monocytogenes se efectueaz n conformitate cu standardul
EN ISO 11290-2:1998 Microbiologia alimentelor i furajelor - Metoda orizontal de
detectare i enumerare a Listeria monocytogenes - Partea 2: Metoda de enumerare,
modificat cu standardul EN ISO 11290-2:1998/Amd 1:2004 Modificarea mediului de
enumerare.
Referenialul de interpretare este Regulamentul(CE) nr. 2073/2005, cu
amendamentele ulterioare.
Principiul metodei
nsmnarea unei cantiti de eantion determinat 25 ml (produs) 25 g (alte
produse). Izolarea L. monocytogenes din produsele alimentare este destul de dificil din
cauza microorganismelor competitive prezente n numr mare.
+ o
Sterilizarea mediilor de cultur trebuie fcut n autoclav la 121 -1 C timp de 15
minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dac mediile de
o
cultur nu sunt folosite imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 0-5 C maxim 7
13
zile pentru evitarea oricrei modificri a volumului sau compoziiei lor.
Echipamente de ncercare i mijloace de msurare utilizate
o o
Termostat 35 0,5 C aparat electric pentru dezvoltarea microbian;
o
Etuv 160 180 C - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl,
o
porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180 C timp de 30-60
minute;
Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii
de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de
o
121 C timp de 20-30 minute;
Lamp - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a
suprafeelor de lucru;
Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura
camerei;
Sterilizator electric pentru instrumentar;
o o
Baie de ap reglabil la temperatur mai mare de 100 C sau reglabil la 45 C;
Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm;
+ +
Pipete gradate sterile de 1 ml - 0,02 ml sau de 10 ml - 0,2 ml;
o
pH metru - cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25 C;
Flacoane cu capacitatea de 250 ml pentru sterilizarea i pstrarea mediilor de
cultur;
Eprubete de 16 x 160 mm sterile;
Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml;
Mojar cu pistil, sterile.
Eantionare - eantioanele sunt etichetate, cuprinznd: produsul recoltat,
examenul cerut; locul prelevrii; ziua i data prelevrii; data de valabilitate; sigiliul;
martorii prelevrii; cine a prelevat.
Lapte i produse lactate se agit energic eantionul de analizat pentru a
asigura o repartizare uniform a microorganismelor rsturnnd rapid de 25
de ori recipientul cu eantion. Trebuie evitat formarea spumei iar cea
format trebuie dispersat. Intervalul dintre omogenizarea eantionului i
prelevarea probei necesare analizei nu trebuie s depeasc 3 minute.
Lapte praf, zer dulce se amestec direct coninutul recipientului nchis,
prin agitri i rsturnri repetate. Se cntresc 25 g eantion ntr-un vas de
sticl i se rstoarn praful n flaconul cu mediu de prembogire Se menin
flacoanele n baia de ap timp de 5 minute agitnd din cnd n cnd.
Brnza i brnza topit se folosesc 25 g prob ntr-un mojar cu pistil steril.
Se transfer proba ntr-un flacon steril peste care se adaug mediu de
prembogire lichid. Omogenizare prin mojarare
Alimentul cu consisten semisolid se omogenizeaz ca atare.
Alimentul cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de
mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 25g/10g + cantitatea
egal de nisip steril. Se tritureaz, se transfer ntr-un flacon steril peste
care se adaug mediu de prembogire.
14
Modul de lucru
Pregtirea eantionului pentru analiz
.Cu instrumente sterile, se recolteaz 25 ml din eantion n cazul produselor lichide
i 25 g din eantionele semisolide i solide. Alimentul cu consisten solid se mrunete
n buci mici nainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 25g/10g +
cantitatea egal de nisip steril. Se tritureaz, se transfer ntr-un flacon steril peste care se
adaug mediu de prembogire.
1. Faza de prembogire selectiv - Cu instrumente sterile, se
recolteaz 25 ml ntr-un flacon steril peste care se adaug 225 ml
mediu de prembogire n cazul eantionului lichid i 25 g din
eantioanele semisolide i solide n mojare cu pistil sterile, se
tritureaz, dup care se introduc n flacoane sterile peste care se
adaug 225 ml mediu de prembogire (demifraser).Se
o
termostateaz la 35 C timp de 24 h.
2. Faza de mbogire selectiv Din cultura cu mediu demifraser

se inoculeaz 0,1 ml n 10 ml mediu lichid fraser. Tuburile inoculate
o
se incubeaz la 35 C timp de 48 h.
3. Faza de izolare selectiv - Din cultura pe mediu fraser cu ansa
bacteriologic se nsmneaz pe dou medii de izolare selectiv
(agar Oxford i agar Palcam) turnate n plci Petri sterile, se
o
incubeaz la 35 C timp de 24 - 48 h. Pe mediile selective Palcam i
Oxford coloniile de Listeria apar sub forma unor colonii de culoare
nchis, nconjurate de un halou tot de nuan maro spre negru,
datorit faptului c bacteria produce hidroliza esculinei prezent n
mediu.
15
Mediu Palcam
Mediu Oxford Mediu Palcam
Mediu cromogen
Interpretarea - Dup incubare, cutiile Petri nsmnate, se examineaz i se rein cele

n care s-au dezvoltat colonii suspecte de L. monocytogenes.
Test de confirmare
Culturile obinute pe suprafaa agarului Oxford i Palcam(Se rein 5 colonii specifice sau
suspecte), suspecte ca fiind L.monocytogenes, se transplanteaz pe bulion i agar nutritiv,
o
se incubeaz la 35 C timp de 24 h dup care se supun urmtoarelor teste:
16
Listeria - agar nutritiv Listeria bulion
1. Mobilitate - Examen microscopic- ntre lam i lamel; Examen cultural n

o
agar moale (dezvoltare sub form de umbrel la 25 C)
Testul mobilitii
2. Reacia catalazei - O ans de cultur se introduce ntr-o pictur de

peroxid de hidrogen 3% depus pe o lam de sticl. Apariia imediat a
bulelor de gaze se interpreteaz ca reacie pozitiv i este specific pentru
L. monocytogenes.
Testul catalazei
3. Testul hemolizei - Pe agar cu snge se striaz o ans bacteriologic din

o
cultura obinut se incubeaz la 35 C timp de 24 h. Tulpinile de Listeria
monocytogenes produc colonii mici, nconjurate de o
17
zon clar dar mic de hemoliz (fig. nr. ), spre deosebire de Listeria
ivanovii care manifest o activitate hemolitic foarte puternic, sau spre
deosebire de alte specii din cadrul genului care nu produc hemoliz.
Hemoliza produs este de tip .
Testul hemolizei
4. Fermentarea hidrailor de carbon (glucoz, manit, xiloz i

rhamnoz)
- n eprubetele cu zaharurile mai sus menionate, cu o pipet steril se
introduc cte 0,1 ml din cultura obinut n bulion nutritiv. Se termostateaz
o
la 35 C timp de 24 h dup care examineaz. Reacia este pozitiv la
glucoz i rhamnoz; reacia este negativ la manit i xiloz.
Fermentaia hidrailor de carbon MIU (stnga i TSI mijloc)
Restul se poate efectua i cu ajutorul testelor Api- Listeria, care conin substraturi
sub form deshidratat, ce permit realizarea testelor enzimatice sau de fermentaie a
zaharurilor. Reaciile produse n timpul perioadei de incubaie se tradus prin schimbri
spontane de coloraie sau schimbri relevate de adiia reactivului. Dup o incubaie de 18-
24 de ore la o temperatur de 35-370C, citirea reaciilor se realizeaz vizual cu ajutorul
unui tabel de citire i identificare.
5. Reacia MR/VP- se folosete mediu Clarc i reacia este pozitiv

6. Reacia reducerii nitratului n nitrit negativ
7. Testul CAMP - Pe suprafaa agarului cu snge de oaie
18
turnat n cutii Petri se striaz n linie dreapt pe tot diametrul cutiei cultur
de 24 h de Stafilococcus aureus i R.eqvi la distan de 3-4 cm una de alta
i pe ct se poate linii paralele. Tulpinile de testat se striaz pe suprafaa
agarului perpendicular pe primele dou strii n aa fel ca striile culturilor de
testat s se opreasc la 2-3 mm de acestea. Rspunsul caracteristic pentru
fiecare specie este pozitiv la Stafilocococus aureus i pozitiv sau negativ la
o
R.eqvi, dup incubare de 24 h la 35 C
O tulpin de Listeria monocytogenes confirmat per eantion pozitiv se conserv n
vederea unor eventuale teste de tipizare. n cazul n care tulpinile de Listeria
monocytogenes sunt identificate att prin metodele de detectare, ct i prin cele de
enumerare, se stocheaz n laborator numai izolatele obinute prin metoda de enumerare.
Tulpinile de Listeria monocytogenes se stocheaz de ctre Laboratorul Naional de
Referin pentru Listeria monocytogenes din cadrul Institutului de Igien i Sntate
Public Veterinar Bucureti folosind metode adecvate pentru colectarea de culturi, astfel
nct s se asigure viabilitatea tulpinilor pentru cel puin doi ani n vederea tipizrii.
Difereniere diferitelor serotipuri n funcie de rezultatele examenelor

biochimice
Testul biochimic L. L. L. L. L. L. L.mu

monocyto ivanovii innocu welshi seelige grayi rrayi
genes a merii ri
Producer D- + + + + + + +
ea de glucoz
acid din:
D-xiloz - + - + + - -
D-manitol - - - - - + +
D- + - V V - - V
rhamnoz

maltoz + + + + + + +
Ptoducer catalaz + + + + + + +
e de :
H2S/TSI - - - - - - -
H2S/benz - - - - - + +
i de
acetat de
plumb
betahem + + - - + - -
oliz
Hidroliza esculinei + + + + + + +
19
Hidroliza hipuratului + + + + + - -
Hidroliza ureei - - - - - - -
Reducerea nitrailor - - - - - - +
Reacia Voges- + + + + + + +
Prostkauer
Reacia Roului de + + + + + + +
metil
CAMP-S.aureus + - - - + - -
CAMP-R.eqvi +/- + - - - - -
20
1 0
Incubare timp de 48 h +/- 3 h la 35
Di 0 0
C +/- 1 C
a m
gr l
a
m m
a e
d Striere pe agar Oxford
m Incubare timp de 24 - 48 h
Striere pe agar Palcam
o i 0 0 Incubare timp de 24-48 h +/-
u +/- 3 h la 35 C +/- 1 C 0 0
d 3 h la 35 C +/- 1 C
F Se rein 5 colonii specifice
Se rein 5 colonii specifice
ul r sau suspecte sau suspecte
ui a
d s
e e
lu r
Transplantare pe bulion i agar nutritiv
cr 0
Incubare timp de 24 h +/- 3 h la 35 C +/-
u
Imbogatire
0
1 C
25 ml sau 25
g peste care
se adaug
225 ml Mobilitate
mediu de Reacia catalazei
prembogir Testul hemolizei
e demifraser Fermentaia hidrailor de carbon
Reacia reducerii nitratului n nitrit
Testul Camp
selectiv
Izolare
Incubare timp de 24
h +/- 2 h la 35
0
+/- 1
21
0,1
Confirmare
ml
din
cul
tur
a
ob
inu
t
se
ino
cul
eaz

n
Interpretarea rezultatelor
Organism indicator
Unele standarde de calitate impun un nivel zero pentru L.monocytogenes n etapa
de producie a unui aliment. Astfel, un nivel de 102cfu/g la punctul de vnzare / consum
reprezint un risc potenial pentru sntate. Numrarea la acest nivel poate de asemenea
indic o lips semnificativ a standardelor de igiena n pregatirea i/sau depozitarea unor
astfel de alimente. In baza informatiilor actuale, este inacceptabil ca alimentele gata pentru
consum s conin serogrupuri de L.monocytogenes la nivelul sau deasupra nivelului de
102cfu/g. Unele serotipuri / fagotipuri de L. monocytogenes pot fi rar asociate cu infecia
uman, dar prezena lor reprezint un nivel necorespunzator de igiena.
L.monocytogenes este larg rspandit n mediu i este capabil s se multiplice
lent la 40C. Termenul de valabilitate a alimentelor variaz foarte mult. Anumite alimente
cum ar fi brnza uor maturat, pateu impachetat n vid, i carne feliat. - au un termen de
valabilitate lung n condiii de refrigerare, i prezena L.monocytogenes la orice nivel poate
fi riscant datorit potenialului su de dezvoltare n timpul depozitrii.
Regulamentul (CE) nr. 2073/2005 definete criteriile microbiologice pentru
alimente. Anexa I a acestui Regulament definete criteriile pentru L. monocytogenes
pentru trei categorii de alimente gata de consum.
Stabilirea conformitii probelor
Limitele stabilite conform R (CE) 2073/2005 se refer la fiecare unitate de prob
testat. Rezultatele testelor demonstreaz calitatea microbiologic a lotului testat.
L. monocytogenes n produsele alimentare gata pentru consum care permit
dezvoltarea de L. monocytogenes nainte ca produsul alimentar s fi prsit controlul
imediat al operatorului din sectorul alimentar care l-a produs, n cazul n care acesta nu
este n msur s demonstreze c produsul nu va dep i limita de 100 ufc/g n timpul
perioadei de conservare:
satisfctoare, n cazul n care toate valorile observate indic absen a bacteriei;
nesatisfctoare, n cazul n care prezen a bacteriei este detectat n oricare dintre
unitile de prob. L. monocytogenes n alte produse alimentare gata pentru
consum;
satisfctoare, n cazul n care toate valorile observate sunt limita;
nesatisfctoare, n cazul n care oricare dintre valori este > limita.
22
CURS NR. 3
Determinarea Salmonella
n conformitate cu prevederile EN ISO 6579
Aparatur i sticlrie folosit:

o o o o
Termostat 35 C; 37 0,5 C; 42 C pentru dezvoltarea microbian;
o
Etuv 160 180 C - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de
o
sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180 C
timp de 30-60 minute;
Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune.
o
Temperatura este de 121 C timp de 20-30 minute;
Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului
ncperilor i a suprafeelor de lucru;
Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de
temperatura camerei;
Sterilizator electric pentru instrumente;
Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip
Atomix de nalt turaie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile;
o o o o o
Baie de ap reglabil la temperatur 35 C sau 37 C, 45 C, 55 C i 70 C;
+ +
pH metrucu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la
o
25 C;
Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platin-iridiu sau nichel-crom
;
Flacoane pentru medii de cultur;
Eprubete cu diam de 8/160 mm;
Mojar cu pistil, sterile;
Eprubete gradate;
Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml.
Metodologia de diagnostic
Detecia Salmonella spp. se efectueaz n conformitate cu standardul ISO
6579/2003 AC/2006 "Microbiologia alimentelor i a hranei pentru animale Metoda
orizontal de cercetare a Salmonella spp.
Detecia Salmonella spp. necesit parcurgerea a patru faze succesive:
1. Prembogirea n medii lichide neselective: apa peptonat tamponat se
inoculeaz la temperatura camerei cu proba pentru analiz, apoi se incubeaz la
37C 1 C timp de 18 h 2 h. Prembogirea este necesar pentru resuscitarea
germenilor distrui subletal.
23
2. mbogire n medii selective lichide: Mediul Rappaport-Vassiliadis cu soia (bullion

RVS) i bulionul Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocin (bullion MKTTn) se
inoculeaz cu cultura obinut n urma inoculrii apei peptonate. Bulionul RVS se
incubeaz la 41,5 C 1 C timp de 24 h 3 h i bulionul MKTTn la 37 C timp de
24 h 3 h. Aceste medii conin substane inhibitorii pentru bacterii non- Salmonella.
Mediu Rappaport Vasilliadis Mller Kauffman

nainte i dup incubare nainte i dup incubare
3. Izolare i identificare: din culturile obinute n urma inoculrii RVS i MKTTn, se

inoculeaz dou medii selective solide: agar xiloz-lizin-dezoxicolat (agar XLD);
orice alt mediu selectiv solid complementar cu agarul XLD i potrivit n special
pentru izolarea Salmonellei lactoz-pozitiv (de exemplu Rambach, MC Conkey
sau Rou Fenol). Agarul XLD i mediul Rambach (recomandat a fi ales) se
incubeaz la 37C 1C i se examineaz dup 24 h 3 h. Acestea permit
diferenierea salmonelelor de alte enterobacterii.
24
Mediu XLD Mediu Rambach
Muler - Kaufman Mediu cromogen
4. Dup izolarea tulpinilor n cultur pur, confirmarea se face prin diverse teste
biochimice i serologice. Salmonelele posed antigene somatice (O), flagelare (H)
i de virulen (VI) ce pot fi identificate prin serotipizare, iar serovariantele pot fi
identificate dup formula lor antigenic, conform schemei KauffmanWhite. Pentru
confirmarea identificrii serologice complete, tulpinile de Salmonella izolate trebuie
s fie trimise la Institutul de Igien i Sntate Public Veterinar Bucureti
(IISPV).
Bulion nutritiv - Salmonella Agar nutritiv colonii de Salmonella
Teste biochimice
Agar TSI - se nsmneaz coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin
o o
trasare. Se incubeaz la temperatura de 35 37 C timp de 24 h. Se interpreteaz
modificrile care se produc n mediu n modul urmtor:
25
Baza mediului:
galben glucoz pozitiv (fermentarea glucozei);
roie sau nemodificat glucoz negativ (lipsa fermentrii glucozei);
neagr formare de hidrogen sulfurat;
bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoz:
Panta mediului:
galben lactoz i/sau zaharoz pozitiv;
roie sau nemodificat lactoz i zaharoz negativ (neutilizarea
lactozei i a zaharozei.
TSI TSI cu producie de gaz
Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roie) cu formare de

gaz i a unei baze acide (galben) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat
(nnegrirea agarului. Atunci cnd se izoleaz o Salmonella lactoz pozitiv panta agarului
TSI este galben, n consecin o confirmare preliminar a culturilor de Salmonella nu
trebuie s se bazeze doar pe rezultatele obinute pe agarul TSI.
Agar cu uree
o o
Se nsmneaz panta agarului n striuri. Se incubeaz la 35 sau 37 C (conform
acordului) timp de 24 h i se examineaz din cnd n cnd. n cazul reaciei pozitive
descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, fcnd s vireze rou de fenol la
roz apoi la rou nchis Reacia este deseori vizibil dup 2 pn la 4 h.
26
Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei

o o
Se nsmneaz mediul lichid sub suprafa. Se incubeaz la 35 sau 37 C timp
de 24 h. O culoare violet aprut dup incubare indic o reacie pozitiv. O culoare
galben indic o reacie negativ.
Evidenierea betagalactozidazei
Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet ce conine 0,25 ml
soluie salin, se adaug o pictur de toluen i se agit eprubeta. Se introduce eprubeta
o o
n baie de ap reglat la 35 sau 37 C (conform acordului) i se las s stea cteva
minute. Se adaug 0,25 ml Reactiv pentru evidenierea betagalactozidazei i se
o o
amestec. Se reintroduc eprubetele n baia de ap la 35 sau 37 C (conform acordului) i
se las 24 examinndu-le din timp n timp. O culoare galben indic o reacie pozitiv,
deseori reacia este vizibil n 20 minute. n cazul folosirii discurilor de hrtie gata
preparate se respect instruciunile fabricantului.
Mediu pentru reacia VP
Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet coninnd 0,2 ml VP,
o o
se incubeaz la 35 sau 37 C (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug
2 picturi din soluia de creatin, 3 picturi din soluia alcoolic de l-naftol i apoi 2 picturi
din soluia de hidroxid de potasiu agitnd dup adugarea fiecrui reactiv. Formarea unei
coloraii roz pn la rou aprins ntr-un interval de 15 minute indic o reacie pozitiv
Mediu pentru evidenierea indolului
Se nsmneaz o eprubet ce conine 5 ml mediu tripton-triptofan cu
27
o o
colonia suspect Se incubeaz la 35 sau 37 C (conform acordului) timp de 24 h. Dup
incubare se adaug 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel rou indic o reacie pozitiv.
Formarea unui inel galben brun indic o reacie negativ.
Testul indolului indol negativ Testul indolului indol pozitiv
ONPG
Reacia de aglutinare rapid , pe lam cu ser polivalent anti- Salmonella

Cercetarea prezenei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectueaz prin
aglutinare pe lam cu seruri adecvate din colonii pure i dup eliminarea tulpinilor
autoaglutinabile.
Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile . Se depune pe o lam de sticl curat o
pictur de soluie salin, se disperseaz n aceast pictur o fraciune din colonia de
testat aa fel nct s se obin o suspensie omogen i tulbure prin micarea lamei timp
de 30-60 secunde. Dac bacteriile se adun n grmezi, tulpina este considerat
autoaglutinabil i nu mai trebuie supus examinrilor ulterioare. Examinarea se face cu
ajutorul unei lupe pe fond negru
Evidenierea antigenelor O. Dintr-o colonie pur cunoscut ca neaglutinabil se
procedeaz ca mai sus, dar n locul soluiei saline se folosete o pictur de antiser O.
Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv. Se utilizeaz serurile poli i
monovalente unul dup altul.
Evidenierea antigenelor Vi. Se procedeaz ca mai sus utiliznd o pictur de
antiser Vi. Dac se produce aglutinarea reacia este pozitiv.
Evidenierea antigenelor H. Se nsmneaz un agar nutritiv semisolid cu
28
o o
o colinie pur neautoaglutinabil, se incubeaz la 35 37 C timp de 24 h, se utilizeaz
aceast cultur pentru examenul antigenelor H procedmd ca mai sus, dar folosind o
pictur antiser H.Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv.
Reacia de aglutinare
Fermentarea biochimic a zaharurilor

Confirmarea identificrii prin teste biochimice, cu zaharuri n ap peptonat,
sisteme API (Analitical Profile Index). Se recomand utilizarea unor teste biochimice
suplimentare care ajut la identificarea unor serovariante tipizate: maltoza i dulcitolul
pentru diferenierea S. pullorum de S. gallinarum
Testarea sensibilitii la substane antiinfecioase
29
Diagrama modului de lucru
Apa peptonata tamponata

la temperature camerei
Preimbogatire
Incubare (9,2) timp de 18 h

0 0
+/- 2 h la 37 C +/- 1 C
0,1 ml cultura 1 ml cultura

+ +
selectiva
Imbogatire
10 ml bullion RVS 10ml bullion MKTTNn

Incubare timp de 24 h +/- Incubare timp de 24 h +/- 3
0 0 0
3 h la 41,5 C +/- 1 C h la 37 C
Mediu XLD si al
doilea agar la
alegere
Izolare
Incubare timp de
24 h +/- 3 h la
0
37
placa se testeaza o
Confirmare
caracteristica .
Daca rezultatul e
negativ se testeaza
Agar nutritive
Incubare timp
de 24 h +/- 3 h
la 37
C
Exprimare rezultate
30
Alte posibiliti de diagnostic

Teste de biologie molecular
n ultimii ani au fost utilizate cu bune rezultate analizele genotipice ale germenilor
(profil plasmidic i ADN cromozomial). Analiza profilului plasmidic este o metod rapid i
relativ simpl de amprentare a tulpinilor i a fost aplicat n medicina uman i veterinar
pentru studiul distribuiei germenilor. Nu toate tulpinile de Salmonella posed plasmide,
motiv pentru care s-au utilizat i tehnici genetice alternative pentru genotiparea tulpinilor
lipsite de plasmide. n ultimii ani, genotipia a cptat amploare, creandu-se multe noi
tehnici.
ELISA pentru S. enteritidis
Pentru detecia de IgG (IgY) specific S. enteritidis sunt utilizate 2 sisteme de baz:
ELISA indirect (1) i ELISA competitiv tip sandwich. Reaciile ELISA sunt uor pretabile
la automatizare, i prin urmare pot fi incluse n programe de testare, ns echipamentele
necesare, precum i reagenii sunt costisitori.
ELISA mix (sau ELISA aplicabil pe suc de carne) este utilizat n Danemarca
pentru decelarea infeciilor salmonelice la porci. Aceast variant ELISA include antigene
somatice (O) 1, 4, 5, 6 i 12 cu care poate detecta serologic 95% din serogrupele de
salmonele circulante la porcii din Danemarca. Pentru porcii abatorizai se utilizeaz sucul
rezultat prin congelarea i decongelarea a 10 g de muchi.
Interpretarea
rezultatelor Organism
indicator
Alimentele gata pentru consum nu trebuie sa contina Salmonella spp. Trebuie s se
asigure masuri de control specifice in timpul produciei, standarde de igiena adecvate,
gtire adecvat n timpul pregtirii finale pentru ca produsele finale s nu conin
organisme viabile i ca alimentele gtite s fie de bun calitate.
Stabilirea conformitii probelor
Limitele stabilite conform R (CE) 2073/2005 se refer la fiecare unitate de prob
testat. Rezultatele testelor demonstreaz calitatea microbiologic a lotului testat.
Salmonella n diferite categorii de produse alimentare:
satisfctoare, n cazul n care toate valorile observate indic absen a bacteriei;
nesatisfctoare, n cazul n care prezen a bacteriei este detectat n oricare dintre
unitile de prob.
31
CURS NR. 4
Metoda orizontal pentru numrarea stafilococilor coagulaz-

pozitivi Tehnic pe mediu de gar Baird - Parker
SR EN ISO 6888-1 /iunie 2002
Stabilete metoda orizontal pentru numrarea stafilococilor coagulaz - pozitivi

din produsele destinate consumului uman, prin numrarea coloniilor obinute pe un mediu
solid (mediu Baird - Parker), dup incubare aerob la 35C sau 36 C.
Metoda analitic de referin pentru stafilococi coagulazo-pozitivi din anumite
brnzeturi, lapte praf i zer praf, a fost revizuit de laboratorul comunitar de referin
pentru enterotoxine stafilococice - metoda european de selecie a LCR pentru stafilococi
coagulazo pozitivi., conform prevedrilor Regulamentului (CE) nr. 1441/2007 al Comisiei
din 5 decembrie 2007 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile
microbiologice pentru produsele alimentare. (Reg 1441)
Termeni i definiii
Stafilococ coagulaz - pozitivi - bacterii care formeaz colonii tipice i / sau atipice
pe suprafaa mediului de cultur i care prezint o reacie coagulaz - pozitiv;
Numrarea stafilococilor coagulaz - pozitivi - determinarea numrului de
stafilococi coagulaz - pozitivi gsii pe mililitru sau pe gram de prob
Principiul metodei
Inocularea suprafeei unui mediu selectiv de cultur solid, folosind plci n dublu, cu
o cantitate precizat din suspensia iniial n cazul produselor solide.
Incubarea aerob a plcilor la 35 C sau 37 C i examinat att dup 24 de ore
ct i dup 48 de ore.
Calcularea numrului de stafilococi coagulaz- pozitiv pe mililitru sau pe gram de
prob din numrul coloniilor tipice i/sau atipice ob inute pe plci la nivelele de dilu ie
alese n aa fel nct s dea un rezultat semnificativ i confirmat prin rezultatul unui test
coagulaz-pozitiv.
Medii de cultur utilizate
Mediu agar Baird - Parker
Pentru preparare se dizolv componentele sau baza complet deshidratat n ap
la fierbere. Dac este necesar se ajusteaz pH-ul astfel nct dup sterilizare s fie 7,2
0,2 la 25 C. Se transfer mediul n cantiti de 100 ml n flacoane de sticl de capacitate
adecvat. Seterilizeaz mediul timp de 15 min. la 121 C
Soluii utilizate
Soluia telurit de potasiu - K2TeO3 - se dizolv teluritul de potasiu n ap la
nclzire minim,. dac n ap rmne un precipitat alb se arunc pulberea.
Se sterilizeaz prin filtarare folosind membrane cu pori de 0,22m. Soluia
poate fi pstrat maxim o lun la + 3 C2C. Se arunc soluia dac
formez un precipitat alb.
Emulsie de glbenu de ou (concentraie aproximativ
32
20%). Se folosesc ou proaspete cu coaja intact. Se cur oule cu o perie
folosind un detergent lichid. Se cltesc sub ap curent, apoi se dezinfecteaz
coaja fie prin imersare n etanol (70% procente n volum) timp de 30 de
secunde i uscare n aer, fie prin pulverizare cu alcool urmat de sterilizare n
flacr. n condiii aseptice se sparge fiecare ou i se separ glbenuul de
albu prin transferri repetate ale glbenuului dintr-o jumtate de coaj n
cealalt. Se pun glbenuurile ntr-un balon steril i se adaug de patru ori
volumul de ap steril. Se amestec bine. Se nclzete amestecul pe baie de
ap adus la 47C timp de 2h i se las ntre a8 - 24h la +3C2C pentru a
forma un precipitat. Se colecteaz aseptic lichidul supernatant ntr-un balon
proaspt sterilizat. Soluia poate fi pstrat maxim
72h la + 3 C2C.
Soluie de sulfametazin (sulfadimidin) - se utilizeaz numai dac spcii de
Proteus sunt suspectate n prob. Pentru aceasta se procedeaz la
dizolvarea sulfametazinei n soluia de hidroxid de sodiu, se dilueaz la 100
ml cu ap, se sterilizeaz prin filtrare utiliznd membrane cu dimensiunea
porilor de 0,22m. Soluia poate fi pstrat maxim o lun la + 3 C2C.
Mediu complet trebuie s conin:
1. mediu de baz - 100 ml;
2. soluie de telurit de potasiu - 1,0 ml;
3. emulsiue glbenu de ou - 5,0 ml
4. Soluie sulfametazin (dac este cazul) - 2,5 ml.
Pregtire
Se topete mediul de baz, apoi se rcete la aproximativ 47C prin intermediul
bii de ap.Se adaug n condiii aseptice celelalte 2 soluii i dac este cazul soluia de
sulfametazin, fiecare soluie fiind nclzit nainte de baie de ap la 47C, amestecnd
bine dup fiecare adugare.
Pregtirea plcilor cu agar - se pun cantiti adecvate de mediu complet n cutii
Petri sterile pentru a se obine o grosime a agarului de 4 mm i se las s se solidifice.
Plcile pot fi pstrate pn la 24h la temperatura de +3 C2C. nainte de utilizare se
usuc plcile, de preferat fr capac i cu suprafaa agarului n jos, ntr-o etuv adus la
temperaturi ntre 25C i 50C, pn cnd dispar picturile de pe suprafaa mediului
Infuzie creier - inim
Se dizolv mediul complet deshidratat n ap, nclzind dac este cazul. Se
ajusteaz pH-ul astfel nct dup sterilizare s fie de 7,4 0,2 la 25C. Se transfer mediul
de cultur n cantiti ntre 5 - 10 ml n eprubete sau sticle de capacitate adecvat. Se
sterilizeaz mediul timp de 15 min la 121C.
Plasma de iepure
Se utilizeaz plasma de iepure deshidratat disponibil comercial i rehidratat.
Dac plasma de iepure nu este disponibil se dilueaz un volum de plasm steril
proaspt de iepure cu trei volume de ap steil. Se adaug EDTA
(etilendiaminotetracetic) pentru a se ajunge la 0,1% EDTA n plasma rehidratat sau
diluat, dac s-a utilizat citrat de sodiu sau de potasiu ca anticoagulant al plasmei..
Plasma oxalat sau heparinizat nu necesit EDTA. Plasma rehidratat sau
33
diluat trebuie utilizat imediat. nainte de utilizare se testeaz fiecare lot de plasm cu
tulpini de stafilococ coagulaz - pozitiv i de stafilococ coagulaz - negativ.
Aparatur i sticlrie
Aparatur pentru sterilizare uscat (etuv) i sterilizate umed (autoclav);
Incubator pentru meninerea mediilor inoculate, a plcilor ia eprubetelor la
temperatura de 35C1C sau la 37C1C;
Etuv sau incubator, posibil de meninut la 25C1C i la 50C1C;
Baie de ap sau aparatur similar, posibil de men inut la 47C2C;
Eprubete, pahare sau sticle cu capac nsurubabil, de capacitate adecvat,
pentru sterilizare, i pstrare a mediilor de cultur i incubare a mediilor lichide;
n special eprubete de hemoliz sterile sau sticle cu fund rotund cu dimensiunile
de aproximativ 10 mm x 75 mm;
Cutii Petri, sterile, fcute din sticl sau material plastic.
Ans i pipete Pasteur;
Pipete gradate, de capacitate nominal de 1 ml, 2 ml i 10 ml, gradate cu
diviziuni de 0,1 ml i respectiv 0,5 ml;
Pulverizator, steril, fcut din sticl sau plastic;
pH-metru, capabil de a citi cu exactitate de 0,01 unit i de pH la 25C, apt
pentru msuri cu toleran de 0,1 uniti pH.
Eantionare
Probele primite trebuie s fie reprezentative, s nu fie alterate sau modificate n
timpul transportului sau depozitrii.
Pregtire prob
Mod de lucru
Proba pentru analiz, suspensie iniial i diluii - ISO 68887 -1
Inoculare
Se transfer cu ajutorul unei pipete sterile, 0,1 ml prob dac este lichid sau 0,1
-1
ml din suspensia iniial (diluie 10 ) n cazul celorlalte produse, pe fiecare din cele dou
-2
plci cu agar. Se repet procedura pentru diluia 10 i pentru urmtoarele diluii dac
este cazul.
Dac, pentru anumite produse, se dorete s se numere cel mai mic numr de
stafilococi coagulaz-pozitivi, limita de detecie poate fi mrit cu un factor de 10 prin
inoculare a 0,1 ml din suspensia iniial, fie pe suprafaa unei plci mai mari de agar (140
mm), fie pe suprafaa a trei plci mici de agar (90 mm). n ambele cazuri, se pregtesc
duplicate prin folosirea a dou plci mari sau a ase plci mici.
Se distribuie inoculul cu atenie, ct mai repede posibil pe suprafa a plcii de agar,
fr s se ating marginile cutiei, folosind pulverizatorul. Se las plcile s se usuce cu
capacele puse circa 15 minute la temperatura laboratorului.
Incubare
Se ntorc plcile pregtite i se incubeaz timp de 24 2 ore, apoi se reincubeaz
din nou 24 2 ore n incubator la 35 C i la 37C.
Selectarea plcilor i interpretare
Dup incubare de 242 de ore , se marcheaz pe dosul plcii poziia fiecrei
34
colonii tipice prezente. Se reincubeaz toate plcile la 35 C i la 37 C pentru nc 242
ore i se marcheaz orice nou colonie tipic. De asemenea se marcheaz orice colonie
atipic prezent.
Se iau pentru numrare numai acele plci care conin maximum 300 colonii din
care 150 de colonii tipice i / sau atipice la dou diluii succesive. Una din plci trebuie s
conin cel puin 15 colonii. Se selecteaz pentru confimare un anumit numr A (n general
cinci colonii tipice dac exist numai colonii tipice sau cinci colonii atipice dac exist
numai colonii atipice sau cinci colonii tipice i cinci colonii atipice dac ambele tipuri de
colonii sunt prezente, de pe fiecare plac).
Dac sunt prezente mai puin de 15 colonii tipice i / sau atipice pe plcile cu cea
mai mic diluie se poate face o numrare estimativ.
Coloniile atipice pot prezenta una din caracterele morfologice:
Colonii strlucitoare negre cu sau fr margine ngust alb; zona clar este absent sau
slab vizibil i inelul opalecent este absent sau greu vizibil;
Stafilococ coagulaz pozitiv Stafilococ necoagulaz pozitiv

(mediu Baird Parker) (mediu Baird Parker)
Coloniile atipice sunt formate n principal de tulpini de stafilococi coagulaz-pozitivi.

Acestea sunt mult mai rar formate din tulpini de stafilococi coagulaz - pozitivi care
contamineaz alte produse.
Bacteriile aparinnd acestui gen, altele dect stafilococii, pot da colonii cu aspect
similar stafilococilor. Examinarea microscopic prin coloraia Gram, nainte
35
de confirmare, permite s se fac distincie fa de alte genuri de stafilococi.
Dac 1,0 ml inocul a fost pulverizat peste trei plci, se trateaz aceste trei plci ca
una n toate numrrile i procedurile de confirmare ulterioare. Pentru a face o estimare a
numrului celui mai mic de stafilococi coagulaz - pozitivi, se rein toate plcile care conin
colonii tipice ui atipice. Se selecteaz toate acele colonii pentru confirmare ntre limitele
descrise mai sus.
Confirmare ( testul coagulazei)
De pe suprafaa fiecrei colonii selectate, se ia inocul cu ans steril i se transfer
ntr-o eprubet sau sticl cu infuzie de creier-inim. Se incubeaz la 35 C i la 37 C timp
de 242 ore.
Se adaug aseptic 0,01ml din fiecare cultur la 0,3 ml plasm de iepure n
eprubet sau sticl de hemoliz sterile i se incubeaz la 35 C i la 37 C.
Prin nclinarea eprubetei se examineaz coagularea plasmei dup incubare de 4
ore pn la 6 ore i, dac testul este negativ, se reexamineaz la 24 ore incubare sau se
examineaz la timpii de incubare precizai de productori.
Se consider testul coagulazei pozitiv dac volumul de cheag ocup mai mult de
jumtate din volumul iniial al lichidului.
Testul coagulazei pozitiv
Pentru control negativ, pentru fiecare lot de plasm se adaug 0,1 ml infuzie steril
creier-inim la canitatea recomandat de plasm de iepure i se incubeaz fr inoculare.
Pentru ca analiza s fie validat, plasma controlat nu trebuie s prezinte semne de
nchegare.
Exprimare rezultate
Caz general
Calculul numrului a de stafilococi coagulaz pozitivi identificai pentru fiecare
placa selectat
Se calculeaz, pentru fiecare plac, numrul a de stafilococi coagulaz pozitivi,
conform formulei.
36
bc bnc
A = ------ x Cc + ------ x Cnc
Ac Anc
Unde :
- numr de colonii tipice supuse testului coagulazei
- numr de colonii atipice supuse testului coagulazei
bc - numr de colonii tipice care s-au dovedit a fi coagulz-pozitive;
bnc - numr de colonii atipice care s-au dovedit a fi coagulz-
pozitive; cc numr total de colonii tipice vzute pe plac;
cnc - numr total de colonii atipice vzute pe plac.
Calcularea numrului N de stafilococi coagulaz pozitivi prezen i n prob

Pentru acele plci care conin maxim 300 de colonii, cu 150 colonii tipice i / sau
atipice la dou diluii consecutive, se calculeaz numrul de stafilococi coagulaz-pozitivi
pentru fiecare plac conform punctului precedent i se calculeaz, ca o medie ponderat
din dou diluii succesive, numrul N de stafilococi coagulaz-pozitivi identifica i, prezen i
n prob, folosind urmtoarea formul:
a
N = --------------------------------
V (n1 + 0,1 n2) d
Unde:
- suma coloniilor de stafilococ coaguleaz pozitiv identificate pe toate plcile
selectate
V volumul de inocul aplicat pe fiecare plac n
ml n1- numrul de plci selectate la prima dilu ie
n2- numrul de plci selectate la a doua dilu ie
d- gradul de diluare care corespunde la prima dilu ie selectat
Rezultatul calculat se rotunjete la dou cifre semnificative.

Rezultatele se raporteaz ca numr de stafilococi coagulaz pozitiv pe gram,
x
exprimat ca un numr ntre 1,0 i 9,9 nmul it cu 10 n care x este puterea a lui 10.
Exemplu
O numrare dup inoculare cu 0,1 ml produs d urmtoarele rezultate:
-2
Pentru prima diluie (10 ): 65 colonii tipice i 85 colonii tipice i lipsa coloniilor
atipice;
-3
Pentru a doua diluie selectat (10 ): 3 colonii tipice i 7 colonii tipice i lipsa
coloniilor atipice;
Au fost calculate urmtoarele numere:
Din 65 colonii, 5 colonii au fost selectate i toate 5 s-au dovedit a fi coagulaz -
pozitive, dnd a =65;
37
65 0
A = ------ x 5 + ------ = 65
5 0
Din 85 colonii, 5 colonii au fost selectate din care 3 s-au dovedit a fi coagulaz -
pozitive, dnd a =51;
85 0
A = ------ x 3 + ------ = 51
5 0
Din 3 colonii, toate au fost selectate i s-au dovedit a fi coagulaz - pozitive, dnd a
=3;
3 0
A = ------x 3 + ------ = 3
3 0
Din 7 colonii, 5 au fost selectate i toate 5 s-au dovedit a fi coagulaz - pozitive,

dnd a =7;
0 7
A = ------ x 5 + ------ = 7
5 0
65+ 51+3+7 126 126

N = ------------------------- = ------------------------ = ---------------- = 57.272
-2
0,1( 2 + 0,1x2) 10 0,1 x 2,2 x0,01 0,0022
4
Rezultatul dup rotunjire este 5,7 x 10
Estimarea dilu iei celei mai mici
Dac cele 2 plci care corespund suspensiei ini iale con ine fiecare mai pu in de
15 colonii identificate, rezultatele se raporteaz dup cum urmeaz:
a) Pentru produse lichide numrul estimat de stafilococi coagulaz pozitiv pe ml:

Ne=
Unde:
a= suma coloniilor de stafilococi coagulaz pozitiv identificate pe 2 plci
selectate
V= volumul aplicat pe fiecare plac
38
b) Pentru alte produse, numrul estimat de stafilococi coagulaz pozitiv pe gram:

Ne=
Unde:
a= suma coloniilor de stafilococi coagulaz pozitiv identificate pe 2 plci
selectate
V= volumul aplicat pe fiecare plac
D= factorul de diluie a suspensiei iniial
Dac cele 2 plci, care corespund probei sau suspensiei ini iale nu con in nici o
colonie de stafilococi coagulaz-pozitivi i dac inocularea a fost efectuat cu 0,1 ml
prob, se raporteaz rezultatele dup cum urmeaz:
Mai puin de 10 stafilococi coagulaz pozitiv pe ml ( produse lichide)
Mai puin de 10/d stafilococi coagulaz pozitiv pe gram ( alte produse), unde d
este factorul de diluie a suspensiei iniiale
Dac inocularea a fost fcut cu 1ml de prob , rezultatul se raporteaz dup
cum urmeaz:
Mai puin de 1 stafilococ coagulaz pozitiv pe ml ( produse lichide)
Mai puin de 1/d stafilococ coagulaz pozitiv pe gram ( alte produse)
Contaminarea alimentelor gata pentru consum cu stafilococi coagulazo-pozitivi este
n mare msur un rezultat al contactului uman. Contaminarea trebuie s fie minimizat
prin bune practici de manipulare a alimentelor iar dezvoltarea organismelor trebuie evitat
prin controlul adecvat al temperaturii.
Nivelurile nesatisfacatoare a stafilococilor coagulazo-pozitiv indic faptul c
folosirea excesiva a timpului/temperaturaturii pentru un aliment poate s fi aparut n urma
manipulrii improprii n timpul pregtirii alimentelor. Un test pentru enterotoxine, SET,
poate fi corespunzator dac nivelul stafilococilor coagulazo-pozitivi depeste 103 cfu/g.;
Este posibil ca organisme viabile s nu mai fie prezente ntr-un numar semnificativ n
alimente, n acest caz suspectam practici necorespunzatoare de manipulare a alimentelor.
Nivelurile 104 cfu sunt considerate riscuri poteniale deoarece consumul alimentelor cu
acest nivel de contaminare poate conduce la toxiinfecii alimentare.
39
CURS NR. 5
Metoda orizontal pentru enumerarea Escherichia coli pozitive

la glucuronidaz.
SCOP
Procedura stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene cu E. Coli -
glucuronidaz n produsele cercetate n vederea stoprii vinderii produsului, fiind pericol
pentru sntatea consumatorului.
DOMENIU DE APLICARE
Procedura de diagnostic se realizeaz n conformitate cu SR ISO 16649 2:2007,
o metod de orizontal pentru enumerarea E. coli pozitive la glucuronidaz din
o
produse destinate consumului uman la 44 C, folosind 5 bromo 4 cloro 3 indolil
D glucuronat, un mediu solid care conine un ingredient cromogen pentru detectarea
enzimei glucuronidaz.
De menionat c tulpinile de E.coli care nu se dezvolt la 44C i n special cele
negative la glucuronidaz, E. coli O157, nu pot fi detectate.
TERMENI I DEFINIII
E. coli pozitive la glucuronidaz - bacterii care la 44C formeaz colonii
tipice albastre pe mediu de tripton bil glucuronat (TBX);
Enumerare E. coli pozitive la glucuronidaz determinarea numrului de
uniti formatoare de colonii (ufc) de E. coli pozitive la glucuronidaz, pe mililitru sau
pe gram de prob, cnd analiza i calculele se efectueaz n conformitate cu aceast
metod.
PRINCIPIU
Cte dou plci cu mediu de tripton bil glucuronat (TBX) se inoculeaz cu
cantiti specifice de prob pentru analiz sau de suspensie iniial. Se inoculeaz n
aceleai condiii, folosind diluiile decimale ale probei pentru analiz sau ale suspensiei
iniiale, cte dou plci din fiecare diluie.
Plcile se incubeaz timp de 18h pn la 24h la 44C1C apoi se examineaz
pentru a detecta prezena coloniilor care, dup caracteristicile lor, sunt considerate a fi de
E.coli pozitive la glucuronidaz.
Se calculeaz numrul de ufc de E. coli pozitive la glucuronidaz pe gram sau
pe mililitru de prob.
MEDII DE CULTUR I SOLUII DE DILUARE FOLOSITE
Mediu de tripton bil glucuronat (TBX), care are urmtoarea compoziie:
digest enzimatic cu cazein 20,0g, sruri de bil nr. 3, 1,5g, 5 bromo 4 cloro 3
indolil - D glucuronic (BCIG) 144mol, dimetilsulfoxid (DMSO) 3 ml, agar 9 18g i
ap 1000ml.
Pentru preparare se dizolv toate componentele n ap prin fierbere, se ajusteaz
pH-ul dac este cazul, aa nct dup sterilizare s fie de 7,2 0,2 la 25C. Se
40
sterilizeaz mediul n autoclave fixat la 121C timp de 15 min. Se rcete imediat mediul
n baia de ap la 44C pn la 47C.
Soluie salin steril
Se repartizeaz soluiile de diluare pentru diluiile iniiale n flacoane sau sticle iar
pentru diluiie urmtoare n eprubete sau sticle. Cantitile trebuie repartizate astfel nct
dup sterilizare fiecare flacon sau sticl s conin 90 ml soluie de diluare sau un multiplu
de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie nchise cu dopuri.
o
Sterilizarea trebuie fcut n autoclav la 1211 C timp de 15 minute (un timp mai
lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dac soluiile de diluare nu sunt folosite
o
imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 0-5 C maxim o lun pentru evitarea oricrei
modificri a volumului sau compoziiei lor.
APARATUR I STICLRIE
o
Termostat 44 C aparat electric pentru dezvoltarea microbian;
o
Etuv 160 180 C asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl,
o
minute;
Autoclav realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii
o
de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121 C timp
de 20-30 minute;
Baie de ap, capabil s fie meninut la 44C pn la 47C;
Balan monoplatan - balan electronic cu reglare automat funcie de
Omogenizator Stomacher 400-Circulator, MF 7971 omogenizare eantion;
Autoclav Tuttnauer pentru instrumentar;
+ +
o
pH metru cu precizie de 0,1 uniti de pH la 25 C;
Pipete cu scurgere total (cu suflare) cu vrful lrgit, cu capacitate nominal de 1
ml i 10 ml sterile, gradate n diviziuni de 0,1ml i respectiv de 0,5ml;
Cutii Petri, cu diametrul de aproximativ 90 mm;
Flacoane cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml;
Lamp U.V. radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i
a suprafeelor de lucru;
EANTIONARE
Este important ca laboratorul s primeasc un eantion reprezentativ fr
degradri sau modificri datorate transportului sau depozitrii.
REGULI DE PROCEDUR PENTRU DETERMINAREA DE ESCHERICHIA
COLI -GLUCURONIDAZ
Pregtirea eantionului pentru analiz i a diluiei iniiale i diluii
succesive
Alimentul cu consisten semisolid se omogenizeaz ca atare.
Alimentul cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de mojarare.
Din proba de analizat se introduc n mojar 1g/10g + cantitatea egal de nisip steril. Se
tritureaz adugndu-se treptat lichid de diluie de 9 ori mai mare dect eantionul. Pipeta
se schimb pentru fiecare diluie. Se efectueaz un numr suficient de diluii
41
astfel nct toate eprubetele ultimei diluii se fie negative.
Folosind o pipet steril sau o micropipet steril, se transfer ntr-o cutie Petri
-1
steril 1 ml prob pentru analiz (dac este lichid), sau 1 ml diluie iniial (10 ) n cazul
altor produse
Se inoculeaz cte dou plci pentru fiecare diluie.
Se repet modul de lucru cu urmtoarele diluii decimale, dac este necesar,
folosind o pipet steril nou pentru fiecare diluie.
o
Se toarn n fiecare cutie Petri aproximativ 15 ml TBX, rcit n prealabil la 44 C
o
pn la 47 C n baie de ap.
Se amestec cu atenie inoculul cu mediu i se las amestecul s se solidifice,
aeznd plcile Petri pe o suprafa orizontal rece.
Intervalul de timp ntre distribuirea inoculului n cutie i turnarea mediului nu trebuie
s depeasc 15 minute.
o
Se ntorc plcile turnate cu susul n jos i se plaseaz ntr-un incubator fixat la 44
C timp de 18 h pn la 24 h. Timpul total de incubare nu trebuie s depeasc 24 h.
Dac se suspecteaz prezena celulelor stresate, se incubeaz pentru o perioad
iniial de 4h la 37C i apoi se ridic temperatura de incubare la 44C pentru 18h la 24h.
Temperatura de incubare nu trebuie s depeasc 45C.
Mediu TBX
Numrarea unitilor formatoare de colonii

Dup o perioad suficient de incubare se numr ufc tipice de E.coli pozitive la
glucuronidaz din fiecare plac care conine mai puin de 150ufc tipice i mai puin de
300 ufc totale (tipice i netipice).
Dac exist cutii pe care nu au crescut ufc tipice, acestea sunt luate n considerare
utiliznd metode diferite de calcul.
Exprimarea
rezultatelor Calculul
Pentru ca un rezultat s fie valabil, n general se consider c este necesar
numrarea ufc de pe cel puin o plac care conine un minim de 15 ufc albastre.
Se calculeaz N, numrul de ufc de E. coli pozitive la glucuronidaz
42
prezente n proba analizat, pe mililitru sau pe gram, media a dou diluii succesive
folosind ecuaia urmtoare:
a
N = -----------------------------
V x (n1 + 0,1 n2) x d
n care:
a suma ufc numrate pe toate plcile reinute din dou diluii succesive,
dintre care cel puin una conine un minim de 15 ufc albastre;
n1 numrul de plci reinute la prima diluie;
V volumul de inoculum aplicat pe fiecare plac, n mililitrii;
n2 - numrul de plci reinute la a 2-a diluie;
d- factor de diluie corespunztor primei diluii reinute (d=1 n cazul n care
se reine proba pentru analiz inoculat direct (produse lichide);
Rezultatele se rotunjesc la dou cifre semnificative. Se ia ca rezultat numrul de

E.coli pozitive la glucuronidaz pe mililitru (produse lichide) sau pe gram (alte produse)
exprimat ca un numr ntreg cu dou cifre semnificative (dac este sub 100) sau ca un
numr de ntre 1,0 i 9,9 nmulit cu puterea corespunztoare a lui 10.
Estimarea numrului cel mai sczut
Dac cele dou plci la nivelul probei pentru analiz (probe lichide) sau a
suspensiei iniiale (alte produse) sau a primei diluii inoculate sau reinute conin mai puin
de 15 ufc albastre, se calculeaz numrul estimat N E de ufc de E. coli pozitive la
glucuronidaz prezente n proba analizat, ca fiind media aritmetic Y de ufc tipice
numrate pe dou plci paralele folosind urmtoarea ecuaie:
c
NE = ------------------------
Vxnxd
n care:
a suma ufc albastre numrate pe cele dou plci;

n2 - numrul de plci reinute (n = 2 n acest caz);
d- factor de diluie corespunztor primei diluii reinute (d=1 n cazul n care
se reine proba pentru analiz inoculat direct (produse lichide);
Rezultatele se rotunjesc la dou cifre semnificative. Rezultatul se exprim astfel:

numrul estimat de E. coli pozitive la glucuronidaz pe mililitru (produse lichide) sau
pe gram (alte produse): NE = Y.
43
Dac cele dou plci la nivelul probei pentru analiz (produse lichide) sau
suspensiei iniiale (alte produse) din prima diluie inoculat sau reinut nu conine nici o
ufc, rezultatul se exprim astfel:
mai puin de 1/d de Escherichia coli pozitive la glucuronidaz pe mililitru
(produse lichide) sau pe gram (produse solide) n care d este factorul de
diluie al suspensiei iniiale sau al primei diluii inoculate sau reinute (d=1 n
cazul n care se reine proba pentru analiz inoculat direct (produse
lichide).
Dac pentru cele dou plci din prima diluie d, numrul total de ufc albastre
(tipice) i netipice este mai mare de 300 ufc vizibile albastre, i dac pentru cele dou
plci din diluia ulterioar d2 conin mai puin de 300 colonii, nu pot fi numrate ufc
albastre, rezultatul se exprim astfel:
mai puin de 1/d2 i mai mult de1/d1 Escherichia coli pozitive la
glucuronidaz pe mililitru (produse lichide) sau pe gram (produse solide).
n care d1 i d2 sunt factori de diluie corespunztori diluiilor d1 i d2.
Dac pentru cele dou plci din prima diluie d 1 numrul total de ufc albastre
(tipice) i netipice este mai mare de 300 fr ufc albastre vizibile i dac cele dou plci
din diluia ulterioar d2 coninnd mai mult de 300 de colonii, nu s-au putut numra ufc
albastre, rezultatul se exprim astfel:
mai puin de 1/d2 ufc de Escherichia coli pozitive la glucuronidaz pe
mililitru (produse lichide) sau pe gram (produse solide) - n care d 2 este
factorul de diluie corespunztor diluiiei d2.
Metoda de calcul: Cazuri speciale
n cazul n care numrul de ufc albastre este mai mare de 150 pentru cele dou
plci din prima diluie d1 cu un numr de ufc albastre sub 15 pentru cele dou plci din
diluia ulterioar d2:
dac numrul de de ufc albastre de pe fiecare din cele dou plci din diluia
d1 este cuprins ntre 167 i 150 (limita superioar a intervalului de ncredere
este egal cu 150 ufc) se folosete metoda de calcul pentru cazul general;
dac numrul de de ufc albastre de pe fiecare din cele dou plci din diluia
d1 este mai mare de 167 (limita superioar a intervalului de ncredere este
egal cu 150 ufc) se ia n considerare numai rezultatul numrrii diluiei d 2 i
44
se procedeaz ca la estimarea numrului cel mai sczut.
n cazul n care numrul de ufc albastre de pe fiecare plac din toate diluiile
inoculate depete 150, rezultatul se exprim astfel:
mai mult de 150/d de Escherichia coli pozitive la glucuronidaz pe
mililitru )produse lichide) sau pe gram (produse solide) n care d este
factorul de diluie al ultimei diluii inoculate.
n cazul n care numai cele dou plci cu diluia mai sczut (concentraia cea mai
mare) conin mai puin de 150 ufc tipice, se calculeaz numrul N de Escherichia coli
pozitive la glucuronidaz prezente n proba analizat ca media aritmetic a coloniilor
numrate pe cele dou plci, folosind ecuaia urmtoare:
c
1
N = ------------------------
Vxnxd
n care:
a suma ufc albastre numrate pe cele dou plci dintre care cel puin
una conine un minim de 15 ufc tipice;
n2 - numrul de plci reinute (n = 2 n acest caz);
d- factor de diluie corespunztor primei diluii reinute.
Rezultatele se rotunjesc la dou cifre semnificative.
Test de confirmare
Sistem de identificare bacterian Vitek 2 Compact.
45
CURS NR. 6
Determinarea Enterobacteriaceaelor
n conformitate cu prevederile ISO 21528-1,2
Aceast familie prezint o semnificaie deosebit pentru igiena alimentar. Ea

conine12 genuri, fiecare din acestea incluznd specii patogene sau condiionat patogene
pentru om i animale. Bacteriile din aceast familie contamineaz frecvent produsele
alimentare de origine animal, crora de cele mai multe ori, le produc degradri
importante sau le fac duntoare pentru consumator. Alimentele contaminate cu
enterobacterii stau de multe ori la originea multor infecii i toxiinfecii alimentare ale
omului.
Enterococii prezeni n alimente sunt folosii i ca indicatori igienico-sanitari,
prezena lor demonstrnd posibilitatea contaminrii alimentului n cauz cu germeni
enterici patogeni, ca i insuficiena unor tratamente (n special termice) aplicate n
procesul tehnologic.
Enterobacteriaceaele sunt microrganismele cel mai des ntlnite motiv pentru care
prezena lor poate fi folosit ca indicatori de risc. Monitorizarea i testarea pentru
Enterobacteriaceae s-a recomandat att n mediul de fabricare ct i n produsul finit de
ctre EFSA. Cu toate acestea, pe lng speciile patogene ale familiei Enterobacteriaceae
sunt incluse i speciile din mediu, care apar des in mediul de fabricare al alimentului far a
prezenta riscuri asupra sntii. De aceea, familia Enterobacteriaceaelor se poate folosi
n monitorizarea de rutin i dac sunt prezente se trece la testarea de patogeni specifici.
(Reg. 2073)
Morfologie
Enterobacteriile sunt bacterii cu form de bastonae mici, bacili sau cocobacili,
gram negativi, care fermenteaz glucoza, sunt oxidaz negative, catalaz pozitive, reduc
nitraii n nitrii, asporogene, capsulogene sau nu, mobile sau nu, acidosensibile, aerobe i
facultativ anaerobe.
n raport de patogenitatea lor pentru om, enterobacteriile au fost clasificate n
specii:
nalt patogene(Yersinia pestis, Salmonella typhi,etc.);
patogene (toate celelalte serotipuri de Salmonella i celelalte specii de
Sighella);
condiionat patogene (Escherichia, Klebsiella, Proteus,Yersinia
enterocolitica i Yersinia pseudotuberculosis );
accidental patogene (Citrobacter, Enterobacter, Serattia);
nepatogene ( Edwardsiella, Hafnia, Erwinia).
Habitat
46
Enterobacteriaceaele sunt bacterii ubicvitare ce ocup o larg varietate de nie
ecologice. Multe specii pot cohabita n interiorul aceleai nie ecologice, prezentnd o
specificitate relativ fa de gazd.
Nia ecologic obinuit a bacteriilor din aceast familie o formeaz tubul digestiv
al omului i animalelor, n special partea lui posterioar. Din aceast cauz prezena
enterobacteriilor pe alimente se consider deobicei contaminare fecal, stare de igien
precar a personalului. Prezena enterococilor n alimente nu trebuie ns considerat
ntotdeauna ca un indicator de contaminare fecal, deoarece ei sunt foarte des prezeni i
n afara organismului uman i animal, pe suprafeele de lucru i pe utilajele din unitile de
procesare. Aceasta este posibil datorit rezistenei mari fa de cei mai diveri factori de
mediu, ceea ce le permite supravieuirea lor timp ndelungat n cele mai diferite condiii.
Rezistena
Este cunoscut rezistena crescut a enterococilor n alimente i n mediul extern,
rezisten care se aproprie de cea a unor spori bacterieni. (41)
Produse alimentare care pot fi contaminate
Laptele
Ca rezultat al asocierii cu animalele, enterococii se gsesc i n lapte n calitate de
conatminani alimentari naturali. Enterococii prezeni n lapte sunt considerai indicatori
igienico sanitari, prezena lor demonstrnd att posibilitatea contaminrii laptelui cu
germeni enterici patogeni, ct i ineficiena unor tratamente termice aplicate n procesul
tehnologic de fabricaie.
n produsele lactate i mai ales la brnzeturi, unii enterococi produc histamin i
amine biogene care sunt responsabile de tulburri circulatori de tipul hipertensiunii
arteriale i migrenelor, vom i chiar reacii alergice de intensitate puternic. Aminele
biogene sunt de asemenea un motiv de ngrijorare n ceea ce privete igiena produselor
alimentare, nivelele ridicate ale acestora putnd fi considerate ca indicatori ai procesului
de deteriorare a alimentelor i/sau a deficienelor de fabricaie a acestora. (46)
ngheata
Controlul microbiologic al ngheatei include determinarea nivelulului de contaminare
general (NTG) i al contaminrii cu bacterii coliforme, iar pe de alt parte, prezena
principalilor germeni patogeni ce pot contamina ngheata: enterobacteriaceae i salmonella.
Carcase
Microorganismele patogene care pot fi gsite pe / n carcase sunt:
Enterobacteriaceae.
Carnea i produselor de carne deshidratate
n aceast categorie de produse intr carnea deshidratat, supele deshidratate,
gelatina, colagenul i plasma sanguin. Deshidratarea este considerat ca un mijloc de
conservare. Principalele categorii de bacterii ce se dezvolt n asemenea produse sunt:
Enterobacteriile.
Carne tocat
ncrctura microbian iniial a crnii tocate depinde de ncrctura crnii din care
este preparat ct i de condiiile n care se obine. Dezosarea mecanic a crnii
contribuie la obinerea unei crni tocate cu o ncrctur microbian mai mic dect una
47
provenit din carnea dezosat manual. n carnea tocat, microflora iniial este format i
din specii de Enterobacteriaceae.
Carnea de iepure germenii din genul Enterobacter E. cloacae i E. sakazakii au
fost izolai din carcasele de iepuri domestici. (Krupaci)
Carnea crud a animalelor acvatice
Pe suprafaa petelui de ap dulce i rece predomin bacteriile Gram negative, pe
suprafaa celor din ap dulce i cald, bacteriile Gram pozitive. Spre deosebire de
vieuitoarele marine, pe petele de ap dulce se constat deseori bacterii din familia
Enterobacteriaceae i din genul
Aeromonas. Apa
Pentru om mai importante care pot polua apa i determin modificarea statusului
de salubritate al produselor alimentare sunt: bacteriile din familia Enterobacteriaceelor
(Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Bacteriile
coliforme), etc.
Cartofii
Putrezirea umeda a tuberculilor este o boala produsa de bacteria Erwinia
phytophtora, specie care face parte din marea familie a Enterobacteriaceaeelor . Genul
Erwinia din care face parte aceasta specie cuprinde numeroase specii fitopatogene. La
inceputul infectiei tuberculii au aspect exterior normal, dar structura interioara este roz-
violacee. Treptat, unele zone din interiorul tuberculului se ramolesc, se transforma intr-un
mucilagiu galben cu miros neplacut. Aceasta boala in faza initial evolueaza pe culturile
din camp, dar continua si se intensifica in timpul depozitarii.
Putrezirea umeda a cartofului poate fi produsa si de Bacterium Xanthochru, o
bacterie Gram negativa, existenta in sol.
Detectarea Enterobacteriaceaelor - folosete tehnica de numrare a coloniilor

o
la 37 C pe mediu solid agar cu rosu violet bila glucoza (VRBG).
Definiii
o
Enterobacteriacee sunt microorganisme care la 37 C formeaz colonii tipice pe
mediu agar cu rosu violet bila glucoza (VRBG), atunci cnd analiza este efectuat
conform metodei specificate n standard SR ISO 21528-1/2007;
Enumerarea Enterobacteriacee determinarea numrului de uniti formatoare de
colonii (ufc) Enterobacteriacee, pe mililitru sau gram de prob, cnd analiza i
calculele se efectueaz n conformitate cu SR ISO 21528-2/2007.
PRINCIPIUL METODEI
Cte doua plci cu mediu agar cu rosu violet bila glucoza (VRBG) se inoculeaz cu
cantiti specifice de prob pentru analiz sau de suspensie iniial.
Se inoculeaz, n aceleai condiii folosind, diluii decimale ale probei pentru
analiz sau ale suspensiei iniiale , cte dou plci din fiecare diluie.

Plcile se incubeaz timp de 24 h la 37 C, apoi se examineaz pentru a detecta
prezena coloniilor care, dup caracteristicile lor, sunt considerate a fi colonii de
Enterobacteriacee.
Se rensmneaz coloniile presupuse Enterobacteriacee pe mediu neselectiv, i
se confirm prin teste de fermentare a glucozei i prezena oxidazei.
48
Se calculeaz numrul de uniti formatoare de colonii (UFC) de Enterobacteriacee
pe gram sau pe mililitru.
Repartizarea, sterilizarea i pstrarea soluiilor de diluare
Se repartizeaz soluiile de diluare pentru diluiile iniiale n flacoane sau sticle iar
pentru diluiile urmtoare n eprubete sau sticle. Cantitile trebuie astfel repartizate astfel
nct dup sterilizare fiecare flecon sau sticl s conin 90 ml soluie de diluare sau un
multiplu de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie nchise cu dopuri. Sterilizarea
+ o
trebuie fcut n autoclav la 121 -1 C timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi
necesar pentru volume mai mari). Dac soluiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele
o
trebuie pstrate la ntuneric ntre 0-5 C maxim o lun pentru evitarea oricrei modificri a
volumului sau compoziiei lor.
MOD DE LUCRU
Pregtirea eantionului pentru analiz i a diluiei iniiale i diluii
succesive
Se prepar o singur serie de diluii zecimale din proba pentru analiz dac
produsul este lichid, sau din suspensia initiala n cazul altor produse.
Se efectueaz un numr suficient de diluii astfel nct toate eprubetele ultimei
diluii se fie negative.
Folosind o pipet steril sau o micropipet steril, se transfer ntr-o cutie Petri
-1
steril 1 ml prob pentru analiz (dac este lichid), sau 1 ml diluie iniial (10 ) n cazul
altor produse.
Se inoculeaz cte dou plci pentru fiecare diluie.
Se repet modul de lucru cu urmtoarele diluii decimale, dac este necesar,
folosind o pipet steril nou pentru fiecare diluie.
o
Se toarn n fiecare cutie Petri aproximativ 15 ml VRBG, rcit n prealabil la 37 C
o
pn la 47 C n baie de ap.
Se amestec cu atenie inoculul cu mediu i se las amestecul s se solidifice,
aeznd plcile Petri pe o suprafa orizontal rece.
Intervalul de timp ntre distribuirea inoculului n cutie i turnarea mediului nu trebuie
s depeasc 15 minute.

Se ntorc plcile turnate cu susul n jos i se plaseaz ntr-un incubator fixat la 37
C timp de 18 h pn la 24 h. Timpul total de incubare nu trebuie s depeasc 24 h.
Test de confirmare
Sistem de identificare bacterian Vitek 2 Compact.
Enumerarea i selectarea coloniilor pentru confirmare
Coloniile caracteristice sunt roz spre rou sau purpuriu (cu sau fr halouri
precipitate).
Se aleg plcile care conin mai puin de 150 colonii caracteristice, se numr
aceste colonii. Apoi se aleg la ntmplare cinci astfel de colonii pentru rensmnare n
vederea testelor de confirmare biochimic.
Rensmnarea coloniilor selectate.
Se depun pe plci de agar nutritiv fiecare din coloniile selectate pentru confirmare.
o
Se incubeaz aceste plci la 37 C timp de 24 h.
49
Se selecteaz cte o colonie bine izolat de pe fiecare din plcile incubate pentru
analize biochimice de confirmare.
Analize biochimice de
confirmare A.Reacia oxidazei
Folosind o ans, un ac sau o baghet de sticl se ia o poriune din fiecare colonie
bine izolat i se depune pe o hrtie de filtru umectat cu reactiv de oxidaz sau pe o
rondel disponibil n comer.
Se consider rezultat pozitiv atunci cnd banda de hrtie de filtru care conine
oxidaz se coloreaz n violet dup aproximativ 10 15 secunde.
B.Test de fermentaie
Se transfer, folosind o ans, aceleai colonii selectate care au dat testul oxidazei
o
pozitiv n eprubete care conin agar cu glucoz. Se incubeaz aceste eprubete la 37 C
timp de 24 h. Dac apare o culoare galben a mediului de cultur, reacia este
considerat ca fiind pozitiv.
Foto nr. Agar glucozat nainte de Foto nr. Agar glucozat dup nsmnare i
nsmnarea coloniilor selectate termostatare- reacie pozitiv (modificare
culoare n galben)
Interpretarea analizelor biochimice
Coloniile care sunt pozitive la oxidaz i glucoz se confirm ca Enterobacteriacee
EXPRIMAREA REZULTATELOR
Calculul se efectueaza conform ISO 7218 , cazul general sau la alegere in acord
cu numarul de colonii numarate in cele doua placi inoculate.
50
CURS NR. 7
Detectarea speciilor termotolerante de Campylobacter
Bacteriile din genul Campylobacter sunt microorganisme care formeaz colonii

o
tipice pe mediile solide, selective la 42 C, dintr-o cantitate dat de produs i care manifest
caracteristicile de mobilitate i proprietile biochimice specifice.
Procedura stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene din genul
Campylobacter n produsele cercetate.
Metoda se aplic urmtoarelor produse: lapte crud; carne de pasre
Principiul metodei:
Pentru detectarea speciilor termotolerante de Campylobacter se cer urmtoarele
faze:
mbogire n mediu lichid - nsmanarea probei luate n lucru n mediu
o
lichid (bulion Preston) i incubare la 42 C timp de 18 h.
Izolare i identificare - din culturile obinute se face nsmanarea mediului
o
selectiv solid (Agar Karmali) i incubare la 42 C timp de 24-72 h.
Confirmare - efectuare de teste biochimice i serologice adecvate.
Soluii de diluare i medii de cultur folosite:
Soluii de utilizare special: Bulion Brucella; Agar Columbia cu sange; Agar
TSI.
Medii de cultur
1. Bulion Preston;
2. Agar Karmali.
+ o
Sterilizarea trebuie fcut n autoclav la 121 -1 C timp de 15 minute (un timp mai
lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dac soluiile de diluare nu sunt folosite
o
imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 0-5 C maxim 7 zile pentru evitarea oricrei
modificri a volumului sau compoziiei lor.
Echipamente de ncercare i mijloace de msurare
o
Termostat - reglabil la 42 C
o
o
sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180 C
timp de 30-60 minute
Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune
pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc.
o
Temperatura este de 121 C timp de 20-30 minute
Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului
ncperilor i a suprafeelor de lucru
Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de
temperatura camerei
51
Sterilizator electric pentru instrumente
Ans buclat din platin-iridiu sau nichel-crom cu diametrul de 3 mm
Pipete gradate sterile cu scurgere total de 1 ml, de 10 ml i pipete Pasteur
Lup cu putere de mrire de 3x
pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la
o
25 C
Microscop
Recipiente n principal eprubete de 16 mm x 160 mm i de 9 mm x 180 mm,
eprubete pentru hemoliz de 13 mm x 75 mm, sticle cu capace metalice
netoxice i/sau flacoane prevzute cu dopuri de bumbac, care s permit
circulaia gazelor pentru a se realiza atmosfera microaerob necesar.
Cutii petri de sticl sau de material plastic cu diametrul de 90 mm i 100 mm
Mojar cu pistil, sterile
Eeantionare - este important ca laboratorul s primeasc un eantion cu
adevrat reprezentativ
Reguli de procedur pentru determinarea germenilor din genul
Campylobacter
Eantioanele sunt etichetate, cuprinznd: produsul recoltat, examenul cerut, locul
prelevrii, zua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a
prelevat.
Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator
folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la
o o
etuv la 180 C timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121 C timp de 30 minute.
Pregtirea materialului de sterilizat:
- Splarea sticlriei cu ap cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de
ap, dup care splarea cu ap distilat
- Punerea de dopuri de vat cu tifon, mpachetarea cu hrtie a gtului
eprubetelor sau baloanelor
o
- Introducerea n etuv pentru 30 de minute la 121 C
Omogenizare prin mojarare - alimentul cu consisten lichid se omogenizeaz ca
atare.
tritureaz adugndu-se treptat lichid de diluie de 9 ori mai mare dect eantionul.
52
Diagrama modului de lucru
Prob de testat
Xg sau X ml
Se adaug la 9 ml bulion Preston pentru a obine un

Imbogatire
raport de 1/10 ntre produsul de examinat i mediu.
o
Suspensia obinut, se incubeaz la 42 C,
ntr-o atmosfer microaerob timp de 18 h.
se
Din cultura obinut se nsmaneaz, prin striere

suprafaa agarului Karmali, din dou cutii Petri.
Cutiile Petri nsmanate, se incubeaz n atmosfer

Izolare
o
microaerob la 42 C timp de 24 h, 48 h sau chiar 3
pan la 5 zile
Se examineaz cutiile Petri n vederea

detectrii prezenei coloniilor tipice de Campylobacter
Pentru confirmare se aleg, din toate cutiile Petri

inoculate cate 5 colonii tipice i/sau suspecte. Dac ntr-
o cutie Petri sunt mai puin de 5 colonii tipice i/sau
suspecte, se iau toate pentru confirmare.
Examinarea caracterelor morfologice i de mobilitate

Confirmare
(bulion Brucella i agar Columbia)

Examene biochimice (detectarea oxidazei, catalazei,
fermentarea zaharurilor, testarea sensibilitii la cefalotin
i acid nalidixic
Se efectueaz conform standardului internaional pentru produsul de analizat.
53
Dac nu exist standard internaional de produs se recomand ca prile interesate s se
pun de acord asupra subiectului.
1. Faza de mbogire
Pentru a prepara suspensia iniial se adaug o poriune din eantionul de
examinat (mas sau volum) n 9 ml mediu de mbogire, bulion Preston pentru a obine
un raport de 1/10 (mas/volum sau volum/volum) ntre produsul de examinat i mediu.
o
Suspensia obinut, se incubeaz la 42 C, ntr-o atmosfer microaerob timp de 18
h.
2. Izolare i Identificare
Din cultura obinut prin mbogire n bulion Preston, dup 18 h incubare, cu o
ans bacteriologic se nsmaneaz, prin striere suprafaa agarului Karmali, din dou
o
cutii Petri. Cutiile Petri nsmanate, se incubeaz n atmosfer microaerob la 42 C timp
de 24 h, 48 h sau chiar 3 pan la 5 zile, dup care se examineaz cutiile Petri n vederea
detectrii prezenei coloniilor tipice de Campylobacter termotolerant.
3. Interpretare
Pe mediul agar Karmali coloniile tipice sunt plate asemntoare unor picturi
alungite.
4. Test de confirmare
Alegerea coloniilor pentru confirmare
Pentru confirmare se aleg din toate cutiile Petri inoculate cate 5 colonii tipice i/sau
suspecte.Dac ntr-o cutie Petri sunt mai puin de 5 colonii tipice i/sau suspecte, se iau
toate pentru confirmare.
Examinarea caracterelor morfologice i de mobilitate
Din fiecare cutie Petri se utilizeaz cte o colonie perfect izolat pentru realizarea
unui frotiu colorat Gram;
Se ia o colonie din cele 5 alese i se omogenizeaz ntr-un 1 ml bulion Brucella;
Se examineaz la microscop morfologia i mobilitatea fiecrei colonii selectate;
Pentru examinrile ulterioare, se rein suspensiile n care se evideniaz bacili
Gram negativi, curbai cu o micare n spiral, de tirbuon, caracteristic.
Studiu morfologic
Din suspensiile selectate se fac strieri cu ansa pe agar Columbia cu sange pentru a
obine colonii bine izolate. Cutiile Petri inoculate se incubeaz n atmosfer
54
o
microaerob, la 42 C, timp de 24 h i se utilizeaz pentru testele biochimice, culturile
pure.
o
Cretere la 25 C
Din cutiile Petri cu agar Columbia cu sange se ia cate o colonie i se descarc ntr-
o
un tub de bulion Brucella, se incubeaz la 25 C, n atmosfer microaerob timp de dou
pan la cinci zile.Dup incubare se examineaz prezena sau absena creterii.
5. Confirmri biochimice
5.1. Detectarea oxidazei
Cu o ans bacteriologic sau cu o baghet de sticl se ia o poriune dintr-o colonie
bine izolat, din fiecare cutie Petri i se descarc pe o hartie de filtru mbibat cu reactiv
pentru oxidaz. Apariia n 10 sec a unei culori mov, violet sau albastru nchis indic o
reacie pozitiv. Cand se utilizeaz chituri de testare provenite din comer, se respect
instruciunile productorului.
Pentru confirmarea rezultatelor pozitive sau negative se utilizeaz tulpini martor.
5.2. Agar TSI

Din fiecare colonie selectat se face inocularea agarului cu ansa. Se neap cu
ansa, partea drept a agarului, pe toat lungimea sa, apoi se descarc, prin striere, pe
partea nclinat a acestuia.
o
Se incubeaz n atmosfer microaerob la 42 C, timp de 24 h i chiar 5 zile, dac
este necesar.
Interpretarea reaciilor se face n felul urmtor:
55
Partea dreapt
galben - glucoz pozitiv (fermenteaz glucoza)
Rou sau neschimbat - glucoz negativ (nu fermenteaz glucoza)
Negru - formare de hidrogen sulfurat (H2S)
Bule de gaz sau spargerea agarului - formare de gaz din glucoz
Partea nclinat
Galben - lactoz i/sau zaharoz pozitiv (unul sau ambele zaharuri sunt
folosite);
Rou sau neschimbat - lactoz i zaharoz negativ (nici un zahar nu este
folosit).
5.3. Detectarea catalazei

Din culturile obinute pe agar TSI se omogenizeaz cu ansa, ntr-o pictur de
soluie de peroxid de hidrogen depus pe o lam microscopic n stare curat.
Apariia n 30 sec., a bulelor de gaz indic reacie pozitiv.
5.4. Detectarea sensibilitii la acid nalidixic i cefalotin

Se inoculeaz cu ansa, coloniile selectate, n bulion Brucella, pan cand se
realizeaz o suspensie cu densitatea de 0,5 pe scara Mac-Farland.
Suspensia realizat se dilueaz 1 : 10 cu bulion Brucella.
Se inund cu suspensia diluat suprafaa agarului Mueller-Hinton cu 5% sange
dintr-o cutie Petri.
Se las n contact 5 min, dup care se nltur suspensia n exces.
o
Se usuc suprafaa mediului din cutii, prin meninere n etuv, la 37 C, timp de 24
h.Pe suprafaa agarului uscat se aplic un disc cu acid nalidixic i un altul cu cefalotin.
o
Se incubeaz ntr-o atmosfer microaerob la 37 C timp de 24
h. Interpretarea creterii bacteriene se face n felul urmtor;
-cretere realizat n contact cu discul se consider rezisten;
-prezena unei zone de o anumit mrime, unde se observ inhibarea creterii, se
consider sensibilitate.
5.5. Detectarea hidrolizei hipuratului
Coloniile selectate de pe agar Columbia cu sange se inoculeaz cu o ans ntr-un
tub Waserman (de hemoliz) 0,4 ml soluie de hipurat de sodiu.
o
Se agit tubul uor i se incubeaz ntr-o baie de ap la 37 C timp de 24 h.
Se adaug foarte uor 0,2 ml soluie de ninhidrin pe suprafaa soluiei de hipurat
de sodiu. Nu se agit.
o
Se incubeaz n baie de ap la 37 C timp de 10 min.
Reacia este pozitiv atunci cand apare culoarea violet nchis.
Culoarea violet deschis sau lipsa modificrii culorii indic reacie negativ.
6. Eexprimarea rezultatelor - n funcie de rezultatele interpretrii se indic prezena
56
sau absena germenilor din genul Campylobacter termotolerant n x grame de
prob de analizat
7. Interpretarea rezultatelor
Alimentele gata pentru consum nu trebuie sa contina spp Campylobacter. Trebuie
s se asigure masuri de control specifice in timpul produciei, standarde de igiena
adecvate, gtire adecvat n timpul pregtirii finale pentru ca produsele finale s nu
conin organisme viabile i ca alimentele gtite s fie de bun calitate.
57
LABORATOR NR. 8
Determinarea de drojdii i mucegaiurilor
Scop
Procedura de diagnostic stabilete directivele generale pentru numrarea drojdiilor
i mucegaiurilor viabile n produsele destinate consumului uman prin tehnica numrrii

coloniilor la temperatura de 25 C. Drojdiile i mucegaiurile sunt microorganisme care la

25 C formeaz colonii specifice pe mediu selectiv.
Domeniul de aplicare
Metoda se aplic urmtoarelor produse: brnzeturi proaspete (ca, telemea
proaspt); brnz maturat n saramur din lapte pasteurizat sau nepasteurizat, brnz
fermentat cu past tare (svaier), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal);
brnzeturi cu past filat (cacavaluri), afumate i neafumate; brnzeturi fermentate; unt;
margarin de consum; margarin cu lapte; iaurt cu fructe; produse crude (niel, cacava
pane); produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate
calde pasteurizate); pete srat; pete srat cu ceap; maionez; pulberi de maionez
(nlocuitori de maionez); vegetale congelate; vegetale deshidratate; prafuri de budinci i
creme deshidratate, nlocuitori de fric; paste finoase (macaroane, fidea); condimente i
amestecuri; buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14
zile; pulberi pentru sucuri; bere nepasteurizat, filtrat i nefiltrat; bere pasteurizat;
finuri alimentare; produse de panificaie cu umpluturi; derivate din cereale tratate termic
(fulgi de porumb, orez, produse expandate); biscuii, pateuri; fursecuri, napolitane cu
diferite creme; cacao, pudr, ciocolat tablete, ciocolat umplut cu crem sau de tip
fondant; jeleuri, rahat, gemuri, erbeturi, dulceuri, fructe confiate; arome alimentare
naturale sau sintetice; emulsie pentru buturi rcoritoare: concentrate alimentare (supe,
cuburi de carne); oet alimentar; ceai (plant); cafea crud prjit i instant; melanj din ou
praf; produse din gru germinat; pepsin (pulbere n amestec cu sare), etc.
Probele recoltate trebuie s fie etichetate i pe aceasta s fie menionate cel puin
urmtoarele date: produsul recoltat; examenul solicitat, locul prelevrii; ziua i data
prelevrii; data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a prelevat.
Documente de referin
SR ISO 21527/1 sau 2
Principiul metodei
Turnarea n cutii Petri a unui mediu de cultur selectiv i a unei cantiti
determinate din eantionul de analizat. Pregtirea altor cutii n aceleai condiii folosind
diluii decimale din eantionul de analizat sau din diluia iniial

Incubarea aerob a cutiilor cu medii de cultur nsmnate la 25 C timp de 4 sau 5
zile. Calcularea numrului de Drojdii i Mucegaiuri pe gram sau ml de prob din numrul
de colonii obinut n cutiile alese la nivelul de diluii care permit stabilirea unui rezultat
semnificativ
Soluii de diluare i medii de cultur utilizate
Medii de cultur - mediu extract de drojdie-dextroz-cloranfenicol-agar
58
(MEDDCA) si /sau agar DG 18. Instruciunile productorului trebuie riguros respectate.
Soluii de diluare - ap distilat sau deionizat, fr coninut de substane care
ar putea inhiba dezvoltarea drojdiilor i mucegaiurilor n condiii de testare. Pentru a se
evita lezarea microorganismelor datorit schimbrilor brute de temperatur, soluia de
diluare trebuie s alb aproximativ aceeai temperatur cu proba, dac nu exist alte
prescripii.
Echipamente de ncercare utilizate
o+ o
Termostat 25 -0,5 C - aparat electric pentru dezvoltarea microbian;
o
Etuv 160 180 C - asigur sterilizarea Cu cldur uscat a obiectelor de sticl,
o
minute;
Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii
o
de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121 C timp
de 20-30 minute;
Lamp U.V - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i
a suprafeelor de lucru;
Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura
camerei;
Omogenizator Stomacher 400-Circulator omogenizare eantion;
Autoclav Tuttnauer pentru instrumentar;
o o
Baie de ap reglabil la temperatur mai mare de 100 C sau reglabil la 45 C;
Cutii Petri sterile din sticl cu diametrul de 90-100 mm;
+ +
Pipete gradate sterile de 1 ml - 0,02 ml sau de 10 ml - 0,2 ml, gradate n diviziuni
de 0,5 i respectiv 0,1 cu orificiu de 2-3 mm;
Lup cu putere de mrire de 3x;
o
pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25 C;
Perle de sticl cu diametrul de cca 6 mm;
Flacoane cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml.
Pentru a obine o cultur pur de drojdii i mucegaiuri este necesar ca materialul
de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este
o o
sterilizat la etuv la 180 C timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121 C timp de 30
minute.
Eantionul se pregtete conform standardului internaional specific al produsului
respectiv.
Exemple: Brnza se folosesc 10 g prob ntr-o capsul cu o cantitate mic de
soluie de diluare i se omogenizeaz cu pistilul. Se adaug soluie de diluare pn la
-1
ntregul volum de 90 ml. Se obine astfel diluia 10 ; Untul se pune recipientul cu

eantion ntr-o baie de ap la 45 C. Se agit pentru a uura topirea i se menine pn la
topirea complet. Se agit i cu o pipet nclzit la cca 45C se introduc 10 ml ntr-
59
un flacon care conine 90 ml soluie de diluie. Se agit de fiecare dat naintea
-1
transferului urmtor. Se obine diluie de 10 .
Alimentele cu consisten solid se mrunesc n buci mici nainte de mojarare.
Procedura de lucru
nsmnare i incubare
Pentru realizarea diagnosticului trebuie parcurse parcurse urmtoarele etape:
Se iau dou cutii Petri sterile;
Cu o pipet steril se trece n fiecare cutie cte 1 ml eantion de analizat dac
produsul este lichid sau cte 1 ml din diluie iniial a produselor solide i semi-
solide. Pipeta se schimb pentru fiecare diluie.
Pe fiecare cutie se noteaz numrul probei, diluia i data;
Se iau nc dou cutii Petri sterile;
-1
Cu o alt pipet steril, se trece cte 1 ml din diluia 10 n fiecare cutie. n unele
situaii, procedeul se repet i cu alte diluii, preparndu-se attea diluii de lucru
nct ntr-o cutie Petri s se obin mai mult de 10 i mai puin de 150 colonii.
Pipeta se schimb pentru fiecare diluie. Prin operaia de diluie n tuburile cu diluii
se vor obine cantitile de prob ilustrate n tabel de mai jos din care reiese c
ntre dou diluii consecutive, diferena de concentraie este de 10 ori (diluii
decimale)
Nr. tub 1 2 3 4
x
Diluia 1/10 ) 1/100 1/1000 1/10000
Cantitate (g) 0,1 0,01 0,001 0,0001
sau volum (ml)
sau sau sau sau
Din proba 10-1 10-2 10-3 10-4
iniial pe ml
diluie xx)
x) n cazul produselor solide sau semi-solide aceast diluie se afl n recipientul
omogenizatorului sau n mojar;
xx) n cazul nsmnrii a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-
-1 -0
solide (10 ml diluie 10 ) aceast cantitate se noteaz cu 10 .
Se toarn circa 15 ml mediu extract de drojdie-dextroz-cloranfenicol-agar
0 0
(MEDDCA) si /sau agar DG 18, (topit n prealabil i meninut la 45 +- 1 C ntr-o
baie de ap), n fiecare cutie Petri. Timpul scurs ntre finalul preparrii suspensiei
-1
iniiale (sau diluiei 10 dac produsul este lichid) i momentul n care mediul este
turnat n cutiile Petrii, nu trebuie s depeasc 15 min;
Inoculul se amestec cu mediul i amestecul rezultat este lsat s se solidifice,
dup ce cutiile Petri au fost aezate pe o suprafa orizontal, rece;
Se prepar o cutie martor, cu 15 ml mediu, pentru verificarea sterilitii.
60

Se efectueaz incubarea aerob a cutiilor la 25 C timp de 4 sau 5 zile;
Penicilium urtice i Fusarium nivale, Aspergillus citrinum, Penicilium urticae,

colonii pe mediu DDCA colonii pe mediu DDCA
-1 -2
D+M diluie de 10 colonii pe mediu DDCA D+M diluie de 10 colonii pe mediu DDCA
-3
D+M diluie de 10 colonii pe mediu DDCA
Calculul
Dup 3 5 zile de incubare se numr coloniile din fiecare cutie Petri, fiind reinute
acele cutii care au coninut sub 150 colonii;
61
Se procedeaz la calcularea numrului de Drojdii i Mucegaiuri pe gram sau ml de

prob din numrul de colonii obinut n cutiile alese la nivelul de diluii care permit
stabilirea unui rezultat semnificativ.
Numrul de drojdii i mucegaiuri pe gram sau pe mililitru se calculeaz utiliznd
urmtoarea formul:
C
------------------------
(n1 + 0,1 n2) d
unde; C suma coloniilor numrate n toate cutiile

n1 numrul cutiilor reinute, de colonii la prima diluie
n2 - numrul cutiilor reinute, la a doua diluie
-2
d diluia din care s- au fcut primele numrri( de exemplu , 10 )
x
Rezultatul se exprim ca un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 nmulit cu 10 ,n care x
este puterea lui 10.
Dac nu exist nici o colonie n cutiile corespunztoare suspensiei iniiale cnd
produsul iniial a fost solid, numrul de drojdii i mucegaiuri pe gram de produs trebuie
raportat ca fiind mai mic de 10. Dac n cutiile cu prob nu exist nici o colonie, cnd
produsul iniial a fost lichid, numrul de drojdii i mucegaiuri pe mililitru produs se
raporteaz ca fiind mai mic de 1.
62
Exemplu de calcul
Numrarea drojdiilor i mucegaiurilor indic urmtoarele rezultate (au fost incubate
cte dou cutii Petri pentru fiecare diluie):
-2
diluia 10 :83 i 97;
3
diluia 10 : 33 i 28 colonii.
C 83+97+33+28 241
N = ---------------------------- = ------------------------ = --------- = 10954
-2
(n1 + 0,1 n2 ) d [2+(0,1x2)] x 10 0,022
Rotunjind rezultatul se obtine 11.000. Prin urmare, numrul de drojdii i mucegaiuri

4
estimat pe gram sau pe mililitru, este de 1,1 x 10 .
Buletinul de analiz
Trebuie s indice metoda folosit, timpul de incubare i rezultatele obinute,
precum i modul lor de exprimare. El trebuie s menioneze de asemenea, orice detaliul
de lucru care nu este specificat n Standard, sau considerat ca obional, mpreun cu
detalii asupra oricrui incident care poate influiena rezultatele.
63
CURS NR. 10
Examinarea apei utilizat ca ingredient

alimentar i produs n contact cu produsul
alimentar
Recoltarea, conservarea, identificarea, transportul i pstrarea probelor de ap se

fac conform prevederilor Legii nr 458/2002 modificat prin Legea nr.311/2004 i STAS -
ului 2852/1993.
La stabilirea frecvenei de recoltare a probelor se va avea n vedere urmtoarele:
ponderea probelor necorespunztoare n ultimele 12 luni;
calitatea apei brute;
numrul surselor de ap;
eficiena procedeelor de tratare i capacitatea staiei de tratare a apei;
riscurile de contaminare la nivelul sursei i a reelei de distribuie;
mrimea i complexitatea reelei de distribuie;
numrul de epidemii hidrice din ultimele 12 luni i riscurile rspndirii
unor epidemii. (83)
Identificarea probelor de ap se va face prin marcarea clar, vizibil i durabil a
recipienilor care conin probele. Pe adresa de nsoire se va meniona momentul recoltrii,
data, ora de recoltare, natura i cantitatea conservanilor adugai etc.
Transportul probelor de ap se face n ambalaje care protejeaz recipienii, n timp
operativ i dup caz n condiii de refrigerare sau congelare.
Pstrarea probelor de ap n laborator se face n condiii de refrigerare sau
congelare i ferite de lumin. (83)
Frecvena controlului pentru examenul microbiologic este semestrial din reeaua
public i trimestrial din sursa proprie conform prevederilor Legii nr. 458/2002, cu
modificrile i completrile ulterioare. Sursele ce asigura apa potabila in mediul rural,
respectiv fntani, puuri de mic adncime i captri de ap, exploatate n sistem local, vor
fi controlate, la un interval de 1-3 luni, prin prelevare de probe de ap i analize de
laborator. (63)
Conform Programului de Strategie Naional, supravegherea prin examene de
laborator n timpul produciei a apei potabile care intr n compoziia materiilor prime i
produselor de origine animal se realizeaz dup cum urmeaz:
Interpretare rezultate
Examen microbiologic
64
Apa din reea public Legea nr. 458/2002 privind calitatea
apei potabile, cu modificrile i
E. coli completrile ulterioare
Enterococi
Apa din surs proprie Legea nr. 458/2002 privind calitatea

apei potabile, cu modificrile i
E coli completrile ulterioare
Enterococi
Cl. Perfringes -
(inclusiv pentru spori)
Probele de ap recoltate din surse clorinate se vor neutraliza cu soluie 2 % de

tiosulfat de sodiu nainte de a fi examinate microbiologic.
Pentru diagnostic se pot utiliza metode de referin dar i alte metode cu condi ia
s se poat demonstra c rezultatele obinute sunt cel pu in la fel de fiabile ca i cele
obinute prin metodele indicate. n acest caz rile membre au abligaia de a transmite
Comisiei toate informaiile privind aceste metode i caracterul echivalent al acestora. Se
pot efectua i controale suplimentare pentru substan ele i microorganismele pentru care
nu s-au stabilit parametri valorici, dac existe motive care s indice prezen a acestor
substane sau microorganisme ntr-o cantitate sau un numr care s reprezinte un
potenial pericol pentru sntatea uman. Laboratoarele n care se analizeaz probele
trebuie s dispun de un sistem analitic de control al calit ii, i s fac obiectul unor
verificri periodice realizate de ctre o persoan care nu se afl n subordinea acestuia i
care este aprobat n acest scop de autoritatea competent.
Laboratoarele n care se efectueaz analiza probelor de ap pentru monitorizare
trebuie s aib asigurat controlul calitii analitice i s fie supuse periodic unui control
efectuat de un laborator aprobat de Ministerul Sntii pentru acest domeniu.
Materiale necesare
- Membrane filtrante sterile din celuloz ester cu diametrul cuprins ntre 47-50
mm, avnd pori cu diametrul de 0,45 m , prevzute cu grile;
- plnii cu capacitatea de 250 ml, din polipropilen autoclavabil, hidrofob
(pentru a nu reine lichid pe pereii plniei) cu gradaii din 50 n 50 ml;
3 3
- baloane Erlenmeyer de diferite volume, sterile (100 cm , 200 cm );
- vas de sticl pentru colectarea materialelor de unic folosin utilizate;
- vas de sticl pentru colectarea sticlriei reutilizabile (pipete,pense, plnii, etc.) cu
soluie decontaminant;
- pipete gradate sterile, cu capaciti diferite (1ml, 2ml, 5ml), cu gradaii de 0,1 ml;
- cutii Petri sterile, cu diametre diferite (100 mm, 140mm);
- anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-
65
crom i/sau ace de nsmnare i baghete sterile de sticl sau plastic;
- hrtie de filtru;
- eprubete sterile de dimensiuni diferite ( 16/160 mm, 18/180 mm);
- stative pentru eprubete;
- pensete sterile din oel inox cu capete rotunjite, vrf neted, fr striaii pentru a
evita deprecierea membranei;
- cilindri gradai sterili, cu capaciti diferite (25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml.);
- sticle sterile n care s se preleveze probele de ap (dac este cazul).
Echipamente de ncercare i mijloace de msurare
Echipament Sartorius sistem de filtrare prin membran, compus din 3 posturi de
filtrare cu filtre metalice i plnii de capacitate 100 ml utilizat pentru filtrarea apei prin
membrane, prevzut cu urmtoarele dotri: -nr. inventar 3009050;
buton de nchis/deschis(valv);
tuburi siliconice i cuple rapide, pentru a fi uor de igienizat;
plnii cu capacitatea de 250 ml, din polipropilen autoclavabil;
hidrofob ( pentru a nu reine lichid pe perei) cu gradaii din 50 n 50 ml.
pompa de vacuum Sartorius STEDIM BIOTECH, nr. inventar 3008984,
seria 03817761, utilizat n procesul analitic;
tub siliconic pentru partea de vacuum;
recipient de colectare filtrat, capacitate 4 litri, rezistent la ocuri.
0
- Etuv Stabilitherm 55 EU 1, la 44 C, utilizat pentru incubarea mediilor
nsmnate;
0
- Termostat Incucell 111, la 37 C , utilizat pentru incubarea mediilor nsmnate;
0
- Etuv Binder BD 53 la 30 C, utilizat pentru incubarea mediilor nsmnate;
- Ni microbiologic Biohazard BSC-EN 1-4, clasa II, cu sterilizare UV, utilizat
pentru protecia spaiului n care se efectueaz operaiunile de nsmnare
descrise n prezenta procedur i a executantului;
- Lampa bacteriologic UV - utilizata pentru sterilizarea suprafeelor de lucru;
- pH metru METTLER TOLEDO MP 225, utilizat pentru deteminarea pH-ului
mediilor;
- Etuv termoreglabil Binder FD 115, la 180C, utilizat pentru sterilizarea prin
cldur uscat a sticlriei.
66
Mod de lucru, execuia propriu-

zis 1. Pregtirea probei de
analizat
Probele de ap potabil supuse examinrii trebuiesc prelevate n recipiente sterile,
n cantitate de minim 500 ml.
Se asigur temperatura ambiental de 20-22C ( n anotimpul cald prin pornirea

climei).
nainte de examinare proba se amestec prin agitare puternic astfel nct s
determine o distribuie uniform a microorganismelor. n funcie de gradul de contaminare
estimat, se recomand efectuarea diluiilor n cazul folosirii membranelor filtrante.
2. Pregtirea echipamentului de lucru:
- Se pornete hota biologic, activndu-se butoanele care indic lampa, becul de
gaz i priza;
- se conecteaz becul de gaz la priz;
- se conecteaz sistemul de filtrare prin membrane la priz;
- se flambeaz unul, dou sau toate cele 3 posturi de filtrare;
- se desigileaz membrana filtrant i cu ajutorul unei pensete sterile se plaseaz pe
postul de filtrare;
- plniile se monteaz pe capul de filtrare prin simpla apsare,nedeteriorndu-se
membrana sau plnia.
Desigilarea membranei filtrante
67
Echipamentul Sartorius Depunerea membranei filtrante pe unul din posturile de filtrare
Volumul de prob care urmeaz a fi filtrat depinde de filtrabilitatea probei de ap i

de membranele folosite. Prin membranele avnd o porozitate de 0,45 m poate fi posibil
filtrarea a ctorva litri de ap printr-o singur membran, obinndu-se astfel un nalt nivel
de sensibilitate. Volumul de testat din prob ( 100 ml, 10 ml cte o membran pentru
fiecare volum ) sau diluii ( cte dou membrane pentru fiecare diluie) trebuie s fie ales
lund n calcul numrul coloniilor tipice formate pe membrana care se ateapt s fie
cuprinse ntre 10 i 100 sau mai mici de 200. Pentru volume diferite ale aceleiai probe,
plnia poate fi refolosit fr dezinfectare prealabil, cu condiia ca volumele mici / diluiile
mari s fie filtrate primele.
Turnarea probei de ap care urmeaz a fi analizat Colectarea probei de ap dup operaiunea de

filtrare
Dup conectarea aparatului Sartorius la sursa de vacuum, se aeaz membranele

filtrante pe suport avnd grij s se respecte condiiile sterile de manipulare.
Se filtreaz un volum cunoscut de prob sau diluii (cel puin 10 ml). Este
recomandabil s se clteasc plnia cu 10-30 ml de diluent steril, iar pentru probe diferite
se recomand sterilizarea plniei prin flambare. Se transfer membrana cu o pens steril
pe suprafaa mediului corespunztor.
68
Transferarea membranei filtrante pe mediul de cultur
mpachetarea plcilor ntr-o pung steril
Termostat cu atmosfer aerob reglat la temperatura de 37C
69
Introducerea plcilor n termostat
Caracteristici culturale:
Bacterii coliforme Partea din spate a plcii
Enterococi intestinali
Bacterii din genul Pseudomonas NTG
70
CURS NR. 10
Identificarea speciilor de mamifere domestice

din produse i subproduse alimentare
Identificarea originii constituenilor unui anumit produs alimentar reprezint o

necesitate real, n condiiile actuale n special n domeniul controlului sanitar veterinar al
produselor alimentare de origine animal. Exist o diversitate de situaii n care aceste
tehnici i gsesc utilitatea i anume:
verificarea primar a materiilor prime supuse prelucrrii;
substituirea unei specii de animale cu o alta care nu se regsete n lista de
ingrediente,
lipsa crnii dintr-o anumit specie, eventual substituit prin utilizarea aromelor
artificiale pentru pstrarea caracteristicilor organoleptice ale produsului original,
introducerea cu sau fr intenie a unui anumit tip de specie de animal din cauza
msurilor neadecvate de salubritate (ex. oarece, obolan);
utilizarea de produse care provin de la alte specii de animale care nu sunt
considerate a fi utilizate n consumul uman, etc.
Identificarea speciilor la nivel de produse i subproduse alimentare de origine
animal, s-a dovedit a fi foarte important i adesea extrem de greu de realizat.
Acurateea identificrii speciilor a beneficiat de o evoluie spectaculoas, ncepnd de la
tehnici care sunt mai mult sau mai puin subiective n ceea ce privete specificitatea i
sensibilitatea, cum ar fi: diferenele de ordin anatomic, examenul histologic (ex. firul de
pr), proprietile particulare ale esutului adipos, cantitatea i calitatea glicogenului
muscular, i mai recent tehnicile de biologie molecular.
Dintre acestea cel mai frecvent utilizate se refer la analiza proteinelor / proteomic
(prin electroforez, cromatografie, teste imunologice) sau informaia genetic specific
(hibridizare ADN, PCR, PCR RFLP, secveniere, etc.). Alegerea protocolului este
influenat de numeroi factori, cei mai importani fiind capacitatea tehnic, resursele
umane (legate de gradul de instruire n domeniu), materialul biologic supus investigaiilor
i probabil cel mai important, complexitatea tehnicii.
Astfel n ceea ce privete speciile de animale domestice cel mai frecvent utilizate n
industria alimentar, analizele bazate pe tehnica PCR cu identificarea informaiei genetice
specifice, reprezint pentru majoritatea covritoare a cazurilor metoda de elecie, fiind
relativ uor de implementat, specific, sensibil, capabil de detecie simultan a unui
numr variabil de specii.
Tehnica de diagnostic presupune realizarea unei prelucrri primare prin
omogenizare (MagNa Lyzer) cu obinerea unei suspensii de 10% care se supune
centrifugrii i recoltrii de supernatant, extracia ADN, amplificarea ADN (reacia PCR) i
electroforeza produilor de amplificare.
Rezultatele obinute n identificarea / discriminarea speciilor domestice prin
71
tehnica PCR se dovedesc a fi valoroase ca parte integrant a unui protocol mai complex
desemnat pentru acest scop; performanele legate de obinere a rezultatelor, specificitate,
sensibilitate, uurina de implementare (n comparaie cu alte metode din domeniu),
evaluate pn n prezent, recomand acest test ca metod de elecie n identificarea
speciilor de animale din produse i subproduse alimentare. (55)
Determinarea speciei de animal prin reacii imunologice din produsele
alimentare (reacia de seroprecitare n gel de agar)
Scop
Procedura stabilete specia de animal de la care provin diferite esuturi n caz de
suspiciuni, de substituiri sau braconaj.
Domeniu de aplicare
Carne proaspt, refrigerat, congelat;
Carne tocat i semipreparate din carne tocat (hamburger, past de mititei,
crnai proaspei etc.);
Preparate din carne srate i/sau afumate;
Mezeluri (prospturi, salamuri semiafumate);
Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci,
fr alt prelucrare ( biftec);
Produse crude (niel pane)
Definiii
Determinarea de specie se bazeaz pe reacia de seroprecipitare n gel de agar
(reacia de seroprecipitare antigen-anticorp).
Principiul metodei
Se bazeaz pe reacia antigen-anticorp:
antigen - este reprezentat de serul antispecie produs de un institut
specializat;
anticorp - care este reprezentat prin extractul din esutul de analizat.
Soluii de diluare i medii de cultur
Soluii de diluare de utilizare general - Ser fiziologic (0,85% NaCl)
Soluii de utilizare special:
Ser fiziologic tampon cu pH =7,2;
Soluie tampon fosfat;
Seruri antispecie
Medii de cultur - Agar 1%

Echipamente utilizate

sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180C timp
de 30-60 minute;
Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru:
medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de

121 C timp de 20-30 minute;
Lamp UV - radiaii UV cu efect bactericid pentru sterilizarea
72
aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru;
Balan analitic- balan electronic cu reglare automat funcie de

Stomacher 400-Circulator, MF 7971 omogenizare eantion;
-

Baie de ap termoreglabil - la temperatur de 50 55 C;


Pipete gradate sterile de 1 ml 0,02 ml sau de 10 ml 0,2 ml;

Lup cu putere de mrire de 3x;

pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25
C;

Eprubete de 20 ml i flacoane cu capacitatea de 250 ml pentru sterilizarea i
pstrarea mediilor de cultur;


Pipete Pasteur;


Plnii de sticl;

Eprubete cu lumen mic (6 x 50 mm);

Preducea sau dispozitiv special pentru sparea godeurilor n gel de agar;

Hrtie de filtru;

Colorimetru.
Aciuni i/sau msuri preventive
Protecia personalului: obligatorie purtarea halatului; folosirea lampei de UV
(nainte i dup nsmnare); folosirea hotei de nsmnare; pipetele sunt prevzute cu
dop de vat nehidrofil pentru a preveni aspirarea accidental a eantionului; flambarea
ansei se face nti la baza flcrii i apoi la vrf pentru a mpiedica rspndirea
germenilor; dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante.
Protecia mijloacelor de ncercare i/sau msurare: sticlria steril se pstreaz n
dulapuri speciale; sticlria steril se folosete maxim 6 zile; executarea periodic a
serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii; verificarea i nregistrarea
temperaturii din ncperea de lucru; eantionare
Reguli de procedur
Condiii i aciuni prealabile
Eantioanele sunt etichetate, cuprinznd; produsul recoltat; examenul cerut; locul
prelevrii, ziua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a
prelevat.
Pregtirea materialului: splarea i sterilizarea sticlriei
Splarea sticlriei cu ap cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de
ap, dup care splarea cu ap distilat;
Punerea de dopuri de vat cu tifon, nvelirea cu hrtie a gtului eprubetelor
sau baloanelor;

Introducerea n etuv pentru 30 de minute la 121 C.
Repartizarea, sterilizarea i pstrarea soluiilor de diluare
Se repartizeaz soluiile de diluare n flacoane sau sticle care trebuie nchise cu
73

dopuri. Sterilizarea trebuie fcut n autoclav la 121 1 C timp de 15 minute. Dac soluiile

de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 0-5 C maxim o
lun pentru evitarea oricrei modificri a volumului sau compoziiei lor.
Omogenizare prin mojarare
Inoculare
Se las la temperatura camerei timp de 2 h. Pentru eantioanele din produsele
tratate termic extracia se face la frigider timp de 3 zile. Se filtreaz prin hrtie de filtru n
eprubete. Filtratul trebuie s fie clar-transparent sau cu nuan roz-roie. Dac filtratul nu
este clar se refiltreaz i se introduce n testare nainte de a se tulbura. Extractul de la
eantioanele provenite de la produsele tratate termic se testeaz la 18; 48 i 72 h.(dac
nu apare nici o recie nici la extractul de 3 zile, proba este improprie pentru aceast
reacie).
Pregtirea plcilor cu agar
Se topete agarul preparat, se repartizeaz cte 20 ml n plci Petri cu diametrul
de 10 cm i cu fundul perfect plan. Se las s se solidifice agarul i se refrigereaz cel
puin 30 min. Se taie godeurile n agar cu ajutorul unei preducele, avnd un godeu n
o
centru i 6 periferice n jurul acestuia aezate n unghi de 60 .
Umplerea godeurilor
Godeul central - se umple cu antiser antispecie (antigen);
Godeurile periferice se umplu cu extractul de cercetat ncadrat de 2
antigeni cunoscui.
Incubare i citire
Plcile pregtite se acoper i se las la temperatura camerei 2 h dup care
godeurile se reumplu cu antiserurile i antigenele respective. Se aaz pe suprafee
perfect orizontale n cutii bine nchise cu atmosfer umed, realizat prin introducerea n
ele a unor tampoane de vat sau hrtie de filtru mbibate n ap, se las la temperatura
camerei 18-24 h dup care se citete reacia.
Dac nu au aprut linii de precipitare, godeurile se reumplu cu reageni i se
continu incubarea nc 24-48 h la temperatura camerei sau la frigider. Dup incubaie se
arunc reactani rmai n godeuri i se spal uor suprafaa agarului cu un curent de ap
distilat.
Interpretarea
Rezultatele depind de liniile formate ntre antiserul cunoscut pe de o parte i
extractul necunoscut.
n cazurile cnd ntre anticorpi din antiser (din godeul central) i antigenii din
extract (din godeurile periferice) nu exist nici o nrudire, nu apar linii de precipitare. n
cazul c asemenea linii apar, nseamn c exist nrudire sau chiar identitate.
74
Foto nr. Apariia liniilor de seroprecipitare (partea dreapt)
Exprimarea rezultatelor
n cazul apariiei liniilor de precipitare dintre antiserul cunoscut i extractul
necunoscut se apreciaz c esutul provine de la specia unde a aprut reacia de
seroprecipitare.
Repetabilitate
n situaia n care apar dubii sau linii de seroprecipitare firave, operaiunrea se reia
de la capt.
75
CURS NR. 11
Comportarea fa de antibiotice a unor

microorganisme care pot fi izolate din
alimente
Produciile animaliere intensive au condus la o cretere semnificativ a utilizrii

agenilor microbieni n medicina veterinar, att n scopuri terapeutice i profilactice, ct i
pentru stimularea creterii. Orice utilizare a acestor ageni antimicrobieni este o problem
de sntate public, folosirea nejudicias a antibioticelor fiind considerat fora motrice n
apariia rezistenei bacteriene.
Fenomenul de rezisten a bacteriilor la agenii antimicrobieni, poate deveni o
problem major, drept consecin a utilizrii intensive i greite a acestora.
Repercursiunile asupra sntii omului sunt reprezentate de apariia patogenilor
multirezisteni ce pot fi izolai din alimentele de origine animal i a microorganismelor
rezistente care infecteaz animalele i produc zoonoze. Exist studii care atrag atenia
asupra procentelor crescute de rezisten la ciprofloxacin a tulpinilor de E. coli i care pot
fi asociate cu utilizarea fluoroquinolonelor la puii de gin. Ultimile cercetri din Europa au
evideniat enterococi vancomicino rezisteni cu determinant vanA i care se datoreaz
utilizrii avoparcinului (antibiotic glicopeptidic) utilizat ca promotor de cretere la animalele
de ferm.
Comportarea fa de antibiotice a diferitelor microorganisme se realizeaz dup
identificarea tulpinilor bacteriene pure. Sensibilitatea la antimicrobiene pentru acestea,
este evaluat n conformitate cu prevederile standardului CLSI, M100 S18, 2008. n
funcie de diametrul zonei de inhibiie, tulpinile bacteriene se consider a fi sensibile,
intermediare sau rezistente la un anumit antibiotic.
Datele studiilor efectuate n aceast direcie subliniaz potenialul unor bacterii (ex.
E. coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, E. faecalis ) de a afecta populaia
uman prin intermediul lanului alimentar ca urmare a consumului de alimente de origine
animal care coni reziduuri de antibiotice.
Rezistena manifestat de diferitele microorganisme care pot contamina alimentele
este n general ntlnit la antibioticele frecvent utilizate n antibioterapie. Astfel,
Staphylococcus aureus i Escherichia coli, pot exprima rezisten la lactamice
(amoxicilin, acid clavulanic, ampicilin, penicilin), fluroquinolone (ciprofloxacin,
aminoglicozide i cloramfenicol). Studiile efectuate pentru testarea sensibilitii la
antimicrobiene a Staphylococcus aureus din carne au artat c tulpinile izolate au
prezentat procente crescute de rezisten la penicilin, ampicilin i amoxicilin acid
clavulanic, dar au fost sensibile la cefaloxin i oxacilin, fapt ce poate indica prezena
lactamazelor.
Prezena tulpinilor bacteriene izolate din produse alimentare de origine animal,
rezistente la anumite antibiotice, reprezint un factor extrem de grav pentru sntatea
public. (17)
76
Determinarea sensibilitii fa de antibiotice (antibiograma)
Principiul se bazeaz pe inhibarea dezvoltrii unei culturi microbiene puse n
contact cu doze variate de antibiotice pe medii de cultur adecvate. Ea se poate realiza
prin mai multe metode i anume: metoda difuzimetric (cel mai des folosit), utilizarea de
metode alternative (Aparatul Vitek) i metode folosind diluii seriate.
Metodele difuzimetrice se bazeaz pe nsuirea soluiilor de antibiotice de a difuza
n mediul de cultur pe diferite distane de la punctul n care sunt puse.
Ca medii de cultur se folosesc agarul nutritiv sau medii speciale cum ar fi mediul
Muelle - Hinton. Ca tehnici de lucru, tehnica microcomprimatelor este cel mai des utilizat.
De-a lungul timpului s-au folosit diferite alte tehnici cum ar fi: tehnica rondelelor de hrtie
de filtru mbibate cu diferite antibiotice; tehnica benzilor de hrtie de filtru; tehnica cilindrilor
sau tuburilor de sticl cu agar; tehnica agarului cu godeuri; tehnica jgeaburilor de agar i
tehnica difuziunii verticale.
Materiale utilizate
Mediul de cultur Mueller Hinton permite dezvoltarea majoritii bacteriilor
patogene, neavnd efecte antagonice fa de antibiotice i este izoton cu sngele care i
se poate aduga pentru cultivarea speciilor pretenioase din punct de vedere nutritiv (ex.
streptococi). pH-ul trebuie s fie de 7,30,1.
Biodiscuri formate dintr-o rondea de hrtie absorbant, impregnat cu soluie de
antibiotic, cu o anumit concentraie. Ele au nscrise simboluri corespunztoare
antibioticului pe care l conin i sunt meninute n flacoane, incluse n truse de
antibiogram.
Tehnica de lucru
Mediul de cultur Mueller Hinton, se toarn n plci Petri, respectnd o nlime
uniform de 4 mm, dup care se zvnt prin inerea acestuia la termostat cu capacul
semideschis timp de 20 30 minute, pn la solidificarea complet. Dac mediul a fost
turnat n plci Petri la o dat anterioar, acestea trebuie scoase din frigider cu minim 30 de
minute nainte. Se elimin de la nsmnare mediile care nu au fost turnate drept sau nu
au nlimea corespunztoare i se noteaz pe capacul fiecreia (cu un marker), numrul
de nregistrare al probei. Microcomprimatele cu antibiotice se scot de la frigider cu
aproximativ 30 de minute nainte de a fi depuse pe mediul nsmnat.
n momentul nceperii lucrului se aprinde becul Bunsen , reglndu-se flacra, astfel
nct arderea s fie complet.
Se face nsmnarea culturii microbiene de cercetat. n acest scop din culturi de
-3
18 24 de ore n bulion, se realizeaz mai nti o diluie de 10 n ser fiziologic steril.
Diluarea se realizeaz pentru a obine colonii dese dar nu confluente.
Pentru nsmnare se poate proceda n dou moduri:
prin inundarea mediului - din suspensia microbian rezultat se ia cu o
pipet Pasteur o cantitate de 1 1,2 ml care n apropierea flcrii se
depune pe suprafaa mediului. Prin nclinri repetate se disperseaz apoi
suspensia pe toat suprafaa, dup care excesul de cultur se scoate cu
ajutorul aceleai pipete i se arunc n vasul cu dezinfectant.
prin utilizarea unui tampon steril n culturile pregtite, se imerseaz un
77
tampon steril, dup care se disperseaz inoculul pe mediu,
printr-o micare strns sub form de zig zag, de la o extremitate la
cealalt a plcii, pn cnd ntreaga suprafa a fost parcurs. Placa trebuie
s fie rotit, de fiecare dat, relundu-se micarea anterioar pe o alt
direcie, astfel nct s nu rmn nici o zon nensmnat. (Idomir)
Mediul nsmnat se pune din nou la termostat cu capacul plcii semideschis,
pentru zvntare timp de 20 30 minute, dup care cu ajutorul unei pensete flambate n
prealabil se repartizeaz microcomprimatele, avndu-se grij ca acestea s fie la
aproximativ 15 mm de periferia mediului, la aproximativ 30 mm unul de altul iar simbolul
imprimat pe microcomprimate care indic antibioticul s fie deasupra.
Numrul recomandat de biodiscuri care se pot aplica pe plac este de 7 8.
Pentru plasare se poate utiliza i un dispenser, sistem care permite aplicarea simultan a
tuturor discurilor. Plcile se acoper cu capacul, dup care se las pe masa de lucru 15-
20 minute pentru predifuziune n aa fel nct antibioticul s difuzeze n mediu. Plcile se
introduc apoi la termostat pentru o perioad de 18 24 ore, dup care se interpreteaz
rezultatele.
Citirea const n aprecierea mrimii zonelor de inhibiie indus de antibiotic, zone
n care coloniile microbiene lipsesc. Diametrul acestora este direct proporional cu
sensibilitatea germenului respectiv, n sensul c cu ct antibioticul este mai activ zona de
inhibiie este mai extins. n general diametrul zonei de inhibiie este mai mare de 6 mm
pentru microorganismele sensibile, 2 -5 mm pentru microorganismele moderat sensibile,
2 mm sau chiar absent pentru microorganismele rezistente.
Cu ajutorul tabelului de interpretare al antibiogramei, pe baza valorilor obinute,
este determinat gradul de sensibilitate al tulpinii bacteriene izolate i identificate la
aciunea fiecruia dintre antibioticele testate. Fiecare substan antimicrobian testat
este menionat n buletinul de analiz, precizndu-se dac bacteria este sensibil,
moderat sensibil sau rezistent la acesta. (Foto nr....)
Foto nr. Modul n care trebuie depuse biodiscurile Foto nr. Zone de inhibiie de mrimi diferite
Pentru controlul de calitate se pot utiliza tulpini de referin tulpini standard ATCC
(American Type Culture Collection) a cror sensibilitate la antibiotice este cunoscut, care
sunt testate n aceleai condiii tehnice ca i bacteriile izolate din diferitele produse
alimentare. (Idomir)
78
CURS NR. 12
EXAMENUL PARAZITOLOGIC AL CRNII
Carnea proaspt provenit de la porci i mistrei se admite pentru consum uman

numai dup efectuarea examenului pentru decelarea Trichinella spp.
Efectuarea examenului pentru decelarea Trichinella spp. poate fi realizat i de
personalul auxiliar oficial sau de personalul din unitile de tiere autorizate sanitar-
veterinar, care i desfoar activitatea sub supravegherea i responsabilitatea medicului
veterinar oficial sau a medicului veterinar de liber practic mputernicit, decizia final
privind admiterea n consum a crnii fiind luat de ctre medicul veterinar oficial.
n conformitate cu prevederile art. 5 din Regulamentul (CE) nr. 2075/2005 al
Comisiei din 5 decembrie 2005 de stabilire a normelor specifice aplicabile controalelor
oficiale privind prezena de Trichinella n carne, cu amendamentele ulterioare, tot
personalul implicat n examinarea probelor pentru decelarea Trichinella spp. trebuie s fie
instruit corespunztor i s participe la:
un program de control al testelor utilizate pentru decelarea Trichinella spp;
evaluare periodic a procedurilor de testare, nregistrare i analiz utilizate n
laborator.
Examenul pentru decelarea Trichinella spp. se efectueaz n cadrul institutelor
naionale de referin, la LSVSA din cadrul DSVSA, n circumscripiile sanitar - veterinare
i pentru sigurana alimentelor, n laboratoarele din circumscripiile sanitar - veterinare de
asisten, n laboratoarele special amenajate i dotate pentru decelarea trichinei din
abatoarele n care se sacrific porcine i/ sau cabaline, ori n laboratoarele din unitile
care manipuleaz carne de vnat slbatic.
Recoltarea probelor pentru decelarea Trichinella spp. se face conform prevederilor
Regulamentului (CE) nr. 2075/2005, cu amendamentele ulterioare.
Examenul pentru depistarea trichinelei se efectueaz printr-una din urmtoarele
metode, dup cum urmeaz:
metoda digestiei:

metoda digestiei eantioanelor combinate/ colective, utiliznd un agitator
magnetic metoda de referin;

metoda digestiei eantioanelor combinate/ colective cu asisten mecanic prin
tehnica sedimentrii - metoda echivalent i prin tehnica de izolare prin filtrare-
metoda echivalent;

metoda de digestie automat pentru eantioane combinate/ colective pn la
35g metoda echivalent.
examen trichineloscopic direct prin compresie pe lam n condiiile prevzute
de Regulamentul (CE) nr. 2075/2005, cu amendamentele ulterioare.
Marcarea crnii care a fost supus examenului pentru decelarea Trichinella spp. se
efectueaz conform prevederilor legale.
79
Examenul trichineloscopic i pentru sarcosporidioz la porci i mistrei
Procedura stabilete prezena sau absena chisturilor sau formelor libere ale
parazitului Trichinella spiralis i Sarcocystis suicanis(S.miescheriana) precum i
Sarcocystis suihominis n musculatura striat de mistre supus examinrii, n vederea
diagnosticrii Trichinelozei i Sarcosporidiozei.
Reguli de procedur pentru examenul trichineloscopic i al sarcosporidozei al
crnurilor de porcine, condiii i aciuni prealabile:
Modul de analiz, acceptare i nregistrare a comenzilor este conform Manualului
de Calitate. Probele sunt etichetate i identificate cu numr de ordine i sunt nsoite de
note care corespund datelor de individualizare ale animalelor.
Nota de nsoire va fi verificat i va trebui s cuprind urmtoarele puncte principale
:
nr. probelor de carne recoltate ;
specia de la care provine carnea recoltat, conform procedurii de prelevare;
data prelevrii probelor ;
locul (fondul de vntoare sau unitatea de abatorizare vnat) de unde s-a fcut
prelevarea;
situaia epidemiologic a efectivului ;
examenele solicitate ;
persoana (Medicul veterinar) care a efectuat prelevarea;
semntura i parafa medicului veterinar.
Pregtirea probelor pentru analiz:

Probele se pregtesc conform metodei omologate pentru care se solicit examenul.
Dup recepie, probele de carne se examineaz ct mai urgent.
Probele de carne trebuie s fie recoltate corespunztor din zonele de elecie ale
parazitului Trichinella spiralis i Sarcocystis suicanis(S.miescheriana) precum i
Sarcocystis suihominis (pilierii diafragmatici) cca. 20 40 g/carcas ntreag sau 10 20
g/semicarcas.
Principiul metodei:
Metoda se bazeaz pe evidenierea paraziilor Trichinella spiralis i Sarcocystis
suicanis(S.miescheriana) precum i Sarcocystis suihominis ntr-un fragment de
musculatur striat, cu ajutorul trichineloscopului.
Echipament de ncercare i mijloace de msurare utilizate:
aparatur, sticlrie i instrumentar ;
frigider cu congelator;
sticlrie: compresor pentru examenul trichineloscopic ;
instrumentar: cuit sau bisturiu, pens, foarfec, cutie metalic sau din material
plastic, creion de scris pe metal sau sticl ;
80
aparatur: trichineloscop cu ecran Steak.
Reactivi:
clarificator: acid clorhidric 0,05 N, acid acetic de 9, sau soluie de hidroxid de
potasiu 3% ;
ap cald ;
cloramin soluie 20%.
Recoltarea probelor:
Din carcasa ntreag de mistre se recolteaz cel puin o prob de mrimea unei
nuci din fiecare pilier diafragmatic din apropierea prii tendinoase. Dac nu exist dect
un pilier diafragmatic, se recolteaz din acesta o prob de mrimea a 2 nuci.
n absena pilierilor diafragmatici, se recolteaz 2 probe, de mrimea unei nuci, din
partea muscular a diafragmei situat n apropierea coastelor sau a sternului, din
musculatura limbii, din muchii maseteri i din muchii abdominali.
Pentru piesele din carne: din fiecare pies se recolteaz, din locuri diferite, din
apropierea oaselor sau a tendoanelor, 3 probe de muchi scheletici fr grsime i, pe ct
posibil, de dimensiunea unei nuci.
Din preparatele crude se recolteaz, din 3 puncte diferite, cte o prob de
dimensiunea unei nuci.
Procedur:
Durata examinrii la carnea de porc i mistre este de aproximativ 20 minute.
Compresorul este alctuit din dou plci de sticl, perfect transparente, cu lungimea de 23
cm, limea de 5 cm i grosimea de 0,6 cm. Placa inferioar este mprit n 28 de
cmpuri aezate pe dou rnduri numerotate de la 1 14 i de la 15 28. Dimensiunile
unui cmp sunt de 2,5 cm cu 1,5 cm. Att placa superioar ct i cea inferioar sunt
prevzute cu cte dou orificii, prin care trec dou uruburi cu piulie, piese metalice care
servesc la compresarea propriu-zis. ntre piuliele de strngere i masa de sticl, se
aeaz garnituri mici de cauciuc sau plastic cu rol protector.
81
Etalatorul, desface compresorul aezndu-i n prim-plan placa inferioar, n plan
secund placa superioar, garniturile i piuliele i noteaz pe poriunea rodat numerele
probelor. Cu forfecua, din cei doi pilieri, etalatorul face cte 14 seciuni din locuri diferite i
pe ct posibil din apropierea inseriei tendinoase.
Seciunile trebuie s fie ct mai subiri, de mrimea unui bob de ovz i ntotdeauna
din lungul fibrelor musculare. Ele sunt depuse n mijlocul cmpurilor.
Se umple un compresor cu 1,0 0,1 g de carne, corespunznd n mod normal la 28
fragmente de mrimea unui bob de ovz. Dup aezarea seciunilor pe rnduri, se aeaz
placa superioar a compresorului, se apas uniform cu podurile palmelor iar cu degetele
se imprim plcii superioare o mic alunecare, n aa fel nct seciunile s fie bine
strivite. Se aeaz apoi garniturile i se nurubeaz piuliele. n jurul cmpului de carne,
dup compresare apare o zon cu lichid de mrime variabil cu prospeimea i constituia
crnii.
Cnd probele sunt vechi sau au culoare nchis, pe fiecare seciune se pune cte o
pictur din cele trei substane de clarificare. Examinarea fiecrui cmp de pe compresor
se face la trichineloscopul cu ecran, cu mult atenie, examinndu-se att proba de carne
ct i sucul din jurul probei.
Confirmarea diagnosticului se face n funcie de prezena sau absena parazitului
Trichinella spiralis sub form nchistat sau larv liber i a parazitului Sarcocystis
suicanis(S.miescheriana) precum i Sarcocystis suihominis.
Examinarea trichineloscopic a crnurilor de vnat (urs, mistre) se execut astfel:
dup identificarea prin numerotare a carcasei, se recolteaz, de la fiecare dintre
muchii diafragmei, muchii intercostali sau abdominali, cte 2 probe, n total 4
probe a cte 20 grame pentru fiecare carcas (Figura 2.4);
din fiecare prob se execut cte un compresor a 28 seciuni, n total 4
compresoare pentru fiecare carcas;
seciunile se clarific, de preferin, cu acid acetic 10% sau oet alimentar de 9
grade la mistre, si cu hidroxid de sodiu 3%, la urs. Cnd chisturile sunt calcificate,
la ambele specii, clarificarea se face cu acid acetic 10%.
Norma de lucru pentru examenul trichineloscopic al vnatului este: un mistre sau un
urs este echivalent cu 8 carcase.
Evaluarea i interpretarea rezultatului:

Metoda este calitativ, exprimarea rezultatelor fcndu-se prin termenul de negativ
cnd pe compresor nu apar chisturi sau larve de Trichinella spiralis i Sarcocystis suicanis
(S.miescheriana) precum i Sarcocystis suihominis i pozitiv cnd una sau ambele forme
parazitare sunt prezente.
Exprimarea rezultatelor:
Valoarea normal este considerat situaia cnd pe compresor nu apar cmpuri cu
larve i/ sau chisturi de Trichinella spiralis i Sarcocystis suicanis (S.miescheriana) precum
i Sarcocystis suihominis. Prezena acestora ndreptete diagnosticul de trichineloz i
sarcosporidioz.
n caz pozitiv, intensitatea infeciei este apreciat dup numrul cmpurilor n
82
care s-au depistat paraziii. Dac n mai puin de 5 seciuni de pe compresor s-au gsit
larve de Trichinella spiralis, libere sau nchistate, se consider infestaie slab.
Factorii care influeneaz fidelitatea metodei sunt urmtorii :

probele recoltate s fie corespunztoare, deci din zonele de elecie ale parazitului
Trichinella spiralis (pilerii diafragmatici);
probele recoltate s fie ct mai proaspete;
trichineloscopul cu ecran trebuie s fie ntreinut i curat zilnic.
83
CURS NR. 13
METODE ALTERNATIVE RAPIDE DE DIAGNOSTIC
Metodele de referin utilizate n diagnosticul microbiologic, prezint unele

dezavantaje: sunt laborioase; necesit un timp mai ndelungat de lucru (3 6 zile
ntrziind astfel livrarea produsului finit i oferind un rspuns ntrziat al datelor obinute n
programul de monitorizare al igienei); o cantitate mai mare de materiale consumabile i
furnizori numeroi; rezultatele pot fi subiective (multe rezultate fals negative si fals
pozitive), ele depinznd de experiena i competena persoanelor implicate n procesul
analitic i incertitudine de masurare mare.
Ele rmn ns foarte importante, fiind cele la care raportm rezultatele altor
metode de diagnostic utilizate n microbiologie
2 3
1 Prepararea probelor Dilutii
Prepararea mediilor decimale
8 4
6 Inoculare
7
5
Rezultate
Numarare Turnare
Incubare
Din aceast cauz necesitile unui diagnostic mai rapid, generate de perioada
scurt de valabilitate a produselor alimentare au dus la implementarea de metode
alternative de diagnostic, prevzute n reglementrile europene ca metodologii posibile de
diagnostic (Regulamentul CE 2073/2005). Ele se recomand a fi utilizate n special pentru
realizarea programului de autocontrol al unitilor, innd cont de timpul redus n care pot fi
generate buletinele de analiz.
Examenele microbiologice prin utilizarea metodelor alternative permit:
Enumerarea indicatorilor de calitate utiliznd echipamentul TEMPO;
Detecia patogenilor alimentari utiliznd echipamentul VIDAS;
Identificare bateriana utiliznd VITEK 2 COMPACT.
n toate cazurile, interpretarea se face n conformitate cu prevederile
Regulamentului 2073/2005 care stabilete criteriile de siguran microbiologic care
definesc caracterul acceptabil al proceselor, precum i a unor criterii de siguran
microbiologic a produselor alimentare care s stabileasc o limit peste care un
84
produs alimentar trebuie considerat n mod inacceptabil ca fiind contaminat.
Metoda Tempo
Este o metod complet automat, ce permite determinarea cantitativa a germeniilor
bacterieni, bazat pe microbiologia tradiional, avnd la baz metoda tuburiilor multiple.
Prezint sensibilitate i uurin n utilizare, permite eliberarea unui rezultat rapid fa de
metoda clasic de lucru (3 7 zile prin metode clasice de referin) i o economie de timp
la prepararea mediilor, pregtirea pentru sterilizarea sticlriei, ambalare , etichetare,
inoculare, citirea plcilor, autoclavarea i splarea sticlariei, etc.
Foto nr. Staie TEMPO
Testul TEMPO este compus dintr-un card cu un tub de transfer i o fiol cu un

mediu de cultur specific. Medii deshidratate, sterile, gata de utilizare, unic folosin,
selective TC (Coliformi totali), EC (E. Coli), EB (Enterobacteriaceae), STA
(Staphilococcus coagulaz +), LAB (Lactic Acid Bacteria) sau ne-selective TVC ( NTG),
Y +M (Drojdii i Mucegaiuri), identificate prin cod de bare si cod de culoare. (Foto nr) i
sculei tip Stomacher TEMPO (Foto nr..)
Mediul este inoculat cu o diluie a probei ce urmeaz a fi testat i este transferat
de ctre instrumentul de umplere tempo n cardul tempo. Mediul este dispersat n mod
omogen n 48 de godeuri cu trei volume diferite. Cardul este apoi sigilat ermetic pentru a
evita orice risc de contaminare n timpul manipulrilor ulterioare.
Foto nr. Card cu un tub de transfer i o fiol cu un mediu de cultur specific.
85
Foto nr. Saculeti de tip Stomacher
Exemple:
Tempo TVC i tempo EC - n timpul incubrii microorganismele prezente n card
reduc substratul din mediul de cultur i provoac apariia unui semnal fluorescent care
este detectat de cititorul TEMPO. n funcie de numrul i mrimea godeurilor pozitive,
sistemul tempo deduce NTG (pentru testul tempo TVC) sau numrul de E.coli (pentru
testul EC) prezent n proba iniial, conform calculrii bazate pe metoda numrului cel mai
probabil.
Tempo TC mediul de cultur conine un indicator fluorescent care atunci cnd pH-
ul este neutru, emite un semnal detectat de cititorul tempo. n timpul incubrii, coliformele
totale prezente n card fermenteaz lactoza n mediul de cultur, rezultnd scderea ph-lui
i dispariia semnalului fluorescent. n funcie de numrul i mrimea godeurilor pozitive,
sistemul TEMPO deduce numrul coliformelor totale prezente n proba iniial conform
calculrii bazate pe metoda numrului cel mai probabil.
Etapele de lucru: preparare - transfer automat al amestecului de proba si mediu
in cardul TEMPO ; ctirea, interpretarea, validarea si transferul rezultatelor intr- o singura
etapa......................................
Avantaje:
Flexibilitate (etape de lucru): permite o organizare corespunztoare a perioadelor
cu vrf de activitate; examinarea multor probe de testat n doar 4 etape de lucru.
Tempo poate lucra pna la 40 000 Teste/ an;
Usor de utilizat: reactivi gata de utilizare; acelasi protocol de lucru pentru toti
parametrii; mai putine dilutii pentru produsele foarte contaminate (datorita metodei
MPN); nu necesita confirmare; optimizarea etapelor de lucru;

Trasabilitate completa: cod de bare trasabilitatea este parte a procesului TEMPO; conectare

LIMS , fara inregistrari in registre; rezultate: export / salvate in sistem (audit) Acreditare usor
de obtinut;
Performante: validari internationale (ISO 16140 AFNOR, AOAC); reproductibilitate;
utomatizare: dilutii, citire, interpretare; reducerea timpului de manevrare;
productivitate; reduce etapele de preparare a probelor si a timpului de citire;
capacitate mare;
Reduce timpul de furnizare a rezultatelor catre utilizatorul final: legatura cu LIMS;
nu apar erori de transcriere a rezultatelor; rezultate mai rapide decit metoda ISO
(ex: STA 24h vs 48h & YM 3 zile vs 5 zile); nu necesita confirmare;
86
Organizare mai buna a timpului: organizare mai buna in perioadele cu analize
multe; laboratorul trebuie sa raspunda in orice context.
Germenii bacterieni, matricile din care acetia pot fi identificai i timpul necesar
diagosticului de laborator sunt menionate n tabelul nr
Tabelul nr..
Nr. Germeni bacterieni care Matrice Timpul
Crt. pot fi identificai necesar
(ore)
1. E.coli Preparate din carne, carne separat 24
mecanic, brnzeturi din lapte tratat
termic, produse nonanimaliere.
2. Staph. c.p. Brnzeturi din lapte crud supus 24
tratamentului termic mai sczut dect
pasteurizarea i din lapte tratat termic,
lapte praf, produse din pete.
3. Enterobacteriaceae Carcase bovine, ovine, caprine, 48
cabaline, suine, lapte pasteurizat i
produse lactate pasteurizate, lapte
praf, ngheat i deserturi pe baz de
lactate, formule uscate sugari i
alimente cu scopuri medicale, produse
din ou.
4. NTG Lapte materie prim, carcase bovine, 48
ovine, caprine, suine, cabaline, pasre,
carne tocat i separat mecanic.
5. D+M Produse panificaie 72
Foto nr. TEMPO statia de preparare: Foto nr. Staia de citire : citirea, interpretarea,
transfer automat al amestecului de proba si Validarea i transferul rezultatelor, ntr-o singur
mediu in cardul TEMPO. etap.
87
Analizorul automat MiniVidas
Este un sistem compact de nalt performan n identificarea germenilor nalt
patogeni, avnd ca principiu analiza imunologic.
Utilizarea lui permite o economie de timp, la prepararea mediilor, pregtirea pentru
sterilizarea sticariei, ambalare, etichetare, inoculare, citirea plcilor, autoclavarea i
splarea sticlariei, etc. , folosind reactivi gata de utilizare.
Analizorul automat MiniVidas ofer o gam larg de aplicaii, siguran i
simplicitate n utilizare, fiind un echipament automat, standardizat, robust care permite o
citire obiectiv i eliberarea unui rezultat rapid fa de metoda clasic de lucru.
Foto nr. Analizorul automat MiniVidas Foto nr. Vidas stripuri.....
Diagrama de lucru pentru Salmonella este urmtoarea: proba de analizat n

cantitate de 25 g se pune n 225 ml ap peptonat tamponat, dup care se
termostateaz o perioada de 16-20 h la o temoeratur de 371C.
25 gr in 225mL
Apa peptonata tamponata
16-20 h @ 37 1 C
VIDAS ICS2
88
Pentru Listeria, diagrama de lucru este urmtoarea: proba de analizat n cantitate de 25 g
se pune n 225 ml bulion Demi Fraser, dup care se termostateaz o perioada de 24-26 h
la o temoeratur de 301C. Dup terminare se ia 1 ml din bulionul Demi Fraser i se
pune n 10 ml bulion Fraser.
Germenii bacterieni, matricile din care acetia pot fi identificai i timpul necesar
diagosticului de laborator sunt menionate n tabelul nr.
Tabelul nr.....
Nr. Germeni bacterieni Matrice Timpul

Crt. care pot fi identificai necesar
(ore)
1. Salmonella Toate produsele alimentare n timpul 48
valabilitii lor
89
2. L.monocytogenes Toate produsele alimentare nainte de a 72
fi plecat de la controlul direct al unitii
care le-a produs i produse desfcute
pe pia n timpul valabilitii lor (carne i
preparate din carne, lapte materie
prim, brnzeturi din lapte
nepasteurizat, produse de cofetrie i
patiserie, preparate culinare, pete i
produse din pete)
3. Campylobacter jejuni Carcase pasre - examen prevzut n 72
PS/2010. Perioada de supraveghere
1.04 - 30.09.2010. (sezonul cald).
4. E.coli O 157 Carne vit, carne tocat i preparate din 72
carne care conin carne de bovine.
5. Enterotoxina Brnzeturi din lapte crud supus 72
Stafilococica, tratamentului termic mai sczut dect
pasteurizarea i din lapte tratat termic,
lapte praf, produse din pete.
Foto nr. Analizorul automat MiniVidas
Vitek 2 Compact
Echipamentul Vitek 2 Compact este un sistem automat pentru identificare i confirmare

biochimic i antibiogram; este capabil s selecteze organismele patogene i nalt
patogene izolate pe medii solide efectundu-le testele biochimice n timp extrem de rapid
rezultand economie de timp in eliberearea rezultatului.
90
Foto nr. Vitek Compact
Prin utilizarea lui se face economie de materiale si reactivi. Astfel cardul folosit
economisete toate tipurile de reactivi necesari identificrilor i confirmrilor i nu necesit
nici un tip de sticlrie, sterilizare termic, termostatare, sau alte etape premergtoare
operariei n sine.
Este un echipament uor de utilizat, cu un timp redus de manoper, software
intuitiv i conexiune cu sistemul LIMS. Metoda este complet automat, pentru diagnostic
utilizndu-se carduri diferite care permit identificarea bacteriilor Gramm+ (GP), Gramm
(GN), bacteriilor anaerobe (ANC), Campylobacterii (NH), Corynebacterii (CBC), drojdii
(YST) i Bacillus (BCL).
Etapele de lucru:
1. 1g de din proba de alimente;
2. Soluie MCF standardizat;
3. Umplere automata, incubare (toate cardurile in acelasi incubator);
4. citite automata carduri la fiecare 15;
5. Rezultate finale;
6. Raport final
91
(2) Densiceck
(3) (4) (5) (6)
Nr. Germeni bacterieni care pot fi identificai Timpul necesar efecturii

Crt. analizelor de laborator (ore)
1. E.coli 4-6
2. Stf. C.p. 4-6
3. Salmonella 5-6
4. L.monocytogenes 6-8
5. Campylobacter j. 8-12
E.coli O 157 5-6
Etc.
92
Avantajele utilizrii metodelor alternative de diagnostic:
creterea eficienei activitii de diagnostic prin procesarea unui numr mai mare
de probe n aceiai unitate de timp; datorit reducerii timpului de lucru, personalul
laboratorului poate lucra un numr mai mare de probe, n consecin veniturile
ncasate sunt mai mari, putndu-se concentra atenia i asupra altor activiti ca de
exemplu buna funcionare a Sistemului Calitii.
furnizarea mai rapid a rezultatelor analizelor de laborator (Salmonella 48 ore.
Listeria, NTG, Bacterii coliforme - 72 ore); utilizarea lor n cadrul programului de
autocontrol (preuri mai mari dect ale analizelor efectuate prin metode de
referin, compensare prin timpul mai scurt de furnizare a rezultatelor analizelor de
laborator);
Crete sigurana prin: rezultate obiective prin automatizare; protocoale cu etape
limitate de lucru;
automatizarea nseamn standardizare, ceea ce nseamn obinerea unor rezultate
sigure, fr erori, aducnd valoare rezultatelor obinute;
reproductibilitate si repetabilitate rapid a rezultatelor; export de date rapid n orice
sistem; spaiu eficient folosit;
cantitile de reziduuri sunt mici, comparativ cu cele generate n urma utilizrii
metodelor clasice;
export de date rapid n orice sistem;
spaiile ocupate cu depozitarea materialelor consumabile sunt mult mai reduse.
Inconvenientele metodelor rapide
necesit confirmarea prin teste de referin n caz de pozitivitate pentru
determinrile calitative;
risc cresut de interferene/ inhibiie datorit matricei;
necesit validare international i intern;
93
CURS NR. 14
Verificarea eficienei decontaminrilor

Scop: descrierea modului n care se apreciaz decontaminarea suprafeelor.
Domeniu de aplicare: spaiile din unitile de procesare a alimentelor i spaiile n care se
desfoar activitatea de diagnostic de laborator.N,,,,,,,,,,AR
Documente de referin:
SR EN ISO 4832 / 2009 - Microbiologia alimentelor i furajelor. Metod orizontal
pentru numrarea bacteriilor coliforme. Metoda numrrii coloniilor;
SR EN ISO 4833:2003 - Microbiologia alimentelor i nutreurilor. Metoda orizontal
pentru numrarea microorganismelor. Tehnica de numrare a coloniilor la 30C;
SR EN ISO 6888-1:2002 - Microbiologia alimentelor i furajelor. Metod orizontal
pentru numrarea stafilococilor coagulaz-pozitivi (Staphylococcus aureus i alte
specii). Partea1: Tehnica pe mediu de agar Baird-Parker;
SR EN ISO 6888-1:2002/A1:2005 - Microbiologia alimentelor i furajelor. Metod
orizontal pentru numrarea stafilococilor coagulaz-pozitivi (Staphylococcus
aureus i alte specii). Partea1: Tehnica pe mediu de agar Baird-Parker.
Amendament 1: includerea datelor de fidelitate;
SR EN ISO 7218:2007 - Microbiologia alimentelor i furajelor. Cerine generale i
ghid pentru examenele microbiologice;
SR EN ISO 8199:2008 - Calitatea apei. Linii directoare pentru numrarea
microorganismelor n mediul de cultur;
SR CEN ISO/TC 11133-1:2009 - Microbiologia alimentelor i furajelor. Ghid de
preparare i obinere a mediilor de cultur. Partea 1: Ghid general de asigurarea
calitii pentru pregtirea mediilor de cultur n laborator;
SR CEN ISO/TS 11133-2:2009 - Microbiologia alimentelor i furajelor. Ghid de
preparare i obinere a mediilor de cultur. Ghid teoretic pentru ncercri de
performan ale mediilor de cultur;
SR ISO 18593:2007 - Microbiologia alimentelor i nutreurilor. Metode orizontale
privind tehnicile de eantionare de pe suprafee folosind plci de contact i
tampoane;
SR ISO 21527-1:2009 - Microbiologia alimentelor i furajelor: Metod orizontal
pentru numrarea drojdiilor i mucegaiurilor. Partea 2: Tehnica de numrare a
coloniilor in produse cu activitatea apei mai mare de 0,95;
SR ISO 21527-2:2009 - Microbiologia alimentelor i furajelor: Metod orizontal
pentru numrarea drojdiilor i mucegaiurilor. Partea 2: Tehnica de numrare a
coloniilor n produse cu activitatea apei mai mic sau egal cu 0,95;
SR ISO 21528-2:2007 - Microbiologia alimentelor i nutreurilor: Metod orizontal
pentru detecia i numrarea Enterobacteriaceelor.
Verificarea eficienei decontaminrii suprafeelor se realizeaz prin:
94
determinarea numrului total de germeni;
determinarea numrului total de fungi;
izolarea stafilococilor;
izolarea bacteriilor coliforme;
izolarea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae.
Materiale de referin:
Escherichia coli ATCC 25922;
Enterococcus faecalis ATCC 19433;
Staphylococcus aureus ATCC 25923;
Candida albicans ATCC 10231;
Aspergillus brasiliensis Aspergillus niger ATCC 9642scop
ce, ce
Medi Medii de cultur i diluani
Nr. Mediul de cultur / diluant Utilizare

Crt.
1. Ser fiziologic ca soluie de cltire Constituirea probei de analizat
2. Soluie peptonat salin (0,1% concentraie de mas)
ca soluie neutralizant nespecific
3. Agar Baird-Parker Izolarea stafilococilor
4. Agar cu cristal violet, rosu neutru, bil i lactoz (VRBL) Izolarea bacteriilor coliforme
5. Bulion lactoz-bil-verde briliant
6. Agar cu cristal violet, rosu neutru, bil i glucoz (VRBG) Izolarea bacteriilor din familia
7. Agar nutritiv Enterobacteriaceae
8. Agar cu glucoz i brom crezol purpur
9. Agar pentru numrarea coloniilor (Plate Count Agar) Determinarea numrului total de
germeni
10. Agar cu glicerol i dicloran 18% (DG18) Determinarea numrului total de
11. Agar cu dicloran, rosu Bengal i cloramfenicol (DRBC) fungi
aer, a Aparatur i materiale necesare

Etuv; incubator (25 1C); incubator (30 1C sau 37 1C); baie de ap
(451C); cabinet de protecie cu flux laminar; echipament de numrare a coloniilor; pH-
metru, cu acurateea de 0,1 uniti de pH la 25C; microscop; arztor cu gaz; pipete
semiautomate cu capacitatea de: 20-200 l, 100-1000 l, 1000-10000 l; flacoane din
sticl cu capacitate mai mic de 500 ml, sterile; tampoane de recoltare sterile; ablon
reprezentat de un ptrat gol cu latura de 10 cm, utilizat pentru prelevarea probelor de pe
suprafeele decontaminate; plci Petri, cu diametrul de 90-100 mm, de unic folosin;
tuburi-test cu dimensiunea de 16 mm x 160 mm sterile; tuburi Durham, de dimensiuni
corespunztoare, pentru folosirea in asociere cu tuburile-test; anse bacteriologice,
confecionate din plastic; varfuri de pipet sterile, cu capacitatea de: 20-200 l,100-
95
1000 l, 1000-10000 l; anse Drigalski, confecionate din plastic sau sticl;p, organi
Materialul supus examinrii
Proba de sanitaie = rezultat n urma prelevrii cu un tampon steril, de pe o
suprafa de 100 cm decontaminat dintr-un obiectiv din cadrul unitilor de procesare,
laboratorului. = microorganisme unicelulare constituite din: nucleu, citoplasm, atic,
perete Pregtirea probei ce va fi supus examinrii
Pentru recoltarea probelor de sanitaie sunt necesare: un tampon, un tub cu soluie
de cltire (ser fiziologic, 10 ml) i un tub cu soluie neutralizant (soluie peptonat
salin,10 ml) pentru fiecare suprafa examinat. Dac suprafaa este ud, tamponul nu
trebuie s mai fie umezit n prealabil.
Dac este necesar umezirea tamponului (n cazul unei suprafee uscate), se
ndeprteaz capacul tubului de cltire, se scoate tamponul din tubul de protecie i se
cufund n soluia de cltire. Se ndeprteaz excesul de lichid de pe tampon prin apsare
uoar de pereii tubului.
Pentru acurateea rezultatelor, umezirea tampoanelor nu trebuie s se fac cu mai
mult de o or nainte de recoltare !
Prelevarea probelor de sanitaie - se realizeaz prin tergerea suprafeei de
testat cu tamponul (n zig-zag, n dou planuri, transversal i longitudinal), astfel nct s
se acopere o suprafa de 10 cm x 10 cm (folosind un ablon); tamponul cu proba
recoltat se neutralizeaz ntr-un tub cu soluie neutralizant, timp de 1-5 minute;
Dup neutralizare, tamponul se introduce n tubul cu soluie de cltire i se spal
aprox. 10 secunde; aceast soluie de cltire, n care s-a descrcat tamponul, constituie
proba de analizat; tamponul i tubul protector se elimin ca deeu ncadrat n categoria
deeurilor cod 180202*; coninutul tubului se mixeaz timp de 30 de secunde nainte de a
fi analizat.erci) = talofite cu celule nucleate, lipsii de orice fel de pigmeni asimilatori si p
lNOT
Normele sanitar-veterinare prevd ca suprafaa de pe care se face recoltarea
probelor s fie cel puin 1/10.000 din suprafaa total supus decontaminrii. Este
important ca recoltarea probelor de sanitaie s se realizeze din puncte greu accesibile
operaiunilor de curare (30%) i de pe suprafeele cu care alimentele intr n contact
direct (mese de lucru, blaturi,, perei) (70%). Pentru obiectivele cu suprafaa mai mic de
1000 m, recoltarea probelor de sanitaie se realizeaz din minim 5 puncte iar pentru cele
mai mari de 1000 m - din minim 10 puncte.
Recoltarea probelor de sanitaie se efectueaz imediat dup desigilarea
obiectivului decontaminat.ast
de, cu
Verificarea eficienei decontaminrii suprafeelor
prin izolarea stafilococilor
Principiu: Const in izolarea stafilococilor pe mediu selectiv Baird-Parker, prin

incubare la 35C - 37C n condiii de aerobioz, timp de 48 ore.
Procedur: cu ajutorul pipetei semiautomate, se transfer 0,1 ml prob pe o plac
Petri cu agar Baird-Parker; se distribuie inoculul pe suprafaa plcii cu agar. Placa Petri se
las s se usuce timp de 15 minute la temperatura laboratorului. Se introduce in
96
incubator la temperatura de 35C - 37C timp de 24 2 ore.dii (levuri) = ciuperci micros
Identificarea coloniilor - dup o incubare de 24 2 ore, se examineaz plcile i
se marcheaz poziia fiecrei colonii tipice prezente; dup 48 2 ore de incubare, plcile
se examineaz din nou i se marcheaz orice nou colonie tipic precum i orice colonie
atipic prezent.
Coloniile tipice sunt negre/gri, strlucitoare i convexe, cu diametrul de 1-1,5 mm
dup 24 ore de incubare i de 1,5-2,5 mm dup 48 ore de incubare, nconjurate de o zon
clar, care poate fi parial opac. Dup o perioad de incubare de cel puin 24 de ore, n
aceast zon clar poate aprea un inel opalescent n jurul coloniilor.
Coloniile atipice pot fi colonii negre strlucitoare, cu sau fr o margine ngust

alb; zona clar este absent sau abia vizibil i inelul opalescent este absent sau greu
vizibil; colonii gri fr zon clar. Alte colonii: toate coloniile rmase, care nu prezint
aspect tipic sau atipic i considerate flor de fond.ia alcoolic n produse zaharo
Confirmarea coloniilor - prin examinarea la microscop a frotiului colorat Gram (cu
ocular 5x i obiectivul de imersie 100 x)
Confirmarea coloniilor (Testul coagulazei)
Cu o ans bacteriologic steril se recolteaz un inocul de pe suprafaa fiecrei
colonii selectate i se transfer ntr-o eprubet cu infuzie de creier-inim; Se incubeaz la
temperatura de 35C i la 37C timp de 242 ore; Se adaug aseptic 0,1 ml din fiecare
cultur la 0,3 ml de plasm de iepure n eprubete de hemoliz sterile i se incubeaz la
temperatura de 35C i la 37C;
Prin nclinarea eprubetei, se examineaz coagularea plasmei la 4-6 ore de
incubare i dac testul este negativ, se reexamineaz la 24 de ore sau la timpii de
incubare precizai de productor.
Testul de coagulare este pozitiv dac volumul de coagul ocup mai mult de
jumtate din volumul iniial al lichidului.
Pentru control negativ, pentru fiecare lot de plasm, se adaug 0,1 ml infuzie
creier-inim steril la cantitatea recomandat de plasm de iepure i se incubeaz.
Analiza este valid cand plasma de iepure controlat nu prezint semne de coagulare.
Stafilococi abseni/0,1ml prob analizat Stafilococi abseni/1 cm2 suprafa
analizat;
97
Stafilococi prezeni/0,1ml prob analizat Stafilococi prezeni/1 cm2 suprafa
analizat.
MENIUNE: Dac proba de sanitaie recoltat de pe o suprafa de 100 cm2 se
constituie in 10 ml soluie de cltire, rezult c 0,1 ml de prob analizat corespunde unei
suprafee de 1 cm2.
Raportarea rezultatelor:
Rezultat negativ = stafilococi abseni/1 cm2 suprafa analizat;
Rezultat pozitiv = stafilococi prezeni/1 cm2 suprafa analizat.
Interpretarea rezultatelor:
Decontaminarea obiectivului este corespunztoare atunci cand numrul total de
probe de sanitaie recoltate din obiectiv au rezultat negativ. n caz contrar, decontaminarea
este necorespunztoare i se recomand refacerea acesteia.
Verificarea eficienei decontaminrii

suprafeelor prin izolarea bacteriilor
coliforme
Principiu:
Const n izolarea bacteriilor coliforme, n condiii de incubare aerob la
temperatura de 30C sau 37C, timp de 24 de ore, pe mediu selectiv agar-lactoz-bil-
rou neutru-cristal violet pe care formeaz colonii tipice i atipice, care sunt testate prin
testul de fermentare a lactozei.
n tuburi cu bulion lactoz-bil-verde briliant, bacteriile coliforme, induc fermentarea
lactozei cu producie de gaz.
Procedur
Se transfer 1 ml prob ntr-o plac Petri, cu ajutorul pipetei semiautomate; se
repartizeaz aproximativ 15 ml de mediu VRBL la temperatura de 44 - 47C n fiecare
plac Petri (astfel nct nlimea mediului n placa Petri s fie de minim 2 mm); se
omogenizeaz atent inoculul cu mediul prin rotirea plcii Petri i se las amestecul s se
solidifice prin aezarea plcilor Petri pe o suprafa orizontal; dup solidificare, se toarn
circa 4 ml de mediu VRBL la temperatura de 44-47C pe suprafaa mediului nsmanat i
se las s se solidifice; plcile Petri se introduc in incubator la temperatura de 30C sau
37C timp de 24 2 ore.
Timpul scurs ntre prepararea diluiilor i momentul repartizrii mediului n plci nu
trebuie s depeasc 15 minute!
Identificarea coloniilor:
Coloniile caracteristice (tipice) sunt de culoare roie purpuriu, cu un diametru de cel
puin 0,5 mm (inconjurate de o zon roiatic); Acestea sunt considerate colonii de
coliformi i nu necesit o confirmare ulterioar.
Coloniile atipice sunt de dimensiuni mai mici de 0,5 mm.
Confirmarea coloniilor atipice:
Se inoculeaz coloniile atipice n tuburi cu bulion lactoz-bilverde briliant;
98
Se introduc tuburile nsmanate n termostat la temperatura de 30C sau 37C
timp de 24 2 ore;
Se consider bacterii coliforme, coloniile care prezint formare de gaz n tuburile
Durham.
Bacterii coliforme absente/1ml prob analizat = Bacterii coliforme absente/10 cm
suprafa analizat;
Bacterii coliforme prezente/1ml prob analizat = Bacterii coliforme prezente/10
cm suprafa analizat.
MENIUNE: Dac proba de sanitaie recoltat de pe o suprafa de 100 cm se
constituie n 10 ml soluie de cltire, rezult c 1 ml de prob analizat corespunde unei
suprafee de 10 cm.
Rezultat negativ=bacterii coliforme absente/10 cm2 suprafa analizat;
Rezultat pozitiv= bacterii coliforme prezente/10 cm2 suprafa analizat.
probe de sanitaie recoltate din obiectiv au rezultat negativ. In caz contrar, decontaminarea
Verificarea eficienei decontaminrii suprafeelor prin izolarea bacteriilor din

familia
Enterobacteriaceae
Principiu:
Const n izolarea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae, n condiii de incubare
semianaerob la temperatura de 37C, timp de 24 de ore, pe mediu selectiv agar-glucoz-
bil-rou neutru-cristal violet pe care formeaz colonii caracteristice, care sunt testate prin:
reacia oxidazei i testul de fermentare a glucozei. n tuburi cu agar glucoz-bromcrezol
purpur, bacteriile din familia Enterobacteriaceae, induc fermentarea glucozei cu virarea
culorii mediului n galben.
Procedur
Se transfer 1 ml prob ntr-o plac Petri, cu ajutorul pipetei semiautomate; se
repartizeaz aproximativ 10 ml de mediu VRBG la temperatura de 44-47C n fiecare
plac Petri; se omogenizeaz atent inoculul cu mediul prin rotirea plcii Petri i se las
amestecul s se solidifice prin aezarea plcilor Petri pe o suprafa orizontal; dup
solidificare, se toarn circa 15 ml de mediu VRBG la temperatura de 44-47C pe suprafaa
mediului nsmanat (pentru a preveni creterea excesiv i a realiza condiii de
semianaerobioz) i se las s se solidifice; plcile Petri se introduc n incubator la
temperatura de 37C timp de 24 2 ore.
Timpul scurs ntre prepararea diluiilor i momentul repartizrii mediului n plci nu
trebuie s depeasc 15 minute!
Identificarea coloniilor:
Coloniile caracteristice (tipice) sunt de culoare roz spre rou sau purpuriu; cnd
99
sunt prezente, se selecteaz aleator 5 colonii pentru rensmanare i confirmare
biochimic.
Coloniile atipice sunt albicioase; cand sunt prezente, se selecteaz aleator 5 colonii
pentru rensmanare i confirmare biochimic.
Confirmarea coloniilor:
Se inoculeaz coloniile tipice i atipice pe plci cu agar nutritiv; Se introduc plcile
nsmanate n termostat la temperatura de 37C timp de 24 2 ore; Se selecteaz cte o
colonie bine izolat de pe fiecare din plcile incubate pentru efectuarea testelor de
confirmare biochimic.
Teste de confirmare biochimic:
Testul oxidazei - se plaseaz 2-3 picturi de reagent pentru testul oxidazei
proaspt preparat pe o hrtie de filtru. Cu ajutorul ansei bacteriologice se recolteaz o
colonie i se amprenteaz hartia de filtru in acelai loc. Reacia este negativ dac
culoarea hartiei de filtru NU vireaz n negru n decurs de 30 secunde.
Testul de fermentaie al glucozei - se efectueaz pasajul unei colonii n tuburi
care conin agar cu glucoz i brom crezol purpur; Se introduc tuburile in termostat la
temperatura de 37C timp de 24 2 ore; Reacia este pozitiv dac culoarea mediului
vireaz in galben.
Alte teste biochimice (fermentarea glucozei, fermentarea lactozei, producerea de
hidrogen sulfurat, mobilitate, indol, uree) - cu ajutorul ansei bacteriologice se recolteaz o
colonie i se fac nsmanri pe mediile TSI (triple sugar iron) i MIU (mobilitate, indol,
uree). Bacteriile din familia Enterobacteriaceae sunt oxidazo-negative i glucozo-pozitive.
Bacterii din familia Enterobacteriaceae absente/1ml prob analizat = Bacterii din
familia Enterobacteriaceae absente/10 cm suprafa analizat;
Bacterii din familia Enterobacteriaceae prezente/1ml prob analizat = Bacterii din
familia Enterobacteriaceae prezente/10 cm suprafa analizat.
MENIUNE: Dac proba de sanitaie recoltat de pe o suprafa de 100 cm se
constituie n 10 ml soluie de cltire, rezult c 1 ml de prob analizat corespunde unei
suprafee de 10 cm.
Rezultat negativ=bacterii din familia Enterobacteriaceae absente/10 cm suprafa
analizat;
Rezultat pozitiv= bacterii din familia Enterobacteriaceae prezente/10 cm suprafa
analizat.
probe de sanitaie recoltate din obiectiv au rezultat negativ. n caz contrar, decontaminarea
Verificarea eficienei decontaminrii suprafeelor prin

determinarea numrului total de germeni
100
Principiu
Const n determinarea numrului total de germeni (bacterii, drojdii sau
mucegaiuri) care se stabilete prin numrarea coloniilor crescute pe un mediu solid
inoculat cu o cantitate specificat de prob (suspensie apoas) i diluii zecimale ale
acesteia dup incubarea aerob la temperatura de 300 C timp de 72 ore.
Procedur
Se efectueaz diluii zecimale seriate ale probei; proba se lucreaz n duplicat,
astfel din fiecare diluie se transfer cate 1 ml de prob, in cate o plac Petri, cu ajutorul
pipetei semiautomate; pentru fiecare diluie zecimal se folosete cate un varf de pipet
steril; se toarn aproximativ 15 ml de mediu PCA la temperatura de 44-47C n fiecare
plac Petri (astfel nct nlimea mediului n placa Petri s fie de minim 2 mm);Timpul
scurs ntre prepararea diluiilor i momentul turnrii mediului n plci nu trebuie s
depeasc 15 minute; se omogenizeaz inoculul cu mediul prin rotirea plcii Petri i se
las amestecul s se solidifice prin aezarea plcilor Petri pe o suprafa orizontal; dup
solidificare, se toarn circa 4 ml de mediu PCA la temperatura de 44- 470C pe suprafaa
mediului insmanat i se las s se solidifice; plcile Petri se introduc n incubator la
temperatura de 30 1 C timp de 72 3 ore.
Numrarea coloniilor
Se realizeaz folosind echipamentul de numrare a coloniilor.
Coloniile mici trebuie incluse la numrare, dar trebuie difereniate de particulele de
material nedizolvat sau precipitat din plci.
Coloniile confluente se vor considera ca o singur colonie. Dac mai puin de un
sfert din plac este invadat, se numr coloniile de pe partea neafectat a plcii i se
calculeaz numrul corespunztor pentru toat placa. Dac mai mult de un sfert din plac
este invadat, numrtoarea nu se ia in calcul!
Exprimarea rezultatelor:
Se calculeaz numrul de uniti formatoare de colonii per ml suspensie in
conformitate cu SR ENV ISO 8199:2008.
Plci Petri care nu conin nicio colonie - dac cele dou plci ale primei diluii nu
conin nicio colonie, rezultatul se exprim astfel: 0 microorganisme per ml, respectiv per
100 cm de suprafa decontaminat.
Numr total de colonii de pe plci mai mic de 10 - dac plcile conin mai puin de
10 colonii, dar numrul total de colonii in toate plcile disponibile este mai mare sau egal
cu 4, rezultatul se va calcula dup modelul de mai jos i va fi dat ca numr estimativ. Dac
numrul total de colonii in toate plcile disponibile este intre 1 i 3, precizia rezultatului va
fi aa de sczut nct raportarea rezultatului se va face ca microorganisme prezente n
volumul studiat. (numr foarte mic).
Numr total de colonii de pe plci cuprins intre 10 i 300 colonii - numrul de
microorganisme per mililitru se calculeaz dup urmtoarea formul:
Z
Cs = ----------- x Vs
Vtot
n care:
Cs = numrul de ufc in volumul de prob de referin Vs;
101
Z = suma coloniilor numrate pe plci pentru diferite diluii;
Vs = volumul de prob de referin ales pentru a exprima concentraia de
microorganisme din prob;
Vtot = volumul total de prob introdus in plcile luate in considerare la numrare.
Ca rezultat se consider numrul de microorganisme per ml exprimat printr-un
numr cuprins ntre 1,0-9,9 multiplicat cu 10x, unde x este puterea atribuit lui 10.
Numr total de colonii de pe plci mai mare de 300 colonii - rezultatul se exprim
ca fiind mai mare sau egal cu 300.
Se calculeaz numrul de uniti formatoare de colonii per 100 cm suprafa
investigat folosind formula din SR ISO 18593:2007:
Ns/A = N x F x D
n care:
Ns/A = numrul de uniti formatoare de colonii per 100 cm2 suprafa investigat;
N = numrul de uniti formatoare de colonii per ml suspensie;
F = volumul soluiei de cltire, in ml;
D = inversul factorului de diluie.
Raportarea rezultatelor
Rezultat negativ: NTG 50/100 cm;
Rezultat pozitiv: NTG > 50/100 cm.
Interpretarea rezultatelor: decontaminarea obiectivului a fost corespunztoare
atunci cnd numrul probelor de sanitaie cu rezultat pozitiv este 30% din numrul total
de probe de sanitaie recoltate din obiectiv. n caz contrar, decontaminarea a fost
necorespunztoare i se recomand refacerea acesteia.
Verificarea eficienei decontaminrii suprafeelor prin

determinarea numrului total de fungi
Principiu
Const n determinarea numrului de drojdii sau de mucegaiuri per mililitru prob i
este calculat din numrul de colonii obinute pe plcile alese la niveluri de diluie care
produc colonii numrabile. Drojdiile i mucegaiurile pot fi numrate i separat.
Procedur
Se efectueaz diluii zecimale seriate ale probei; proba se lucreaz in duplicat,
astfel din fiecare diluie, cu ajutorul pipetei semiautomate, se transfer cate 0,1 ml de
prob pe cate o plac cu agar DRBC; pentru fiecare diluie se folosete cate un varf de
pipet steril (NOT: Dac este suspectat prezena mucegaiurilor cu cretere rapid se va
utiliza standardul ISO 21257-2); se etaleaz lichidul pe toat suprafaa plcii cu agar cu
ansa Drigalski steril pan cand lichidul este complet absorbit de mediu; se incubeaz
plcile insmanate in condiii aerobe, cu capacul n sus, n incubator la 251C timp de 5
zile. Plcile cu agar pot fi lsate s stea la lumin natural timp de 1-2 zile pentru a avea
loc pigmentogeneza specific speciilor de fungi in vederea identificrii acestora.
Se recomand ca plcile Petri s se intrroduc n incubator intr-o pung de
102
plastic nchis pentru a nu contamina incubatorul prin diseminarea mucegaiurilor in afara
plcilor.
Numrarea coloniilor
Se examineaz plcile n intervalul de timp cuprins ntre a doua i a cince-a zi de
incubare. Pentru exprimarea rezultatelor se rein plcile care conin mai puin de 150
colonii i se numr acele colonii. Dac mucegaiurile cu cretere rapid creaz probleme,
plcile se examineaz i coloniile se numr ncepand din a 2-a zi pn n a 5-a zi de
incubare. (ATENIE: Sporii de mucegaiuri difuzeaz in aer cu mare uurin i prin urmare
plcile Petri trebuie manipulate cu mare atenie pentru a impiedica dezvoltarea coloniilor
satelite care vor da o supraestimare a populaiei din prob).
Examinarea poate fi fcut cu ajutorul echipamentului de numrare a
coloniilor/microscopului. Opional, coloniile de drojdii i de mucegaiuri se pot numra
separat. Pentru identificarea drojdiilor i mucegaiurilor, din coloniile acestora se
efectueaz preparate sau frotiuri i se supun examinrii microscopice cu obiectiv 40 x.
Rezultat negativ: NTF 30/100 cm;
Rezultat pozitiv: NTF > 30/100 cm.
Decontaminarea obiectivului a fost corespunztoare atunci cand numrul probelor
de sanitaie cu rezultat pozitiv este 30% din numrul total de probe de sanitaie recoltate
din obiectiv. In caz contrar, decontaminarea a fost necorespunztoare i se recomand
refacerea acesteia.
NOUTATE
TESTUL
RODAC
Principiu:
Const in determinarea numrului total de germeni (bacterii, drojdii sau
mucegaiuri) de pe o plac Petri cu agar pentru numrarea coloniilor (PCA), dup
incubarea aerob la temperatura de 30 C timp de 72 ore.
Proba de sanitaie = rezultat in urma prelevrii cu o plac de contact (plac Petri
cu agar pentru numrarea coloniilor (PCA)).
Procedur
Placa Petri se introduce in incubator la temperatura de 30 1 C timp de 72 3
ore.
Numrul de uniti formatoare de colonii/plac a fost mprit n domenii i fiecrui
domeniu i s-a atribuit un scor astfel: 0 ufc/plac = 0; 1-40 ufc/plac = 1; 41-120 ufc/plac =
2; 121-400 ufc/plac =3; >400 ufc/plac = 4; Nenumrabil (dificil de numrat) = 5.
Scor 1.5 Decontaminarea a fost corespunztoare;
Scor > 1.5 i 3 Decontaminarea a fost necorespunztoare i se recomand
repetarea acesteia;
103
Scor > 3 Decontaminarea a fost necorespunztoare i se recomand repetarea
acesteia de ctre o firm specializat.
104
REGULI DE PROCEDUR PENTRU TRANSMITEREA CULTURILOR

BACTERIENE LA
IISPV N VEDEREA CONFIRMRII I TIPIZRII
Pentru verificarea rezultatelor obinute se vor trimite probe la IISPV n vederea

confirmrii i tipizarii. Astfel de situaii pot fi n cazul punerii n eviden a urmtorilor ageni
patogeni: Salmonella, Listeria, Campylobacter, etc. n momentul izolrii tulpinilor care
urmeaz a fi expediate pentru confirmare identificare - tipizare, eful LSVSA va informa
telefonic eful LNR din cadrul IDSA sau IISPV cruia probele i se adreseaz, transmind
data i ora aproximativ la care probele vor ajunge la destinaie.
n vederea expedierii probelor, se vor efectua transplantri pe medii de cultur
selective, cromogene sau agar semisolid. Dup incubare 24 48 ore la temperatura
prevzut n procedura specific de lucru a fiecrei metodologii de diagnostic, recipienii
se vor pstra la frigider (4 - 8C) o perioad de maxim 48 ore, dup care se vor ambala n
condiii care s permit pstrarea integritii acestora pe toat perioada transportului. n
situaiile n care este posibil acestea vor fi trimise imediat dup finalizarea perioadei de
incubare.
Pentru ambalare, plcile sau tuburile vor fi nvelite n hrtie de pergament sau folie
de aluminiu, dup care se vor introduce n cutii de carton n care se poate introduce vata,
tifon sau zpad artificial sub form de fulgi pentru atenuarea eventualelor ocuri. Pobele
se vor sigila n vederea asigurrii siguranei i trasabilitii.
Transportul se poate efectua cu ajutorul autolaboratorului, caz n care probele
ambalate vor fi introduse ntr-o lad frigorific dezinfectat sau cu pota rapid n baza
unui contract n care se stipuleaz expres faptul c firma prestatoare se oblig s
transporte probele n condiii de biosiguran.
n cazul utilizrii autolaboratorului, persoana care transport probele trebuie s fie
instruit asupra condiiilor care trebuiesc respectate, importante fiind timpul, evitarea
ocurilor i a frnelor brusce.
Probele vor fi nsoite de o adres ntocmit de specialistul care solicit
identificarea i tipizarea. Aceasta va fi semnat de specialist, eful LSVSA i vizat de
Directorul Executiv al DSVSA, dup urmtorul model:
105
Abrevieri
ANSVSA Autoritatea Naional Sanitar Veterinar i pentru Sigurana

Alimentelor BPE Bun Practic de Fabricaie
Comisia BIOHAZ Comisia tiinific pe Riscuri Biologice
CSMVSP - Comitetul tiinific pentru msuri veterinare legate de sntatea public
CSVSA Circumscripia Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor
DDD Dezinfecie, Dezinsecie, Deratizare
DGSA - Direcia General Sigurana
Alimentelor DSA Direcia de Sntate
Animal
DSVSA Direcia Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor
EFSA Autoritatea European pentru Siguran Alimentar
F - Formular
HG Hotrre de Guvern
IISPV Institutul de Igien i Sntate Public Veterinar
HACCP - Hazard Analysis. Critical Control Points. (Analiza riscurilor i a punctelor critice
de control)
NACMF National Advisory Commitee on Microbiological Criteria of Foods
NCP Numrul cel mai probabil
LCR Laborator Comunitar de Referin
LNR Laborator Naional de Referin
LSVSA Laboratorul Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor
OIA - Operator din Industria Alimentar
OMS Organizaia Mondial a
Sntii PCR reacia de polimerizare
n lan PIF Puncte de Inspecie la
Frontier PS - Procedur specific
Reg Regulament
T Thrner
TU Testul Unic
TCS - Testul Comparativ Simultan
UE Uniunea European
ufc uniti formatoare de colonii
UV - ultraviolete
UHT - Ultra High Temperature
WHO (OMS) - Organizaia Mondial a Sntii
106
Definiii
Aliment sau produs alimentar - (1) se nelege orice produs sau substan, indiferent
dac este prelucrat integral, parial sau neprelucrat, destinat consumului uman ori
preconizat a fi destinat consumului uman, (2) Alimentele includ i buturile, guma de
mestecat i orice alta substanta, inclusiv apa, incorporata intentionat n hrana n timpul
producerii, pregtirii sau tratarii acesteia. (Articolul 3 al Legii nr. 150 /2004);
Apa potabil - apa destinat consumului uman, dup cum urmeaz:
a) orice tip de apa n stare naturala sau dup tratare, folosit pentru but, la prepararea
hranei ori pentru alte scopuri casnice, indiferent de originea ei i indiferent dac este
furnizat prin reea de distribuie, din rezervor sau este distribuita n sticle ori n alte
recipiente;
b) toate tipurile de apa folosit ca sursa n industria alimentara pentru fabricarea,
procesarea, conservarea sau comercializarea produselor ori substanelor destinate
consumului uman, cu excepia cazului n care Ministerul Sntii i Familiei i Ministerul
Agriculturii, Alimentaiei i Pdurilor aproba folosirea apei i este demonstrat ca apa
utilizata nu afecteaz calitatea i salubritatea produsului alimentar n forma lui finita,
c) apa provenind din surse locale, precum fntni, izvoare etc., folosit pentru but, gtit
sau n alte scopuri casnice; n funcie de condiiile locale specifice, autoritile de sntate
public judeene, respectiv a municipiului Bucureti, pot face excepie de la valorile
parametrilor de calitate, dar fr s fie pus n pericol sntatea consumatorilor (Artticolul
1 alin.1 a Legii nr. 458 /2002);
Autoritate competent - reprezint autoritatea centrala a unui stat membru care dispune
de competena de a organiza controale oficiale sau orice alt autoritate careia i s-a conferit
respectiva competen, de asemenea, include, dupa caz, autoritatea corespunztoare
dintr-o tara terta..<in cazul de fata, ANSVSA> (Articolul 2(4) al Regulamentului (CE) nr.
882/2004);
Bacterii - microorganisme unicelulare constituite din: nucleu, citoplasm, organite
citoplasmatice, membran citoplasmatic, perete celular i/sau capsul, care prezint
caracteristicile procariotelor.
Coliformi - grup heterogen de bacterii incadrate in Fam. Enterobacteriaceae, care se
prezint sub form de bacili Gram negativi, nesporulai, mobili i care fermenteaz
lactoza.
Control oficial - orice form de control pe care l efectueaz autoritatea competent ori
Comisia European mpreun cu statele membre ale Uniunii Europene, pentru verificarea
conformitii cu legislaia n domeniul hranei pentru animale i cu legislaia n domeniul
alimentelor, cu regulile de sntate i bunstare a animalelor; (Articolul 2(1) al
Regulamentului (CE) nr. 882/2004);
Criteriu microbiologic - criteriul ce defineste acceptabilitatea produsului, a lotului de
produse alimentare sau a prelucrarii bazat pe absenta, prezenta sau numarul de
microorganisme, si/sau cantitatea toxinei/metabolitilor lor, pe unitate (ti) de masa, volum,
arie sau lot ;
Criteriul de siguran a alimentelor un criteriu care defineste gradul de
107
acceptabilitate al unui produs sau al unui lot de produse alimentare, aplicabil produselor
introduse pe pia; (Articolul 2(c) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Criteriul de igien a procesului - un criteriu care indic gradul de acceptabilitate al
funcionrii procesului de productie. Un astfel de criteriu nu se aplic produselor introduse
pe pia. Acesta stabileste o valoare de referin a contaminarii, la depairea creia se
impun msuri corective destinate s mentin igiena procesului n conformitate cu legislaia
n domeniul alimentelor; (Articolul 2(d) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Defect nendeplinirea unei cerine referitoare la o utilizare intenionat sau specificat.
(SR EN ISO 9000:2006, Sisteme de management al calitii. Principii fundamentale i
vocabular)
Not: Distincia dintre conceptele de defect i neconformitate este important deoarece
aceasta are conotaii legale, n special cele asociate problemelor referitoare la
rspunderea juridic pentru produs. n consecin, termenul defect ar trebui utilizat cu
deosebit pruden. (SR EN ISO 9000:2006, Sisteme de management al calitii. Principii
fundamentale i vocabular) - un defect (o neconformitate) apare ntr-o unitate de produs
atunci cnd una sau mai multe caracteristici calitative nu ndeplinesc specificaia calitativ
stabilit. O unitate defectuoas conine unul sau mai multe defecte; (CAC/GL 50-2004);
Drojdii (levuri) - ciuperci microscopice unicelulare care triesc n colonii i care de obicei
produc fermentaia alcoolic n produse zaharoase.
Enterobacteriaceae - reprezint o familie mare de bacterii, care cuprinde mai multe
bacterii patogene precum Salmonella si Escherichia coli. Membrii acestei familii au form
bacilar, cu dimensiuni de 1-5 m, sunt Gram-negativi, facultativ anaerobi, fermenteaz
glucidele, reduc nitraii, majoritatea mobili, nesporulai i catalazo-pozitivi cu excepia
Shigella dysenteriae.
Evaluarea riscului - un proces cu baze tiinifice, constnd din patru etape: identificarea
pericolului, caracterizarea pericolului, evaluarea expunerii i caracterizarea riscului;
Fungi (ciuperci) - talofite cu celule nucleate, lipsii de orice fel de pigmeni asimilatori i
plastide, cu nutriie heterotrof si nmulire vegetativ, asexuat sau sexuat.
Germeni (microorganisme) - fiine unicelulare sau chiar subcelulare, microscopice, ce
triesc n sol, aer, ap, organisme vegetale sau animale, ca saprofite, condiionat-
patogene i patogene.
Gestiunea riscului - procesul, diferit de evaluarea riscului, de apreciere a politicilor
alternative prin consultarea prilor interesate, lund n considerare evaluarea riscului i
ali factori legitimi i, dac este necesar, selectnd opiunile de prevenire i control
adecvate;
Microorganisme - bacterii, virusi, drojdii, mucegaiurii, alge, protozoare parazitice,
helminti paraziti microscopici si toxinele si metabolitii acestora ;
Monitorizare - realizarea de observaii sau msuri planificate secvenial, cu scopul de a
obine o evaluare general a nivelului de conformitate cu legislaia n domeniul hranei
pentru animale sau cu legislaia n domeniul alimentelor, cu regulile de sntate i
bunstare a animalelor; (Articolul 2(8) al Regulamentului (CE) nr. 882/204);
Mucegaiuri - ciuperci saprofite sau parazite care se dezvolt pe suprafaa unui substrat
organic sub forma unui strat pslos i care provoac degradarea mediului pe care se
dezvolt.
108
Neconformitate nendeplinirea unei cerine (SR EN ISO 9000:2006, Sisteme de
management al calitii. Principii fundamentale i vocabular);
Legislaie n domeniul alimentelor - legi, alte acte normative, precum i prevederi
administrative ce reglementeaz alimentele, n general, i sigurana alimentelor, n special,
inclusiv reziduurile i contaminanii prezeni n alimente i n hrana pentru animale, i se
aplic n toate etapele de producere, prelucrare i distribuie a alimentelor, precum i a
hranei pentru animale, produs sau utilizat pentru animalele destinate producerii de
alimente; (Articolul 3(3) al Regulamentului (CE) nr. 178/2002);
Lot un grup sau o serie de produse identificabile obnute n urma unui anumit proces n
condiii practic identice i produse ntr-un anumit loc n cadrul unei perioade de producie
determinate; (Articolul 2(e) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Omogenitate - un lot este omogen raportat la o caracteristic dat, dac caracteristica
este uniform distribuit n intreg lotul n conformitate cu o regul de probabilitate dat.
Dac un lot este omogen pentru o caracteristic dat aceasta nu inseamna c valoarea
caracteristicii este aceeai n ntreg lotul. Un lot este neomogen raportat la o caracteristic
dat dac caracteristica nu este uniform distribuit n ntreg lotul. Unitile dintr-un lot pot fi
omogene pentru o caracteristic n timp ce pentru alt caracteristic pot fi neomogene;
(CAC/GL 50-2004);
Operator cu activitate n domeniul alimentar - persoan fizic sau persoan juridic
ce rspunde de ndeplinirea cerinelor legislaiei n domeniul alimentelor n ntreprinderea
cu profil alimentar aflat sub controlul acesteia; (Articolul 3(3) al Regulamentului (CE) nr.
178/2002);
Pericol - un agent biologic, chimic sau fizic aflat n alimente, avnd potenialul de a cauza
un efect negativ asupra sntii;
Plan de prelevare reprezint o procedur planificat care permite s se aleag, sau s
se preleveze probe separate dintr-un lot, pentru a obine informaiile dorite, cum ar fi o
decizie referitoare la starea de conformitate a lotului. Un plan de prelevare este o schema
care definete numrul de uniti ce trebuie colectate i numrul de uniti neconfirmate
cerute intr-o prelevare pentru a evalua starea de conformitate a lotului. (CAC/GL 50-2004).
Prelevarea - procedura utilizat pentru obinerea sau constituirea unei probe;
Proba - un set compus din una sau mai multe uniti sau dintr-o poriune a unei materii,
selectate prin diferite mijloace dintr-o populatie sau dintr-o cantitate important de materie
i avnd ca scop furnizarea de informaii cu privire la o anumit caracteristic a populaiei
sau a materiei studiate i oferirea unei baze pentru o decizie cu privire la populaia n
cauz sau la materia n cauz sau cu privire la procesul din care a rezultat; (Articolul 2(j) al
Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Proba elementara - cantitatea de material prelevata dintr-un singur punct al lotului.
Proba global - totalul combinat al tuturor probelor elementare prelevate din lot.
Proba de laborator - parte din proba global, destinat examenului de laborator.
Proba reprezentativ o proba n care se pstreaz caracteristicile lotului din care a
fost prelevat. Acesta este cazul n special atunci cnd oricare dintre articolele sau
prelevrile elementare din lot este caracterizat de acelasi grad de probabilitate de a face
parte din prob; (Articolul 2(k) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Respectarea criteriilor microbiologice obinerea rezultatelor satisfctoare sau
109
acceptabile atunci cnd se testeaz valorile stabilite pentru aceste criterii prin prelevarea
de probe, efectuarea de analize i aplicarea de msuri corective, n conformitate cu
legislaia n domeniul alimentar i cu instruciunile date de ctre autoritile competente;
(Articolul 2(l) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Risc - probabilitatea apariiei unui efect nociv pentru sntate, precum i severitatea
acestui efect, ca urmare a expunerii la un pericol; Articolul 3(9) al Regulamentului (CE) nr.
178/2002);
Stafilococi - bacterii de form sferic (coci), grupate sub form de ciorchini, care se
coloreaz Grampozitiv, imobile, ncadrate n Genul Staphylococcus din familia
Micrococcaceae, strict aerobe sau anaerobe, catalazo-pozitive, saprofite i patogene
(produc procese purulente locale (abcese) sau generalizate (septicemii).
Supraveghere - examinare atent a uneia sau mai multor ntreprinderi cu activitate n
domeniul alimentar i ntreprinderi cu activitate n domeniul hranei pentru animale, a
operatorilor cu activitate n domeniul hranei pentru animale sau a operatorilor cu activitate
n domeniul alimentar ori a activitilor acestora; (Articolul 2(9) al Regulamentului (CE) nr.
882/204);
Transport - o cantitate de produse livrate n acelasi timp. Poate fi format fie dintr-o
poriune a unui lot, fie dintr-un grup de mai multe loturi. In cazul inspeciei statistice, pentru
interpretarea rezultatelor se va considera transportul ca un lot nou. Dac transportul este o
poriune a unui lot, fiecare poriune este considerat ca un lot, n vederea inspeciei; Dac
transportul este un grup de mai multe loturi, naintea oricrei inspecii, se va avea n
vedere omogenitatea transportului. Dac nu este omogen, poate fi utilizat o prelevare
stratificata; (CAC/GL 50-2004);
Trasabilitate - capacitatea de a depista i a urmri anumite alimente, un animal de la
care se obin produse alimentare sau o substan destinat ncorporrii sau care este de
ateptat s fie ncorporat n anumite alimente, pe parcursul tuturor etapelor de producie,
prelucrare i distribuie;
Unitati ale produselor alimentare - un obiect concret sau conventional pe care se pot
face o serie de observaii i care este prelevat, pentru a forma o prob; cantitatea de
material prelevat o dat dintr-o cantitate mai mare de material pentru a forma o prob;
(CAC/GL 50-2004); Nota: termenii individ, element si unitatesunt sinonime;
Valabilitate - perioada corespunzatoare celei anterioare a se consuma inainte de sau
durabilitatea minima, definita in Articolul 9 si 10 al Directivei 2000/13/CE.
110
Bibliografie
Bacterial Nomenclature up to date (Approved lists, validation lists), April 2012.

Compiled by Leibniz Institute DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroornismen und
Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany.
Antoniu Silvia, 2010. Verificarea eficienei decontaminrii suprafeelor n domeniul
sanitar veterinar. Instruire IDSA.
Brzoi D., Meica S., Negu M. 1999. Toxiinfecii alimentare. Editura Diaconu Coresi,
Bucureti.
Brzoi D., Apostu S., 2002. Microbiologia produselor alimentare. Editura Risoprint, Cluj
Napoca.
Enache T., Paul I., Snescu V., Popescu O., Iordache I.,1994. Medicin Legal
Veterinar. Editura ALL Bucureti.
Ivana Simona 2007. Microbiologie Medical Veterinar, Vol I. Editura tiinelor Medicale.
Ivana Simona, 2007. Microbiologie Medical Veterinar, Vol II. Editura Asclepius.
Mateescu C., Nicolae I., Negu Lucia, Bluc N., Onac N., Nicolae F., 2006. Tratat de
Siguran Alimentar. Editura Biotera Bucureti.
One E., Constantinescu Virginia, 1978. Diagnosticul de laborator n medicina
veterinar. Editura Ceres
Savu C., 2002. Igiena i controlul produselor de origine animal. Editura Semne E,
Bucureti.
Savu C., Georgescu Narcisa, 2004. Sigurana Alimentelor. Editura Semne E, Bucureti.
Savu C. 2008. Igiena i controlul produselor de origine animal. Editura Semne.
Savu V. 2012. Metoda recuperrii pe mediu solid pentru izolarea i cuantificarea
enterococilor din brnzeturi. Revista Romn de Medicin Veterinar , Vol. 22, nr. 1/2012.
tirbu C., Turcu D., 1999. Noiuni de bacteriologie. Editura Brumar Timioara.
Turcu D., 2005. Virusologie Lucrri aplicative. Editura Fundaiei Romnia de
Mine. Turcu D., 2007. Bacteriologie General. Editura Fundaiei Romnia de
Mine.
Turcu D., 2004. Bacteriologie Lucrri aplicative. Editura Fundaiei Romnia de Mine.
Ordinul 13..............................
Ordinul ANSVSA nr. 43/2012. Norme metodologice de aplicare a Programului aciunilor
de supraveghere, prevenire, control i eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile
de la animale la om, protecia animalelor i protecia mediului, de identificare i
nregistrare a bovinelor, suinelor, ovinelor i caprinelor pentru anul 2012
din 15 noiembrie 2005 privind
Regulamentului (CE) nr. 2073 / 2005 criteriile
microbiologice pentru produsele alimentare publicat n Official Jurnal of the European
Union. Realizat la Brussels, la 15 Noiembrie 2005.
Procedur ANSVSA privind prelevarea probelor.
Regulamentul (CE) Nr.2074/2005 al Comisiei din 5 decembrie 2005 de stabilire a
msurilor de aplicare privind anumite produse reglementate de Regulamentul (CE) nr.
853/2004 al Parlamentului European i al Consiliului i organizarea unor controale oficiale
prevzute de Regulamentele (CE) nr. 854/2004 al Parlamentului European i al Consiliului
i (CE) nr. 882/2004 al Parlamentului European i al Consiliului, de derogare de
111
la Regulamentul (CE) nr. 852/2004 al Parlamentului European i al Consiliului i de
modificare a Regulamentelor (CE) nr. 853/2004 i (CE) nr. 854/2004
Regulamentul (CE) nr. 1441/2007 al Comisiei din 5 decembrie 2007 de modificare a
Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele
alimentare.
112

Proceduri de Expertizare Master

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proceduri de Expertizare Master

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proceduri de expertizare prin examene de laborator pentru produsele agricole i alimentare - Curs

Numrul Denumire Pag.

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI

Standardul stabilete o metod orizontal pentru enumerarea microorganismelor

Mediu de cultur PCA Pulbere deshidratat

Mediu de cultur PCA determinare pH

Distribuie - se repartizeaz mediul n eprubete, n cantiti de 12 - 15 ml/ eprubet,

Mediu de cultur PCA

Probe de lapte materie prim care urmeaz

Pregtirea eantionului pentru analiz i a diluiei iniiale

9ml 9ml 9ml 9ml

Diluia 10-1 10-2 10-3 10-4

Prin operaia de diluie n tuburile cu diluii se vor obine cantitile de prob

Se amestec atent inoculul cu mediul prin rotirea plcii Petri i se las

Introducerea plcilor n incubator

Colonii care s-au dezvoltat Numrtor de colonii

unde; C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute

Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative. Ca rezultat se ia

C 168 + 215 + 14+ 25 422

Cazul 2. Rezultate cu un numr de germeni peste 300.000/ml

Cazul 3. Rezultate cu un numr de germeni peste 500.000/ml

560 490 58 52 1160

Cazul 4. Rezultate cu un numr de germeni peste 700.000/ml

760 700 77 68 1605

Cazul 5. Rezultate cu un numr de germeni peste 1.000.000/ml

DETERMINAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES

Listeria monocytogenes, reprezint specia de interes pentru microbiologia

2. Faza de mbogire selectiv Din cultura cu mediu demifraser

Mediu Oxford Mediu Palcam

Interpretarea - Dup incubare, cutiile Petri nsmnate, se examineaz i se rein cele

Listeria - agar nutritiv Listeria bulion

1. Mobilitate - Examen microscopic- ntre lam i lamel; Examen cultural n

2. Reacia catalazei - O ans de cultur se introduce ntr-o pictur de

3. Testul hemolizei - Pe agar cu snge se striaz o ans bacteriologic din

4. Fermentarea hidrailor de carbon (glucoz, manit, xiloz i

Fermentaia hidrailor de carbon MIU (stnga i TSI mijloc)

5. Reacia MR/VP- se folosete mediu Clarc i reacia este pozitiv

Difereniere diferitelor serotipuri n funcie de rezultatele examenelor

Testul biochimic L. L. L. L. L. L. L.mu

Aparatur i sticlrie folosit:

2. mbogire n medii selective lichide: Mediul Rappaport-Vassiliadis cu soia (bullion

Mediu Rappaport Vasilliadis Mller Kauffman

3. Izolare i identificare: din culturile obinute n urma inoculrii RVS i MKTTn, se

Mediu XLD Mediu Rambach

Muler - Kaufman Mediu cromogen

Bulion nutritiv - Salmonella Agar nutritiv colonii de Salmonella

TSI TSI cu producie de gaz

Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roie) cu formare de

Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei

Testul indolului indol negativ Testul indolului indol pozitiv

Reacia de aglutinare rapid , pe lam cu ser polivalent anti- Salmonella

Fermentarea biochimic a zaharurilor

Testarea sensibilitii la substane antiinfecioase

Apa peptonata tamponata

Incubare (9,2) timp de 18 h

0,1 ml cultura 1 ml cultura

10 ml bullion RVS 10ml bullion MKTTNn

Alte posibiliti de diagnostic

Metoda orizontal pentru numrarea stafilococilor coagulaz-

Stabilete metoda orizontal pentru numrarea stafilococilor coagulaz - pozitivi

Stafilococ coagulaz pozitiv Stafilococ necoagulaz pozitiv

Coloniile atipice sunt formate n principal de tulpini de stafilococi coagulaz-pozitivi.

Testul coagulazei pozitiv