Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
toxiinfectii
alimentare.
Din
punct
de
vedere
morfologic,
mucegaiurile sunt formate din mai multe cellule eucariote care formeaza
miceliul, avand la randul lui o portiune aeriana si una situata n mediul n
care se dezvolta. Din punct de vedere fiziologic, o parte din miceliu este
reprezentata de aparatul vegetativ (hife tubular septate sau neseptate), iar o
alta parte de aparatul reproducator (hife pe care se dezvolta sporii).
Din punct de vedere metabolic, mucegaiurile au cteva caracteristici si
anume: cele mai multe sunt saprofite, dezvoltndu-se pe substraturi
organice; folosesc pentru hranire surse de carbon; prefer atmosfera umeda si
temperatura de dezvoltare ntre 20-300C; sunt n general aerobe si acidofile,
dezvoltndu-se la un pH cuprins ntre 3-7.
Identificarea mucegaiurilor se face cu ajutorul unor chei dicotomice, pe baza
clinica va fi acuta sau subacuta, iar la doze mici, patrunse n organism ntr-o
perioada de timp ndelungata manifestarea clinica va avea o evolutie cronica.
Morbiditatea si mortalitatea cuprind adesea un numar mare de animale mai
cu seama cnd factorii care favorizeaza dezvoltarea mucegaiului persista.
Micozootoxicoza apare n special n conditii de supraaglomerari, umiditate
ridicata, suprancalzire, etc., factorii principali fiind tot nutretul infestat si
aerul contaminat cu spori. Sporii de Aspergillus pot patrunde si prin porii
cojii n oua unde pot creste omornd embrionul sau producndu-i leziunile
caracteristice aspergilotoxicozei chiar n faza embrionara. n tara noastra sau diagnosticat numeroase cazuri de aspergilotoxicoza la majoritatea
speciilor de mamifere (bovine, ovine, porcine, cabaline, iepuri) si pasari
furajate cu nutreturi infestate cu mucegaiul Aspergillus flavus, A. fumigatus,
A. nidulans, etc. Incidenta maxima s-a nregistrat la tineretul aviar (boboci
de rata si gsca, pui de gaina, curca) precum si la pesti si albine.
asemenea furaje, la nivelul tubului digestive se absorb n organismul care lea consumat numai micotoxinele, iar fungii nu trec bariera intestinala si se
elimina cu fecalele.
Ochratoxina A
Cereale neprocesate 5 g/kg
Cereale neprocesate, destinate direct consumului uman 3 g/kg
Cereale procesate pentru copii 0,5 g/kg
Deoxinivalenol
Cereale neprocesate, altele dect gru dur, ovz i porumb 1250 g/kg
Gru dur, porumb i ovz neprocesate 1750 g/kg
Cereale i produse de mcini destinate direct consumului uman 750
g/kg
Paste finoase 750 g/kg
Pine, biscuii, snacks 500 g/kg
Cereale procesate pentru copii 200 g/kg
Produse de la mciniul porumbului cu particule > 500 m 750 g/kg
Produse de la mciniul porumbului cu particule 500 m 1250 g/kg
Zearalenon
Cereale neprocesate, altele porumb 100 g/kg
Porumb neprocesat 200 g/kg
ANALIZA
IMUNOLOGICA
ELISA
IMUNO
DETERMINARI
BAZATE PE
MEMBRANE
TEHNOLOGIA
LUMINEX xMAP
TEHNOLOGIA
MICROARRAY
ANALIZA
FLUORIMETRICA
MICOTOXINE
POLIMERI CU
RECUNOASTERE
MOLECULARA
METODA
FLUOROMETRICA
TEHNOLOGIA
UNDELOR
EVANESCENTE
CLASIFICAREA TEHNICILOR
CROMATOGRAFICE
S-au
realizat
numeroase
variante
ale
metodei
sa
corespunda
dimensiunilor
moleculelor
supuse
Cromatografia
lichid-lichid
(LLC),
care
faza
stationara este o
faza lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un
suport solid, ntr-o coloana. Aici suportul solid este inert fata
de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai
raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de
lichide.
5.
Cromatografia
pe
coloana
deschisa
sau
cromatografia planara
(PC) faza mobila circula printr-un material poros dispus ntrun plan si formnd un strat relativ subtire, dar de compozitie
confectionata
de
dimensiuni
capilare,
gazului
nu
modifica
selectivitatea.
Faza
azi,
substantelor
proportie
moleculare:
aproximativ
organice,
80%,
analiza
organometalice
si
de
realizat
prin
alte
tehnici.
Cuplajul
cu
izolarea
preparativa
compusilor
naturali.
Prin
coloanei
intra
ntr-un
detector
de
unde
conductivitate a solutilor;
-
fuorescenta a substantelor.
Un alt criteriu prin care se deosebesc sau se aseamana este
cel referitor la amestecurile de substante asupra careia se
fac analizele:
- detectori spectrofotometrici n UV-VIS sunt folositi in
identificarea
hidrocarburilor
liniare
si
aromatice
si
FAZE IN HPLC
Prepararea probei
Injectarea in coloana
Eluarea cu faza mobila
Detectarea componentilor din proba
Identificare si masurare
A) Tatonari
1) preparari solutii standard
- apa + substanta (concentratii medii si mici)
- parametrii HPLC (conc, debit, detector, injectare)
- coloana si faza mobila
- gradient de concentratie (cand e cazul)
2) stabilire profil de actiune al substantei
- substante izomere prezente in sistem concomitent
- substante rezultate prin degradare
- etaloane (izomeri, substante de degradare)
3) - concluzii
- stabilire lungime de unda pentru analiza
- specificitate fara interferente la RT (Retention Time)
B) Studii intermediare
- stabilitate on line ( 1 2 3 12 24 ore) la diferente de
temperatura cuprinse intre 5C
- liniaritate solutii standard 8 conc. ( 3 conc. la limita minima)
C) Validare
1) Specificitate
- teste in diferiti solventi (polari si nepolari cel putin 5)
- lipsa interferentelor la RT
2) Partea Esentiala preparari solutii
a) liniaritate din faza mobila se prepara 8 conc. (3 la minim)
C1-1 C2 C3-1 C4-1 C5 C6 C7-1
C8
C1-2
C3-2 C4-2
C7-2
C1-3
C3-3 C4-3
C7-3
C1-4
C3-4 C4-4
C7-4
C1-5
C3-5 C4-5
C7-5
LDD
QCA QCB
QCC
A. Tatonari
a) se prepara solutii standard n mediu apos sau solvent
preselectat:
- prepararea solutiilor de concentratii medii si mici utiliznd
substanta active si apa purificata sau solvent pur;
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului HPLC;
- se alege coloana cromatografica si faza mobila de lucru;
- eventual se stabileste gradientul de concentratie respectiv
etapele intermediare de spalare a coloanei cromatografice.
b) se prepara blanc-uri de solutie n vederea eliminarii
posibilelor interferente cu substantele active luate n lucru:
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului HPLC;
- se efectueaza studii pe coloana cromatografica si faza mobila
aleasa;
-
se
efectueaza
studii
pentru
alegerea
gradientului
de
concentratie si a
etapelor de spalare a sistemului.
c) se dopeaza matricea cu substante active la concentratii medii
si mici:
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului HPLC astfel nct
semnalele
de raspuns ale substantelor active respectiv ale componentelor
de degradare sa nu se suprapuna, pentru posibilitatea evaluarii
cantitative a substantelor active dopate;
- se efectueaza studii pe coloana cromatografica si faza mobila
aleasa;
se
efectueaza
studii
pentru
alegerea
gradientului
de
concentratie si a
etapelor de spalare a sistemului.
d) se stabileste profilul de actiune al substantei active:
- se stabileste daca exista substante rezultate printr-o posibila
degradare sau asociere;
- se stabileste semnalul de raspuns corespunzator fiecarei
componente
cunoscute;
- se efectueaza studii de determinare a substantelor noi aparute
n procesul de dopare (substante de asociere, degradare,
metaboliti etc), n vederea selectarii celor care prezinta interes.
B. Faza de stabilire a caracteristicilor de performan ta a
metodei
a) se efectueaza studii de stabilitate on-line pentru substantele
active, derivati respectiv standarde de lucru, n autosamplerul
sistemului HPLC, la temperatura prestabilita si la intervale de
timp de 1, 2, 3 ... 10, ...12, ...24, ...48 ore, perioada care sa fie
acoperitoare cu un exces de cel putin 30% fata de timpul maxim
stabilit pentru secventa completa.
b) se verifica liniaritatea nregistrarilor pentru 8(opt) concentratii
diferite (dintre care 3(trei) aproape de limita minima) att pentru
solutiile standard ct si pentru cele dopate cu substante active,
derivati, alte substante etalon.
C. ntocmirea protocolului de validare Pre-Study
n protocol se trec concluziile referitoare la caracteristicile si
parametri
Reproductibilitatea
(Intermediate
Precision)
se
determina n
urmatoarele 4 zile consecutive, repetnd probele de la liniaritate
cu cele 8
concentratii c1 c8 alese mai sus pentru care se calculeaza
exactitatea (acuratetea)E% si coeficientul de variatie (precizia)
CV%,
respectnd
criteriile
precizate
la
paragrafele
corespunzatoare.
D. Stabilitatea (Stability) care se determina tinnd seama de
urmatoarele:
1.
stabilitatea
on-line
(intermediara)
autosamplerul
anexate
cromatogramele
nregistrate
cu
numele
mica
concentratie
de
cuantificare
(Lower
Limit
of
ntr-un
domeniu
de
20%
pentru
cea
mai
mica
assay).
Se
calculeaza
concentratiile
medii,
deviatiile
de
calibrare
corespunzatoare
zilei
respective.
proaspat
preparate
ziua
respectiva
(cu
aceleasi
cuantificare
(LLQ),
iar
celelalte
trei
pentru
valorile
Nr.
1
2
3
4
Ziua
0
2
3
10
Arie pic
33,8
30,9
33,3
31,8
Date statistice
Arie medie=32,45
SD= 1,3379
RSD (%)= 4,1230
TABEL 1
cromatograma
a fost
corespunzator
I
20,000
33,800
II
17,1
26,7
Arie pic
III
IV
15,9
13,8
30,9
25,4
V
18,1
26,2
VI
17,8
33,3
Arie
medie
17,12
29,38
39,06250
78,12500
156,2500
312,5000
625,0000
937,5000
1250,000
56,100
95,000
177,30
337,80
628,40
898,74
1232,1
53,4
86,7
172,8
328,5
614,50
904,2
1194,8
45,1
93,3
165,8
331,9
619,70
898,4
1166,5
47,9
89,3
165,7
302,5
602,10
905,4
1192,6
42,6
85,8
164,5
306,8
559,90
909,7
1041,4
48,7
80,6
158,3
321,5
611,50
914,8
1202,2
48,97
88,45
167,40
321,50
606,02
905,21
1171,60
TABEL 2
1,0750780952381
LQ=10xSE=10x1,3229431474665=12,31ng/ml (2)
panta
1,0750780952381
Precizie si exactitatea
Prima etapa in determinarea preciziei o reprezinta studiul sistemului.
Astfel, o solutie de concentratie de 20ng/ml a fost analizata de cinci ori.
Ariile picurile corespunzatoare ochratoxinei A pentru cele cinci determinari
sunt prezentate in tabelul nr 3.
Precizia sistemului la determinarea ochratoxinei A
Nr.
1
2
3
4
5
Arie pic
26,7
30,4
30,7
26,2
31,8
Date statistice
Arie medie = 26,16
SD = 2, 5344
RSD (%) = 8,6912
TABEL 3
si
respectiv,
9,765625ng/ml(concentratii
urmarita +50%).
Intregul experiment a fost realizat in zile diferite, de alt analist, cu scopul
de a obtine informatii despre robustetea metodei.
Utilizand ecuatia curbei de calibrare si ariile picurilor au fost calculate
concentratiile pentru fiecare proba. A fost determinata regasirea ca procent
din valoarea concentratiei teoretice, regasirea medie si precizia metodei
Concentratia
Teoretica(ng/ml)
9,765625
19,53125
39,0625
Arie pic
I
20,0
18,1
17,8
33,8
26,2
33,3
56,1
42,6
48,7
II
17,1
13,8
15,9
26,7
25,4
30,9
53,4
47,9
45,1
Concentratia
calculata(ng/ml)
I
II
11,79
9,09
10,02
6,02
9,74
7,98
24,63
18,02
17,56
16,81
24,16
21,93
45,37
42,86
32,81
37,74
38,49
35,14
Regasire(%)
I
120,7
102,6
99,7
126,1
89,9
123,7
116,1
84,0
98,5
Media =
Minim =
Maxim =
Deviatia standard(SD) =
Deviatia standard relativa(RSD%) =
II
93,1
61,1
81,7
92,3
86,1
112,3
109,7
96,6
90,0
99,2%
61,6%
126,1%
16,7206
16,9629%
TABEL 4
Nr. crt.
Nr. proba
1
2
3
4
5
6
3
4
5
6
10
40
Continutul in ochratoxina A
Denumire
proba
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Columbia
Cafea India
Ochratoxina A
(g/kg proba cafea
boabe)
0,77
0,87
1,06
0,55
9,47
3,35
TABEL 5
adoptarea
unor
masuri
in
vederea
protejarii
sanatatii
deoxinivalenolului,
la
oaie,
produce
modificri
ale
Tabelul 1
Concentratie DON
Amestec 1 ( HPLC)
Amestec 2 ( ELISA)
g/kg
41,86
41,52
41,68
41,11
41,56
41,55
g/kg
3,11
3,21
3,52
3,65
3,75
3,45
Tabelul 2
(Maxim limits fixed by the European Union regarding DON concentrations in different
matrices
Produs
Nivel maxim
(g/kg)
1250
1750
1750
750
500
750
200
Concentratie DON
Crt.
g/l
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Medie
11
35
74
34
25
46
15
63
55
13
37,10
CONCLUZII
Gradul de contaminare cu deoxinivalenol a amestecului de furaj nu a fost
foarte mare (41,54 g/kg ) n condiiile primului amestec testat.
Administrarea de durat (4 luni) a unei raii de 0,5 kg din acest amestec
(cantitatea medie de DON ingerat a fost de 500 ng/kg greutate corporal) la
ovine nu conduce la detectarea n ser a acestei micotoxine.