Controlul Produselor Agroalimentare

Controlul produselor agroalimentare de origine vegetală - Lucrări practice
Manuela GHERGHEL
CONTROLUL PRODUSELOR AGROALIMENTARE

DE ORIGINE VEGETALĂ
LUCRĂRI PRACTICE
1
2020
CUPRINS
Numărul Conţinutul Pag.

lucrărilor
practice
1 Prelevarea probelor de produse alimentare de origine vegetală în 3
vederea expertizării prin examene de laborator
2 Determinarea Numărului Total de Germeni din produsele 14
alimentare de origine vegetală
3 Determinarea germenilor din genul Salmonella din produsele 23
alimentare de origine vegetală
4 Detectarea drogdiilor şi mucegaiurilor 30
ISO 21527-1 din produsele agroalimentare de origine vegetală
5 Determinarea Listeriei monocytogenes din produsele alimentare 35
de origine vegetală
6 Determinarea micotoxinelor prin metoda imunoenzimatică ELISA 44
7 Determinarea metalelor grele prin SAA din produse alimentare 49
Bibliografie 56
2
LABORATOR NR. 1
PRELEVAREA PROBELOR DE PRODUSE ALIMENTARE ÎN

VEDEREA TESTĂRII MICROBIOLOGICE
Prelevarea de probe în vederea testării microbiologice presupune parcurgerea

mai multor etape: organizarea şi desfăşurarea activităţilor de prelevare, transport şi
păstrarea/ depozitarea probelor în vederea testării microbiologice. Examinarea probelor
permite interpretarea rezultatelor analizelor microbiologice, cu verificarea conformităţii
alimentelor cu cerinţele microbiologice.
Procedura de prelevare
Presupune alegerea unei probe (sau a mai multor probe) dintr-un lot, inspecţia şi
analiza probelor şi clasificarea lotului ca fiind „acceptabil sau „inacceptabil” pe baza
rezultatelor inspecţiei sau analizei probelor.
Trebuie luate toate masurile necesare pentru a se asigura că proba prelevată este
reprezentativă pentru transport sau lot. Dacă un transport este format din mai multe
loturi, trebuie prelevate probe reprezentative pentru fiecare lot.
Scopul prelevarii
Situaţiile în care este necesar examenul sanitar veterinar de laborator sunt
următoarele:
 verificarea conformităţii cu criteriile stabilite în Regulamentul (CE) nr.
2073/2005;
 verificarea siguranţei microbiologice a alimentelor pentru care nu sunt stabilite
criterii microbiologice la nivel comunitar;
 obţinerea de informaţii generale despre starea microbiologica a anumitor
produse puse pe piaţă;
 identificarea şi obţinerea de informaţii cu privire la pericole noi sau pericole
microbiologice emergente, generând date pentru analiza şi evaluarea riscului;
 monitorizarea atentă a unuia sau mai multor operatori din domeniul alimentar
prin verificarea implementării procedurilor bazate pe principiile HACCP şi/sau
sistemul lor de management al siguranţei alimentelor;
 pentru controlul periodic în unităţile care produc, proceseaza, depozitează,
manipuleaza, transporta şi valorifica produse alimentare de origine
nonanimală, în scopul verificării respectării condiţiilor de salubritate şi calitate,
în conformitate cu reglementările în vigoare;
3
 la produsele destinate exportului, când eliberarea certificatului sanitar
veterinar este condiţionată de efectuarea examenului de laborator;
 la produsele importate în conformitate cu reglementările în vigoare;
 în situaţia în care prin examenul organoleptic nu se poate preciza dacă
produsele controlate sunt bune pentru consum;
 ori de câte ori produsele sunt suspecte de alterare;
 când există suspiciunea contaminării produselor în timpul preparării,
manipulării, depozitării, transportului sau desfacerii lor de către persoane
bolnave sau suspecte de boli transmisibile sau de către persoane purtătoare şi
eliminatoare de germeni patogeni;
 în cazurile când produsele sunt suspectate în declanşarea unor toxiinfecţii
alimentare la om;
 în cazuri de reclamaţii, litigii, expertize sau contraexpertize;
 ori de câte ori medicul veterinar sau alte autorităţi abilitate consideră necesar.
Prelevarea şi testarea oficiala reprezintă o parte a procesului de verificare
efectuat de către ANSVSA. Verificarea conformităţii cu criteriile stabilite în Regulamentul
(CE) nr. 2073/2005 se poate efecua prin audituri, inspecţii, monitorizări, supravegheri,
prelevare şi testare.
Pentru verificarea implementării de către operatorii din domeniul alimentar a
procedurii/procedurilor bazate pe principiile HACCP şi a bunelor practici de igienă se va
realiza o evaluare a caracterului adecvat al schemelor de prelevare şi testare ale
acestora, verificând buletinele de analiza obţinute în urma testării şi evaluând dacă
acţiunile preventive şi corective intreprinse sunt adecvate.
Operatorii din domeniul alimentar realizează prelevări şi testări, în cadrul
procedurilor lor bazate pe principiile HACCP şi/sau sistemului lor de management al
siguranţei alimentelor, pentru a demonstra conformitatea cu R (CE) nr. 2073/2005.
Reguli pentru prelevarea de probe
 Pentru examenul de laborator se recoltează probe reprezentative în unităţi care
produc, procesează, depozitează, manipulează, transportă şi valorifică produse
alimentare;
 Probele pot să fie recoltate de către: medici veterinari oficiali în cadrul Programului
acţiunilor de supraveghere; medici veterinari oficiali de la agenţi economici; agenţi
economici pentru autocontrol; alte organizaţii (OPC, MI, MAN, etc ); persoane fizice
sau juridice pentru expertiză şi contraexpertiză; etc.
 Înainte de recoltarea probelor, medicul veterinar oficial trebuie să se informeze
amănunţit asupra originii produsului, data fabricării, condiţiile de fabricare,
depozitare, manipulare, transport sau desfacere, rezultatul controalelor sau
analizelor de laborator efectuate până la acea data, aspectul general al produsului
sau lotului, starea ambalajului, modul de etichetare sau ştanţare, dacă se află în
termenul de valabilitate.
 Probele trebuie sa fie reprezentative şi să fie adecvate examenului solicitat. Pentru
examenul microbiologic se vor folosi instrumente sterilizate şi se vor ambala în
4
recipiente sterilizate sau în pungi de polietilenă de uz alimentar. Pentru recoltarea
fiecărei probe se vor folosi alte instrumente sterilizate. Recoltarea succesivă a mai
multor probe trebuie să se facă în aşa fel încât sa nu se amestece părţi din acestea
sau sa nu se contamineze între ele.
 După recoltare, fiecare probă se va individualiza prin etichetare. Eticheta trebuie să
conţină următoarele elemente: nr. proces verbal de prelevare; nr. probă (în situaţia
în care se întocmeşte un singur proces verbal de prelevare pentru mai multe
probe); tip probă; nr. lot; data şi ora efectuării prelevării; locul de prelevare;
temperatura probei; numele inspectorului; numele martorului.
Probele se ambalează separat în aşa fel încât să nu se deterioreze în timpul
transportului, se sigilează pentru a nu face posibilă substituirea produsului. Numărul
sigiliului aplicat va fi menţionat în procesul verbal de recoltare probe. Probele
trebuie să fie ambalate în aşa fel încât să se prevină eventuala lor substituire,
contaminare sau degradare a probelor. Probele recoltate se trimit la laborator pe
cheltuiala proprietarului. Ele trebuie transportate la laborator în timp util, în aşa fel
încât acestea sa îşi păstreze nemodificaţi parametrii de integritate.
 La prelevarea probelor se întocmeşte un proces verbal de recoltare care va fi
semnat de medicul veterinar oficial care recoltează proba/probele, contrasemnat de
un reprezentant legal al unităţii asupra căreia se află în gestiune sau proprietate
produsul. În cazul în care reprezentantul unităţii refuză să semneze, procesul verbal
de recoltare poate fi semnat numai de medicul veterinar oficial şi de un martor.
Procesul verbal se întocmeşte în trei exemplare, din care primul va însoţi probele
expediate la laborator, al doilea va rămâne la medicul veterinar oficial care a
efectuat recoltarea, iar cel de al treilea va rămâne la unitatea deţinătoare a
produsului.
 După fiecare procedură de recoltare a probelor se va întocmi un proces verbal de
recoltare, avându-se în vedere următoarele: denumirea şi adresa autorităţii
competente care a efectuat recoltarea; numele specialistului sau codul de
identificare; codul (numărul) oficial al probei; data recoltarii; numele şi adresa
proprietarului sau persoanei care are în păstrare produsele de origine animala;
numărul de autorizare al unităţii; identificarea animalului (număr matricol) sau
produsului respectiv (număr lot-şarja); specia şi vârsta animalului; proba
(matricea/substrat) respectivă; medicaţia folosită pe perioada de 4 săptămâni
înaintea recoltarii probelor (în cazul în care prelevarea se face de la fermă);
examenele solicitate; motivele cererii de analiză şi explicaţii care ar putea orienta
cercetările, menţiuni speciale - date suplimentare (ca de exemplu: destinaţia
produsului, condiţiile de păstrare a produsului până la primirea buletinului de
analiză şi altele). Pentru produsele procesate, în lipsa standardelor naţionale,
eşantioanele vor fi însoţite de fişa tehnică a produsului. Pentru produse provenite
din import, eşantioanele vor fi însoţite de fişa tehnică a produsului.
Comercianţii din sectorul alimentar stabilesc frecvenţele adecvate de prelevare, cu
excepţia cazului în care anexa I a Regulamentului (CE) nr. 2073 / 2005 prevede frecven ţe
5
specifice de prelevare, caz în care frecvenţa prelevării de probe va fi cel puţin cea
prevăzută în anexă. Comercianţii din sectorul alimentar iau această decizie în contextul
procedurilor bazate pe principiile HACCP şi pe bună practică de igienă şi ţinând seama de
instrucţiunile privind utilizarea produselor alimentare.
Frecvenţa prelevării de probe se poate adapta în funcţie de natura şi mărimea
întreprinderilor din sectorul alimentar, cu condiţia ca siguranţa produselor alimentare să nu
fie pusă în pericol. Pentru aceste prelevări de probe, standardul ISO 18593 se foloseşte ca
metodă de referinţă.
Numărul de unităţi (care constituie o probă), trebuie prelevate în conformitate cu
planurile de prelevare de probe stabilite în anexa I a Regulamentului (CE) nr. 2073 / 2005,
acesta putând fi redus în cazul în care comerciantul din sectorul alimentar poate
demonstra, pe baza rezultatelor anterioare, că dispune de proceduri eficiente bazate pe
HACCP.
Produsele necorespunzătoare nu se reexaminează din punct de vedere
microbiologic. Destinaţia produselor din care s-au prelevat probe reprezentative pentru
examenul de laborator va fi stabilită de medicul veterinar oficial care a efectuat recoltarea
acestora, coroborând datele oferite de examenul de laborator, respectiv buletinul de
analiză, cu toate datele menite să contribuie la luarea unei decizii în condiţiile legii.
Norme de recoltare pentru examenul microbiologic
Recoltarea de probe se efectuează în scop bine determinat în cadrul controlului
oficial şi autocontrol, în vederea verificării siguranţei produsului şi a conformităţii
alimentului cu criteriile de siguranţă prevăzute în Regulamentul (CE) nr. 2073/2005, cu
amendamentele ulterioare, după cum urmează: verificarea siguranţei produsului şi
respectiv, a conformităţii alimentului din punct de vedere microbiologic cu criteriile de
siguranţă prevăzute în Regulamentul (CE) nr. 2073/2005, cu amendamentele ulterioare;
verificarea siguranţei produsului şi respectiv, a conformităţii alimentului din punct de
vedere microbiologic cu criteriile de siguranţă care nu sunt prevăzute de legislaţia
comunitară, dar care sunt cuprinse în legislaţia naţională; obţinerea de informaţii privind
statusul microbiologic a unor alimente comercializate pe piaţă; verificarea sistemului de
proceduri şi programe implementate de către operatorii cu activitate în domeniul alimentar
în vederea asigurării siguranţei alimentelor (proceduri de bune practici de igienă şi
producţie, program HACCP, sistem de trasabilitate, proceduri de retragere/rechemare,
evitarea contaminării încrucişate şi/sau a contaminăriii post - tratament termic); verificarea
conformităţii alimentului/ lotului/ loturilor suspicionate; dezvoltarea investigaţiilor în cursul
anchetelor de toxiinfecţii alimentare, reclamaţiilor, sesizărilor; obţinerea de informaţii cu
privire la noi hazarde, rezultate în urma evaluării riscului.
Recoltarea de probe de către autoritatea sanitară veterinară locală se realizează
planificat în baza unei strategii stabilite de către DSVSA. În stabilirea strategiei de
recoltare DSVSA trebuie să ţină cont de următoarele principii de recoltare randomizată şi
reprezentativă pentru lot;
 recoltare selectivă – când se adresează unor categorii de alimente cu risc înalt
(în baza informaţiilor, investigaţiilor şi a experienţei anterioare);
6
 recoltare în caz de suspiciune – care se bazează pe o analiză şi o experienţă
privind lotul şi circumstanţele recoltării (de exemplu, recoltarea efectuată ca parte
a investigaţiei în focarele de TIA, sau în timpul unei evaluări a programului
HACCP în urma cărora se constată deficienţe care afectează siguranţa
produsului).
În scopul obţinerii de date relevante, al monitorizării şi al supravegherii
corespunzătoare a riscului microbiologic pe întreg lanţul alimentar, DSVSA trebuie să
ţină cont în elaborarea strategiei de recoltare, ca frecvenţa şi procedura de recoltare să
se aleagă în funcţie de tipul de microorganism sau toxină şi tipul de aliment implicat
(perisabil, stabil).
Operatorii din domeniul alimentar trebuie sa decidă asupra graficului de prelevare
a probelor, cu excepţia prevederilor regulamentelor europene unde este specificată
frecvenţa de prelevare a acestora. Ei trebuie sa realizeze acest lucru în contextul
procedurilor bazate pe principiile HACCP şi bunei practici de igienă. Frecvenţa prelevării
se poate adapta la natura şi mărimea unităţii producătoare cu condiţia ca siguranţa
produselor alimentare să nu fie periclitată. (71)
Activităţi preliminare. Pregătirea prelevării
Anterior desfăşurării activităţii de prelevare oficială a probelor în vederea testării
lor microbiologice, inspectorul are în vedere asigurarea următoarelor dotări necesare:
 documentele necesare: Procesul verbal de prelevare, Cererea de analiză,
Eticheta probei;
 echipamentul individual de protecţie;
 echipamentele şi instrumentele sterile pentru prelevare;
 recipiente sterile pentru prelevare şi transportul probelor;
 echipamente de măsură şi control – termometru verificat metrologic;
 lăzi frigorifice - ambalaje pentru transportul probelor, care să asigure temperatura
de conservare a acestora până la laboratorul de destinaţie, precum şi condiţii de
transport pentru ca proba să nu fie deteriorată, sigiliul să rămână intact.
Prelevarea probelor în cadrul controlului oficial se face în mod obligatoriu de
catre inspectorul oficial (ANSVSA), în prezenţa operatorului sau a unui reprezentant
legal al acestuia (un martor).
Metode de prelevare
Se aplică metode de prelevare distincte, în funcţie de tipul probei prelevate:
 probe de produse alimentare şi apă;
 teste pentru verificarea eficienţei operaţiunilor de igienizare, dezinfecţie şi
curăţenie.
Probele prelevate în vederea testării microbiologice trebuie să fie predate
laboratorului specializat în cel mai scurt timp posibil, astfel încât să nu depăşească 24
ore din momentul prelevării (ora prelevării va fi înregistrată pe procesul verbal de
recoltare şi pe eticheta probei).
Responsabilitatea respectării acestei prevederi este a inspectorului care
realizează prelevarea.
7
Probele primite în laboratorul specializat în vederea testării microbiologice se
introduc în lucru în cel mai scurt timp posibil, cu precizarea că intervalul maxim este de
24 ore de la momentul primirii, respectiv maximum 48 ore din momentul prelevării lor.
Responsabilitatea respectării acestei prevederi este a laboratorului specializat care
realizează testarea microbiologică.
Tehnici de prelevare pentru diferite produse alimentare
Metodele de prelevare diferă în funcţie de materialul ce trebuie să fie prelevat (ex
apa, produse alimentare solide, lichide, vrac sau preambalate). Dacă probele nu sunt
luate în ambalajul final, atunci trebuie să se utilizeze tehnici aseptice de prelevare.
Proba primara - este porţiunea de produs colectată dintr-un lot în prima etapa a
procesului de prelevare si este denumită „unitate”. Atâta timp cât este posibil, probele
primare trebuie luate de peste tot din lot şi abaterile de la această cerinţă trebuie
înregistrate în Procesul verbal de prelevare.
Se colectează probe primare de dimensiuni similare şi în cantităţi suficiente,
pentru a facilita analizele de laborator. Este importantă şi imperios necesară menţinerea
măsurilor de precauţie în cursul prelevării probelor primare şi a tuturor procedurilor
ulterioare, pentru a păstra integritatea probelor (de ex., evitarea contaminării probelor,
sau altor operatiuni ce ar putea face ca proba să devină nereprezentativa pentru lotul din
care a fost prelevată).
Proba finală - dacă este posibil, proba rezultată în urma alăturării unităţilor, trebuie
să formeze proba finală şi trebuie să fie trimisă la laborator pentru analize.
Proba de laborator - trebuie sa fie păstrată în aşa fel încât caracteristicile
controlate să nu fie
modificate; este obligatorie utilizarea de echipamentele şi instrumentele sterile
pentru prelevare; recipiente sterile pentru prelevare şi transportul probelor.
Produse alimentare ambalate individual
A. Produse în stare solidă
În cazul produselor alimentare în stare solidă ambalate individual, unitatea ( n)
este reprezentată de un produs aflat în ambalajul propriu.
Unităţile (n) se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale lotului, numărul acestora
fiind dat de Planul de prelevare aplicat. Dimensiunea unităţii (n) este cuprinsă între 250 g
şi 500 g şi va fi consemnată în Procesul verbal de prelevare. Fiecare unitate de produs
va fi identificată unic şi clar prin numerotare.
În cazul unităţilor de produs ambalate individual, cu masa mai mică decât 250 g,
unitatea va fi constituită din mai multe ambalaje individuale, astfel incât
cantitatea/unitatea să aibă minimum 250 g. În cazul unităţilor de produs ambalate
individual, cu masa mai mare decât 500 g, unitatea va fi constituită din unitatea de
produs ambalată individual utilizănd o metodă de reducere adecvată, astfel încât
cantitatea/unitatea să aibă minimum 250 g.
Totalul unităţilor de produs prelevate constituie proba finală, care se ambalează şi
sigilează, numărul sigiliului fiind consemnat în Procesul verbal de prelevare.
B. Produse în stare lichidă
8
În cazul produselor alimentare în stare lichidă ambalate individual, unitatea ( n)
este reprezentată de un produs aflat în ambalajul propriu.
Unităţile se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale lotului, numărul acestora
fiind dat de planul de prelevare aplicat.
Dimensiunea unităţii este cuprinsă între 250 ml şi 500 ml şi va fi consemnată în
Procesul verbal de prelevare . Fiecare unitate de produs va fi identificată unic şi clar
(individualizată prin numerotare).
În cazul unităţilor de produs ambalate individual, cu masa mai mică de 250 ml,
unitatea va fi constituită din mai multe ambalaje individuale, astfel incat cantitatea/unitate
sa aibă minimum 250 ml. În cazul unităţilor de produs ambalate individual, cu masa mai
mare decât 500 ml, unitatea va fi constituită din unitatea de produs ambalată individual
utilizănd o metodă de reducere adecvată, astfel incat cantitatea/unitate sa aibă minimum
250 ml.
Totalul unităţilor de produs prelevate constituie proba finală, care se ambalează şi
sigilează, numărul acestuia fiind consemnat în Procesul verbal de prelevare.
Produse alimentare vrac
A. Produse în stare solidă
În cazul produselor alimentare în stare solidă neambalate (vrac), unitatea ( n) este
reprezentată de cantitatea de produs prelevată o dată cu echipamentul special de
prelevare, din masa produsului.
Unităţile se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale lotului, numărul acestora fiind dat
de planul de
prelevare aplicat.
Dimensiunea unităţii este cuprinsă între 250 g şi 500 g şi va fi consemnată in
Procesul verbal de prelevare. Fiecare unitate de produs va fi prelevată în ambalaj
corespunzător, (de ex. ambalaj de uz alimentar, la prima utilizare), suficient de rezistent
la rupere, individualizat unic şi clar prin numerotare.
Totalul unităţilor de produs prelevate constituie proba finală, care se ambalează,
se eticheteaza şi sigilează, numărul sigiliului fiind consemnat în Procesul verbal de
prelevare.
B. Produse în stare lichidă
În cazul produselor alimentare în stare lichidă neambalate (vrac), unitatea ( n) este
reprezentată de cantitatea de produs prelevată o dată cu echipamentul special de
prelevare, din volumul produsului. Unităţile se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale
lotului, numărul acestora fiind dat de planul de prelevare aplicat.
Dimensiunea unităţii este cuprinsă între 250 ml şi 500 ml şi va fi consemnată in
Procesul verbal de prelevare. Fiecare unitate de produs va fi prelevată în ambalaj
corespunzător, respectiv flacoane de prelevare sterile, etanşe, suficient de rezistente,
individualizate unic şi clar prin numerotare,. Totalul unităţilor de produs prelevate
constituie proba finală, care se ambalează şi sigilează, numărul acestuia fiind consemnat
în Procesul verbal de prelevare.
Ambalarea si transportul probelor către laborator. Păstrarea şi înregistrarea
probelor
9
După prelevare, fiecare probă se indentifică unic prin etichetare, se ambalează
separat, se ambalează în recipiente inerte şi curate, care să confere protecţie adecvată
împotriva contaminării externe şi deteriorării probei în timpul transportului. Ulterior,
probele se sigilează în aşa fel încât deschiderile neautorizate sa fie detectabile (pentru a
nu fi posibilă substituirea produsului sau contaminarea lui). Numărul sigiliului aplicat va fi
menţionat în Procesul verbal de prelevare.
Proba finală (de laborator) este trimisă la laborator cat mai curand posibil, luând
toate măsurile necesare de precauţie împotriva scurgerilor sau alterării (de ex.,
alimentele congelate trebuie păstrate congelate, cele perisabile trebuie păstrate reci sau
congelate, după caz).
Pentru produsele refrigerate proaspete foarte perisabile sunt necesare
următoarele indicaţii suplimentare: trebuie evitate temperaturile de congelare în timpul
transportului şi depozitării; alimentele preambalate trebuie să fie depozitate la sau sub
temperatura de depozitare indicată pe
eticheta produsului.
În lipsa unor menţiuni existente pe eticheta produsului privind condiţiile de
transport şi păstrare a probelor de produse alimentare, se recomandă ca pe perioada
transportului şi păstrarii probelor până la analizarea lor să se asigure: temperatura probei
finale (de laborator) – menţinută în regimul de refrigerare (2-4ºC); materialul în care este
ambalată proba finală (de laborator)– să fie inert şi curat, să aibă facilitatea de închidere
etanşă şi de redeschidere uşoară, rezistenţă la şocuri mecanice sau alte deteriorări
intenţionate sau accidentale; introducerea în lucru a probei finale (de laborator) sosite la
laborator se va face în maximum 48 ore de la momentul prelevării.
Prelevarea probelor pentru opinii suplimentare
În conformitate cu articolul 11(5) si (6) al R (CE) nr. 882/2004, autoritatea
competenta - ANSVSA, prin reprezentanţii ei, trebuie să asigure în timpul prelevării
oficiale informarea operatorului din domeniul alimentar (sau a reprezentantului acestuia)
referitor la:
 dreptul lui de a obţine probe pentru o opinie suplimentara din partea unui expert.
Acordul OIA referitor la prelevarea/neprelevarea probei pentru opinie suplimentară
se înregistrează în Procesul verbal de prelevare; limitarea prelevărilor
suplimentare pentru analizele microbiologice. Pentru analizele microbiologice
rezultatele probelor pentru o opinie suplimentară pot avea o valoare limitată
deoarece distribuţia microorganismelor într-un aliment este adesea neomogenă.
Două probe de aliment nu vor fi la fel şi nu este neobişnuit ca rezultatele probelor
pentru controlul oficial şi cele pentru opinia suplimentară să fie diferite. De
asemenea, bacteriile pot să nu supravieţuiască sau pot uneori să se multiplice în
timpul depozitării probelor afectând din nou rezultatele probelor pentru o opinie
suplimentară.
 dreptul OIA să deţină probe pentru o opinie suplimentară poate fi restricţionat doar
dacă alimentul este foarte perisabil sau lotul este într-o cantitate insuficientă
pentru o prelevare suplimentară;
10
 condiţiile de depozitare şi transport în vederea analizării a probei suplimentare, în
cazul prelevării acesteia.
În cazul în care operatorul optează pentru existenţa probei pentru opinie
suplimentară, prelevarea acesteia trebuie făcută cu respectarea următoarelor condiţii:
 termenul de valabilitate a produsului să permită prelevarea şi păstrarea în
vederea testării microbiologice a unei probe, pentru un interval de timp mai
îndelungat;
 să existe suficient substrat pentru o prelevare suplimentară;
 prelevarea se face simultan cu cea a probei oficiale, de către aceeaşi persoană şi
aplicând aceeaşi procedură de prelevare;
 proba suplimentară, ambalată, sigilată corespunzător şi unic identificată prin
etichetare rămâne în grija şi răspunderea OIA. Pe eticheta probei suplimentar
prelevate se vor înscrie aceleaşi date ca pe cea a probei oficiale, cu menţiunea
‚Probă pentru opinie suplimentară’ . Prelevarea probei pentru opinie suplimentară
şi instruirea OIA cu privire la aceasta va fi consemnată în Procesul verbal de
prelevare.
Contraprobele
Se vor preleva concomitent cu recoltarea probelor reprezentative, recoltându-se
în aceleaşi condiţii, contraprobe la probele recoltate pentru examenul de laborator.
Contraprobele recoltate în condiţiile legii se vor depozita sub responsabilitatea
producătorului (proprietarului) în condiţii care să permită respectarea integrităţii acestora.
Numărul sigiliului contraprobei va fi precizat în procesul verbal de recoltare a probei.
Analiza contraprobelor se poate face contracost la solicitarea unităţii (proprietarului) sau
atunci când situaţia o impune.
Documente utilizate în activitatea de prelevare oficială
Documentele asociate activităţii de prelevare în cadrul controlului oficial sunt:
 Procesul verbal de prelevare şi Cererea de analiză - formulare aprobate prin
Ordinul preşedintelui ANSVSA nr. 145/2007 privind aprobarea Normei pentru
siguranţa alimentelor care stabileşte condiţiile în care se derulează operaţiunile de
import-export şi comerţ intracomunitar de produse alimentare de origine
nonanimala supuse supravegherii şi controlului pentru siguranta alimentelor;
 Eticheta probei;
 Buletinul de analiză.
Procesul verbal de prelevare
Orice act de prelevare implică întocmirea unui asemenea raport, care, pe lângă
datele de identificare ale OIA şi ale inspectorului oficial, indică în special:
 numele inspectorului oficial,
 numele martorului ( reprezentant legal al OIA),
 data şi locul prelevării,
 ora prelevării,
 motivul prelevării (control oficial, la solicitarea operatorilor),
11
 numărul sigiliului aplicat pe ambalajul probei;
 originea probei (date de identificare ale lotului/transportului: nr. lot, cantitate lot,
ţara de provenienţa, ţara de origine a produsului),
 cantitatea de probă prelevată, numărul de probe prelevate
 temperatura probei,
 temperatura la care se transportă proba către laborator,
 număr de unităţi, planul de prelevare utilizat,
 metoda de prelevare utilizată (test de sanitaţie, probă produs solid/lichid,), precum
şi alte informaţii suplimentare ce pot veni în sprijinul analistului, cum ar fi durata
(ora) şi condiţiile de transport (acestea, ca şi orice alte date suplimentare pot fi
completate la rubrica ,Menţiuni’),
 informaţii cu privire la prelevarea probei pentru opinie suplimentară (decizia OIA
de prelevare/neprelevare, instruirea OIA cu privire la condiţiile de depozitare şi
transport în vederea analizării probei, metoda de prelevare utilizată, numărul
sigiliului aplicat pe ambalajul probei). În cazul oricăror abateri de la procedura de
prelevare stabilită (când acest lucru se impune, din orice motive), la Procesul
verbal de prelevare se anexează un raport detaliat despre procedura de prelevare
care a fost aplicată, şi cauzele care au condus la neaplicarea procedurii.
Cererea de analiză
Este documentul care însoţeşte proba (probele) prelevate la laboratorul care o (le)
va analiza şi care conţine: datele de identificare a probei prelevate şi supuse analizelor
de laborator, precum şi detalii referitoare la tipul analizelor solicitate, natura eventualei
pretratări (unde e cazul, de ex. la apă); agenţii de conservare sau stabilizare folosiţi (în
cazul conservării probei).
Eticheta
Probele trebuie să fie clar (vizibil şi lizibil) şi unic identificate, prin etichetare.
Fiecare unitate ce compune proba se va identifica prin numerotare: număr de forma x / y,
unde x = numărul unităţii de probă 1, 2, 3, 4 sau 5, iar
y = numărul probei formată din x unităţi.
Ambalajul final ce reuneşte toate unităţile unei probe, va fi etichetat. Eticheta
trebuie să conţină cel puţin următoarele date: numarul probei (in situatia in care sunt
prelevate mai multe probe cu un singur proves verbal de prelevare); tipul probei (ex: apă,
alimenta gata pentru consum, legume tăiate, etc.); numărul lotului din care s-a făcut
prelevarea; numărul Procesului verbal de prelevare; data şi ora efectuării prelevării; locul
de prelevare; temperatura probei; numele inspectorului; numele martorului
Completarea Procesului verbal de prelevare şi a Cererii de analiză se face în trei
exemplare, semnate si ştampilate de părţile implicate (reprezentant autoritate,
reprezentant operator economic), iar cele trei exemplare se distribuie astfel:
 exemplarul original rămâne la inspectorul oficial şi se îndosariază în conformitate
cu procedura proprie privind controlul înregistrărilor;
 un exemplar în copie este predat operatorului;
 un exemplar în copie însoţeşte proba la laboratorul indicat în Cererea de analiză.
12
Buletinul de analiză
Buletinul de analiză este documentul emis de laboratorul care efectuează testarea
probei prelevate şi, după emitere, acesta este transmis către DSVSA judeţeană sau a
municipiului Bucureşti care a solicitat efectuarea analizelor. Buletinul de analiză
completează, alături de Procesul verbal de prelevare şi Cererea de analiză lista
documentelor întocmite cu ocazia prelevării oficiale.
Echipamente
Echipamentele utilizate în activitatea de prelevare a probelor de produse
alimentare în vederea testării microbiologice sunt: echipamentul individual de protecţie
folosit de persoana care efectuează
prelevarea, instrumente şi recipiente sterilizate folosite pentru prelevarea şi transportul
probelor la laborator.
Echipamentul individual folosit de inspectorul care realizează prelevarea probelor
trebuie să elimine riscul contaminării accidentale a probei prelevate. El include: halat,
mănuşi chirurgicale, mască
facială, bonetă (capelină), botoşi. Echipamentul individual trebuie să fie curat, să nu
contribuie la contaminarea microbiologică suplimentară a probelor prelevate.
Pentru examenul microbiologic se folosesc pentru prelevare instrumente
sterilizate, iar probele prelevate se ambalează în recipiente sterilizate (pentru unităţi) sau
în pungi de polietilenă de uz
alimentar (pentru proba finală). Pentru prelevarea fiecărei probe se folosesc alte
instrumente sterilizate. Prelevarea succesivă a mai multor probe trebuie să se facă în
aşa fel încât să nu se amestece părţi din acestea, sau să nu se contamineze între ele.
Materialele necesare prelevării probelor de apă (recipientele de recoltare) şi
placile Petri cu mediu nutritiv pentru determinări microbiologice din mediul ambiant sunt
puse la dispoziţia inspectorului de către laboratorul din cadrul DSVSA judeţene şi a
municipiului Bucureşti.
Celelalte materiale, instrumente şi ambalaje pentru unităţi/probe sunt asigurate de
către DSVSA judeţeană şi a municipiului Bucureşti, ele trebuind să fie sterile în momentul
efectuării prelevării. Pentru asigurarea transportului probelor în condiţii optime, cu
menţinerea temperaturii probelor la un nivel constant, care să nu permită se folosesc lăzi
frigorifice.
Mijloace de măsură şi control: termometru aflat în perioada de valabilitate a
buletinului de verificare metrologică.
Criterii de refuzare a probelor
Eşantioanele (probele) sunt refuzate la nivelul laboratoarelor de diagnostic în
următoarele situaţii:
 neconcordanţa înscrierilor din documentele de însoţire a probelor cu
eşantioanele trimise;
 cantitate insuficientă de probă;
 matrici necorespunzătoare pentru examenul solicitat;
13
 produse cu început de alterare sau alterate la care se solicită analiza
microbiologică;
 produse transportate necorespunzător, fără respectarea regimului termic impus
sau a altor condiţii specifice;
 probe nesigilate sau neasigurate (pentru cele venite in control oficial);
 produse cu termen de valabilitate depăşit;
 lipsa documentelor însoţitoare;
 probe dirijate greşit către un anume laborator;
 prevederi ale unor reglementări în vigoare sau note de serviciu;
 respingeri din motive speciale (condiţii epidemiologice, tehnice, etc.);
Pentru probele refuzate se va preciza motivul refuzului în registrul de probe
refuzate. Aceste probe vor fi ecarisate sau returnate prin delegat.
RESPONSABILITATI
ANSVSA: pregătirea prelevării, prelevarea probelor, transportul probelor,
completarea procesului verbal de prelevare şi a cererii de analiză, a etichetei probei ,
păstrarea înregistrărilor (procesului verbal de prelevare şi a cererii de analiză , buletin de
analiză) conform legislaţiei în vigoare, acţiunile intreprinse în cazul neconformităţilor,
păstrarea înregistrărilor acestora.
Laboratoare: recepţionarea probelor, păstrarea probelor, introducerea în lucru în
cel mai scurt timp posibil a probelor prelevate în vederea testării microbiologice, cu
precizarea că intervalul maxim este de 24 ore de la momentul primirii, respectiv
maximum 48 ore din momentul prelevării lor, păstrarea înregistrărilor (procesului verbal
de prelevare şi a cererii de analiză , buletin de analiză) conform legislaţiei în vigoare.
Orice alte acţiuni intreprinse în conformitate cu procedurile de lucru ale laboratorului
(denaturarea probelor, neanalizarea lor, etc.) sunt comunicate inspectorului oficial,
acesta informând la rândul său OIA.
Operator din Industria Alimentară (OIA) - asigură condiţii optime pentru
desfăşurarea controlului oficial respectiv acţiunea de prelevare de probe, asigură
prezenţa unui reprezentant pe durata desfăşurării controlului oficial /prelevării probelor,
păstrează proba pentru opinie suplimentară (dacă aceasta a fost prelevată) în condiţiile
specificate în procesul –verbal. În cazul unor rezultate nesatisfăcătoare iniţiază
proceduri de retragere /rechemare a produselor neconforme.
14
LABORATOR NR. 2
DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI

DIN PRODUSELE ALIMENTARE
Metodă orizonatlă pentru enumerarea microorganismelor.
Tehnică de numărare a coloniilor la 30ºC
SR EN ISO 4833/2003
Standardul stabileşte o metodă orizontală pentru enumerarea microorganismelor

prin numărarea coloniilor crescute pe unh mediu solid după incubarea aerobă la 30 ºC.
Microorganism - este o bacterie, drojdie sau colonie numărabilă formatoare de mucegai,
produsă în condiţiile menţionate în acest standard.
Produse alimentare care se examinează în vederea detectării NTG
Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile;
pulberi pentru sucuri; făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de
orez, orezin, fosfarin); ceai (plantă); produse din grâu germinat; etc.
Principiul metodei
Prepararea a două plăci turnate prin folosirea unui mediu de cultură specific şi a
unei cantităţi specificate de probă, dacă produsul iniţial este lichid sau a unei cantităţi
specificate de suspensie îniţială în cazul altor produse. Prepararea în aceleaşi condiţii, a
altei perechi de plăci turnate, folosind diluţiile decimale ale probei sau ale suspensiei
15
iniţiale. Incubarea plăcilor Petri în condiţii de aerobioză timp de 72 de ore la temperatura
de 30oC. Calcularea numărului de microorganisme pe ml sau pe g de probă din numărul
de colonii obţinute pe plăcile selectate.
Medii de cultură şi diluanţi
Medii de cultură
Compoziţie - Agar pentru numărare - PCA.
Foto nr. Mediu de cultură PCA – Pulbere deshidratată
Acesta conţine: digest enzimatic pentru cazeină 5,0g, extract de drojdie 2,5g,
glucoză anhidră (C6H12O6) 1,0g, agar 9 - 18g şi apă 100 ml. La examinarea produselor
lactate se adaugă 1,0g lapte praf degresat pe un litru de mediu de cultură. Laptele praf
degresat trebuie să nu conţină substanţe inhibitoare;
Preparare - pentru preparare în caz că se utilizează mediu complet deshidratat
disponibil comercial se respectă instrucţiunile producătorului. După preparare se necesar
să se regleze pH-ul dacă este necesar, în aşa fel încât după sterilizare să fie 7,0±0 la
25oC;
Foto nr. Mediu de cultură PCA – determinare pH
16
Distribuţie - se repartizează mediul în eprubete, în cantităţi de 12 - 15 ml/
eprubetă, sau în flacoane sau sticle cu capacitatea de până la 500 ml;
Foto nr. Mediu de cultură PCA
Sterilizare - se sterilizează la autoclav la 121oC timp de 15 minute;

Păstrare - dacă mediul se foloseşte imediat, se răceşte înainte de folosire pe o
baie de apă (aptă de a opera de la 44 - 47 oC). În caz contrar se păstrează la întuneric la
temperatura de 3±2 oC pentru maxim 3 luni, în condiţii care să nu provoace nici o
modificare a compoziţiei sau proprietăţilor. Înainte de începerea examenului
microbiologic, pentru a evita orice întârziere la turnarea mediului, înainte de folosire, se
topeşte complet mediul, apoi se răceşte pe o baie de apă între 44 - 47 oC. Pentru a
verifica temperatura mediului se recomandă să se pună un termometru într-o porţiune de
soluţie de control ce conţine 15g/l agar, într-un container separat, identic cu cel folosit
pentru mediu. Soluţia de control trebuie să fie supusă la celeaşi operaţii de încălzire şi
răcire ca şi mediul.
Aparatură şi sticlărie
 Aparat pentru sterilizare uscată (etuvă) sau umedă (autoclav);
 Incubator apt de a opera la 30o±1oC;
 Cutii Petri din sticlă sau plastic, cu diametrul de 90 - 100 mm;
 Pipete cu capacitate nominală de 1 ml;
 Baie de apă, aptă de a opera de la 44 - 47 oC;
 Echipament de numărare a coloniilor, costând dintr-o bază luminată pe un
fond întunecat, prevăzut cu lentile de mărire cu putere corespunzătoare de
circa 1,5x şi un dispozitiv de numărare mecanic sau electronic digital;
 pH- metru, avînd o acurateţe a etalonării de 0,1 unităţi de pH la 25 oC;
 Eprubete, flacoane sau sticle de capacitate corespunzătoare nu mai mare
de 500 ml.
Eşantionare
Este important ca laboratorul să primească un eşantion care este cu adevărat
reprezentativ şi care să nu fi fost deteriorat sau modificat în timpul transportului sau
depozitării.
Pregătirea probei
17
Exemple:
Lapte şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura
o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu
eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. Intervalul
dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să
depăşească 3 minute.
Lapte praf, zer dulce – se amestecă direct conţinutul recipientului închis, prin
agitări şi răsturnări repetate..Se cântăresc 10 g eşantion într-un vas de sticlă şi se
răstoarnă praful în sticlă cu soluţia de diluare (90 ml de soluţie adecvată la 45 +-1oC în
baie de apă). Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în
când. Se obţine astfel o diluţie de 10-1.
Pregătirea eşantionului pentru analiză şi a diluţiei iniţiale
Cu o nouă pipetă sterilă se introduce 1 ml din soluţia iniţială într-o eprubetă care
conţine 9 ml de soluţie diluare sterilă. Pipeta se schimbă pentru fiecare diluţie.
Diluţii decimale următoare
Prin operaţia de diluţie în tuburile cu diluţii se vor obţine cantităţile de probă
ilustrate în tabel, din care reiese că între două diluţii consecutive, diferenţa de
concentraţie este de 10 ori (diluţii decimale):
Nr. tub 1 2 3 4
Diluţia 1/10 x) 1/100 1/1000 1/10000
Cantitate (g) 0,1 0,01 0,001 0,0001
sau volum (ml)
Sau Sau Sau Sau
Din proba 10-1 10-2 10-3 10-4
iniţială pe ml
diluţie xx)
x) în cazul produselor solide sau semi-solide această diluţie se află în recipientul
omogenizatorului sau în mojar;
xx) în cazul însămânţării a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-solide (10 ml
diluţie 10-1) această cantitate se notează cu 10-0.
Inoculare şi incubare
 Se iau două cutii Petri sterile. Se transferă în fiecare cutie cu ajutorul unei
pipete sterile 1 ml probă, dacă este lichidă sau 1 ml suspensie îniţială în
cazul altor produse (dfiluţia 10-1);
 Se iau alte 2 cutii Petri sterile. Se transferă în fiecare cutie cu ajutorul altei
pipete sterile 1 ml din diluţia10 -1 (produse lichie) sau 1 ml din diluţia10 -1
(alte produse). Dacă este necesar se repetă procedura cu diluţiile
următoare, folosind o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală. Se
selectează numai etapele diluţiilor critice (cel puţin două diluţii decimale
consecutive) pentru inocularea plăcilor Petri care vor da între 15 şi 300
colonii pe placă;
18
 Se toarnă de la 12 - 15 ml agar pentru placa de numărare la 44 - 47 oC în
fiecare placă Petri. Timpul scurs între sfârşitul preparării suspensiei iniţiale
(sau a diluţiei 10-1 dacă produsul este lichid) şi momentul când mediul este
turnat în plăci nu trebuie să depăşească 45 min;
 Se amestecă atent inoculul cu mediul prin rotirea plăcii Petri şi se lasă
amestecul să se solidifice prin lăsarea plăcilor Petri pe o suprafaţă
orizontală rece;
 După solidificare completă şi numai în cazul în care se suspectează că
produsul examinat conţine microorganisme ale căror colonii pot
suprapopula suprafaţa mediului, se toarnă circa 4 ml mediu de acoperire la
44 - 47 oC pe suprafaţa mediului de inoculare. Se lasă să se solidifice pe o
suprafaţă orizontală rece;
 Se întorc plăcile pregătite cu faţ în jos şi se pun la incubator la 30 o±1oC
pentru 72h±3h. Nu se suprapun mai mult de şase plăci pe coloană.
Coloanele cu plăci trebuie să fie separate unele de altele şi de pereţii şi
partea superioară a incubatorului.
Foto nr. Introducerea plăcilor în incubator
Numărarea coloniilor
După perioada de incubare (72h±3h), se numără coloniile de pe plăci, folosind
dacă este necesar echipamentul pentru numărarea coloniilor. Se examinează plăcile în
lumină difuză. Este necesar ca coloniile mici să fie încluse în numărare, dar este esenţial
ca operatorul să evite confundarea particulelor înşelătoare de material nedizolvat sau
precipitat din plăci cu colonii mici. Se examinează atent obiectele înşelătoare, folosind o
mărire mai mare dacă este necesar, pentru a distinge coloniile de materiale străine.
Coloniile extinse se vor considera o singură colonie. Dacă mai puţin de un sfert
din placă este acoperită de extinderi, se numărp coloniile de pe partea neafectată a plăcii
19
şi se calculează numărul corespunzător pentru toată placa. Dacă mai mult de un sfert
este acoperită cu colonii extinse nu se ia în considerare numărătoarea.
Foto nr. Colonii care s-au dezvoltat (original) Foto nr. Numărător de colonii (original)
Exprimarea rezultatelor
Metoda de calcul
Pentru numărătoare se utilizează cutiile ce conţin cel mult 300 de colonii şi cel
puţin 15 colonii.
Numărul de microorganisme pe ml sau gram de produs, N, se calculează, ca
medie ponderată cu următoarea formulă:
C
N = ------------------------
(n1 + 0,1 n2) x d
unde;  C – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute

n1 – numărul cutiilor reţinute la prima diluţie
n2 - numărul cutiilor reţinute la adoua diluţie
d – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii
Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative. Ca rezultat se ia

numărul de microorganisme pe ml sau pe gram de eşantion exprimat printr-un număr
cuprins între 1,0 şi 9,9 x 10x unde x este puterea atribuită lui 10.
Exemplu:
O numărătoare de microorganisme obţinute la 30 °C a dat următoarele rezultate.
la prima diluţie reţinută 10-2: 168 şi 215 colonii
la a doua diluţie reţinută 10-3: 14 şi 25 de colonii
C 168 + 215 + 14+ 25 422

N = ----------------------------------= _________________ =________=19.162
(n1 + 0,1 n2 + 0,01 n3) x d [2+(0,1x2)]x10-2 0,022
20
Se rotunjeşte la două cifre semnificative adică 19.000 sau 1,9 x 10 -4
microorganisme pe ml sau pe gram de produs
Estimarea numerelor mici
Dacă cele două cutii la nivelul eşantionului de analizat (produse lichide) sau al
diluţiei iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii se face media aritmetică, ,m, a
coloniilor numărate în cele două cutii. Rezultatul se dă sub forma:
- număr de microorganisme estimat pe ml
NE = m(produse lichide)
- număr de microorganisme estimat pe gram:
NE = m x d-1 (alte produse), în care d este factorul de diluţie al
diluţiei iniţiale.
Dacă cele două cutii corespunzătoare eşantionului de analizat (produse lichide)
sau diluţiei iniţiale (alte produse) nu conţin nici o colonie rezultatul se dă sub forma:
mai puţin de 1 microorganism pe ml (produse lichide)
mai puţin de 1 x d-1microorganisme pe gram (alte produse) în care d este factorul de
diluţie al diluţiei iniţiale.
Alte exemple de calcul
Cazul 1. Rezultate cu un număr de germeni sub 100.000/ml.
Nr.diluţiei -1 -2 -3 -4
Nr.coloniilor >300 >300 72 8
>300 >300 87 8
Cazul 2. Rezultate cu un număr de germeni peste 300.000/ml

Nr. coloniilor >300 >300 310 38
>300 >300 290 36

Nr. coloniilor >300 >300 560 58
>300 >300 490 52
560  490  58  52 1160

N   527272, (72)  500.000,00
 2   0,1 * 2  *10 3 0,0022
21

Nr. coloniilor >300 >300 760 77
>300 >300 700 68
760  700  77  68 1605

N   729545(45)  700.000,00
 2   0,1 * 2  *10 3 0,0022
Cazul 5. Rezultate cu un număr de germeni peste 1.000.000/ml

Nr.diluţiei -1 -2 -3 -4 -5
Nr.coloniilor >300 >300 >300 320 38
>300 >300 >300 260 44
Buletinele de analiză sunt întocmite de responsabilii de încercare şi verificate de
responsabilii de compartiment în trei sau patru exemplare ( în funcţie de situaţie) dintre
care unul se păstrează în laborator iar celelalte sunt preluate de la Biroul recepţie probe
de către medicul veterinar care a întocmit procesul verbal de recoltare, procesator ( în
cazul probelor recoltate în cadrul programului de autocontrol) iar un exemplar se
dirijează către serviciul de igienă şi sănătate publică din cadrul D.S.V.
Buletinul de analiză trebuie să cuprindă; toate informaţiile necesare pentru
identificarea completă a probei; metoda de eşantionare folosită (dacă se cunoaşte);
metoda de analiză folosită, cu referire la standardul internaţional; toate condiţiile de
operare nespecificate în standard, sau privite ca opţionale, împreună cu detalii ale căror
incidente pot influenţa rezultatul; rezultatele obţinute în analiză.
22
LABORATOR NR. 3
Determinarea Salmonella
în conformitate cu prevederile EN ISO 6579
Aparatură şi sticlărie folosită:

 Termostat 35oC; 37o ±0,5oC; 42oC – pentru dezvoltarea microbiană;
 Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de
sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180 oC
timp de 30-60 minute;
 Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune.
Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute;
 Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului
încăperilor şi a suprafeţelor de lucru;
 Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de
temperatura camerei;
 Sterilizator electric pentru instrumente;
 Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip
Atomix de înaltă turaţie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile;
 Baie de apă reglabilă la temperatură 35 oC sau 37oC, 45oC, 55oC şi 70oC;
 Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm;
 Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml;
 pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la
o
25 C;
23
 Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platină-iridiu sau nichel-
crom ;
 Eprubete de 16 x 160 mm sterile;
 Flacoane pentru medii de cultură;
 Eprubete cu diam de 8/160 mm;
 Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml;
 Mojar cu pistil, sterile;
 Eprubete gradate;
 Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 şi 250 ml.
Metodologia de diagnostic
Detecţia Salmonella spp. se efectuează în conformitate cu standardul ISO
6579/2003 AC/2006 "Microbiologia alimentelor şi a hranei pentru animale – Metoda
orizontală de cercetare a Salmonella spp.
Detecţia Salmonella spp. necesită parcurgerea a patru faze succesive:
1. Preîmbogăţirea în medii lichide neselective: apa peptonată tamponată se
inoculează la temperatura camerei cu proba pentru analiză, apoi se incubează la
37ºC ± 1º C timp de 18 h ± 2 h. Preâmbogăţirea este necesară pentru
resuscitarea germenilor distruşi subletal.
2. Îmbogăţire în medii selective lichide: Mediul Rappaport-Vassiliadis cu soia (bullion
RVS) şi bulionul Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocină (bullion MKTTn) se
inoculează cu cultura obţinută în urma inoculării apei peptonate. Bulionul RVS se
incubează la 41,5º C ± 1º C timp de 24 h ± 3 h şi bulionul MKTTn la 37 º C timp
de 24 h ± 3 h. Aceste medii conţin substanţe inhibitorii pentru bacterii non-
Salmonella.
Foto nr. Mediu Rappaport –Vasilliadis Foto nr. Müller –Kauffman

înainte şi după incubare înainte şi după incubare
3. Izolare şi identificare: din culturile obţinute în urma inoculării RVS şi MKTTn, se

inoculează două medii selective solide: agar xiloză-lizină-dezoxicolat; orice alt
mediu selectiv solid complementar cu agarul XLD şi potrivit în special pentru
izolarea Salmonellei lactoză-pozitivă (de exemplu Rambach, MC Conkey sau
Roşu Fenol). Agarul XLD şi mediul Rambach (recomandat a fi ales) se incubează
24
la 37ºC ± 1ºC şi se examinează după 24 h ±3 h. Acestea permit diferenţierea
salmonelelor de alte enterobacterii.
Foto nr. Mediu XLD Foto nr. Mediu Rambach
Foto nr. Mediu cromogen
4. După izolarea tulpinilor în cultură pură, confirmarea se face prin diverse teste
biochimice şi serologice. Salmonelele posedă antigene somatice (O), flagelare (H)
şi de virulenţă (VI) ce pot fi identificate prin serotipizare, iar serovariantele pot fi
identificate după formula lor antigenică, conform schemei Kauffman–White.
Pentru confirmarea identificării serologice complete, tulpinile de Salmonella
izolate trebuie să fie trimise la Institutul de Igienă şi Sănătate Publică Veterinară
Bucureşti (IISPV). (ISO 6759)
Teste biochimice
Agar TSI - se însămânţează coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin
trasare. Se incubează la temperatura de 35 o 37oC timp de 24 h. Se interpretează
modificările care se produc în mediu în modul următor:
Baza mediului:
– galbenă – glucoză pozitiv (fermentarea glucozei);
– roşie sau nemodificată – glucoză negativ (lipsa fermentării
glucozei);
– neagră – formare de hidrogen sulfurat;
25
– bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoză:
Panta mediului:
– galbenă – lactoză şi/sau zaharoză pozitiv;
– roşie sau nemodificată lactoză şi zaharoză negativ (neutilizarea
lactozei şi a zaharozei.
Foto nr. TSI
Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roşie) cu formare de

gaz şi a unei baze acide (galbenă) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat
(înnegrirea agarului. Atunci când se izolează o Salmonella lactoză pozitiv panta agarului
TSI este galbenă, În consecinţă o confirmare preliminară a culturilor de Salmonella nu
trebuie să se bazeze doar pe rezultatele obţinute pe agarul TSI.
Agar cu uree
Se însămânţează panta agarului în striuri. Se incubează la 35o sau 37oC (conform
acordului) timp de 24 h şi se examinează din când în când. În cazul reacţiei pozitive
descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, făcând să vireze roşu de fenol la
roz apoi la roşu închis Reacţia este deseori vizibilă după 2 până la 4 h.
Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei
Se însămânţează mediul lichid sub suprafaţă. Se incubează la 35 o sau 37oC timp
de 24 h. O culoare violet apărută după incubare indică o reacţie pozitivă. O culoare
galbenă indică o reacţie negativă.
Evidenţierea betagalactozidazei
Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă ce conţine 0,25 ml
soluţie salină, se adaugă o picătură de toluen şi se agită eprubeta. Se introduce eprubeta
în baie de apă reglată la 35 o sau 37oC (conform acordului) şi se lasă să stea câteva
minute. Se adaugă 0,25 ml Reactiv pentru evidenţierea betagalactozidazei şi se
amestecă. Se reintroduc eprubetele în baia de apă la 35 o sau 37oC (conform acordului) şi
se lasă 24 examinându-le din timp în timp. O culoare galbenă indică o reacţie pozitivă,
deseori reacţia este vizibilă în 20 minute. În cazul folosirii discurilor de hârtie gata
preparate se respectă instrucţiunile fabricantului.
Mediu pentru reacţia VP
26
Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă conţinând 0,2 ml VP,
se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. După incubare se
adaugă 2 picături din soluţia de creatină, 3 picături din soluţia alcoolică de l-naftol şi apoi
2 picături din soluţia de hidroxid de potasiu agitând după adăugarea fiecărui reactiv.
Formarea unei coloraţii roz până la roşu aprins într-un interval de 15 minute indică o
reacţie pozitivă
Mediu pentru evidenţierea indolului
Se însămânţează o eprubetă ce conţine 5 ml mediu triptonă-triptofan cu colonia
suspectă Se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. După incubare
se adaugă 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel roşu indică o reacţie pozitivă.
Formarea unui inel galben brun indică o reacţie negativă.
Reacţia de aglutinare rapidă, pe lamă cu ser polivalent anti-Salmonella
Cercetarea prezenţei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectuează prin
aglutinare pe lamă cu seruri adecvate din colonii pure şi după eliminarea tulpinilor
autoaglutinabile.
Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lamă de sticlă curată o
picătură de soluţie salină, se dispersează în această picătură o fracţiune din colonia de
testat aşa fel încât să se obţină o suspensie omogenă şi tulbure prin mişcarea lamei timp
de 30-60 secunde. Dacă bacteriile se adună în grămezi, tulpina este considerată
autoaglutinabilă şi nu mai trebuie supusă examinărilor ulterioare. Examinarea se face cu
ajutorul unei lupe pe fond negru
Evidenţierea antigenelor O. Dintr-o colonie pură cunoscută ca neaglutinabilă se
procedează ca mai sus, dar în locul soluţiei saline se foloseşte o picătură de antiser O.
Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă. Se utilizează serurile poli
şi monovalente unul după altul.
Evidenţierea antigenelor Vi. Se procedează ca mai sus utilizând o picătură de
antiser Vi. Dacă se produce aglutinarea reacţia este pozitivă.
Evidenţierea antigenelor H. Se însămânţează un agar nutritiv semisolid cu o
colinie pură neautoaglutinabilă, se incubează la 35 o 37oC timp de 24 h, se utilizează
această cultură pentru examenul antigenelor H procedâmd ca mai sus, dar folosind o
picătură antiser H.Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă.
Foto nr. Reacţia de aglutinare
27
Fermentarea biochimică a zaharurilor

Confirmarea identificării prin teste biochimice, cu zaharuri în apă peptonată,
sisteme API (Analitical Profile Index). Se recomandă utilizarea unor teste biochimice
suplimentare care ajută la identificarea unor serovariante tipizate: maltoza şi dulcitolul
pentru diferenţierea S. pullorum de S. gallinarum
Testarea sensibilităţii la substanţe antiinfecţioase
Foto nr. Agar nutritiv – colonii de Salmonella
Diagrama modului de lucru
Apa peptonata – tamponata

Preimbogatire
la temperature camerei
Incubare (9,2) timp de 18 h

+/- 2 h la 370 C +/- 10 C
0,1 ml cultura 1 ml cultura

Imbogatire
+ +
selectiva
10 ml bullion RVS 10ml bullion MKTTNn

Incubare timp de 24 h +/- Incubare timp de 24 h +/- 3
3 h la 41,50 C +/- 10 C h la 370 C
se
Mediu XLD si al doilea agar la alegere

Incubare timp de 24 h +/- 3 h la 370 C +/- 10 C
Confirmare Izolare
De pe fiecare placa se testeaza o colonie

28
caracteristica . Daca rezultatul e negativ se
testeaza nutritive
Agar alte 4 colonii
Confirmare biochimica Exprimare rezultateConfirmare serologica
Alte posibilităţi de diagnostic

Teste de biologie moleculară
În ultimii ani au fost utilizate cu bune rezultate analizele genotipice ale germenilor
(profil plasmidic şi ADN cromozomial). Analiza profilului plasmidic este o metodă rapidă
şi relativ simplă de amprentare a tulpinilor şi a fost aplicată în medicina umană şi
veterinară pentru studiul distribuţiei germenilor. Nu toate tulpinile de Salmonella posedă
plasmide, motiv pentru care s-au utilizat şi tehnici genetice alternative pentru genotiparea
tulpinilor lipsite de plasmide. În ultimii ani, genotipia a căpătat amploare, creandu-se
multe noi tehnici.
ELISA pentru S. enteritidis
Pentru detecţia de IgG (IgY) specific S. enteritidis sunt utilizate 2 sisteme de bază:
ELISA indirect (1) şi ELISA competitiv „ tip sandwich”. Reacţiile ELISA sunt uşor pretabile
la automatizare, şi prin urmare pot fi incluse în programe de testare, însă echipamentele
necesare, precum şi reagenţii sunt costisitori.
ELISA mix (sau ELISA aplicabilă pe suc de carne) este utilizată în Danemarca
pentru decelarea infecţiilor salmonelice la porci. Această variantă ELISA include antigene
somatice (O) 1, 4, 5, 6 şi 12 cu care poate detecta serologic 95% din serogrupele de
salmonele circulante la porcii din Danemarca. Pentru porcii abatorizaţi se utilizează sucul
rezultat prin congelarea şi decongelarea a 10 g de muşchi.
Interpretarea rezultatelor
29
Organism indicator
Alimentele gata pentru consum nu trebuie sa contina Salmonella spp. Trebuie să
se asigure masuri de control specifice in timpul producţiei, standarde de igiena adecvate,
gătire adecvată în timpul pregătirii finale pentru ca produsele finale să nu conţină
organisme viabile şi ca alimentele gătite să fie de bună calitate.
Stabilirea conformităţii probelor
Limitele stabilite conform R (CE) 2073/2005 se referă la fiecare unitate de probă
testat. Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a lotului testat.
Salmonella în diferite categorii de produse alimentare:
 satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
 nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare
dintre unitățile de probă.
LABORATOR NR. 4
Detectarea drogdiilor şi mucegaiurilor

ISO 21527-1 din produsele agroalimentare de origine vegetală
Scop
Procedura de diagnostic stabileşte directivele generale pentru numărarea
drojdiilor şi mucegaiurilor viabile în produsele destinate consumului uman prin tehnica
numărării coloniilor la temperatura de 25 °C. Drojdiile şi mucegaiurile sunt
microorganisme care la 25°C formează colonii specifice pe mediu selectiv.
Domeniul de aplicare
Metoda se aplică următoarelor produse: vegetale congelate; vegetale
deshidratate; paste făinoase (macaroane, fidea); condimente şi amestecuri; băuturi
răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile; pulberi pentru
sucuri; bere nepasteurizată, filtrată şi nefiltrată; bere pasteurizată; făinuri alimentare;
produse de panificaţie cu umpluturi; derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb,
orez, produse expandate); biscuiţi; pateuri; fursecuri, napolitane cu diferite creme;
cacao; pudră; ciocolată tablete, ciocolată umplută cu cremă sau de tip fondant; jeleuri;
rahat; gemuri; şerbeturi; dulceţuri, fructe confiate; arome alimentare naturale sau
sintetice; emulsie pentru băuturi răcoritoare; oţet alimentar; ceai (plantă); cafea crudă
prăjită şi instant; produse din grâu germinat; etc.
30
Probele recoltate trebuie să fie etichetate şi pe aceasta să fie menţionate cel puţin
următoarele date: produsul recoltat; examenul solicitat, locul prelevării; ziua şi data
prelevării; data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevării, cine a prelevat.
Documente de referinţă
SR ISO 21527/1 sau 2
Principiul metodei
Turnarea în cutii Petri a unui mediu de cultură selectiv şi a unei cantităţi
determinate din eşantionul de analizat. Pregătirea altor cutii în aceleaşi condiţii folosind
diluţii decimale din eşantionul de analizat sau din diluţia iniţială
Incubarea aerobă a cutiilor cu medii de cultură însămânţate la 25 °C timp de 4 sau
5 zile. Calcularea numărului de Drojdii şi Mucegaiuri pe gram sau ml de probă din
numărul de colonii obţinut în cutiile alese la nivelul de diluţii care permit stabilirea unui
rezultat semnificativ
Soluţii de diluare şi medii de cultură utilizate
Medii de cultură - mediu extract de drojdie-dextroză-cloranfenicol-agar (MEDDCA)
si /sau agar DG 18. Instrucţiunile producătorului trebuie riguros respectate.
Soluţii de diluare - apă distilată sau deionizată, fără conţinut de substanţe care ar
putea inhiba dezvoltarea drojdiilor şi mucegaiurilor în condiţii de testare. Pentru a se
evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de temperatură, soluţia de
diluare trebuie să albă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba, dacă nu există alte
prescripţii.
Echipamente de încercare utilizate
 Termostat 25o +-0,5oC - aparat electric pentru dezvoltarea microbiană;
 Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea Cu căldură uscată a obiectelor de sticlă,
porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180 oC timp de 30-
60 minute;
 Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru:
medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de
121oC timp de 20-30 minute;
 Lampă U.V - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor
şi a suprafeţelor de lucru;
 Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura
camerei;
 Omogenizator Stomacher 400-Circulator –omogenizare eşantion;
 Autoclav Tuttnauer pentru instrumentar;
 Baie de apă reglabilă la temperatură mai mare de 100 oC sau reglabilă la 45oC;
 Cutii Petri sterile din sticlă cu diametrul de 90-100 mm;
 Pipete gradate sterile de 1 ml +- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml, gradate în diviziuni
de 0,5 şi respectiv 0,1 cu orificiu de 2-3 mm;
 Lupă cu putere de mărire de 3x;
 pH metru IL-L-10 cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la
25o C;
31
 Eprubete de 16 x 160 mm sterile;
 Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml;
 Mojar cu pistil, sterile;
 Perle de sticlă cu diametrul de cca 6 mm;
 Flacoane cu capacitatea de 90, 150 şi 250 ml.
Pentru a obţine o cultură pură de drojdii şi mucegaiuri este necesar ca materialul
de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată
este sterilizată la etuvă la 180 oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121 oC timp
de 30 minute.
Pregătirea eşantionului pentru analiză
Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului
respectiv.
Exemple:
Alimente cu consistenţă lichidă - se agită energic eşantionul de analizat pentru a
asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori
recipientul cu eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie
dispersată. Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare
analizei nu trebuie să depăşească 3 minute.
Alimentele cu consistenţă solidă - se mărunţesc în bucăţi mici înainte de
mojarare. Din proba de analizat se introduc în mojar 1g/10g + cantitatea egală de nisip
steril. Se triturează adăugându-se treptat lichid de diluţie de 9 ori mai mare decât
eşantionul.
Procedura de lucru
Însămânţare şi incubare
Pentru realizarea diagnosticului trebuie parcurse parcurse următoarele etape:
 Se iau două cutii Petri sterile;
 Cu o pipetă sterilă se trece în fiecare cutie câte 1 ml eşantion de analizat dacă
produsul este lichid sau câte 1 ml din diluţie iniţială a produselor solide şi semi-
solide. Pipeta se schimbă pentru fiecare diluţie.
 Pe fiecare cutie se notează numărul probei, diluţia şi data;
 Se iau încă două cutii Petri sterile;
 Cu o altă pipetă sterilă, se trece câte 1 ml din diluţia 10 -1 în fiecare cutie. În unele
situaţii, procedeul se repetă şi cu alte diluţii, preparându-se atâtea diluţii de lucru
încât într-o cutie Petri să se obţină mai mult de 10 şi mai puţin de 150 colonii.
Pipeta se schimbă pentru fiecare diluţie. Prin operaţia de diluţie în tuburile cu
diluţii se vor obţine cantităţile de probă ilustrate în tabel, din care reiese că între
două diluţii consecutive, diferenţa de concentraţie este de 10 ori (diluţii decimale):
Tabelul nr.....
Nr. tub 1 2 3 4
Diluţia 1/10x) 1/100 1/1000 1/10000
Cantitate (g) 0,1 0,001 0,0001
32
sau volum (ml) 0,01
sau sau sau sau
Din proba 10-1 10-2 10-3 10-4
iniţială pe ml
diluţie xx)
x) în cazul produselor solide sau semi-solide această diluţie se află în recipientul
omogenizatorului sau în mojar;
xx) în cazul însămânţării a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-
solide (10 ml diluţie 10-1) această cantitate se notează cu 10-0.
 Se toarnă circa 15 ml mediu extract de drojdie-dextroză-cloranfenicol-agar

(MEDDCA) si /sau agar DG 18, (topit în prealabil şi menţinut la 45 0 +- 10 C într-o
baie de apă), în fiecare cutie Petri. Timpul scurs între finalul preparării suspensiei
iniţiale (sau diluţiei 10-1 dacă produsul este lichid) şi momentul în care mediul este
turnat în cutiile Petrii, nu trebuie să depăşească 15 min;
 Inoculul se amestecă cu mediul şi amestecul rezultat este lăsat să se solidifice,
după ce cutiile Petri au fost aşezate pe o suprafaţă orizontală, rece;
 Se prepară o cutie martor, cu 15 ml mediu, pentru verificarea sterilităţii.
 Se efectuează incubarea aerobă a cutiilor la 25 °C timp de 4 sau 5 zile;
Foto nr. Penicilium urtice şi Fusarium nivale, Foto nr. Rodothorulla rubra, Rodothorulla mucilaginosa
colonii pe mediu DDCA - original colonii pe mediu DDCA – original
33
Foto nr. Aspergillus citrinum, Penicilium urticae,
colonii pe mediu DDCA - original
Calculul
 După 3 – 5 zile de incubare se numără coloniile din fiecare cutie Petri, fiind
reţinute acele cutii care au conţinut sub 150 colonii;
 Se procedează la calcularea numărului de Drojdii şi Mucegaiuri pe gram sau ml
de probă din numărul de colonii obţinut în cutiile alese la nivelul de diluţii care
permit stabilirea unui rezultat semnificativ.
 Numărul de drojdii şi mucegaiuri pe gram sau pe mililitru se calculează utilizând
următoarea formulă:
C
------------------------
(n1 + 0,1 n2) d
unde; C – suma coloniilor numărate în toate cutiile

n1 – numărul cutiilor reţinute, de colonii la prima diluţie
n2 - numărul cutiilor reţinute, la a doua diluţie
d – diluţia din care s- au făcut primele numărări( de exemplu , 10 -2 )
Rezultatul se exprimă ca un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 înmulţit cu 10 x ,în care
x este puterea lui 10.
Dacă nu există nici o colonie în cutiile corespunzătoare suspensiei iniţiale când
produsul iniţial a fost solid, numărul de drojdii şi mucegaiuri pe gram de produs trebuie
raportat ca fiind mai mic de 10. Dacă în cutiile cu probă nu există nici o colonie, când
produsul iniţial a fost lichid, numărul de drojdii şi mucegaiuri pe mililitru produs se
raportează ca fiind mai mic de 1.
Exemplu de calcul
Numărarea drojdiilor şi mucegaiurilor indică următoarele rezultate (au fost
incubate câte două cutii Petri pentru fiecare diluţie):
 diluţia 10-2 :83 şi 97;
 diluţia 103 : 33 şi 28 colonii.
SC 83+97+33+28 241
N = ---------------------------- = ------------------------ = --------- = 10.954
(n1 + 0,1 n2 ) d [2+(0,1x2)] x 10-2 0,022
34
Rotunjind rezultatul se obtine 11.000. Prin urmare, numărul de drojdii şi
mucegaiuri estimat pe gram sau pe mililitru, este de 1,1 x 10 4 .
Trebuie să indice metoda folosită, timpul de incubare şi rezultatele obţinute,
precum şi modul lor de exprimare. El trebuie să menţioneze de asemenea, orice detaliul
de lucru care nu este specificat în Standard, sau considerat ca obţional, împreună cu
detalii asupra oricărui incident care poate influienţa rezultatele.
LABORATOR NR. 5
DETERMINAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES

DIN PRODUSELE ALIMENTARE DE ORIGINE VEGETALĂ
Listeria monocytogenes, reprezintă specia de interes pentru microbiologia

alimentelor, fiind patogenă pentru om şi pentru animale. Se prezintă ca un bacil drept
sau cocobacil, lung de 0,5 – 2 microni şi gros de 0,3 – 0,5 microni, cu capetele rotunjite,
mobil, gram pozitiv,aşezat în lanţuri scurte, în palisadă,”V” sau „Y”. Este asporogenă,
ciliată,deci mobilă, aerobă şi microaerofilă. Listeria monocytogenes se deosebeşte de
celelalte specii prin faptul că produce hemoliză, fermentează glucoza şi ramnoza, nu
fermentează xiloza şi manita, nu reduce nitratul, testul CAMP pozitiv cu Staphylococcus
aureus.
Metoda de diagnostic stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene
cu L. monocytogenes în produsele alimentare.
Metoda se aplică următoarelor produse: fructe; legume – salată, varză, etc.
Documente de referinţă
Detectarea Listeria monocytogenes se efectuează în conformitate cu versiunea
modificată a standardului EN ISO 11290-1:1996 „Microbiologia alimentelor şi furajelor -
35
Metoda orizontală de detectare şi enumerare a Listeria monocytogenes - Partea 1:
Metoda de detectare”.
Enumerarea Listeria monocytogenes se efectuează în conformitate cu standardul
EN ISO 11290-2:1998 „Microbiologia alimentelor şi furajelor - Metoda orizontală de
detectare şi enumerare a Listeria monocytogenes - Partea 2: Metoda de enumerare”,
modificat cu standardul EN ISO 11290-2:1998/Amd 1:2004 „Modificarea mediului de
enumerare”.
Referenţialul de interpretare este Regulamentul(CE) nr. 2073/2005, cu
amendamentele ulterioare.
Principiul metodei
Însămânţarea unei cantităţi de eşantion determinată – 25 ml (produs) – 25 g (alte
produse). Izolarea L. monocytogenes din produsele alimentare este destul de dificilă din
cauza microorganismelor competitive prezente în număr mare.
Sterilizarea mediilor de cultură trebuie făcută în autoclav la 121 +-1oC timp de 15
minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dacă mediile de
cultură nu sunt folosite imediat, ele trebuie păstrate la întuneric între 0-5oC maxim 7 zile
pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor.
Echipamente de încercare şi mijloace de măsurare utilizate
 Termostat 35o +-0,5oC (LP 116 / 3622 – aparat electric pentru dezvoltarea
microbiană
 Etuvă 160 – 180oC (SP 125G 0220/90 /3620) asigură sterilizarea cu
căldură uscată a obiectelor de sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice
la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute
 Autoclav (17148 / 3802) - realizează sterilizarea prin
încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură, produse patologice
obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121 oC timp de 20-30 minute
 Lampă - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a
suprafeţelor de lucru
 Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura
camerei
 Sterilizator electric pentru instrumentar
 Baie de apă reglabilă la temperatură mai mare de 100 oC sau reglabilă la 45oC
 Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm
 Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml
 pH metru - cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25 o
C
 Flacoane cu capacitatea de 250 ml pentru sterilizarea şi păstrarea mediilor de
cultură
 Eprubete de 16 x 160 mm sterile
 Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml
 Mojar cu pistil, sterile
36
Eşantionare - eşantioanele sunt etichetate, cuprinzând: produsul recoltat,
examenul cerut; locul prelevării; ziua şi data prelevării; data de valabilitate; sigiliul;
martorii prelevării; cine a prelevat.
 Alimentul cu consistenţă semisolidă se omogenizează ca atare.
 Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de
mojarare. Din proba de analizat se introduc în mojar 25g/10g + cantitatea
egală de nisip steril. Se triturează, se transferă într-un flacon steril peste
care se adaugă mediu de preîmbogăţire.
Modul de lucru
 Pregătirea eşantionului pentru analiză
.Cu instrumente sterile, se recoltează 25 ml din eşantion în cazul produselor
lichide şi 25 g din eşantionele semisolide şi solide. Alimentul cu consistenţă solidă se
mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc în mojar
25g/10g + cantitatea egală de nisip steril. Se triturează, se transferă într-un flacon steril
peste care se adaugă mediu de preîmbogăţire.
1. Faza de preîmbogăţire selectivă - Cu instrumente sterile, se
recoltează 25 ml într-un flacon steril peste care se adaugă 225 ml
mediu de preîmbogăţire în cazul eşantionului lichid şi 25 g din
eşantioanele semisolide şi solide în mojare cu pistil sterile, se
triturează, după care se introduc în flacoane sterile peste care se
adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire (demifraser).Se
termostatează la 35oC timp de 24 h.
2. Faza de îmbogăţire selectivă – Din cultura cu mediu demifraser se

inoculează 0,1 ml în 10 ml mediu lichid fraser. Tuburile inoculate se
incubează la 35oC timp de 48 h.
3. Faza de izolare selectivă - Din cultura pe mediu Fraser cu ansa
bacteriologică se însămânţează pe două medii de izolare selectivă
(agar Oxford şi agar Palcam) turnate în plăci Petri sterile, se
incubează la 35oC timp de 24 - 48 h. Pe mediile selective Palcam şi
Oxford coloniile de Listeria apar sub forma unor colonii de culoare
închisă, înconjurate de un halou tot de nuanţă maro spre negru,
37
datorită faptului că bacteria produce hidroliza esculinei prezentă în
mediu.
Mediu Palcam (înainte de însămânţare) Mediu Palcam (după însămânţare şi termostatare)
Foto nr. Mediul Oxford
Foto nr. Mediu cromogen (ALOA)
 Interpretarea - După incubare, cutiile Petri însămânţate, se examinează şi

se reţin cele în care s-au dezvoltat colonii suspecte de L. monocytogenes.
 Test de confirmare - Culturile obţinute pe suprafaţa agarului Oxford şi
Palcam (se reţin 5 colonii specifice sau suspecte), suspecte ca fiind
L.monocytogenes, se transplantează pe bulion şi agar nutritiv, se
incubează la 35oC timp de 24 h după care se supun următoarelor teste:
38
Foto nr. Listeria - agar nutritiv Foto nr. Listeria – bulion
1. Mobilitate - Examen microscopic- între lamă şi lamelă; Examen

cultural în agar moale (dezvoltare sub formă de umbrelă la 25 oC)
Foto nr. Testul mobilităţii
2. Reacţia catalazei - O ansă de cultură se introduce într-o picătură de

peroxid de hidrogen 3% depusă pe o lamă de sticlă. Apariţia
imediată a bulelor de gaze se interpretează ca reacţie pozitivă şi
este specifică pentru L. monocytogenes.
Foto nr. Testul catalazei
3. Testul hemolizei - Pe agar cu sânge se striază o ansă

bacteriologică din cultura obţinută se incubează la 35 oC timp de 24
39
h. Tulpinile de Listeria monocytogenes produc colonii mici,
înconjurate de o zonă clară dar mică de hemoliză (fig. nr. ), spre
deosebire de Listeria ivanovii care manifestă o activitate hemolitică
foarte puternică, sau spre deosebire de alte specii din cadrul
genului care nu produc hemoliză. Hemoliza produsă este de tip β.
Foto nr. Testul hemolizei
4. Fermentarea hidraţilor de carbon - în eprubetele cu zaharuri

(glucoză, manită, xiloză şi rhamnoză), cu o pipetă sterilă se introduc
câte 0,1 ml din cultura obţinută în bulion nutritiv. Se termostatează
la 35oC timp de 24 h după care examinează. Reacţia este pozitivă
la glucoză şi rhamnoză; reacţia este negativă la manită şi xiloză.
Foto nr. Fermentaţia hidraţilor de carbon Foto nr. MIU (stânga şi TSI mijloc)
Restul se poate efectua şi cu ajutorul testelor Api- Listeria, care conţin substraturi
sub formă deshidratată, ce permit realizarea testelor enzimatice sau de fermentaţie a
zaharurilor. Reacţiile produse în timpul perioadei de incubaţie se tradus prin schimbări
spontane de coloraţie sau schimbări relevate de adiţia reactivului. (fig. nr.). După o
incubaţie de 18-24 de ore la o temperatură de 35-370C, citirea reacţiilor se realizează
vizual cu ajutorul unui tabel de citire şi identificare. (Carp Cărare)
40
5. Reacţia MR/VP- se foloseşte mediu Clarc şi reacţia este pozitivă

6. Reacţia reducerii nitratului în nitrit –negativă
7. Testul CAMP - Pe suprafaţa agarului cu sânge de oaie turnat în
cutii Petri se striază în linie dreaptă pe tot diametrul cutiei cultură de
24 h de Stafilococcus aureus şi R.eqvila distanţă de 3-4 cm una de
alta şi pe cât se poate linii paralele. Tulpinile de testat se striază pe
suprafaţa agarului perpendicular pe primele două strii în aşa fel ca
striile culturilor de testat să se oprească la 2-3 mm de acestea.
Răspunsul caracteristic pentru fiecare specie este pozitiv la
Stafilocococus aureus şi pozitiv sau negativ la R.eqvi, după
incubare de 24 h la 35oC
O tulpină de Listeria monocytogenes confirmată per eşantion pozitiv se conservă
în vederea unor eventuale teste de tipizare. În cazul în care tulpinile de Listeria
monocytogenes sunt identificate atât prin metodele de detectare, cât şi prin cele de
enumerare, se stochează în laborator numai izolatele obţinute prin metoda de
enumerare.
Tulpinile de Listeria monocytogenes se stochează de către Laboratorul Naţional
de Referinţă pentru Listeria monocytogenes din cadrul Institutului de Igienă şi Sănătate
Publică Veterinară Bucureşti folosind metode adecvate pentru colectarea de culturi,
astfel încât să se asigure viabilitatea tulpinilor pentru cel puţin doi ani în vederea tipizării.
Diferenţiere diferitelor serotipuri în funcţie de rezultatele examenelor

biochimice
Testul biochimic L. L. L. L. L. L. L.mu
monocyto ivanovii innocu welshi seelige grayi rrayi
genes a merii ri
Producer D- + + + + + + +
ea de glucoză
acid din:
D-xiloză - + - + + - -
D-manitol - - - - - + +
D- + - V V - - V
rhamnoz
41
ă
maltoză + + + + + + +
Ptoducer catalază + + + + + + +
e de :
H2S/TSI - - - - - - -
H2S/benz - - - - - + +
i de
acetat de
plumb
betahem + + - - + - -
oliză
Hidroliza esculinei + + + + + + +
Hidroliza hipuratului + + + + + - -
Hidroliza ureei - - - - - - -
Reducerea nitraţilor - - - - - - +
Reacţia Voges- + + + + + + +
Prostkauer
Reacţia Roşului de + + + + + + +
metil
CAMP-S.aureus + - - - + - -
CAMP-R.eqvi +/- + - - - - -
Diagrama modului de lucru

25 ml sau 25 g peste care se adaugă
225 ml mediu de preâmbogăţire
demifraser
Preimbogatire
Incubare timp de 48 h +/- 2

h la 350 C +/- 10 C
Striere pe agar Oxford Striere pe agar Palcam

Imbogatire
Incubare timp de 24 h +/- Incubare timp de 24 h +/- 3

selectiva
3 h la 350 C +/- 10 C h la 350 C +/- 10 C

se
42
Confirmare
Izolare
0,1 ml din cultura obţinută se inoculează în 10 ml mediu

Fraser Incubare timp de 48 h +/- 3 h la 350 C +/- 10 C
Striere pe agar Oxford Striere pe agar Palcam

Incubare timp de 24 - 48 h Incubare timp de 24-48 h +/-
+/- 3 h la 350 C +/- 10 C 3 h la 350 C +/- 10 C
Se reţin 5 colonii specifice Se reţin 5 colonii specifice
sau suspecte sau suspecte
Transplantare pe bulion şi agar nutritiv

Mobilitate
Reacţia catalazei
Testul hemolizei
Fermentaţia hidraţilor de carbon
Reacţia reducerii nitratului în nitrit
Testul Camp
Stabilirea conformităţii probelor
Limitele stabilite conform R (CE) 2073/2005 se referă la fiecare unitate de probă
testată. Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a lotului testat.
L. monocytogenes în produsele alimentare gata pentru consum care permit
dezvoltarea de L. monocytogenes înainte ca produsul alimentar să fi părăsit controlul
imediat al operatorului din sectorul alimentar care l-a produs, în cazul în care acesta nu
este în măsură să demonstreze că produsul nu va depăși limita de 100 ufc/g în timpul
perioadei de conservare:
 satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
 nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare
dintre unitățile de probă. L. monocytogenes în alte produse alimentare gata pentru
consum.
43
LABORATOR 6
DETERMINAREA MICOTOXINELOR
PRIN METODA IMUNOENZIMATICA – ELISA
SCOP
Procedura stabileste metoda de determinare a micotoxinelor (Aflatoxina totala,
Aflatoxina B1, Ochratoxina A, Zearalenona, Deoxinivalenon din produsele alimentare şi
furajelor.
DOMENIUL DE APLICARE
Metoda se aplica, conform protocolului de lucru al kitului, urmatoarelor produse:
carne deshidratată; peşte; cereale; produse de morarit si panificatie; produse expandate
din cereale; furaje; seminţe; fructe uscate; fructe in coaja; cafea verde si prajita; vin si
44
sucuri pe baza de struguri; condimente; carne; ficat; rinichi ; lapte (degresat ,
nedegresat) ; alune, fistic.
Documente de referinta
STAS-urile si specificatiile tehnice folosite sunt urmatoarele:
 Kitul de lucru al micotoxinei:
 Aflatoxina totala - Test MaxSignalTM Total Aflatoxin ELISA –
BIOO SCIENTIFIC;
 Ochratoxina A - Test MaxSignalTM Ochratoxin ELISA BIOO
SCIENTIFIC;
 Ochratoxina A - Ridascreen Ochratoxina A 30/15;
 Coloane de imunoafinitate RIDA Ocratoxina A ;
 Coloane de imunoafinitate RIDA Aflatoxin B1;
 Coloane de imunoafinitate Aflatoxin Totala BIOO SCIENTIFIC;
 Aflatoxina B1 – Ridascreen Aflatoxin B1 30/15;
 Zearalenona - Test MaxSignal TM Zearalenona ELISA - BIOO
SCIENTIFIC;
 Zearalenona- Ridascreen Zearalenon;
 Deoxinivalenol - Ridascreen DON ELISA R-Biopharm;
Regulament CE 401/2006, cu modificarile si completarile ulterioare: stabilirea metodelor

de prelevare de probe si a metodelor de analiza pentru controlul oficial al continutului de
micotoxine din produse alimentare ;
ORDIN ANSVSA 18/2007 cu modificarile si completarile ulterioare (Dir.CE 2002/32; Reg.

UE nr. 574/2011) – privind aprobarea Normei sanitare veterinare si pentru siguranta
alimentelor privind substantele nedorite din hrana pentru animale.
Regulamentul CE 1881/2006 cu modificarile si completarile ulterioare– stabilirea nivelului

maxim pentru anumiti contaminanti din produse alimentare
Recomandare CE 576/2006 : privind prezenta Deoxinevalenol, Zearalenona,

Ochratoxina A, in produsele destinate pentru hrana animalelor ;
Reg. UE nr. 574/2011, cu modificarile si completarile ulterioare) – privind aprobarea

Normei sanitare veterinare si pentru siguranta alimentelor privind substantele nedorite
din hrana pentru animale.
ORDIN ANSVSA 51/2005 – Norma sanitar veterinara de implementare a masurilor de

supraveghere si control al unor substante si reziduurilor acestora la animalele vii si la
produsele lor privind performanta metodelor analitice si interpretarea rezultatelor.
45
SR EN ISO/CEI 17025 :2005 /AC:2007– Cerinte generale pentru competenta
laboratoarelor de incercari si etalonari.
Definitii
Reziduu - orice substanţă având o acţiune farmacologică cât şi alte substanţe,
inclusiv derivaţii şi metaboliţii săi, care, în mod natural, nu se găseşte în organismul
animal sau în produsele de origine animală, dar care poate fi regăsită ca urmare a
încorporării ei în mod conştient sau accidental în produsele de origine animală şi care,
prin depăşirea limitelor admise, poate constitui un factor de risc pentru sănătatea umană
Aflatoxinele - sunt produşi toxici, metabolici secundari produse de fungi: din specii
Aspergillus flavus, A. parasiticus şi A. nominus. Afltoxina totala este considerate ca fiind
un amestec de Aflatoxinei B1, B2, M1,M2, G1 ,G2 si este considerată cea mai
cancerigenă toxină naturală. Aflatoxina B1 este cea mai puternică toxină. Aceste toxine
sunt termostabile de aceea sunt foarte dificil de distrus.
Ochratoxina A - este produsă de fungi din speciile de Aspergillus şi Penicillium şi
reprezintă cea mai răspândită micotixină contaminantă a alimentelor . Ochratoxina a fost
izolată din ţesuturi şi organe de la animale inclusive din sânge şi lapte de la
om.Ochratoxina are acţiune nefrotoxică, dar şi hepatotoxic, carcinogenă,
imunosupresoare şi imunotoxică. Riscul pentru sănătatea oamenilor nu o reprezintă doar
ingestia de alimente de origine vegetală ci şi alimentele de origine animală.
Zearalenona, Deoxinivalenol, - sunt produsi de fungi din speciile de Fusarium.
Echipamente utilizate pentru diagnostic

 Balanta analitică electronică, tip Kern ABJ, seria WB0450085 – asigură
cântărirea probelor cu precizie de 10 –4g.
 Balanta tehnică Partner, model WPX 1500, seria 209970/07– asigură
cântărirea probelor cu precizie de 10 –2g.
 Bidistilat Fistreen SANYO tip Cyclon 4l/h model WSCO44MH3.4,seria
F1-E120008 - asigură apa distilată, necesară analizelor de laborator
 Baie de apă termoreglabilă tip Funke Gerber WP436-D, seria nr. 3707-
1086 - asigură încălzirea probelor la temperatura de lucru.
 Moară de laborator Retsch, tip Grindomix GM200, serie/nr.
125081225G – asigura macinarea si omogenizarea probelor .
 Moară de laborator IKA A11 BASIC, serie/nr. 01.623236 – asigura
macinarea si omogenizarea probelor
 Centrifuga HETTICH universal 320R,seria 1009551- asigura obtinerea
extractului alcoolic
 Vortex, model Reax top, seria 090729877-asigura omogenizarea
probelor
 Pipetor Accu-jet, seria/nr. 12E57249 – asigura dozarea unor volume de
reactivi ,extracte metanolice ale probelor de lucru.
46
 Agitator Heildoph, uminax 2010, seria 010603173 - asigura
omogenizarea extractelor metanolice ale probelor.
 Hota ESCO, Model. ACII-4E1, serie 2600-19594 - asigura crearea
conditiilor de lucru specifice de securitate.
 Incubator plăci, model Stat Fax-2200,seria 2200-5533- asigura crearea
conditiilor de lucru specifice la temperatura indicata de protocolul de
lucru al kitului
 SPE-Vacuum cu Mini-Labor pumpen, tip N86Kt.57, seria/nr. 202636520
– asigura purificarea probelor prin utilizarea coloanelor de
imunoafinitate, dupa caz.
 Spălător plăci, model Stat Fax-2600, seria 2600-5710 - asigura
spalarea godeurilor
 Cititor plăci, model Stat Fax 3200 ,seria 3200-2151 – asigura citirea
densitatilor optice al probelor la lungimea de unda adecvata protocolului
de lucru al kitului.
 Pipete monocanal si multicanal: 5-50µl; 20-200µl; 100-1000µl,–
asigura prelucrarea extractelor alcoolice si al tuturor reactivilor din kit,
conform protocoluli de lucru, in godeuri.
Principiul testului:
Testul Elisa de determinare al micotoxinelor este un test cantitativ competitiv
imunoenzimatic. Micotoxina se extrag din probe cu ajutorul alcoolului metilic 70% ( sau
35%, apa distilata- in functie de micotoxina analizata-DON). Micotoxina este fixată în
godeuri În timpul analizei extractul de proba este adăugată împreună cu anticorpul
specific. Dacă toxina este prezentă în probă ea se va lega de anticorp împiedicându –l
pe acesta să se lege de toxina ataşată de godeu. Dupa etapa de spalare, adaugarea
substratului enzimatic, anticorpul secundar marcat cu o enzima peroxidază, se leagă de
anticorpul primar de care este legată toxina si astfel se induce aparitia culorii (de regula -
albastre). Intensitatea culorii este invers proportionala cu concentratia micotoxinei din
proba sau standard. Se adauga apoi solutia de stopare care conduce la schimbarea
culorii (de regula,de la albastru in galben). Intensitatea culorii se masoara
spectrofotometric la lungimea de unda indicate de kitul de lucru, in nm. Densitatile optice
ale standardelor se compara cu ale probelor, aflandu-se astfel concentratia probelor in
micotoxina analizata.
SOLUŢII
Solutii de utilizare generala
Metanol 70%
Metanol 35%
REGULI DE PROCEDURA PENTRU DETERMINAREA AFATOXINEI TOTALE
Pregatirea materialului:
 Spalarea sticlariei cu apa cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de
apa, clătire cu apa distilata, uscată, conform PO-L-10.
Dezinfectia suprafetelor de lucru cu solutii dezinfectante
47
Pregatirea esantionului pentru analiza
Esantionul se pregateste conform standardului specific al produsului respectiv. In
general probele se păstrează maxim 2 zile în frigider, după care se congelează la 20 ºC
atunci când trebuie păstrate pe o perioadă mai lungă. Probele congelate trebuie să fie
lăsate să se încălzească la temperatura camerei sau la frigider înainte de utilizare.
Prepararea reactivilor
Este important ca toţi reactivi să fie ţinuti 1-2 ore la temperatura camerei înainte
de utilzare, iar înainte de pipetare să fie agitaţi uşor. Se va prepara doar cantitatea
necesară pentru numărul de godeuri care se folosesc la determinare.
Actiuni si / sau masuri preventive
Protectia personalului
 Obligatorie purtarea halatului
Protectia mijloacelor de incercare si / sau masurare
 Sticlaria se pastreaza in dulapuri speciale
 Executarea periodica a serviciilor de intretinere si curatire zilnica a
aparaturii
 Verificarea si inregistrarea temperaturii din incaperea de lucru
Precauţii
Este necesar să se efectueze verificări periodice asupra kitului şi manualului, de
aceea este important să respecte protocolul venit odată cu kitul:
- Standardele conţin micotoxina, de aceea se vor manipula cu grijă.
- A nu se folosi kitul după data de expirare.
- A nu se folosi reagenţi de la alte kituri sau loturi cu excepţia componentelor cu
acelaş număr de lot în termen de valabilitate. ANTICORPII ŞI PLACA SUNT
SPECIFIC KIT-ului ŞI LOTULUI. Pentru solutiile preparate se va avea in vedere ca
să fie amestecate în volume corecte.
- A se menţine temperatura laboratorului între 20º - 25º C. A nu se efectua analiza în
prezenţa curenţilor de aer, pentru că poate determina scăderea
temperaturii/încălzire excesivă, precum şi evaporarea. În timpul incubării placa nu
se va pune pe suprafeţe reci.
- A se folosi doar apă distilată.
- Când se face pipetarea în godeuri goale vârful pipetei să atingă pereţii godeurilor.
- Timpul de incubaţie să fie cât mai precis. La pipetare se vor pipeta mai întâi
standardele şi apoi probele.
- Standardele se adaugă în ordinea concentraţiei în ordine crescătoare, minimalizând
astfel compromiterea curbei standard.
- Placa trebuie să fie păstrată întodeauna în pungă şi aceasta să fie sigilată. Pentru a
prevenii apariţia condensului şi se va lăsa să se încălzească treptat la 20-25ºC
împachetată.
MOD DE LUCRU
Factorii care influenteaza fidelitatea metodei sunt urmatorii :
 Mărunţirea şi omogenizarea probei
48
 Pregătirea corespunzătoare a sticlăriei
 Corectitudinea preparării extractului apos
 Corectitudinea pipetarii standardelor si al probelor
CALCULUL ŞI EXPRIMAREA REZULTATELOR MICOTOXINELOR
Curba standard poate fi trasată prin împărţirea absorbanţei (%) obţinută la fiecare
standard la concentraţia în ng/mL pe o curbă logaritmică.
Absorbanţa standard (sau probă) X 100

Absorbanţa relativă(%)=
Absorbanţa standard zero
ASIGURAREA CALITATII REZULTATELOR

Asigurarea calitatii rezultatelor se realizeaza prin :
- verificarea intermediara a balantelor : zilnic - prin activarea meniului de
calibrare interna si saptamanal cu ajutorul trusei de greutati F2 (etalonata) ;
- Coeficientul de corecţie al curbei de calibrare R2 trebuie sa fie minim 0,950 ;
- Absorbanta standardului 0,00 (control negativ) sa nu scada sub 0,600nm;
- Folosind o proba cu valoare cunoscuta sau fara valoare in analitul de interes,
se realizeaza o fortificare la limita maxima admisa corespunzatoare unei
matrici din setul de determinari efectuate intr-o zi. Procentul de recuperare
astfel obtinut trebuie sa se incadreze in intervalul conform Reg. CE 401/2006
dupa cum urmeaza :
Criterii de performanta micotoxine Interval procent de recuperare

conf Reg C.E. 401/2006
Aflatoxina Totala si B1 70-110 %
Ochratoxina A 70-110 %
Zearalenona 60-120%
Deoxinivalenol 60-120%
LABORATOR 7
DETERMINAREA METALELOR GRELE PRIN S.A.A. DIN

PRODUSE ALIMENTARE ŞI FURAJE
Scop
49
Procedura stabileste modul in care se efectueaza determinarea continutului de
reziduuri in plumb si cadmiu al produselor alimentare prin spectrometrie de absorbtie
atomica.
Domeniu de aplicare
Metoda se aplica la determinarea continutului de reziduuri de metale grele din
produse alimentare de origine animala, non-animala şi apa prin spectrometrie de
absorbtie atomica dupa calcinare.
Documente de referinta
 SR EN 13804/2003 – Produse alimentare. Determinarea microelementelor.
Criterii de performanta, consideratii generale si pregatirea probei.
 SR EN 14082/2003 – Produse alimentare. Determinarea microelementelor.
Determinare plumb, cadmiu, zinc, cupru, fier si crom prin spectrometrie de absorbtie
atomica (SAA) dupa calcinare.
 ORDIN ANSVSA 18/2007 – privind aprobarea Normei sanitare veterinare si
pentru siguranta alimentelor privind substantele nedorite din hrana pentru animale.
 ORDIN ANSVSA 97/2005 – privind aprobarea Normei sanitare veterinare si
pentru siguranta alimentelor privind anumiti contaminanti din alimentele de origine
animala si nonanimala.
 SR EN ISO/CEI 17025 :2005 – Cerinte generale pentru competenta
laboratoarelor de incercari si etalonari.
 Ordinul MAAP 76/2003 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind
metodele de referinţă pentru detectarea reziduurilor de metale grele si arsen
 Ordinul ANSVSA 141/2004 privind aprobarea Normelor sanitar veterinare şi
pentru siguranţa alimentelor privind anumiţi contaminanţi din alimentele de origine
animală şi nonanimală
Definiţii
Reziduu - orice substanţă având o acţiune farmacologică cât şi alte substanţe,
inclusiv derivaţii şi metaboliţii săi, care, în mod natural, nu se găseşte în organismul
animal sau în produsele de origine animală, dar care poate fi regăsită ca urmare a
încorporării ei în mod conştient sau accidental în produsele de origine animală şi care,
prin depăşirea limitelor admise, poate constitui un factor de risc pentru sănătatea umană
Metalele grele sunt elemente care, ca atare sau compuşii lor, în concentraţie
peste anumite niveluri în alimente, sau apa sunt recunoscute ca substanţe vătămătoare
pentru organismul uman sau animal: mercur, arsen, plumb, cupru, cadmiu, zinc, staniu,
etc.
Principiul metodei
Spectrofotometria de absorbţie atomică se bazează pe determinarea
concentraţiei unui element chimic din proba ce se analizează, prin măsurarea absorbţiei
unei radiaţii electromagnetice cu lungime de undă specifică, la trecerea acesteia prin
mediul în care sunt uniform distribuiţi atomii liberi ai elementului respectiv. Nivelul de
absorbţie este proporţional cu concentraţia atomilor în mediul de distribuţie.
50
Pentru evaluare cantitativa este necesara folosirea unui standard de referinta si
anume, o solutie care contine numai elementul dorit, cu concentratie cunoscuta.
Soluţii
Reactivii necesari pentru efectuarea analizelor sunt conform SR EN 13804 –
pct.7.1., 7.2.:
 Apa de înaltă puritate (distilata şi deionizată). Se pastrează numai în recipiente
de material plastic bine închise.
 Acid azotic : 65% pro analysis
 Acid azotic : c = 0,1 mol/l ( se diluează 7 ml acid azotic conc. 65% cu apa
deionizată, la 1000 ml în balon cotat) Acid clorhidric : 37% pro analysis
 Acid clorhidric : c = 6mol/l ( se dilueaza 500ml HCl conc. 37% cu apa
deionizată, la balon cotat de 1000 ml.)
 Peroxid de hidrogen : 30% (m/m).
 Soluţii standard concentrate (1000mg/l) : Cadmiu (Cod 1.19777); Plumb (Cod
1.19776)
Soluţiile standard pentru elementele : Pb şi Cd se prepară din soluţii concentrate
(1000 mg/l) astfel : din fiecare soluţie standard se masoară câte un volum de 10 ml cu
micropipeta 1-10 ml sau pipete cl. A, fiecare se aduce cu acid azotic ( c = 0,1 mol/l ) la
100 ml în balone cotate şi se omogenizează bine. Acestea sunt soluţiile stoc ce conţin
100 µg/ml ( 100ppm ). Soluţiile se pot păstra timp de o lună.
Solutiile standard de utilizare pe SAA(ppm)
Din solutia stoc (100 ppm) se prepara solutiile de utilizare cu concentratii de
ordinul microgra-melor/ml, ca in exemplele din tabelul nr. 2, masurarile trebuie facute cu
mare exactitate (se folosesc micropipete sau pipete clasa A). Solutiile de utilizare se
prepara cu acid azotic (c=0,1 mol/l ) in baloane cotate de 100 ml si pot fi folosite max. 2
saptamani.
Tabelul nr. 2
Sol. de Sol. de Sol. de Sol. de Sol. de
Sol.
Sol. standard utilizare nr. utilizare nr. utilizare nr. utilizare nr. utilizare nr.
stoc
1 2 3 4 5
Cd 100 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0
Pb 100 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Cu 100 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0
Zn 100 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Fe 100 0,5 1,0 1,5 2,5 5,0
Aparatură şi sticlărie
 Moara Grindomix, tip GM200, seria/nr. 125081225G
 Baie de nisip Gerhardt, tip HC 33, seria 4020996
 Plita electrica Schott, seria/nr. 00998792 ;
51
 Etuva termoreglabilă tip FD 115 seria nr. 02-35471 - reglabilă la 103  2C ;
 Balanţa analitică electronică Kern, tip ABJ 220-4M, serie/nr. WB 04550085.
 Cuptor de calcinare NABERTHERM model L5/11/B170 , seria/nr. 181719;
 Spectrofotometru de absorbţie atomică GBC, tip Avanta PM, serie /nr. A5405
 Aparat de bidistilat Fistreen Cyclon Sanyo, model WSCO44MH3.4,seria/nr. F1-
E120008;
 Baie de apă termoreglabilă Julabo , tip TW 8 serie/ nr. 10074474;
 Creuzete şi capsule de porţelan pentru calcinare.
 Pipete gradate de 1,2,5,10 cm3
 Baloane cotate de 50, 100,500 cm3 (clasa A)
 Cilindri gradaţi, exicator şi sticlărie uzuală de laborator (pâlnii simple, pahare,
baghete).
 Butelie de acetilenă
 Hartie de filtru cu filtrare rapida, spatule, cleste pentru creuzeti, site de azbest,
triunghiuri de samota, alcool medicinal, vata, tifon, perii si bureti pentru spalat
sticlaria de diverse dimensiuni, suporti pentru pipete, suporti pentru sticlarie,
cutite, tocatoare, desfacator conserve.
Reguli de procedură
Pregătirea instrumentelor prin spalare
Spalarea sticlariei si a altor echipamente contaminate se face cu apa de la robinet
si apoi cu detergent daca este necesar sa se indeparteze grasimea.
Se indeparteaza toate urmele de detergent prin spalare cu apa de robinet si se
lasa sticlaria si ustensilele de plastic cel putin peste noapte intr-un vas umplut cu
amestec de acid azotic concentrat si apa (1+9 parti in volume), apoi se clatesc bine cu
apa deionizata.
Trebuie data atentie speciala creuzetelor. Daca este necesar, creuzetele se fierb
cu acid inainte de folosire.
Pipetele, dupa utilizare, se vor spala cu apa de la robinet, se vor introduce intr-un
amestec oxidant : bicromat de potasiu solutie 30% - acid sulfuric conc. in raportul 1 : 3–
cel putin peste noapte, se spala apoi cu multa apa de la robinet si se clatesc cu apa
deionizata. Daca pipeta este bine spalata apa se scurge fara a lasa picaturi pe peretii
vasului. Daca raman picaturi se repeta operatia de spalare. Dupa spalare, pipetele se
usuca asezandu-se in suporti de plastic.
Pregătirea eşantionului pentru analiză
Eşantionul se pregăteşte conform standardului specific al produsului. Proba
supusă analizei se prelucrează corespunzător (tocare, mărunţire, mojarare,
omogenizare) astfel încât să se obţină o masă uniformă şi omogenă. În timpul prelucrării
trebuie evitată orice fel de impurificare a probei. Pentru pregatirea esantionului pentru
analiza trebuie sa fie disponibila o masa de esantion de cel putin 200 g din partile
comestibile ale esantionului de laborator. Partile care nu sunt destinate consumului se
indeparteaza din aliment, de exemplu frunzele exterioare, cochiliile, pielita, oasele. Mai
mult, se indeparteaza contaminantii suprafetei brute ca sol, parti sau frunze putrede ale
52
plantei. Cele mai multe esantioane de alimente necesita spalare mai mult sau mai putin
intensa, in functie de gradul de murdarire. Proba astfel prelucrată se păstrează în pungi
de plastic sau borcane ermetic închise,iar pentru unele produse grase (ca de exemplu
carne, produse din carne ) esantioanele pentru analiza se pastreaza congelate.
Acţiuni şi măsuri preventive
Protecţia personalului
 Obligatorie purtarea halatului şi a mănuşilor de protecţie în timpul prelucrării
probelor
 Obligatorie montarea şi funcţionarea hotei deasupra SAA datorită vaporilor toxici
emanaţi în timpul determinărilor
 Niciodată nu va monta sau demonta vasul de reacţie în timpul determinării fiind
posibil formarea unui amestec exploziv aer-hidrogen.
 Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante.
Protecţia mijloacelor de încercare sau măsurare

 Sticlăria se păstrează în dulapuri speciale
 Reactivii se păstrează în dulapuri speciale
 Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a aparaturii
 Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru
Mod de lucru
Factorii care influenţează fidelitatea metodei sunt următorii :
 Omogenizarea probei
 Pregătirea corespunzătoare a sticlăriei
 Corectitudinea preparării probei prin calcinare
 Soluţiile de reactivi
Mineralizarea uscată
Creuzetul de portelan curat, uscat si pastrat in exicator se tareaza la balanta
analitica (avand precizia de 0,1mg), apoi in el se introduce o cantitate convenabila din
proba ( in general 10 g … 20 g ) si se cantareste din nou. Toate cantaririle trebuie
efectuate cu precizie de 10 mg, functie de tipul probei si notate in caietul de lucru.
Creuzetul cu produs se usuca si se arde incet pe plita electrica pana la stadiul de
carbune. In faza finala a arderii se poate produce aprinderea carbunelui. Trebuie
acordata mare atentie la arderea produselor care manifesta tendinta de umflare sau
improscare, pentru a evita pierderile in cursul acestor operatiuni.
Dupa incheierea carbonizarii la flacara ( nu mai iese fum din creuzet ), creuzetul se
introduce in cuptorul electric reglat la 4500±100C unde se mentine un timp convenabil
pentru finalizarea calcinarii (10-16 ore). Cenusa rezultata trebuie sa aiba culoarea
uniforma ( alba sau cenusie ) si sa nu mai contina puncte negre de carbune.
Daca cenusa este gata, se lasa creuzetele sa se raceasca in cuptorul de calcinare
cu usa cuptorului deschisa. Dupa racire, creuzetele se pun pe site de azbest si se
asteapta racirea lor completa pentru a se adauga acidul clorhidric. Daca proba nu este
53
complet calcinata se umecteaza cenusa cu 1 ml pana la 3 ml apa deionizata sau peroxid
de hidrogen, se pune creuzetul din nou in cuptor la nu mai mult de 200 0C si se creste
temperatura treptat pana la 4500 ± 100C pentru 1-2 ore sau mai mult. Se repeta aceasta
operatiune pana ce proba este calcinata complet, adica pana ce cenusa este alba/gri sau
putin colorata ( numa-
rul de repetitii variaza mult in functie de tipul de proba).
Probele cu continut ridicat de grasime si/sau zahar trebuie calcinate cu mare
atentie.Probele grase se pot autoaprinde usor, iar cele cu continut bogat in zahar au
tendinta sa-si mareasca volumul in timpul calcinarii si pot apare pierderi.
Prelucrarea mineralizatului
In creuzetul cu cenusa cu ajutorul pipetei cl. A de 5 ml se adauga 5 ml HCl, de c=
6 mol/l in asa fel incat toata cenusa sa intre in contact cu acidul. Se evapora acidul pe
baia de nisip sau pe sita de azbest incalzita la flacara aragazului. Se dizolva apoi reziduu
intr-un volum exact de acid azotic c= 0,1mol/l, masurat cu pipeta de 10 ml (clasa A) : 10
ml pana la 30 ml. Se roteste creuzetul cu grija astfel incat toata cenusa sa intre in contact
cu acidul. Se acopera cu o sticla de ceas si se lasa proba sa stea de la 1 ora la 2 ore.
Se amesteca bine solutia din creuzet cu o bagheta, se filtraza prin hartie de filtru
cu filtrare rapida trecandu-se continutul intr-un vas de sticla din care se fac direct
determinarile, sau se poate filtra prin hartie de filtru cu filtrare rapida intr-un balon cotat
de 25ml sau 50 ml si se aduce cantitativ la semn cu acid azotic c=0,1mol/l si apoi se vor
face determinarile.
In paralel se pregateste o proba blanc, cu reactivii de la mineralizare, tratandu-se
martorul reactivilor in acelasi fel ca si probele.
Din soluţia probei mineralizate astfel se pot determina : Cu, Zn, Pb, Cd, Fe, Sn.
Determinarea elementelor prin SAAF - obtinute prin mineralizare uscata
Cu aproximativ 30 min. inaintea determinarii se deschide aparatul, apoi se
cupleaza generatorul de aer, se deschide robinetul la butelia de acetilena, se regleaza
debitul de aer la si debitul de acetilena, se actioneaza lampa catodica corespunzatoare
elementului cupru , se aprinde flacara si se regleaza aparatul ( deschiderea
nebulizatorului, inaltimea arzatorului etc.) in asa fel incat absorbanta corespunzatoare
unei solutii de 5,0 µg/ml Cu sa fie de minimum 0,7.
Dupa reglarea aparatului se opreste flacara si se actioneaza lampa catodica
pentru elementul pe care vrem sa-l determinam. Se regleaza parametrii operationali
( lungime de unda, fanta, se verifica daca sunt introdusi parametrii pentru curba de
etalonare . Se vor introduce datele de identificare a probelor de analizat in programul
aferent acestora.
Dupa initializarea aparatului se va aprinde flacara din progamul GBS Avanta sau
manual din butonul galben al aparatului, se aspira pe rand cele cinci solutii standard de
lucru prevazute in tabelul 2, se masoara si se inregistreaza absorbantele si concentratiile
pentru fiecare, stabilindu-se astfel curba standard ( aspiratia solutiei –direct din balonul
cotat) si daca este necesar se va repeta etalonarea pana la un coeficient de corectie de
minim 0,9900.
54
Se aspira apoi solutiile probelor si se inregistreaza concentratiile. Dupa citirea
fiecarei probe se va spala traseul de aspiratie cu apa deionizata.
Din aceeasi solutie a probei se determina in cotinuare celalalt element in aceleasi
conditii, folosind solutiile standard, lampa catodica specifica si parametrii specifici lampii
respective.
La fiecare lot de probe care cuprinde maxim 10 probe se va citi si o proba fortifiata
in elementul de determinat la limita maxim admisa, pe matricea respectiva, conform
legislatiei in vigoare.
Dupa terminarea citirii probelor se spala traseul cu apa deionizata, se usuca prin
aspirare timp de 1 min. aer, apoi se stinge flacara automat din progamul GBS Avanta
sau manual din butonul galben, se inchide robinetul la butelia de acetilena, se
decupleaza compresorul de aer, se opreste aparatul apoi acesta se igienizeaza.
Tabel nr. 3 – Parametrii aparaturii pentru SAA în flacără
Metal Flacara F Conc Lu Dom

anta entratia ngime de eniu
caracteristic unda, nm liniar(mg/L)
a
Zn Aer-acetilena - 0,5 0,018 213,9 1,0
oxidanta
Cu Aer-acetilena - 0,5 0,077 324,7 5,0
oxidanta
Pb Aer-acetilena - 1,0 0,19 217,0 20,0
oxidanta
Cd Aer-acetilena - 0,5 0,028 228,8 2,0
oxidanta
Mn Aer-acetilena - 0,5 0,11 589,6 1,0
oxidanta
Fe Aer-acetilena - 0,2 0,19 248,3 9,0
oxidanta
Calculul şi exprimarea rezultatelor

Calculul rezultatelor – pentru determinarea reziduurilor de Cd, din produse
alimentare cu GFAAS, afisarea rezultatelor se face direct prin introducerea in programul
dezvoltat pe metoda a masei produsului de analizat si a volumului de solutie supusa
analizei.
In cazul in care, in proba analizata continutul elementului este mai mare decat
valoarea maxima a solutiei standard de calibrare, atunci solutia initiala se dilueaza
corespunzator. Atunci cand valorile obtinute sunt sub limita de detectie, rezultatul este
raportat ca « nedetectabil ». Pentru valorile obtinute intre limita de detectie a aparatului
55
(LOD) si limita de coantificare (LQ) rezultatul este raportat  LQ. Rezultatele obtinute se
rotunjesc la a 2-a zecimala.
Valoarea exprimata in mg/kg ( sau µg/g) se obtine si prin aplicarea formulei de
calcul :
E = C x V x 1000/ m x 1000 [ mg/kg]

in care :
- E = denumirea elementului ;
- C = concentratia din solutia de proba preluată din curba standard, in mg/l ;
- V = volumul de solutie de proba, in mililitri ;
- m = cantitatea de proba luata in lucru, in grame ;
- 1000 = factorul de raportare a continutului la 1000 g (1 kg) ;
- 1000 = factorul de transformaare a microgramelor in miligrame.
Nota : In cazul in care se presupune ca proba are un continut foarte redus in elementul
urmarit, atunci se ia in calcul pentru mineralizare o cantitate mai mare de proba, in
functie de natura produsului (solid, lichid) si se tine cont de aceasta la calculul
rezultatelor.
In cazul in care in proba analizata continnutul elementului este mai mare decat valoarea
maxima a solutiei standard de calibrare, atunci solutia initiala se dilueaza corespunzator.
Bibliografie
56
Bacterial Nomenclature up – to – date (Approved lists, validation lists), April 2012.

Compiled by Leibniz Institute DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroornismen und
Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany.
Bârzoi D., Meica S., Neguţ M. 1999. Toxiinfecţii alimentare. Editura Diaconu Coresi,
Bucureşti.
Bârzoi D., Apostu S., 2002. Microbiologia produselor alimentare. Editura Risoprint, Cluj
Napoca.
Enache T., Paul I., Sănescu V., Popescu O., Iordache I.,1994. Medicină Legală
Veterinară. Editura ALL Bucureşti.
Ivana Simona 2007. Microbiologie Medicală Veterinară, Vol I. Editura Ştiinţelor Medicale.
Ivana Simona, 2007. Microbiologie Medicală Veterinară, Vol II. Editura Asclepius.
Mateescu C., Nicolae I., Neguţ Lucia, Bălăucă N., Onac N., Nicolae F., 2006. Tratat de
Siguranţă Alimentară. Editura Biotera Bucureşti.
Oneţ E., Constantinescu Virginia, 1978. Diagnosticul de laborator în medicina veterinară.
Editura Ceres
Savu C., 2002. Igiena şi controlul produselor de origine animală. Editura Semne E,
Bucureşti.
Savu C., Georgescu Narcisa, 2004. Siguranţa Alimentelor. Editura Semne E, Bucureşti.
Savu C. 2008. Igiena şi controlul produselor de origine animală. Editura Semne.
Savu V. 2012. Metoda recuperării pe mediu solid pentru izolarea şi cuantificarea
enterococilor din brânzeturi. Revista Română de Medicină Veterinară , Vol. 22, nr.
1/2012.
Ştirbu C., Turcu D., 1999. Noţiuni de bacteriologie. Editura Brumar Timişoara.
Turcu D., 2005. Virusologie – Lucrări aplicative. Editura Fundaţiei România de Mâine.
Turcu D., 2007. Bacteriologie Generală. Editura Fundaţiei România de Mâine.
Turcu D., 2004. Bacteriologie – Lucrări aplicative. Editura Fundaţiei România de Mâine.
Ordinul ANSVSA nr. 43/2012. Norme metodologice de aplicare a Programului acţiunilor
de supraveghere, prevenire, control şi eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile
de la animale la om, protecţia animalelor şi protecţia mediului, de identificare şi
înregistrare a bovinelor, suinelor, ovinelor şi caprinelor pentru anul 2012
Regulamentului (CE) nr. 2073 / 2005 din 15 noiembrie 2005 privind criteriile
microbiologice pentru produsele alimentare publicat în Official Jurnal of the European
Union. Realizat la Brussels, la 15 Noiembrie 2005.
Procedură ANSVSA – privind prelevarea probelor
Regulamentul (CE) Nr.2074/2005 al Comisiei din 5 decembrie 2005 de stabilire a
măsurilor de aplicare privind anumite produse reglementate de Regulamentul (CE) nr.
853/2004 al Parlamentului European şi al Consiliului şi organizarea unor controale
oficiale prevăzute de Regulamentele (CE) nr. 854/2004 al Parlamentului European şi al
Consiliului şi (CE) nr. 882/2004 al Parlamentului European şi al Consiliului, de derogare
de la Regulamentul (CE) nr. 852/2004 al Parlamentului European şi al Consiliului şi de
modificare a Regulamentelor (CE) nr. 853/2004 şi (CE) nr. 854/2004
57
Regulamentul (CE) nr. 1441/2007 al Comisiei din 5 decembrie 2007 de modificare a
Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele
alimentare.
58

Controlul Produselor Agroalimentare

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Controlul Produselor Agroalimentare

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Controlul produselor agroalimentare de origine vegetală - Lucrări practice

CONTROLUL PRODUSELOR AGROALIMENTARE

Numărul Conţinutul Pag.

PRELEVAREA PROBELOR DE PRODUSE ALIMENTARE ÎN

Prelevarea de probe în vederea testării microbiologice presupune parcurgerea

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI

Standardul stabileşte o metodă orizontală pentru enumerarea microorganismelor

Foto nr. Mediu de cultură PCA – Pulbere deshidratată

Foto nr. Mediu de cultură PCA – determinare pH

Foto nr. Mediu de cultură PCA

Sterilizare - se sterilizează la autoclav la 121oC timp de 15 minute;

Foto nr. Introducerea plăcilor în incubator

unde;  C – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute

Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative. Ca rezultat se ia

C 168 + 215 + 14+ 25 422

Cazul 2. Rezultate cu un număr de germeni peste 300.000/ml

Cazul 3. Rezultate cu un număr de germeni peste 500.000/ml

560  490  58  52 1160

Cazul 4. Rezultate cu un număr de germeni peste 700.000/ml

760  700  77  68 1605

Cazul 5. Rezultate cu un număr de germeni peste 1.000.000/ml

Aparatură şi sticlărie folosită:

Foto nr. Mediu Rappaport –Vasilliadis Foto nr. Müller –Kauffman

3. Izolare şi identificare: din culturile obţinute în urma inoculării RVS şi MKTTn, se

Foto nr. Mediu XLD Foto nr. Mediu Rambach

Foto nr. Mediu cromogen

Foto nr. TSI

Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roşie) cu formare de

Foto nr. Reacţia de aglutinare

Fermentarea biochimică a zaharurilor

Foto nr. Agar nutritiv – colonii de Salmonella

Diagrama modului de lucru

Apa peptonata – tamponata

Incubare (9,2) timp de 18 h

0,1 ml cultura 1 ml cultura

10 ml bullion RVS 10ml bullion MKTTNn

Mediu XLD si al doilea agar la alegere

De pe fiecare placa se testeaza o colonie

Alte posibilităţi de diagnostic

Detectarea drogdiilor şi mucegaiurilor

 Se toarnă circa 15 ml mediu extract de drojdie-dextroză-cloranfenicol-agar

unde; C – suma coloniilor numărate în toate cutiile

DETERMINAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES

Listeria monocytogenes, reprezintă specia de interes pentru microbiologia

2. Faza de îmbogăţire selectivă – Din cultura cu mediu demifraser se

Mediu Palcam (înainte de însămânţare) Mediu Palcam (după însămânţare şi termostatare)

Foto nr. Mediul Oxford

Foto nr. Mediu cromogen (ALOA)

 Interpretarea - După incubare, cutiile Petri însămânţate, se examinează şi

Foto nr. Listeria - agar nutritiv Foto nr. Listeria – bulion

1. Mobilitate - Examen microscopic- între lamă şi lamelă; Examen

Foto nr. Testul mobilităţii

2. Reacţia catalazei - O ansă de cultură se introduce într-o picătură de

Foto nr. Testul catalazei

3. Testul hemolizei - Pe agar cu sânge se striază o ansă

Foto nr. Testul hemolizei

4. Fermentarea hidraţilor de carbon - în eprubetele cu zaharuri

5. Reacţia MR/VP- se foloseşte mediu Clarc şi reacţia este pozitivă

Diferenţiere diferitelor serotipuri în funcţie de rezultatele examenelor

Diagrama modului de lucru

Incubare timp de 48 h +/- 2

Striere pe agar Oxford Striere pe agar Palcam

Incubare timp de 24 h +/- Incubare timp de 24 h +/- 3