METODE ANALITICE UTILIZATE ÎN INVESTIGAREA

TRASABILITĂŢII
9.1. Metode spectrometrice de analiză
9.1.1. Spectrometria de masă cu raport izotopic (IRMS)
9.1.2. Spectrometria de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS)
9.1.3. Spectrometria de masă cu transfer de protoni (PTR-MS)
9.1.4. Cromatografía de gaze cuplată cu spectrometrie de masă (GS-MS)
9.2. Metode spectroscopie
9.2.1. Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară (RMN)
9.2.2. Spectroscopia în domeniul infraroşu (IR)
9.2.3. Spectroscopia de fiuorescenţă
9.2.4. Spectroscopia atomică
9.3. Metode de separare
9.3.1. Cromatografía lichidă de înaltă performanţă (HPLC)
9.3.2. Cromatografía de gaze (GC)
9.3.3. Electroforeza capilară (CE)
9.4. Metode bazate pe analiza ADN
9.4.1. Reacţia în lanţ a poiimerazei (PCR)
9.4.2. Simplificarea analizei ADN
9.4.3. Metode ADN cantitative
9.4.4. Secvenţierea ADN-uiui
9.4.5. Microseriile ADN şi aite metode bazate pe ADN
9.5. Metode proteomice
9.6. Metabolomica
9.7. Metode în timp real
9.8. Metodele imunologice
9.9. Analiza senzorială
9.10. Alte abordări
9.11. Trasabilitatea alergenilor
9.12. Trasabilitatea microorganismelor patogene
 9.8 METODE IMUNOLOGICE

Metodele imunologice se bazează pe capacitatea anticorpilor (imunoglobine) de a

recunoaşte structuri tridimensionale, imunogeni sau antigeni. Moleculele capabile să inducă
producţia de imunoglobine într-o anumită specie poartă numele de imunogeni sau antigeni.
Antigenul trebuie să aibă o masă moleculară de minim 5000 daltoni şi conţine structuri care
sunt străine speciei animale contestate.

Asocierea ireversibilă dintre anticorpi şi antigenii lor corespunzători poartă numele de

reacţie imunologică. Metodele imunologice se caracterizează printr-o mare specificitate,
deoarece antigenii reacţionează numai cu anticorpii care au indus formarea lor. De
asemenea, metodele sunt rapide şi pot conduce la obţinerea unor rezultate cantitative.
 Principala caracteristică a testelor imunochimice constă în marcarea antigenilor (Ag) sau
a anticorpilor (Ac) cu o substanţă care generează un semnal ce poate fi măsurat, facilitând
astfel detecţia complexului Ag-Ac. în funcţie de tipul acestei substanţe, testele imunochimice
sunt clasificate astfel:

- teste radioimunologice (RIA): utilizează marcarea cu radioizotopi (1251,3H, 14C, 32P);

- teste imunoenzimatice (EIA): utilizează marcarea cu enzime;

- teste imunochimice cu detecţie prin fluorescenţă (FIA): utilizează marcarea cu

molecule fluorescente (fluorocromi);

- teste imunochimice cu detecţie prin chemiluminiscenţă (CLIA): utilizează pentru

marcare molecule care generează chemiluminiscenţă, cum ar fi derivaţi de luminol, esteri
acridinici, derivaţi de oxalat de nitrofenil. O variantă a acestora o constituie testele
imunochimice cu detecţie prin electrochemiluminiscenţă (ECLIA) care utilizează pentru
marcare anumiţi compuşi organici (complexe de ruteniu, osmiu, etc.) care generează lumina
electrochimie.
 În prezent, cele mai utilizate metode imunochimice în analiza produselor alimentare sunt
testele imunoenzimatice ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), caracterizate prin
sensibilitate (pg/ml), costuri reduse şi rapiditate. în cadrul acestei metode, antigenul sau
anticorpul de captură este fixat pe un suport solid, după care este pus în contact cu o
imunoglobulină, un antigen sau respectiv orice moleculă pentru care are specificitate. O
enzima cuplată, fie direct de imunoglobulină sau de un alt anticorp anti-imunoglobulină,
degradează un substrat cromogen incolor, producând un compus colorat ce poate fi detectat
spectrofotometric la o lungime de undă corespunzătoare.

Datorită multiplelor aplicaţii ale metodei imunoenzimatice ELISA, au apărut diferite

protocoale pentru executarea acesteia în funcţie de particularităţile moleculei de determinat şi
de modul în care se desfăşoară procesele fundamentale ale metodei. O primă clasificare a
tehnicilor ELISA se poate face referitor la modul de fixare a anticorpului la antigenul de
captură, astfel făcându-se distincţia între fixare competitivă şi necompetitivă. O altă clasificare
se face în funcţie de modul direct sau indirect în care conjugatul se fixează de antigenul sau
anticorpul de captură. O categorie separată de tehnici ELISA o reprezintă tehnicile sandwich,
în care un antigen este prins între 2 sau chiar 3 anticorpi, dintre care primul este cel de
captură şi ultimul este cel de conjugat.
 Aceste metode sunt utilizate în principal pentru confirmarea autenticităţii cărnii şi
produselor din carne, laptelui şi produselor lactate dar şi a altor produse alimentare
de origine animală. Cu toate acestea sunt disponibile puţine aplicaţii comerciale ale
acestei metode.
Cercetările care utilizează tehnicile ELISA includ detectarea prezenţei cărnii de la
diferite specii în produse alimentare. De exemplu, metoda ELISA indirectă s-a
dovedit a fi sensibilă şi a fost standardizată pentru a detecta carnea de porc
(gătită/crudă) adăugată pentru falsificare la un nivel minim de 1% în carnea de
bovine, bivol, oaie, capră şi pasăre. De asemenea, metoda a fost folosită pentru
detectarea prezenţei proteinelor de origine vegetală în laptele praf şi pentru
diferenţierea laptelui provenit de la diferite specii.
Un domeniu cu importanţă din ce în ce mai mare este aplicarea acestor
metode pentru determinarea alergenilor în produse alimentare, de exemplu
pentru migdale sau alune, dar în special pentru gliadine. O aplicaţie
interesantă este folosirea metodei imunoenzimatice de detectare a IgG bovine
pentru clasificarea laptelui de bovină în funcţie de tratamentul termic suferit.
Metoda foloseşte pentru identificarea cu uşurinţă a laptelui UHT, întrucât
denaturarea IgG creşte semnificativ la temperaturi peste 73°C.
 9.9 ANALIZA SENZORIALĂ

Analiza senzorială (sau evaluarea senzorială) este considerată o tehnică

importantă pentru determinarea calităţii produselor. Ea cuprinde un set de tehnici
pentru măsurători precise ale răspunsurilor umane la produsele alimentare.
Aspectul, mirosul, aroma şi textura sunt caracteristici importante care determină
calitatea produselor alimentare.

Analiza senzorială necesită paneluri de evaluatori umani, care testează

produsele şi înregistrarea răspunsurilor date de aceştia. Prin prelucrarea statistică a
rezultatelor este posibil să se facă deducţii şi să se realizeze o cunoaştere profundă
a produselor analizate. Analiza senzorială necesită o pregătire vastă a evaluatorilor,
răspunsuri adecvate şi o analiză statistică detaliată a rezultatelor. Au fost efectuate
numeroase studii în încercarea de a găsi corelaţii între caracteristicile senzoriale şi
măsurătorile instrumentale obiective.
 Analiza componentelor principale a datelor senzoriale a permis diferenţierea vinurilor din
diferite zone geografice. În aceste studii, de obicei, în prima etapă sunt identificaţi mai mulţi
descriptori de către degustătorii de vinuri. Ulterior, numărul descriptorilor se reduce utilizând
metode statistice. în a doua etapă, degustătorii de vinuri identifică şi apreciază intensitatea
descriptorilor rămaşi pentru fiecare vin evaluat.

După aceasta descriptorii caracteristici pot fi găsiţi în vinurile provenite din fiecare zonă
geografică. De multe ori soiul de struguri şi zona de producţie sunt legate între ele. în mod
normal, rezultatele analizelor chimice permit o mai bună clasificare geografică a vinurilor
faţă de datele senzoriale.

Analizele senzoriale au fost aplicate pentru discriminarea geografică a unei băuturi

spirtoase (absint), a brânzeturilor şi uleiurilor de măsline.
 9.10 ALTE ABORDĂRI

Deşi s-au făcut progrese substanţiale în dezvoltarea de metode de autentificare

folosind tehnologii moderne, o serie de metode importante au fost dezvoltate folosind
tehnicile consacrate. Exemple de astfel de metode sunt:
- Conţinutul de azot al ingredientelor proteice a constituit principalul marker
pentru determinarea conţinutului de carne din produsele de carne. O serie de studii
au fost efectuate pentru a determina factorii "oficiali" ai azotului pentru carnea de
porc, vită, miel, pui, curcan, cod şi crustacee.
- Analiza trigliceridelor a fost utilizată pentru a determina cantitatea de grăsimi ce
nu provin din unt de cacao din ciocolată şi ciocolată cu lapte.
- Sterolul şi produsele de degradare a sterolului au fost utilizate pentru a detecta
grăsimile de origine animală în alimente vegetariene.
- O metodă care măsoară activitatea enzimei β-hidroxiacil-CoA dehidrogenaza
(testul HADH) eliberată din mitocondrii în carnea roşie şi de pasăre a fost utilizată
pentru a distinge între carnea răcită şi cea care a fost congelată şi apoi decongelată.
 9.11 TRASABILITATEA ALERGENILOR

Un compus care determină o reacţie imună în organism este denumit antigen iar
antigenul care determină reacţia alergică, alergen. Chiar şi o cantitate foarte mică de
alergen poate provoca probleme şi aproape orice produs alimentar poate provoca alergie
sau simptome de hipersensibilitate, în Europa, de exemplu, se consideră că următoarele
substanţe şi derivatele lor provoacă reacţii de hipersensibilitate: produse din cereale care
conţin gluten, peşte, crustacee, ouă, alune, soia, lapte şi produse lactate care conţin
lactoză, nuci, ţelină, muştar, seminţe de susan şi sulfiţi.

Directiva 2003/89/CE privind indicarea ingredientelor prezente în produsele alimentare a

intrat în vigoare în statele membre în noiembrie 2004. Conform acesteia, toate ingredientele
din produsele alimentare trebuie să fie marcate pe ambalaj, cu câteva excepţii care însă nu
includ alergeni.
 Persoanele care sunt alergice la laptele de vacă ar putea avea de suferit dacă laptele de
capră este falsificat cu lapte de vacă. Compoziţia moleculară a laptelui de la diferite specii de
animale variază şi aceasta este principala caracteristică utilizată pentru a le putea distinge.
Numeroase metode electroforetice, cromatografice şi imunochimice pot fi utilizate pentru
identificarea diferenţelor. Compoziţia grăsimii poate fi de asemenea determinată folosind
analiza acizilor graşi solubili în apă sau cu ajutorul profilului trigliceridelor. Separarea
proteinelor laptelui folosind diferite tehnici electroforetice este una dintre cele mai utilizate
metode pentru garantarea originii acestuia.

Metodele bazate pe analiza ADN au fost utilizate pentru testarea alergenilor de origine
vegetală. Analiza cantitativă PCR a fost folosită pentru detectarea grâului, orzului sau secarei
din alimentele fără gluten. A fost dezvoltată o metodă PCR bazată pe gena lectinei din
seminţe de soia (Lectin Le 1), cu ajutorul căreia se poate demonstra prezenţa soiei în carne
la un conţinut de peste 1%. De asemenea este disponibilă o metodă sensibilă (limită de
detecţie 10 ppm) pentru detectarea urmelor de alune în produse alimentare, bazată pe
amplificarea genei ce codifică alergenul din alune (. Metodele imunoenzimatice pot fi de
asemenea folosite pentru analiza alergenilor precum alune şi migdale.
 9.12 TRASABILITATEA MICROORGANISMELOR PATOGENE

Pentru urmărirea căilor de contaminare cu microorganisme pot fi utilizate diferite metode

microbiologice moleculare bazate pe analiza genotipului şi fenotipului unui microorganism.

Cu aceste metode pot fi stabilite care sunt produsele în care se găsesc acele
microorganisme care au fost găsite în probele recoltate de la pacient sau în care etape ale
procesului se pot găsi microorganisme care corespund celor găsite în produse. Metoda de
testare variază şi trebuie selectată pentru fiecare microorganism.

Metodele bazate pe analiza fenotipurilor includ biotiparea, serotiparea, tiparea fagilor şi

a bacteriocinelor. Există diferite metode de tipare, de exemplu gel electroforeza în câmp
pulsatil (PFGE), ribotiparea şi metode de tipare bazate pe PCR, cum ar fi polimorfismul de
ADN amplificat aleator (engl. Randomly Amplified Polymorphic DNA - RAPD) şi
polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate (engl. Amplified Fragment Length
Polymorphism - AFLP).