Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ETAPA II – 15.12.2009
CUPRINS
Cuprins................................................................................................................................................... 2
Obiective generale ale proiectului si obiectivele etapei …........................................... ........................ 4
Rezumatul etapei de execuŃie.................................................................................... ............................ 6
Descrierea ştiinŃifică şi tehnică.............................................................................................................. 11
A. Activitate II.1.1. – USAMV Bucuresti
Model conceptual privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici de tip
carotenoide, flavonoide sau terpene în plante………………………………………………………… 12
1. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip carotenoide…….......................................... 12
2. Metode de determinare a carotenoidelor…………………………………………………………… 13
2.1 Etapa de extracŃie.................................................................................................................... 14
2.2. Saponificarea……………………………………………………………………………….. 17
2.3. Analiza cromatografică …………………………………………………………………….. 19
2.4. Alte metode…………………………………………………………………………………. 24
3. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip flavonoide………………………………… 24
4. Metode de determinare a flavonoidelor……………………………………………………………. 26
4.1. Pregătirea probei……………………………………………………………………………. 26
4.2. Spectrometria de masă în analiza flavonoidelor……………………………………………. 27
4.3. Cromatografia de înaltă performanŃă pentru analiza flavonoidelor………………………… 30
4.4. Alte metode…………………………………………………………………………………. 31
5. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip terpene……………………………………. 32
6. Metode de determinare a terpenelor………………………………………………………………... 33
6.1. ExtracŃia probei şi concentrarea…………………………………………………………….. 33
6.2. Separarea cromatografică a constituienŃilor………………………………………………... 33
6.3. Detectarea şi caracterizarea constituienŃilor………………………………………………... 34
7. Concluzii……………………………………………………………………………………. 35
B. Activitate II.1.2. – ICDP Braşov
Stabilirea arealelor pastorale şi a tehnicilor de valorificare a pajiştilor; prelevarea şi condiŃionarea
probelor de nutreŃuri şi de lapte din zona Blana Bucegi……………………………………………... 43
1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………………… 43
2. Prezentarea parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……………………………... 44
2.1. Faza I de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……………... 44
2.2. Faza a II-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi………… 46
2.3. Faza a III-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi………. 47
2.4. Faza a IV-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……….. 48
3. Rezultate obtinute in cadrul experimentarilor realizate la Baza de Cercetări Pajişti Montane
(B.C.P.M.) Blana Bucegi……………………………………………………………………………... 51
3.1. Productia de substanta uscata……………………................................................................. 51
3.2. Productia de lapte …………………...................................................................................... 51
C. Activitate II.1.3. – ICDCB Baloteşti
Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregătirea cadrului experimental…………... 53
1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………………… 53
2. Descrierea ştiinŃifică şi tehnică…………………………………………………………………….. 54
3. Evaluarea stării de sănătate a animalelor din loturi experimentale………………………………… 54
3.1. Materiale si metode…………………………………………………………………………. 54
3.2. Rezultate şi discuŃii…………………………………………………………………………. 56
4. Concluzii…………………………………………………………………………………………… 63
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
2
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
3
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Etapa 1:
Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregatirea cadrului experimental.
Etapa 2:
Cercetari preliminare privind elaborarea modelelor experimentale in vederea identificarii
markerilor biochimici regionali care determina specificitatea regionala a laptelui.
Etapa 3:
Studierea comparativa a influentei markerilor biochimici din plante asupra
caracteristicilor fizico-chimice si senzoriale a produselor lactate din diferite zone
geografice
Etapa 4:
Integrarea şi interpretarea rezultatelor. Transferul tehnologic al soluŃiilor propuse,
promovarea rezultatelor. Identificarea si atribuirea drepturilor de proprietate intelectuala
asupra rezultatelor. Intocmirea documentatiei pentru dobandirea protectiei unei indicatii
geografice sau denumirea de origine a produselor lactate din regiunile luate in studiu.
Activitate II.1
Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizată pentru selectarea şi
determinarea markerilor biochimici.
4
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
5
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
6
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
7
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
8
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
9
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
10
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
11
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
MetaboliŃii plantelor sunt întâlniŃi de obicei sub forma unui amestec complex de
mai multe substanŃe cu polaritate şi hidrofobicitate diferite. Cele mai importante grupe de
substanŃe în materialul plantelor sunt împărŃite în: substanŃe cu polaritate scăzută
(terpene), semi-polare (flavonoide, lipide) şi polare (unele carotenoide, glicozide polare,
proteine).
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
12
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
β- caroten
OH
luteina
HO
OH
zeaxantina
HO
O
OH
astaxantina
HO
O
licopen
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
13
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
până ce filtartul este incolor. Filtratul este concentrat, şi carotenoidele sunt separate într-
un solvent organic corespunzător şi apă. Faza organică este îndepărtată şi evaporată; în
timpul evaporării nu este recomandată atingerea unor temperaturi de peste 400C, pentru a
evita degradarea, şi în final reziduul este dizolvat într-o cantitate corespunzătoare de
solvent [26], [30].
2.2. Saponificarea
După etapa de saponificare, carotenoidele sunt extrase cu eter de etil, dietil eter
[46], n-hexan [43], clorură de metilen [16], eter de petrol [47] sau amestecuri, precum n-
hexan : eter de etil (70:30, v/v) [48], dietil eter : eter de petrol (1:1, v/v) [30], n-hexan :
acetat de etil (85:15, v/v) [24], n-hexan : toluen [21] şi apoi, extractul este spălat până
când KOH este îndepărtat.
Khachik şi colab. [49] au observat o pierdere importantă în conŃinutul de xantofile
din broccoli după aplicarea unui tratament cu 30% hidroxid de potasiu metanolic sub
atmosferă de azot la temperatura camerei timp de 3 ore. Contrar, pierderea de carotene nu
a fost semnificativă.
Ye şi colab. [45] au raportat că metoda extracŃiei directe cu solvent reprezintă o
tehnică alternativă saponificării în analiza vitaminelor şi β-carotenului din diferite
alimente fortifiate.
Hart şi Scoot [47] au determinat conŃinutul de carotenoide din legumele şi fructele
consumate în mod obişnuit în Marea Britanie. Următoarea procedură de saponificare a
extractului de carotenoide a fost aplicată pentru fructe şi unele legume, precum ardei:
10% hidroxid de potasiu metanolic sub atmosferă de azot, la întuneric timp de o oră la
temperatura camerei.
Unii cercetători au observat o extracŃie mai bună a carotenoidelor când sunt utilizate
temperaturi ridicate în etapa de saponificare, dar în ceea ce priveşte conŃinutul de
xantofile [50].
Procedurile de extracŃie lichidă descrise în literatură necesită timp îndelungat şi
implică utilizarea de cantităŃi mari de solvenŃi organici volatili, care au impact negativ
asupra mediului şi asupra sănătăŃii umane.
De aceea, interesul în dezvoltarea de noi metode pentru extracŃia carotenoidelor este în
continuă creştere.
Fish şi colab. au dezvoltat [51] o metodă pentru determinarea cantitativă a
licopenului care utilizează cantităŃi reduse de solvenŃi organici.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
18
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Analiza xantofilelor din cereale utilizând un sistem de gradient din doi eluenŃi (A)
MeOH : MTBE : apă (81:15:4, v/v/v) şi (B) MeOH : MTBE (9:91, v/v) şi o coloană C30
(250 mm x 4,6 mm) a fost descriză de Moros şi colab. [Error! Bookmark not defined.].
Debitul a fost 1 mL/min şi cromatogramele au fost monitorizate la 450 şi 445 nm
utilizând detectorul DAD.
Două coloane cu fază normală şi una cu fază inversă au fost folosite pentru a
analiza carotenoidele din extractul de obŃinut de la florile de crăiŃă (Tagetes erecta) [28].
O coloană Zorbax SIL 5 µm (250 mm x 4,6 mm diametru interior) şi n-hexan : acetat de
etil (75:25, v/v) ca fază mobilă la un debit de 2 mL/min a fost utilizată pentru a separa
all-trans-luteina, izomerii cis ai luteinei, precum şi all-trans-zeaxantina. Celălalt sistem
cu fază normală a inclus o coloană β Cyclobond 5 µm (250 mm x 4,6 mm diametru
interior) cu n-hexan : acetat de etil (87:13, v/v) ca fază mobilă şi un debit de 2 mL/min a
fost utilizat pentru a identifica all-trans şi cis izomerii luteinei şi all-trans-zeaxantina. Cu
ajutorul cromatografiei cu fază inversă, o separare mai completă a cis izomerilor luteinei
a fost realizată. A fost utilizată o coloană silica C30 YMC S3-SIL200 3 µm cu o fază
mobilă constând din 3% MTBE în MeOH la un debit de 1 mL/min. All-trans-luteina,
izomerii 9- şi 9᾿-cis-luteina, izomerii 13- şi 13᾿-cis-luteina şi all-trans-zeaxantina au
fost identificaŃi. În toate cazurile, carotenoidele au fost detectate la 450 nm.
Într-un studiu realizat de Lee şi colab. [29], mai mult de 25 de carotenoide dintr-o
probă de portocală dulce (Earlygold) au fost separate în 40 minute utilizând un gradient
de eluŃie ternar constând din: eluent (A) ACN : MeOH (75:25, v/v), eluent (B) 100%
MTBE şi eluent (C) apă conŃinând 0,01% BHT şi 0.05% TEA la un debit de 1 mL/min.
Separarea a fost realizată pe o coloană C30 (150 mm x 4,6 mm diametru interior)
menŃinută la 250C. Într-un alt experiment descris de Lee, aceleaşi condiŃii au fost aplicate
pentru identificarea a 29 de carotenoide în sucul obŃinut dintr-un alt tip de portocală (Red
Navel orange Cara Cara). Carotenoidele au fost detectate la 450 nm.
A fost dezvoltată o metodă pentru a difernŃia citricele din portocală, mandarină şi
amestec pe baza profilului lor carotenoidic. Un sistem de eluŃie compus din MeOH, apă şi
MTBE şi o coloană C30 (25 cm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm) a fost utilizată pentru
separare. Analiza a fost completă în 50 minute, la un debit de 1 mL/min. Pentru a
maximiza absorbanŃa în domeniul roşu/portocaliu din spectrul vizibil, a fost selectată o
lungime de undă de 486 nm [46].
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
20
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
ACN, MeOH sau amestecurile din aceşti solvenŃi sunt constituenŃii majoritari ai
fazei mobile utilizate în analiza carotenoidelor. Pentru a optimiza separarea unor
carotenoide (de exemplu izomerii geometrici), faza mobilă este de obicei modificată prin
adăugarea unor cantităŃi mici din alt solvent organic [2]; de exemplu: DCM [19], [56],
apă [52], [55], n-hexan [57], [58], acetonă [54], cloroform [8], THF [12], [35], [59],
propanol [9], [20], [31], acetat de etil [10], [28], clorură de metilen [16], [22] sau diferiŃi
eteri [15], [33], [60]. MeOH a fost recomandat în diferite lucrări [61] deoarece furnizează
o recuperare mai bună decât ACN sau solvenŃii pe bază de ACN. În acelaşi mod, THF a
asigurat o recuperare uşor mai mare decât acetatul de etil [62]. Utilizarea cloroformului
trebuie evitată pe cât de mult posibil din cauza toxicităŃii ridicate; în plus, solvenŃii
cloruraŃi sunt asociaŃi cu pierderile de carotenoide. AntioxidanŃii, precum acidul ascorbic
sau BHT [8], [16], [47], sunt de obicei adăugaŃi în faza mobilă pentru a o stabiliza.
Gueguen şi colab. [63] au observat o scădere a conŃinutului de carotenoide în timp când
acidul ascorbic a fost adăugat fazei mobile. Contrar, în soluŃii standard, BHT a protejat
eficient carotenoidele de procesele de degradare.
Carotenoidele sunt susceptibile la oxidare şi pot suferi degradări în coloană.
Diferite studii [8], [47], au demonstrat că adăugarea de solvenŃi modificatori, de exemplu
TEA sau acetat de amoniu, în faza mobilă reduce pierderile sau degradarea. TEA
acŃionează ca un modificator puternic, şi micşorează timpul de retenŃie. Totuşi, a fot testat
că la concentraŃii în jur de 0,05% nu modifică semnificativ timpul de eluŃie, şi o separare
bună poate fi realizată [47].
Huck şi colab. [8] au investigat factorii de selectivitate pentru luteină/zeaxantină
şi zeaxantină/β-caroten pentru evaluarea unor sisteme diferite de fază mobilă. O fază
mobuilă cuaternară ACN : MeOH (conŃinând 0,05% TEA şi 0,05 M acetat de amoniu) :
cloroform : n-heptan a fost dezvoltată pentru a îmbunătăŃii recuperarea şi separarea
carotenoidelor.
HPLC cu fază inversă este larg utilizată pentru a separa carotenoidele din diverse
probe. Coloanele C8 [52] şi mai ales C18 [8], [11], [12], [19], [27], [48], [64], [65], [66],
[67], au fost deseori selectate de cercetători pentru a efectua analize.
Epler şi colab. [61] au comparat 65 de coloane cromatografice cu fază inversă
pentru a determina selectivitatea şi recuperarea unui amestec din următoarele
carotenoide: luteina, zeaxantina, β-criptoxantina, licopen, α- şi β-caroten utilizând ACN
şi MeOH modificat cu THF sau acetat de etil ca fază mobilă. Fazele staŃionare au fost în
general C18 şi au fost clasificate ca monomerice, intermediare sau polimerice. S-a
demonstrat că separarea luteinei şi zeaxantinei este realizată doar prin utilizarea coloanei
C18 polimerice şi unele coloane intermediare, dar aceste coloane au furnizat recuperări
mai mici decât coloanele C18 monomerice. Autorii au observat, de asemenea că,
dimensiunea porilor coloanei poate afecta selectivitatea carotenoidelor cu dimensiuni
diferite, precum zeaxantina şi β-caroten, dar nu afectează dacă dimensiunea este
asemănătoare (de exemplu, α- şi β-caroten).
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
21
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
A fost raportat în literatură [39] că, coloanele C18 prezintă o rezoluŃie slabă în
separarea izomerilor geometrici (cis – trans) ai carotenoidelor. Sander şi colab. [68] au
dezvoltat o coloană C30 polimerică, special proiectată pentru separarea izomerilor
carotenoidici. De atunci, numeroase metode analitice au utilizat coloanele C30 polimerice
[15], [20], [21], [33], [60], [69].
Separări satisfăcătoare pentru all-trans-licopen din roşii utilizând o coloană C30 au
fost obŃinute de Gomez-Prieto şi colab [33].
Marsili şi Callahan [14] au testat 3 coloane C18 comerciale cu fază inversă:
coloana Waters Novo-Pak (4 µm dimensiunea particulelor, 3,9 mm x 150 mm), coloana
Supelcosil (5 µm dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) şi coloana Vydac 201TP
(5 µm dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) pentru a investiga care este cea mai
potrivită coloană pentru a separa α- caroten de β-caroten. Rezultatele au indicat că
rezoluŃia cea mai bună a fost realizată utilizând coloana Vydac 201TP şi a fost selectată
pentru determinarea β-carotenului din vegetale.
Principalele xantofile din cereale (luteina, zeaxantina şi β-criptoxantina) au fost
determinate în mai puŃin de 25 minure utilizând o coloană C30 [15].
Un număr important de carotenoide a fost identificat în uleiul vegetal de palmier
[70], precum: fitoen, ε-caroten, neurosporen, α-zeacaroten, β-zeacaroten, licopen, δ-
caroten, α-caroten, β-caroten şi γ-caroten, din care α- şi β-carotenul reprezintă mai mult
de 90%. Înainte de presarea fructelor în scopul obŃinerii uleiului, acestea sunt supuse unui
tratament termic utilizând abur presurizat. Încălzirea cauzează izomerizare cis/trans a
carotenoidelor. Astfel, un amestec complex de carotenoide apolare şi cis-izomerii lor este
obŃinut, ceea ce determină ca separarea să fie dificil de realizat. Acest amestec este
analizat prin HPLC utilizând o coloană C30. Această coloană, pe lângă faptul că produce
o separare foarte bună a carotenoidelor asemănătoare, precum α- şi β-caroten, contribuie
şi la separarea cis-izomerilor, ceea ce nu este posibil utilizând o coloană C18.
Un alt factor important care trebuie luat în considerare pentru a realiza o separare
satisfăcătoare a carotenoidelor este temperatura coloanei. Diverşi autori [8], [71] au
afirmat că modificări ale temperaturii cauzează schimbări semnificative în răspunsul
cromatografic al carotenoidelor; deci, este important a lucra la temperaturi constante.
Scott şi Hart [71] au studiat efectul temperaturii coloaei în separarea unui amestec
de carotenoide dintr-o soluŃie de referinŃă standard şi dintr-un extract al unui aliment
uscat. Au fost testate 4 temperaturi diferite (15, 20, 22,5, 25 şi 300C) şi rezultatele au
indicat că schimbările de temperatură afectează timpul de eluŃie şi profilul. Cea mai bună
separare a fost realizată la 20 – 22,50C.
Asemănător, Huck şi colab. [8] au optimizat temperatura coloanei pentru a realiza o
separare eficientă a luteinei, zeaxantinei, β-criptoxantinei şi β-carotenului. Temperatura a
fost variată în intervalul 21 – 800C. Cea mai bună selectivitate a fost realizată la 210C şI
la temperaturi mai mari de 600C degradarea carotenoidelor a fost semnificativă.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
23
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Tabelul 3 – Câteva metode HPLC recente utilizate pentru analiza carotenoidelor din
diverse surse
Proba ExtracŃie Coloana Faza mobilă DetecŃia
Fructe şi legume Eter de petrol 100 x 4,6 mm, 5 ACN:MeOH:DCM, UV-Vis
tradiŃionale din µm cuplată cu 75:20:5 DAD
Portugalia [76] C18-RP (250 x 4,6
mm, 5 µm)
Cartof dulce Hexan:acetonă:EtOH, C30 A: MeOH:ACN:apă, DAD
(Ipomoea 2:1:1 250 x 4,6mm, 84:12:2
batatas) [77] 5µm B: DCM
Caise, dovleac Acetonă:hexan, 1:1 C30-RP A: ACN:MTBE:apă, DAD –
[78] 150 x 3 mm 81:15:4 MS
3 µm B:MeOH:MTBE:apă,
4:92:4
Vegetale [79] Acetonă rece C18 250 x 4,6 ACN:DCM:MeOH, UV-Vis –
mm, 5 µm 6:2:2 DAD
Planta ierbacee Eter de petrol:acetonă, 150 x 4,6 mm A: MeOH:apă, 90:10 LC – MS
Potamogeton 1:1 B: acetat de etil
crispus [80]
Cartofi acetonă C30 MeOH:MTBE (diferite UV-Vis
(Solanum 250 x 4,6 mm procente)
phureja) [81] 3 µm
Diferite fructe, MeOH C30 A:MeOH:MTBE:apă, DAD
legume [82] 150 x 4,6 mm 95:3:2
3 µm B:MeOH:MTBE:apă,
8:90:2
Flavonoidele sunt în mare parte molecule plane şi variaŃia lor structurală derivă de
la modelul de substituŃie: hidroxilare, metoxilare, prenilare sau glicozilare.
Flavonoidele sunt împărŃite în: flavone, flavonoli, flavanone şi flavanoli în funcŃie de
prezenŃa grupării carbonil în poziŃia C-4, grupării OH în poziŃia C-3, legăturii simple
saturate între C-2 şi C-3, şi o combinaŃie între absenŃa grupării carbonil din C-4 cu o
grupare OH în poziŃia C-3 (figura 2 ).
Deşi câteodată se găsesc în formă agliconă, majoritatea flavonoidelor din plante
sunt prezente ca O-glicozide, în care una sau mai multe grupări hidroxil ale agliconei sunt
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
24
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
HO 7 O HO O
2
A C 2'
5 4
B
OH O O
4' OH OH
Genisteina Daidzeina
(Izoflavona) (Izoflavona)
OH
OH
OH
HO O
HO O
OH O OH
OH
Apigenina Catechina
(Flavona) (Flavanol)
OH OH
HO O HO O
OH
OH
OH O OH O
Narigenina Quercetina
(Flavanona) (Flavonol)
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
25
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Aşa cum a fost prezentat mai sus, flavonoidele sunt diferite din punct de vedere
structural şi în general fac parte dintr-un amestec complex izolat din extractul de plante.
Deşi, GC –MS a fost principala metodă folosită în analiza moleculelor mici în
ultimii 20 de ani, în prezent nu este aşa de des folosită în analiza flavonoidelor datorită
volatilităŃii limitate a glicozidelor flavonoidelor care se găsesc în fructe şi vegetale. Odată
cu apariŃia surselor API, LC – MS a devenit cea mai utilizată metodă pentru analiza
flavonoidelor în amestecuri complexe. Deoarece LC –MS furnizează masa moleculară a
fiecărui component cu timpul lui de retenŃie, este folosită pentru identificarea compuşilor
cunoscuŃi. O caracterizare adiŃională a componentelor cunoscute sau necunoscute poate fi
realizată prin cuplarea LC cu spectrometria de masă. Este utilizată, de asemenea, şi
pentru analiza cantitativă.
EficienŃa ionizării unor diferite surse API, de exemplu ESI şi APCI, a fost revizuită
anterior de Rauha şi colab. [101]. ESI – MS în modul ion-negativ cu tampon acetat de
amoniu acid ca fază mobilă a furnizat cea mai bună sensibilitate. De Rijke şi colab. [102]
au prezentat un studiu comparativ în ceea ce priveşte performanŃele analitice ale
tehnicilor APCI şi ESI, atât în modul ion-pozitiv, cât şi în cel negativ. Cele mai bune
răspunsuri MS au fost în modurile ion-negativ, în general tehnica APCI mai bună decât
ESI. Rezultatele obŃinute cu APCI şi ESI negativ au fost similare pentru toate
flavonoidele aglicone.
Claeys şi colab. au publicat o serie de lucrări despre utilizarea spectrometriei de
masă în determinarea structurii glicozidelor flavonoidelor din plante [103], [104], [105].
Recent, ei au raportat aplicaŃia LC – ESI –MS şi disocierea prin ciocnire indusă (CID) în
caracterizarea structurală a O-glicozidelor flavonolilor acilaŃi din semintele de
Carrichtera annua [104]. Grupările acil produc ioni caracteristici în spectrele [M + H]+ ş i
[M + Na]+. Cuplarea cu spectrometria de masă a fost utilizată pentru caracterizarea
tipului legăturii interglicozidice a izomerilor O-diglicozidici ai flavonoidelor. Scindarea
legăturii O-glicozidice concomitent cu o aranjare a hidrogenilor conduce la eliminarea
reziduurilor de monozaharide dehidratate, de exemplu: pierderea a 162 u (hexoză), 146 u
(deoxihexoză), 132 u (pentoză). Flavonoidele metilate sunt caracterizate de o pierdere de
15 u, având drept rezultat [M – H – CH3]- [106]. Metoda ESI – MS/MS este destul de
bună pentru a deosebi câŃiva izomeri ai flavonoidelor metilate pe baza spectrelor de ioni.
Cuyckens şi Claeys [103] au studiat optimizarea cromatografiei de lichide pe baza
detecŃiei ESI –MS şi a detectorului DAD pentru analiza glicozidelor flavonoidelor. În
modul ion-pozitiv, analiza ESI –MS în metanol conŃinând 1% acid acetic a fost pe
departe cea mai sensibilă, în timp ce faza mobilă ACN / apă conŃinând 0,5% acid formic
a prezentat cea mai bună sensibilitate în analiza LC/ESIMS/UV – DAD.
În modul ion-negativ, cea mai bună sensibilitate a fost obŃinută cu o fază mobilă ce
conŃine 0,1% acid formic, în timp ce adăugarea de baze a redus sensibilitatea. S-a
observat de asemenea că prezenŃa acidului acetic în faza mobilă determină creşterea
sensibilităŃii, reducând timpul de retenŃie în coloana LC.
Hvattum [107] a raportat identificarea în extractul de măceş a unui antocian şi a
câtorva glicozide ale quercetinei.
Determinarea stereochimică a resturilor de hexoză şi pentoză în flavonoidele acetilate a
fost realizată utilizând spectrometria de masă [108].
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
28
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
29
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
OH
OH
O
OH
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
32
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
33
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Detectorul ionizare în flacără (flame ionization detector – FID) este cel mai
utilizat pentru detecŃia şi cuantificarea terpenelor. Un alt detector este detectorul
fotoionizare.
ConstituienŃii separaŃi pot fi identificaŃi prin cromatografie utilizând standarde
dacă ei sunt bine separaŃi şi caracterizaŃi, sau identificarea este realizată prin compararea
cu indicii de retenŃie Kovats (Kovats retention indices RI). Utilizarea acestor date de
retenŃie obŃinute de la două coloane GC cu polarităŃi diferite, permite identificarea sigură
a unui număr mai mare de terpene dintr-o anumită probă.
Cel mai utilizat sistem pentru caracterizarea terpenelor eluate este GC cuplată cu
MS.
GC – MS poate implica folosirea unui detector MS cvadrupol sau a unui detector obişnuit
cu trapă ionică [153].
Combinarea metodei GC cu diferite tehnici MS (EI-MS, CI-MS, MS-MS) oferă
rezultatele cele mai bune în rezoluŃia unui amestec complex.
Câteodată poate fi folositor a confirma printr-o metodă analitică suplimentară
rezultatele obŃinute prin GC şi GC – MS. Acest lucru se poate face prin 13C-RMN care
urmează analizei GC pentru a confirma determinarea structurii propusă prin intermediul
spectrelor de masă şi a datelor de retenŃie.
Pentru deosebirea izomerilor, ceea ce se întâmplă des în grupul terpenelor, metoda GC –
FTIR oferă completări utile [149]. Avantajul spectroscopiei FTIR îl constituie rezoluŃia şi
sensibilitatea mare. Interpretarea destul de lungă şi absenŃa unei baze de date a spectrelor
fazei de vapori determină ca această metodă să nu fie general acceptată în analiza
compuşilor volatili.
HPLC poate fi folosită atunci când analiza GC a compuşilor termolabili şi/sau a
compuşilor polari este dificilă de realizat. Cuplarea cu detectorul DAD este folosită.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
34
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Studiul realizat de Hamm şi colab. [154] a avut ca scop stabilirea conŃinutului de terpene
(în special biomarkeri diterpenici) caracteristici unor specii diferite de tămâie (Boswellia)
utilizând SPME şi GC – MS.
7. Concluzii
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
35
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
PLANTE
Pregătirea probei
• congelare - uscare
• omogenizare
Extractie
• SE • MSPD
• Soxhlet • SPME
ANALIZA INSTRUMENTALĂ
GC LC Altele
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
36
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Legendă generală
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
37
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Bibliografie
1. F. Mattea, A. Martín, M.J. Cocero, J. Food Eng., 2009, 93, 255
2. H. van den Berg, R. Faulks, H.F. Granado, J. Hirschberg, B. Olmedilla, G. Sandmann,
S. Southon, W. Stahl, J. Sci. Food Agric., 2000, 80, 880
3. R.A. Bone, J.T. Landrum, Z. Dixon, Y. Chen, C.M Llerena, Experimental Eye
Research, 2000, 71, 239
4. N.I. Krinsky, E.J. Johnson, Molecular Aspects of Medicine, 2005, 26, 459
5. L.B. Almeida, M.V.C. Penteado, J. Food Comp. Anal., 1988, 1, 341–352
6. D.B. Rodriguez-Amaya, J. Food Comp. Anal., 1996, 9, 196
7. L.B. Almeida-Muradian, M.D.G. Rios, R. Sasaki, R., Bolletino Chimico Farmaceutico,
1998, 137, 290
8. C.W. Huck, M. Popp, H. Scherz, G.K. Bonn, J. Chromatogr. Sci., 2000, 38, 441
9. N.L. Rozzi, R.K. Singh, R.A. Vierling, B.A. Watkins, J. Agric. Food Chem., 202, 50,
2638
10. M. Edelenbos, L.P. Christensen, K. Grevsen, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 4768
11. C.H. Azevedo-Meleiro, D.B. Rodriguez-Amaya, J. Food Comp. Anal., 2004, 17, 385
12. P.J.M. Hulshof, C. Xu, P. van de Bovenkamp, C.E. West, J. Agric. Food Chem.,
1997, 45, 1174
13. B. Gandul-Rojas, M.R.L. Cepero, M.I. Minguez-Mosquera, J. Agric. Food Chem.,
1999, 47, 2207
14. R. Marsili, D. Callahan, J. Chromatogr. Sci., 1993, 31, 422
15. E.E. Moros, D. Darnoko, M. Cheryan, E.G. Perkins, J. Jerrell, J. Agric. Food Chem.,
2002, 50, 5787
16. A.J. Melendez-Martinez, I.M. Vicario, F.J. Heredia, J. Agric. Food Chem., 2003, 51,
4219
17. F. Markus, H.G. Daood, J. Kapitany, P.A. Biacs, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 100
18. Y.P.C. Hsieh, M. Karel, J. Chromatogr., 1983, 259, 515
19. M. Murkovic, U. Mulleder, H. Neunteufl, Analysis, 2002, 15, 633
20. V. Hentschel, K. Kranl, J. Hollmann, M.G. Lindhauer, V. Bohm, R. Bitsch, J. Agric.
Food Chem., 2002, 50, 6663
21. A.C. Kurilich, S.J. Britz, B.A. Clevidence, J.A. Novotny, J J. Agric. Food Chem.,
2003, 51, 4877
22. M.M. Barth, C. Zhou, K.M. Kute, G.A. Rosenthal, J. Agric. Food Chem., 1995, 43,
2876
23. A.B. Barua, J.A. Olson, J. of Chromatogr.B, 1998, 707, 69
24. E. Gimeno, E. Calero, A.I. Castellote, R.M. Lamuela-Raventos, M.C. de la Torre,
M.C. Lopez-Sabater, J.Chromatogr. A., 2000, 881, 255
25. A.K. Taungbodhitham, G.P. Jones, M.L. Wahlqvist, D.R. Briggs, Food Chem., 1998,
63, 577
26. C.H. Lin, B.H. Chen, J. Chromatogr. A, 2003, 1012, 103
27. J. Deli, P. Molnar, Z. Matus, G. Toth, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1517
28. W.L. Hadden, R.H. Watkins, L.W. Levy, E. Regalado, D.M. Rivadeneira, R.B. van
Breemen, S.J. Schwartz, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 4189
29. H.S. Lee, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 2563
30. K.E. Sharpless, M. Arce-Osuna, J.B. Thomas, L.M. Gill, J. AOAC Internat., 1999,
82, 288
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
38
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
31. E. Vagi, B. Simandi, H.G. Daood, A. Deak, J. Sawinsky, J. Agric. Food Chem., 2002,
50, 2297
32. M. Careri, L. Furlattini, A. Mangia, M. Musci, E. Anklam, A. Theobald, C. von
Holst, J. Chromatogr.A, 2001, 912, 61
33. M.S. Gomez-Prieto, M.M. Caja, M. Herraiz, G. Santa-Maria, J. Agric. Food Chem.,
2003, 51, 3
34. L. Ferreira de Franca, G. Reber, M.A.A. Meireles, N.T. Machado, G. Brunner, J.
Supercrit. Fluids, 1999, 14, 247
35. T. Baysal, S. Ersus, D.A.J. Starmans, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 5507
36. I. Gamlieli-Bonshtein, E. Korin, S. Cohen, Biotechnol. Bioeng., 2002, 80, 169
37. R.L. Mendes, B.P. Nobre, M.T. Cardoso, A.P. Pereira, A.F. Palavra, Inorg. Chim.
Acta, 2003, 356, 328
38. A. Chandra, M.G. Nair, Phytochem. Analysis, 1997, 8, 244
39. F. Khachik, G.R. Beecher, M.B. Goli, W.R. Lusby, Methods in Enzymology, 1992,
213, 347
40. F. Granado, B. Olmedilla, I. Blanco, E. Rojas-Hidalgo, J. Agric. Food Chem., 1992.
40, 2135
41. R.X.E. Fernandez, N.W. Shier, B.A. Watkins, J. Food Compo. Anal., 2001, 13, 179–
187
42. J.L. Guil-Guerrero, M.M. Rebolloso-Fuentes, M.E.T. Isasa, J. Food Comp.Anal.,
2003, 16, 111
43. L.A. Howard, A.D. Wong, A.K. Perry, B.P. Klein, J. Food Sci., 1999, 64, 929
44. A.S. Huang, L. Tanudjaja, D. Lum, J. Food Comp. Anal., 1999, 12, 147
45. L. Ye, W.O. Landen, R.R. Eitenmiller, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 4003
46. K.L. Goodner, R.L. Rouseff, H.J. Hofsommer, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1146
47. D.J. Hart, K.J. Scott, Food Chem., 1995, 54, 101
48. S. Otles, Y. Atli, American Laboratory, 2000, 32, 22
49. F. Khachik, G.R. Beecher, N.F. Whittaker, J. Agric. Food Chem., 1986, 34, 603
50. K.J. Scott, Food Chem., 1992, 45, 357
51. W.W. Fish, P. Perkins-Veazie, J.K. Collins, J. Food Comp. Anal., 2002, 15, 309
52. V. Gokmen, S. Bahceci, J. Acar, J. Liquid Chromatography and Related
Technologies, 2002, 25, 1201
53. C.H. Lin, B.H. Chen, J. Chromatogr. A, 2003, 1012, 103
54. L. Englberger, J. Schierle, G.C. Marks, M.H. Fitzgerald, J. Food Comp. Anal., 2003,
16, 3
55. L. Mathiasson, C. Turner, H. Berg, L. Dahlberg, A. Theobald, E. Anklam, R. Ginn,
M. Sharman, F. Ulberth, R. Gabernig, Food Additives Contaminants, 2002, 19, 632
56. E. Bako, J. Deli, G. Toth, J. Biochem. Biophysical Methods, 2002, 53, 241
57. F. Khachik, M.B. Goli, G.R. Beecher, J. Holden, W.R. Lusby, M.D. Tenorio, M.R.
Barrera, J. Agric. Food Chem., 1992, 40, 390
58. U.G. Chandrika, E.R. Jansz, S.M.D.N. Wickramasinghe, N.D. Warnasuriya, J. Sci.
Food Agric., 2003, 83, 1279
59. L. Englberger, W. Aalbersberg, P. Ravi, E. Bonnin, G.C. Marks, M.H. Fitzgerald, J.
Elymore, J. Food Comp.Anal., 2003, 16, 219
60. T. Lacker, S. Strohschein, K. Albert, J. Chromatogr.,A, 1999, 854, 37
61. K.S. Epler, L.C. Sander, R.G. Ziegler, S.A. Wise, N.E. Craft, J. Chromatogr., 1992,
595, 89
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
39
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
62. K.S. Epler, R.G. Ziegler, N.E. Craft, J. Chromatogr., 1993, 619, 37
63. S. Gueguen, B. Herbeth, G. Siest, P. Leroy, J. Chromatogr. Sci., 2002, 40, 69
64. L.R. Howard, S.T. Talcott, C.H. Brenes, B. Villalon, J. Agric. Food Chem., 2000, 48,
1713
65. G.A.G. Kiss, E. Forgacs, T. Cserhati, T. Mota, H. Morais, A. Ramos, J. Chromatogr.
A, 2000, 889, 41
66. E. Darko, B. Schoefs, Y. Lemoine, J.Chromatogr. A, 2000, 876, 111
67. R.B. Assuncao, A.Z. Mercadante, J. Food Comp. Anal., 2003, 16, 647
68. L.C. Sander, K.E. Sharpless, N.E. Craft, S.A. Wise, Anal. Chem., 1994, 66, 1667
69. P.P. Mouly, E.M. Gaydou, J. Corsetti, J. Chromatogr. A, 1999, 844, 149
70. A. Mortensen, Food Research International, 2005, 38, 847
71. K.J. Scott, D.J. Hart, Food Chem., 1993, 47, 403
72. A. Lienau, T. Glaser, G. Tang, G.G. Dolnikowski, M.A. Grusak, K. Albert, J. Nutrit.
Biochem., 2003, 14, 663
73. P. Weller, D.E. Breithaupt, J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 7044
74. D.E. Breithaupt, U. Wirt, A. Bamedi, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 66
75. A.Z. Mercadante, D.B. Rodriguez-Amaya, G. Britton, J. Agric. Food Chem., 1997,
45, 120
76. M.G. Dias, M.F.G.F.C. Camoes, L. Oliveira, Food Chem., 2009, 113, 808
77. S.C. Liu, J.T. Lin, D.J. Yang, Food Chem., 2009, 116, 605
78. C. Kurz, R. Carle, A. Schieber, Food Chem., 110, 2008, 522
79. G. Aruna, B.S. Mamatha, V. Baskaran, J. Food Comp. Anal., 2009, 22, 632
80. D. Ren, S. Zhang, Food Chem., 2008, 106, 410
81. G. Burgos, E. Salas, W. Amoros, M. Auqui, L. Munoa, M. Kimura, M. Bonierbale, J.
Food Comp. Anal., 2009, 22, 503
82. A. Perry, H. Rasmussen, E.J. Johnson, J. Food Comp. Anal., 2009, 22, 9
83. H. Cen, Y. He, Trends Food Sci. Technol., 2007, 18, 72
84. H. Schulz, H.H. Drews, R. Quilitzsch, H. Kruger, J. Near Infrared Spectrosc., 1998,
6, 125
85. S.G. Atienza, C.M Avila, M.C. Ramirez, A. Martin, Aust. J. Agric. Res.. 2005, 56, 85
86. A.M.K. Pedro, M.M.C. Ferreira, Anal. Chem., 2005, 77, 2505
87. O.V. Brenna, N. Berardo, J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 5577
88. X. Chen, J. Wu, S. Zhou, Y. Yang, X. Ni, J. Yang, Z. Zhu, C. Shi, J. Food
Comp.Anal., 2009, 22, 148
89. R.A. Larson, Phenolic and enolic antioxidants. Naturally Occurring Antioxidants.
Boca Raton: CRC press LLC; 1997, 100
90. J.B. Harborne, C.A. Williams, Phytochemistry, 2000, 55, 481
91. L. Coward, M. Smith, M. Kirk, S. Barnes, Am. J. Clin. Nutr., 1998, 68, 1486S
92. R. Llorach, A. Gil-Izquierdo, F. Ferreres, F. Tomas-Barberan, J. Agric. Food
Chem., 2003, 51, 3895
93. C. Yang, Y.R. Xu, W.X Yao, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 846
94. F.J. Senorans, A. Ruiz-Rodriguez, S. Cavero, A. Cifuentes, E. Ibanez, G. Reglero, J.
Agric. Food Chem., 2001, 49, 6039
95. A.N. Giannuzzo, H.J. Boggetti, M.A. Nazareno, H.T. Mishima, Phytochem. Anal.,
2003, 14, 221
96. K. Ishii, T. Furuta, Y. Kasuya, J. Chromatogr. B, 2003, 794, 49
97. W.Wu, C.Y. Yan, L. Li, Z.Q. Liu, S.Y. Liu, J. Chromatogr. A, 2004, 1047, 213
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
40
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
98. Y.C. Fiamegos, C.G.Nanos, J. Vervoort, C.D. Stalikas, J. Chromatogr. A, 2004, 1041,
11
99. P. Dugo, F. Cacciola, M. Herrero, P. Donato, L. Mondello, J. Sep. Sci., 2008, 31,
3297
100. M. Stobiecki, Phytochemistry, 2000, 54, 237
101. J.P. Rauha, H. Vuorela, R. Kostiainen, J. Mass Spectrom., 2001, 36, 1269
102. E. De Rijke, H. Zappey, F. Ariese, C. Gooijer, U.A. Brinkman, J. Chromatogr., A,
2003, 984, 45
103. F. Cuyckens, M. Claeys, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 2341
104. F. Cuyckens, A.A. Shahat, H. Van den Heuvel, K.A. Abdel-Shafeek, M.M. El-
Messiry, M.M. Seif-El Nasr, L. Pieters, A.J. Vlietinck, M. Claeys, Eur.J. Mass Spectrom,
2003, 9, 409
105. Y.L. Ma, F. Cuyckens, H. Van den Heuvel, M. Claeys, Phytochem. Anal., 2001,
12, 159
106. U.J. Justesen, Mass Spectrom., 2001, 36, 169
107. E. Hvattum, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 655
108. F. Cuyckens, A.A. Shahat, L. Pieters, M. Claeys, J. Mass Spectrom., 2002, 37, 1272
109. B.S. Yu, X. Yan, G.B. Zhen, Y.P. Rao, J. Pharm. Biomed. Anal., 2002, 30, 843
110. J. Wang, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 5887
111. J. Wang, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 1657
112. S. Frison-Norrie, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 2782
113. Y. Yang, M. Chien, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 3990
114. R. Colombo, F.M. Lancas, J.H. Yariwake, J. Chromatogr A, 2006, 1103, 118
115. R. Tsao, R. Yang, J. Chromatogr. A, 2003, 1018, 29
116. P. Truchado, F. Ferreres, F.A. Tomas-Barberan, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 7241
117. M.J. Simirgiotis, P.D.S. Caligari, G. Schmeda-Hirschmann, Food Chem., 2009, 115,
775
118. Y.C. Fiamegos, C.G. Nanos, J. Vervoort, C.D. Stalikas, J. Chromatogr. A, 2004,
1041, 11
119. F. Deng, S.W. Zito, J. Chromatogr. A, 2003, 986, 121
120. A. Branco, A.D. Pereira, J.N. Cardoso, F.R.D. Neto, A.C. Pinto, R.Braz,
Phytochem. Anal., 2001, 12, 266
121. J. Liggins, L.J.C. Bluck, S. Runswick, C. Atkinson, W.A. Coward, S.A. Bingham, J.
Nutr. Biochem., 2000, 11, 326
122. M. Medic-Saric, I. Jasprica, A. Mornar, A. Smolcic-Bubalo, P. Golja, J. Planar
Chromatogr., 2004, 17, 459
123. A.D.S. Pereira, M.C. Padilha, F.R.D.A. Neto, Microchem. J., 2004, 77, 141
124. M. Careri, C. Corradini, L. Elviri, A. Mangia, J. Chromatogr. A, 2007, 1152, 274
125. P. Delmonte, J. Perry, J.I. Rader, J. Chromatogr. A, 2006, 1107, 59
126. Z. Huang, B. Wang, P. Williams, R.D. Pace, Food Sci. Technol, 2009, 42, 819
127. N.P. Seeram, L.S. Adams, Y. Zhang, R. Lee, D. Sand, H.S. Scheuller, D. Heber,
J.Agric. Food Chem, 2006, 54, 9329
128. V. Nunez, M. Monagas, M.C. Gomez-Cordoves, B. Bartolome, Postharvest Biol.
Technol., 2004, 31, 69
129. J.-I. Nakajima, I. Tanaka, S. Seo, M. Yamazaki, K. Saito, J. Biomed. Biotechnol.,
2004, 5, 241
130. L.-Z. Lin, P. Chen, J.M. Harnly, J. Agric. Food Chem, 2008, 56, 8130
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
41
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
42
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
1. Rezumatul etapei
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
43
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
2.1. Faza I de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi
Mod de folosire:
- Păşunat liber (continuu) extensiv (lot T), semiintensiv (lot A) şi intensiv (loturile
B, C şi D);
- Prelevare probe pentru determinat producŃia de iarbă, sub cuşti metalice, pe 2 m2
în trei repetiŃii pe fiecare parcelă;
- Cosire resturi neconsumate, toamna, dacă este cazul.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
44
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Fig.1. Aspect general Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
45
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
ObservaŃii şi determinări:
- compoziŃia floristică a covorului ierbos;
- producŃia de substanŃă uscată a păşunii;
- analize de calitate a furajelor şi analize agrochimice de sol;
- producŃia pe cap de vacă determinată săptămânal;
- analiza calităŃii laptelui, grăsime şi proteină din 2 în 2 săptămâni;
- comportamentul alimentar al vacilor pe păşune;
- stabilirea efectului remanent alo îmbunătăŃirii după anul al-III-lea;
2.2. Faza a II-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana
Bucegi (2000 – 2002)
ExistenŃa unei experienŃei cu vaci de lapte, înfiinŃată în anul 1995 a permis
alăturarea a unor variante noi după care să se cerceteze în paralel productivitatea
păşunilor îmbunătăŃite prin târlire (fertilizare organică) sau prin fertilizare chimică, faŃă
de o păşune îmbunătăŃită în urmă cu 2 ani, considerată ca martor.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
46
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Variantele experienŃei:
1. Parcela (lotul) AT: Păşune naturală (nardet) târlit ă cu taurine 1 vacă (6 m2/6
zile în 1999)
2. Parcela (lotul) AC: Păşune naturală (nardet) fertilizată cu îngrăşăminte
chimice
- Anul I (2000) - N200 P100 K100 kg/ha
- Anul II (2001) - N150 P75 K75 kg/ha
- Anul III (2002) - N100 P50 K50 kg/ha
3. Parcela (lotul) B: (martor): Păşune naturală (nardet) fertilizată în perioada
1996-1998, respectiv 3 ani consecutivi cu N150 P75 K75 kg/ha, diminuarea
Ńăpoşicii şi dominarea păiuşului roşu, după care s-a încetat fertilizarea (1999 şi în
continuare), urmărindu-se efectul remanent.
MenŃiune:
- Parcela B a fost martor şi pentru experienŃa 3 unde se urmăreşte efectul remanent
al fertilizării chimice + amendare (parcela C) şi al înfiinŃării de pajişti semânate +
fertilizare chimică + amendare (parcela D).
- Pe locul foste parcele martor A (fertilizare PK) s-au instalat cele două variante
(parcelele) AT şi AC, prezentate mai sus.
Detalii tehnice ale experienŃei:
- suprafaŃa unei parcele: 7.500 m2
- suprafaŃa totală a experienŃei: 22.500 m2
Animale (vaci cu lapte) la păşunat: au caracterele identice cu cea anterioară
Modul de folosinŃă: - păşunat liber intensiv (continuu) în toate parcelele: AT, AC şi B
ObservaŃii şi determinări: aceleaşi ca la experienŃa anterioară
2.3. Faza a III-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana
Bucegi (2003-2008)
Profitând de baza materială bună existentă la experienŃele anterioare cu vaci de
lapte, după 2002 s-au continuat experimentările pe acelaşi amplasament urmărindu-se
efectul remanent după târlire.
Variantele experienŃei privind folosirea păşunilor subalpine cu vaci de lapte au
fost:
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
47
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
48
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
49
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
50
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
ProducŃia cea mai ridicată s-a înregistrat în varianta D şi anume 4372 l/ha urmată
de celelalte două variante AC şi B.
FaŃă de animalele care au păscut în turmă vacile din variantele îmbunătătite au dat
cu 230-268% mai mult lapte, cea ce confirmă eficienŃa măsurilor de îmbunătăŃire.
În ce priveşte conversia furajelor de pajişti în productie de lapte se constată un
consum ridicat de SU şi anume 1,20 kg SU la varianta AC, 1,00 kg SU la var B şi 1,45 kg
US la var D , fiind destul de mari faŃă de alte condiŃii cu climat mai blând.
Aceste experimentări urmează a fi aprofundate pe viitor cu analize mai
amănunŃite asupra calităŃii laptelui în funcŃie de calitatea furajului.
În prezent se fac analize chimice la probele de plantă şi sinteza altor date care se
vor prezenta în etapa următoare a proiectului.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
52
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
1. Rezumatul etapei
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
53
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
54
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
56
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
57
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
58
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
61
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Tabelul 10. Rezultatul examenului biochimic seric (profil proteic şi energetic) efectuat
la 14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada
de păşunat – valori individuale
Nr. crt Proteine totale Albumină Uree Glicemie Colesterol
(g/dl) (g/dl) (mg/dl) (mg/dl) total
(mg/dl)
1. 4.1 3.4 40 60.2 244.7
2. 9.3 3.0 27 74.23 344.7
3. 4.3 2.9 32 53.22 297.9
4. 10.5 2.9 44 50.80 224.3
5. 8.8 3.7 37 51.62 294.8
6. 8.4 3.5 142 46.81 316.8
7. 9.9 3.4 34 60.80 225.8
8. 9.9 3.1 45 82.70 389.5
9. 9.4 3.8 61 74.60 240.1
10. 9.3 3.5 53 43.71 246.8
11. 9.6 3.5 44 79.82 238.3
12. 10.2 2.8 32 64.54 262.2
13. 8.5 4.2 51 60.21 249.9
14. 10.3 4.3 70 58.74 223.4
X 9.60 3.60 50.86 66.33 264.31
ds 0.62 0.55 12.32 13.71 56.46
CV, % 6.42 15.21 24.23 20.67 21.36
Valori de referinŃă 7 - 8,2 3,04-3,84 20-40 48-72 124-224
De asemenea, ureea serică a depăşit maxima admisă la 57,14% din probe, iar
colesterolul total a excedat valoarea maximă admisă în proporŃie de 100%. ConŃinutul
seric de albumină şi glucoză a oscilat, înregistrându-se atât cazuri cu deficit de
biocomponente (3, respectiv 2 cazuri din 14), cât şi cazuri de depăşiri ale pagului maxim
admis (2, respectiv 3 cazuri din 14 investigate).
Profilul enzimatic a fost caracterizat prin valorile individuale prezentate în tabelul
11 şi care au evidenŃiat valori crescute ale activităŃii TGO la toate probele analizate, dar şi
ale fosfatazei alcaline în proporŃie de 50%. Activitatea TGP a fost în limite normale.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
62
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
4. Concluzii
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
63
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Valorile scăzute ale glicemiei indică deficit energetic, în special la vacile aflate în
perioada de stabulaŃie. În timpul lactaŃiei, vacile au nevoie cu 40-60% mai multă energie
decât în perioada de repaus mamar. Dacă lactaŃia se realizează în timpul sezonului rece,
capacitatea vacii de a-şi menŃine condiŃia corporală şi de continua să producă lapte va fi
serios compromisă dacă nivelul de energie din raŃie nu este suficient. Ca regulă generală,
pentru fiecare scădere a temperaturii cu 10°C sub pragul de -20°C, vacile vor avea
nevoie, în plus, de 4-6 Mcal energie digestibilă pe zi. Vara, consumul nutreŃului verde
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
64
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
prin păşunat are o influenŃă favorabilă asupra rezistenŃei organice, asupra sănătăŃii ş i
productivităŃii, datorită acŃiunii favorabile a mişcării, razelor solare şi a aerului curat.
Creşterea colesterolemiei indică stări de suprasolicitare.
Modificările activităŃii unor enzime serice TGO, Pal, GGT indică evoluŃia la vaci a
unor organopatii, cum ar fi hepatopatii (creşterea activităŃii TGO), osteoartropatii
evolutive (creşterea activităŃii Pal) (tabel 3, 7 şi 11).
Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar ş i
hipomagneziemie destul de serioasă (tabel 4, 8 şi 12). Valorile macroelementelor serice
analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii.
Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe
toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană.
Erorile de alimentaŃie determină afecŃiuni metabolice şi funcŃionale. Acestea se
înregistrează cu precădere in perioada de repaus mamar, cit şi in perioada de început de
lactaŃie. Pe ansamblu, erorile alimentare provoacă nu numai stare de boala, determinând
şi scăderea producŃiei de lapte.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
65
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de
la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńări
europene, are conotaŃii de hrană „naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi ca indicatori ai
păşunatului verde.
Din punct de vedere al factorilor care afectează compoziŃia carotenoizilor în alimente,
studiile arată că alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de vedere al
conŃinutului de carotenoizi. ProporŃiile relative ale acestor carotenoizi sunt destul de constante,
dar concentraŃiile absolute variază considerabil. Pot fi deosebite opt modele principale privind
nivelele de carotenoizi în diferite resurse alimentare.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
67
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
68
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
CAPITOL 1
1. 1 Introducere
hrănirea/alimentaŃia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă). In general, controlul concentraŃiei
de β-caroten din lapte se efectuează prin mecanisme de concentrare/ diluare şi prin eficienŃa
extracŃiei din plasmă. ConcentraŃia de β-caroten din brânză este în strânsă legătură cu concentraŃia
de β-caroten din lapte, având în vedere că în timpul producerii brânzei au loc pierderi importante
de retinol. Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de
carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a
trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte permite un control
eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate [3].
Carotenoizii din plante sunt transferaşi în produsele animale, uneori în concentraŃie mai
mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută, cum ar fi în produsele
rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a stratului adipos.
Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de
la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńări
europene, are conotaŃii de hrană „naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi ca indicatori
ai păşunatului verde.
La rumegătoare, ca şi la alte animale, carotenoizii (mai ales β-carotenul), sunt precursori
ai retinolului (vitamina A). Printre rolurile retinolului la rumegătoare, ca şi la alte mamifere, s-a
studiat intens influenŃa sa asupra reproducerii/ înmulŃirii. O deficienŃă în retinol poate reduce
eficienŃa reproducerii la vacile de lapte, în special prin funcŃionarea defectuoasă a ovarelor şi
frecvenŃa producerii avorturilor. Retinolul este, de asemenea, implicat în mai multe funcŃii vitale,
cum ar fi vederea, creşterea şi fertilitatea masculină. Alături de vitamina E şi de polifenoli,
carotenoizii sunt antioxidanŃi naturali în dietele rumegătoarelor. Aceştia joacă un rol important în
comunicarea celulelor şi funcŃia imunologică, prin protejarea celulelor faŃă de radicalii liberi. S-a
demonstrat capacitatea carotenoizilor şi a retinolului de a reduce mastita/mamita la vacile de
lapte, chiar dacă efectul β-carotenului nu a fost sistematic. Carotenoizii au, de asemenea, un rol
pozitiv asupra fertilităŃii, independent de rolul retinolului. În plus, pe lângă rolul pe care îl au în
sănătatea vacilor, concentraŃii ridicate de carotenoizi în lapte contribuie la o îmbunătăŃire a valorii
nutriŃionale a produselor lactate.
Chiar dacă este evident că, în multe Ńări, aportul de carotenoizi în dieta oamenilor
provine, în mare măsură, din morcovi, precum şi din alte fructe şi vegetale, se estimează că o
concentraŃie mai ridicată este disponibilă în produsele lactate, conferindu-i laptelui o imagine mai
bună în acceptabilitatea consumatorilor. În plus, carotenoizii pot juca un rol şi în stabilirea
componentelor oxidabile din lapte. De asemenea, o concentraŃie mai ridicată de retinol în lapte
poate avea efecte benefice în îmbunătăŃirea aportului de vitamina A la oameni, în zone în care
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
70
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
această deficienŃă este des întâlnită. În ciuda diferitelor roluri benefice ale carotenoizilor, trebuie
acordată atenŃie transferului lor, de la dietă până la laptele de vacă [3].
Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmenŃi vegetali, care
prezintă efecte protectoare atât la nivelul Ńesuturilor vegetale cât şi a celor animale. Carotenoizii
reprezintă un grup de coloranŃi naturali, galbeni, portocalii sau roşii, răspândiŃi, în principal, în
regnul vegetal (în morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya,
mango) şi în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon). Sunt compuşi care au 40 de
atomi de carbon (8 resturi de izopren), cu structură de izoprenoide, rezultaŃi prin unirea “cap-
coadă” a unor unităŃi de izopren.
O caracteristică principală este localizarea centrală a sistemului de duble legături
conjugate, care constituie grupările cromofore. Acestea conferă carotenoizilor proprietatea de a
absorbi radiaŃia luminoasă în domeniul vizibil, fiind baza identificării şi cuantificării lor.
Scheletul de bază poate fi modificat în multe feluri, incluzând ciclizarea, hidrogenarea,
dehidrogenarea, introducerea oxigenului, rearanjarea, micşorarea catenei sau combinarea acesteia,
rezultând o multitudine de structuri.
Din punct de vedere chimic, carotenul este o terpenă, sintetizată biochimic din 8 unităŃi
izopren. Ca hidrocarburi care nu contin oxygen, carotenoizii sunt liposolubili, insolubili în apă, în
contrast cu alŃi carotenoizi, precum xantofilele (care sunt mai puŃin hidrofobe).
β-carotenul este compus din două grupări retinyl, care sunt scindate în mucoasa
intestinului subŃire de β-carotene-dioxigenază, în retinal (o formă de vitamina A). Carotenul se
poate acumula în ficat şi Ńesutul adipos şi poate fi convertit în retinal când este nevoie, care este o
forma de vitamina A pentru oameni şi alte specii de mamifere.
Au fost identificate peste 600 de carotenoizi naturali şi se poate estima că natura produce
anual peste 100 de milioane de astfel de pigmenŃi. Cei mai răspândiŃi pigmenŃi cu această
structură sunt: fucoxantina (alge marine), luteina (plante ierboase), β-carotenul, licopina,
violaxantina şi apocarotenoidele (compuşi cu mai puŃin de 40 de atomi de carbon în moleculă).
Carotenoizii de culoare galbenă şi portocalie sunt cunoscuŃi sub numele de caroten iar cei
de culoare roşie sub numele de licopină. Carotenoizii se comportă ca şi antioxidanŃi, şi unii sunt
precursori ai vitaminei A (din ele se sintetizează vitamina A), de aceea sunt numite provitamine.
Carotenoizii sunt folositi în alimentaŃie pentru colorarea untului, margarinei, cremelor lactate etc.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
71
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
α-caroten
α-carotenul este o substanŃă cristalină de culoarea cuprului, solubilă în solvenŃii organici.
Prin încălzire, α-carotenul este posibil să se transforme în β-caroten. În plante se găseşte în
cantităŃi mai mici decât β-carotenul.
β-carotenul se prezintă sub formă de cristale violete, de asemenea solubile în solvenŃii
organici. Este foarte răspândit în tot regnul vegetal, însoŃind permanent clorofila. Prin hidroliză
enzimatică oxidativă, β-carotenul se transformă în două molecule de vitamină A1.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
72
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
γ-carotenul se prezintă sub formă de cristale roşii cu reflexe albastre, solubile în solvenŃi
organici. γ-carotenul este puŃin răspândit în regnul vegetal, însă, în morcov se găseşte în
cantitatea cea mai ridicată.
Licopina (E160d) este o substanŃă cristalină, de culoare roşu-violet, insolubilă în apă,
solubilă în solvenŃi organici.
licopina
DerivaŃi oxigenaŃi ai hidrocarburilor carotenoidice (alcooli, epoxizi, cetone)
Sunt cunoscuŃi sub numele de xantofile. Acest termen, introdus de Berzelius, defineşte grupa
alcoolilor cu schelet carotenoidic. Se cunosc mai multe xantofile, dintre care cele mai importante
sunt luteina şi zeaxantina. Luteina este o substanŃă cristalizată de culoare galbenă cu luciu violet,
însoŃeşte β-carotenul şi clorofila în toate plantele verzi. Este colorantul galben al florilor. Se
găseşte, de asemenea, în gălbenuşul de ou şi în Ńesuturile animale. Zeaxantina se prezintă sub
formă de cristale portocalii. Structural se deosebeşte de luteină prin poziŃia unei duble legături (2
cicluri β-ionice).
Dintre cetonele carotenoidice se pot menŃiona rodoxantina, cantaxantina şi astaxantina.
Rodoxantina - dicetonă carotenoidică, este o substanŃă de culoare roşie-albăstruie, răspândită în
plantele acvatice şi în conifere.
Produşii reprezentativi utilizaŃi drept coloranŃi alimentari sunt luteina şi citraurina,
principiul colorat din coaja de portocale.
luteina
citraurina
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
73
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
norbixina
crocina
Din 1971, majoritatea Ńărilor permit folosirea pigmenŃilor carotenoidici ca pigmenŃi
alimentari pentru colorarea unor produse ca unt, margarină, brânză, îngheŃată, macaroane, frişcă,
gelatină, supe, sucuri de fructe. Compuşii sunt stabili la lumină şi în medii reducătoare şi prezintă
avantajul că sunt compatibili cu alte tipuri de coloranŃi, ceea ce permite nuanŃarea lor.
Datorită solubilităŃii scăzute în grăsimi, pentru mărirea caracterului lipofil, aceştia se
supun esterificării cu acizi graşi. Metodele de realizare a extractelor nu diferă foarte mult, chiar
Ńinând cont de varietatea şi de aria de răspândire în regnul vegetal şi animal. Spre exemplu,
pigmentul galben din cojile de portocale se poate extrage la cald cu eter de petrol. Extractul se
concentrează iar apoi se antrenează carotenoizii cu abur supraîncălzit. FracŃiunea uleioasă
rezultată se extrage din nou cu eter de petrol şi se concentrează rezultând prin răcire pigmentul
care se filtrează şi se usucă [9].
Alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de vedere al conŃinutului de
carotenoizi. Legumele verzi, cu sau fără frunze, au un model/ tipar calitativ de luteină definit, cu
β-caroten, violaxantină şi neoxantină, ca şi carotenoizi principali. ProporŃiile relative ale acestor
carotenoizi sunt destul de constante, dar concentraŃiile absolute variază considerabil. În plus,
legumele verzi conŃin şi carotenoizi mai puŃin importanŃi cum sunt: α-carotenul, α sau β-
criptoxantina, zeaxantina, antheraxantina şi 5, 6-epoxiluteina.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
75
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
76
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este necesară
pentru a minimiza pierderile, pentru a face ca produsele să fie disponibile pe tot parcursul anului,
şi pentru a permite transportarea în alte locuri decât zona de producŃie. Modificarea, reducerea
conŃinutului sau pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării alimentelor poate
avea loc şi prin transportul fizic (ex. decojire neintenŃionată), izomerizarea geometrică sau prin
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
77
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
oxidarea enzimatică sau ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptată spre procesarea
industrială, prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de carotenoizi.
Procentul reŃinut sau pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării
alimentelor au fost studiate în numeroase articole. Oricum, datele obŃinute, sunt adesea
contradictorii şi dificil de interpretat, din următoarele motive:
a) condiŃiile de procesare şi depozitare nu sunt/ sunt doar parŃial descrise;
b) alimente diferite sunt procesate în mod diferit, făcând compararea metodelor de procesare
dificilă;
c) condiŃii diferite (ex. timp şi temperatură) sunt folosite pentru aceeaşi metodă de procesare;
d) procedura urmată pentru calcularea pierderilor de carotenoizi nu este specifică sau calculul
este greşit.
În plus, trebuie avută o grijă deosebită pentru a asigura că orice izomerizare sau oxidare a
carotenoizilor din timpul analizei şi/sau din timpul depozitării probei, anterior analizei, nu este
atribuită eronat procesării sau depozitării alimentelor.
Chiar dacă astfel de date experimentale sunt puŃine, insuficiente şi discrepante, pot fi
conturate unele concluzii:
a) Biosinteza carotenoizilor poate avea loc în fructe, legume, şi în culturile de rădăcinoase,
chiar după recoltare, cu condiŃia ca plantele să fie păstrate intacte, conservând enzimele
responsabile de carotenogeneză. În frunze şi alte legume, degradarea carotenoizilor post-
recoltare poate predomina, în special la temperaturi ridicate de depozitare şi în condiŃii de
favorizare a veştejirii.
b) Carotenoizii sunt protejaŃi în mod natural în Ńesuturile plantei dar procese ca tăierea,
ruperea, lovirea şi decorticarea fructelor şi legumelor sporesc, prin expunerea la acŃiunea
oxigenului, reacŃia de oxidare dintre carotenoizi şi enzime.
c) Stabilitatea carotenoizilor diferă în diferite alimente, chiar şi când sunt folosite aceleaşi
condiŃii de procesare şi depozitare. Astfel, condiŃiile optime pentru reŃinerea
carotenoizilor în timpul procesului de procesare variază de la un aliment la altul.
Carotenoizii ca atare prezintă susceptibilitate diferită la degradare.
d) Principala cauză a distrugerii carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării este
oxidarea enzimatică şi ne-enzimatică. Izomerizarea trans-carotenoizilor în cis-
carotenoizi, în special în timpul tratamentului termic, alterează activitatea şi modifică
culoarea alimentelor, dar nu în aceeaşi măsură ca oxidarea. În multe alimente, degradarea
enzimatică a carotenoizilor poate fi mai accentuată decât descompunerea termică.
e) La prepararea alimentelor în casă, pierderea carotenoizilor are loc în felul următor:
microunde<abur<fierbere<prăjire. Tigaia adâncă, gătirea prelungită, combinarea
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
78
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
O serie de studii au relevat că în timpul maturării sau păstrării brânzei pe parcursul anului
nu apar modificări sau apar doar modificări minore în ceea ce priveşte concentraŃia de retinol şi
carotenoizi, aşa cum este prezentat în figura 1.1
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
79
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
β-caroten Xantofil
Xantofile Retinol
Figura 1.1 Legătura dintre compoziŃia în β-caroten, xantofile şi retinol a laptelui şi brânzei
Legenda:
∆ Tomme de Savoaie
■ Abondance
▲ Rocamadour
x Cantal
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
80
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
CAPITOL 2
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
81
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
DiferenŃele concentraŃiilor de carotenoizi din speciile de furaje verzi sunt mai puŃin
semnificative faŃă de diferenŃele acestora din speciile de furaje uscate. Park şi co., au găsit cu
50% mai mulŃi carotenoizi în Bromus (Bromus inermis) şi trestie (Phalaris arundinacea) decât în
Agropyron (Agropyron repens), în timp ce Chauveau-Duriot şi co. au demonstrat că trifoiul roşu
conŃine cu 25% mai multi carotenoizi decât piciorul cocoşului sau iarba perenă. În ierburile
tropicale, Reynoso şi co. nu au găsit nici o diferenŃă în ce priveşte concentraŃiile de β-caroten şi
luteină din iarba de gazon (Cynodom dactylon) şi iarba Pangola (Digitaria decumbens). Pe baza
datelor din literatură şi pe baza datelor nepublicate, este dificil să se tragă o concluzie în ce
priveşte diferenŃele sistematice dintre speciile de iarbă cultivată şi cele de iarbă naturală, sau
dintre iarbă şi legume. Mai mult, fertilizarea cu N creşte concentraŃia de carotenoizi din ierburi şi
legume. Aceasta se poate datora activării biosintezei carotenoizilor de către proteine.
Efectul stadiului de maturitate şi/sau anotimpului asupra conŃinutului de carotenoizi în
furaje rămâne încă un subiect controversat. Prache şi co. au raportat că pe o păşune din FranŃa
concentraŃia totală de carotenoizi a variat foarte puŃin între luna mai şi sfârşitul lunii iunie (650-
700 mg/kg DM), apoi a scăzut la 430 mg/kg DM la începutul lunii august. În FranŃa, în timpul
unei veri foarte secetoase, Calderon şi co. nu au observat o influenŃă a gradului de maturitate în
concentraŃia de carotenoizi din iarba verde naturală pe parcursul lunii iunie. În urma studiilor
efectuate s-a observat că, concentraŃia de carotenoizi scade cu vârsta furajului, indiferent de
sezon, de numărul cositorilor sau de numărul regenerărilor.
ConcentaŃiile de luteină şi β-caroten în furajele verzi sunt de 2-3 ori mai mari pentru
aceeaşi specie de iarbă umedă tropicală, comparativ cu cea uscată. Unii autori au pus acest
rezultat pe seama proporŃiei ridicate de frunze la tropicele umede, dar este foarte probabil ca alŃi
factori, cum ar fi de exemplu temperatura sau radiaŃia solară, să modifice gradul de sinteză al
carotenoizilor.
Duriot şi co. au arătat că din momentul cosirii fânului şi până în momentul însilozării fânului
uscat se înregistrează o pierdere medie a carotenoizilor de până la 83%, aşa cum este reprezentat
în figura 2.1.
Figura 2.1 Efectele metodelor de conservare a furajelor cultivate, asupra concentraŃiilor de xantofile şi β-
caroten
Legenda:
(□) xantofile
(■) β-caroten
C - piciorul cocoşului (Dactilys glomerata)
PR - iarbă perenă (Lolium perenne)
RC - trifoi roşu (Trifolium pratense)]
Pierderile de luteină şi epiluteină au loc mai lent decât cele de zeaxantină şi caroten.
Această pierdere a carotenoizilor se datorează, în special, radiaŃiilor solare, deoarece prin
expunerea la razele UV pe întuneric poate fi distrusă întreaga cantitate de carotenoizi. Oricum,
pierderi moderate de carotenoizi apar şi în timpul depozitării în interiorul şopronului, probabil
datorită prezenŃei oxigenului.
Independent de veştejire, procesul de însilozare determină scăderea concentraŃiei de
carotenoizi. Pierderile de carotenoizi depind de pH şi sunt favorizate de condiŃiile aerobe. Aceste
pierderi sunt mai mari în cazul legumelor decât în cazul ierbii, când pH-ul este mare (~ 5) şi când
sigilarea silozului este întârziată, crescând proporŃional cu timpul de depozitare. Pierderile
maxime pot ajunge până la 80% din concentraŃia iniŃială, dar în silozurile bine construite
pierderile sunt, în general, mai mici de 20%.
În cazul deshidratării lucernei, rezultă o pierdere a carotenilor şi a xantofilelor, extinderea
pierderii depinzând de proces. Această pierdere este mai mare pentru procesele în care se
foloseşte temperatură mare, în special pentru xantofile, când produsul finit are o concentaŃie mare
a umidităŃii. La o temperatură de 120ºC, şi o umiditate a produsului final de 8%, deshidratarea are
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
83
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
un efect limitat asupra carotenoizilor, cu toate că în condiŃii mai drastice (mai mult de 150ºC, şi
mai puŃin decât 3% umiditate finală) pot rezulta pierderi mai mari de 33% caroteni şi 73%
xantofile. În oricare din cele două cazuri, deshidratarea are un efect negativ mai redus decât
însilozarea sau întoarcerea şi strângerea/adunarea fânului cosit.
CAPITOL 3
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
84
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Figura 3.1 Studierea relaŃiei dintre β-carotenul dietetic şi concentraŃia β-carotenului din grăsimea laptelui la
lactaŃia medie a vacilor
Legenda:
1
Carotenoizi
2
β-caroten
3
Grăsimea din unt estimată la 40 g/kg
4
Date nepublicate de la INRA, Theix, France
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
85
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Tabel 3.1
InfluenŃa rasei vacilor asupra carotenoizilor 1,2 şi retinolului din lapte şi produse lactate
O variaŃie mare apare şi în cazul β-carotenului din plasmă (de la 1 la 16 µg/ml), în timp
ce concentraŃiile de retinol sunt mai puŃin variabile (de la 0.1 la 0.6 µg/ml). Au fost identificati
câŃiva factori atât dietetici cât şi nedietetici care influenŃează această variabilitate. In aceste studii
s-au utilizat numeroase tehnici pentru extracŃie şi/sau cuantificare prin spectrofotometrie sau
cromatografie. In studii mai vechi, rezultatele sunt exprimate diferit (de exemplu: carotină,
carotenoizi, carotene sau caroten), în timp ce importanŃa biochimică pentru fiecare termen nu a
fost specificată. Aceasta se datorează, probabil, variaŃiilor mari ale valorilor absolute raportate, în
diferite publicaŃii [1].
3.2 InfluenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra variaŃiei concentraŃiei de
markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte
ConcentraŃiile scăzute de β-caroten sau retinol din plasmă au fost asociate cu o creştere a
incidenŃei infecŃiei la uger. Vacile care sufereau de mastită severă aveau tendinŃa de a produce
lapte care conŃinea mai puŃin β-caroten şi mai mult retinol decât vacile sănătoase, dar diferenŃele
au fost neînsemnate la lactaŃiile medie şi timpurie.
ProducŃia de lapte şi grăsimea din lapte
Efectul nivelului producŃiei de lapte asupra concentraŃiilor de carotenoizi şi retinol din lapte a fost
evaluat indirect prin intermediul factorilor care o afectează, de exemplu rasa, stadiul de lactaŃie
sau nivelul de alimentare. Mai exact, prin comparare, o singură mulgere pe zi induce o scădere a
producŃiei de lapte şi o creştere a a conŃinutului de grăsime din lapte, în timp ce două mulgeri pe
zi, determină producerea unei brânze mult mai galbene.
Variabilitatea individuală
ConcentraŃia de carotenoizi din plasmă şi din lapte este variabilă între indivizi.
Factorii din dietă care influenŃează concentraŃiile de carotenoizi şi retinol din lapte sunt:
Natura furajelor
ConentraŃia de β-caroten din lapte este direct dependentă de concentraŃia de β-caroten din dietă.
ConcentraŃia de β-caroten variază în funcŃie de maturitatea ierbii şi scade pe parcursul uscării şi
conservării acesteia, proporŃional cu gradul de expunere la lumină, deoarece β-carotenul este
foarte sensibil la radiaŃiile UV.
Gradul de maturitate şi managementul nutreŃului verde
Hrănirea cu nutreŃ verde a fost asociată pentru mult timp cu concentaraŃii mari de β-caroten în
lapte, cu variaŃii mari funcŃie de sezon, când gradul de maturitate şi perioada de lactaŃie sunt
confundate.
β-carotenul şi suplimentarea cu vitamine
Unele studii au demonstrat că β-carotenul are un rol specific în eficienŃa reproducerii la bovine,
pe lângă activitatea sa de provitamină A. La vaci, prin suplimentarea dietei cu vitamina A, are loc
o creştere a concentraŃiei de retinol în plasmă, colostru şi lapte, dar se reduce concentraŃia de
carotenoizi, atât în lapte cât şi în plasmă. Când se suplimentează cu vitamina E furajele pentru
vaci, are loc o scădere a concentraŃiei de β-caroten în plasmă şi în Ńesutul celular.
Durabilitatea şi întârzierea stării de latenŃă
În timpul lactaŃiei medii, schimbarea alimentaŃiei de la iarbă verde la o dietă pe bază de fân,
induce rapid o scădere a concentraŃiei de β-caroten şi a culorii, atât în plasmă cât şi în lapte.
Schimbările apar din prima zi, iar diferenŃa maximă în concentraŃia de β-caroten din lapte, între
dieta pe bază de iarbă verde şi dieta pe bază de fân apare după 10-15 zile de la transferul acestora
din furaje în lapte şi în plasmă.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
87
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
BilanŃul energetic
Cu o cantitate fixă de β-caroten şi retinol ingerată, limitarea energiei consumate pe parcursul
lactaŃiei medii, induce o creştere a concentraŃiei de β-caroten şi retinol din lapte, deşi concentraŃia
din plasmă rămâne neschimbată. Deoarece concentraŃia din plasmă rămâne neschimbată,
creşterea secreŃiei de retinol în lapte, poate fi raportată mai exact la o transmitere a β-carotenului
din rezervele de Ńesut adipos.
Carotenoizii şi retinolul sunt sensibili la diferiŃii factori fizico-chimici, cum ar fi: aerul,
agenŃii de oxidare şi razele UV. Degradarea lor este accelerată de temperatură ridicată şi este
catalizată de ionii anorganici. Retinolul poate fi instabil la valori ale pH-ului mai mici de 4. Un
pH scăzut cauzează izomerizarea parŃială a retinolului de la toate formele trans la mai puŃin
eficientele forme cis, iar prin hidroliza esterilor retinolului rezultă un retinol mult mai instabil.
Prin urmare, tratamentele tehnologice, cum sunt încălzirea sau acidifierea aplicate la procesarea
laptelui (pentru obŃinerea de produse lactate) ca si procesarea imediată (fără repaus după
recoltare) şi mediul de depozitare (lumină, temperatură), sunt factori care degradează/permit
degradarea acestor micronutrienŃi şi influenŃează carenŃa vitaminică a produselor lactate rezultate.
În plus, procesarea unor produse lactate (brânză, unt) implică transferul selectiv al constituenŃilor
din lapte în produse lactate. Oricum, o proporŃie scăzută de retinol şi carotenoizi este asociată cu
proteinele din zer sau este concentrată în membrana globulelor laptelui gras. Ca rezultat, o
anumită cantitate a acestor micronutrienŃi, poate fi pierdută prin zer, în timpul producerii brânzei
şi untului [3].
Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în
componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul care determină
variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui.
MulŃi cercetători au demonstrat că, în afară de aspectele legate de conŃinutul de
substanŃă uscată din brânză, variabilitatea compoziŃională a acesteia în acizi graşi, β-caroten,
xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compoziŃia „laptelui original”.
CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi carotenoizi,
este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compoziŃia biologică, stadiul de maturitate,
modul de conservare etc.), de specia animalului, de rasă, de modul de recoltare a laptelui şi,
bineînŃeles, de stagiul de lactaŃie în care se află animalul [1].
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
88
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Carotenoizii din lapte influenŃează proprietăŃile senzoriale ale produselor din lapte fie
indirect, prin intermediul proprietăŃilor antioxidante, fie direct, prin proprietăŃile lor de
îngălbenire.
a) ProprietăŃile antioxidante
Lipidele din produsele lactate pot suferi procese de oxidare, determinând schimbări ale calităŃii
produselor finite lactate şi, uneori, un impact negativ asupra calităŃii acceptabile apreciată de
consumatori. Autooxidarea lipidelor, similar cu oxidarea indusă de lumină, este afectată de un
complex de pro- şi antioxidanŃi. Principalii compuşi antioxidanŃi din lapte sunt enzimele (adică
superoxid-dismutaza, catalaza, glutation-peroxidaza), lactoferina, vitaminele C şi E, şi
carotenoizii. Vitamina E şi carotenoizii acŃionează ca antioxidanŃi solubili în grăsime (de
exemplu, β-carotenul este implicat în prevenirea foto-oxidării).
CAPITOL 4
łinând cont de faptul că moleculele carotenoidice prezintă un lung lanŃ de legături duble
conjugate, acestea reacŃionează foarte uşor cu acizii, bazele, oxigenul şi lumina, motiv pentru care
trebuie avută o grijă deosebită când se analizează produse cu un conŃinut scăzut de carotenoizi (de
exemplu uleiul din seminŃe de dovleac) [6].
În general, analiza carotenoizilor constă în urmatoarele etape:
a) selecŃia şi prepararea probei,
b) extracŃia,
c) separarea cu un solvent compatibil, imediat după pasul cromatografic,
d) saponificarea şi spălarea,
e) concentrarea sau evaporarea solventului,
f) separarea cromatografică,
g) identificarea şi
h) cuantificarea.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
90
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Legenda:
TLC - eter de petrol/acetonă (80/20 % vol.)
HPLC - metanol, acetonitril, clorură de metilen
Metoda TLC permite separarea a 4 benzi, în timp ce prin metoda HPLC s-au obŃinut 14
picuri. Metodologia TLC poate fi completată de tehnici de separare mult mai eficiente, cum este
de exemplu metoda HPLC cuplată cu UV-Vis şi/sau detecŃie fluorometrică.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
92
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Având un caracter clar hidrofob, pentru analiza carotenoizilor se preferă o coloană C18 cu
inversie de fază (RP - reversed phase). De curând, a apărut pe piaŃă coloana C30-RP, care este, în
mod special, foarte potrivită pentru separarea carotenoizilor, Ńinând cont de faptul că interacŃiile
dintre pigmenŃi şi faza staŃionară sunt maximizate datorită mărimii lor, similare. EficienŃa unei
asemenea coloane este foarte ridicată, permiŃând diferenŃierea mai multor izomeri cis ai aceluiaşi
carotenoid. Această metodă a fost aplicată, cu succes, pentru determinarea carotenoizilor
saponificaŃi din sucul de portocale. Cu toate acestea, când se analizează un amestec foarte
complex, co-eluŃiile devin limitate foarte repede. O fază staŃionară mai puŃin selectivă, cum este
C18-RP, este utilizată, de preferat, pentru analize mai puŃin detaliate. Faza mobilă este alcătuită de
obicei din solvenŃi organici, cu excepŃia cazului în care trebuie separate molecule foarte polare de
carotenoizi, cum sunt glicozil esterii. În acest caz este recomandat un amestec dintre un solvent
organic polar cu o cantitate mică de apă.
În vederea îmbunătăŃirii separării pigmenŃilor, câteodată este utilă încălzirea coloanei.
Această procedură nu este, însă, recomandată, deoarece poate declanşa izomerizarea
carotenoizilor, modificare care nu este detectată foarte exact de metodele HPLC. AtenŃie
deosebită trebuie acordată pentru asigurarea condiŃiilor cromatografice potrivite, pentru ca
pigmenŃii să nu treacă prin coloană neseparaŃi.
Suplimentarea HPLC cu un detector cu diode înseriate, împreună cu nişte computere
puternice, contribuie enorm la îmbunătăŃirea puterii analitice a HPLC. Utilizând asemenea
detectori este posibilă urmărirea simultană a eluŃiei pe întreaga zonă UV-Vis (190-800 nm), ceea
ce garantează că fiecare pigment poate fi urmărit la absorbŃia sa maximă (cu maximă
sensibilitate).
poate fi extras la 43°C şi la aproximativ 70 MPa. Cu toate acestea, unele tipuri de echipamente nu
permit eluŃia la o asemenea presiune. Trebuie găsite noi condiŃii de temperatură şi presiune,
folosind o diagramă care să reprezinte variaŃiile de presiune vs. densitate pentru diferite
temperaturi. Prin intermediul unei temperaturi mai scăzute, densităŃile similare celor atinse la
temperaturi înalte pot fi obŃinute pentru presiuni mai scăzute, acestea fiind, de fapt, densităŃile
corespunzătoare condiŃiilor subcritice. Utilizând această tehnică, Ibanez, Lopez-Sebastian, Tabera
şi Reglero (1998) au separat cu succes β-carotenul din licopen în mai puŃin de 10 minute. Cea mai
bună separare a fost obŃinută la 10°C, sub o presiune de aproximativ 35 MPa, cu o coloană
capilară ce conŃinea grupe de siloxan dezactivat cu reactiv ciclo-octametil-tetrasiloxan. Structura
este „spartă” la o temperatură înaltă, formându-se legături O-Si-CH3 cu fază de silicaŃi.
Nici una din metodele descrise mai sus nu este în întregime potrivită pentru o separare
completă a unui amestec complex de pigmenŃi. Amprenta tetrapirolului, de exemplu, este
adeseori suficientă pentru identificarea cromoforului său, dar nu conŃine informaŃii destule
pentru identificarea structurii complete a pigmentului. Această observaŃie poate fi parŃial dedusă
din comportamentul cromatografic şi din compararea datelor de retenŃie obŃinute cu cele din
literatură. Alte metode, cum ar fi spectrometria de masă (Mass Spectrometry - MS), se aplică
pentru caracterizarea completă a structurii moleculei. Progresele recente făcute în domeniul MS
permit analiza unor cantităŃi de genul sub-nanogramelor şi au făcut această tehnică atractivă
pentru cercetarea din domeniul alimentar [6].
Tabel 4.1
AbsorbŃia UV-Vis pentru carotenoizii găsiŃi frecvent în alimente
Cei mai mulŃi carotenoizi absorb maxim 3 lungimi de undă, rezultând, astfel, un spectru
în 3 picuri. Pe măsură ce numărul legăturilor duble conjugate creşte, λmax se schimbă/modifică la
lungimi de undă mai mari. Cei mai mulŃi carotenoizi sunt nesaturaŃi, aciclici, precum licopenul,
care are 11 legături duble conjugate, este de culoare roşie şi absoarbe la lungimi de undă foarte
mari (λmax = 444, 470 sau 502 nm), aşa cum este reprezentat în figura 4.2.
Figura 4.2 Spectrul de absorbŃie în vizibil al licopenului (___ ), β-carotenului (-.-.-), γ-carotenului (----) şi α-
carotenului în eter de petrol
ζ-carotenul (galben deschis) care este, de asemenea, aciclic, prezintă 3 picuri bine
definite, dar la lungimi de undă mult mai mici (λmax = 378, 400 sau 425 nm), proporŃional cu cele
7 legături duble conjugate. Cei doi carotenoizi mai puŃin coloraŃi, care îi preced ζ-carotenului în
etapa de desaturare a căii biosintetice, phytoenul (cu 3 legături duble conjugate) şi phytofluenul
(cu 5 legături duble conjugate) prezintă o absorbŃie maximă în regiunea UV (la 276, 286, 297 şi,
respectiv, la 331, 348 şi 367), cum este reprezentat în figura 4.3. [5]
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
95
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Figura 4.3 Spectrul de absorbŃie în vizibil al ζ-carotenului (__), phytoenului (….) şi phytofluenului(--).
Faza mobilă: acetonitril/acetat de etil/metanol (85:10:5)
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
96
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Compararea acestui spectru cu cel al unor pigmenŃi puri, permite identificarea familiilor
de pigmenŃi care compun, în cazul de faŃă, uleiul (carotenoizi şi pheophytină). Deoarece mediul
înconjurător în care se găseşte pigmentul (solvent, temperatură etc.) influenŃează puternic poziŃia
şi forma spectrului, un spectru de absorbŃie brut este total inutil pentru măsurarea directă a
concentraŃiei pigmentului. Măsurătorile necesită extracŃia pigmentului cu un solvent potrivit,
pentru care a fost stabilit, în prealabil, setul de ecuaŃii sau pentru care au fost determinaŃi, cel
puŃin, coeficienŃii de absorbŃie. Cu aceste date, este întotdeauna posibilă stabilirea unui nou set de
ecuaŃii, adaptat la o situaŃie particulară. Precizia metodei depinde de tipul de aparat utilizat, de
capacitatea acestuia de a determina cu precizie absorbanŃa maximă şi, bineînŃeles, de acurateŃea
coeficientului de absorbŃie utilizat pentru calcule. Este recomandată, oricum, verificarea cu
regularitate a literaturii de specialitate pentru valori şi seturi de ecuaŃii noi.
Suprapunerea parŃială a benzilor de absorbŃie a pigmenŃilor prezenŃi în amestec complică
estimarea concentraŃiei unui pigment individual, aceasta fiind şi mai puŃin eficientă dacă numărul
de pigmenŃi este mai mare ca 3.
Se mai poate adăuga că, izomerii cis-carotenoidici, pot fi recunoscuŃi deoarece spectrul
lor de absorbŃie prezintă o bandă adiŃională în regiunea UV. PoziŃia legăturii duble din forma cis,
este redată prin raportul Acis/AMAX.
În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brută a pigmenŃilor prezenŃi
într-un extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exactă a
pigmenŃilor dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea şi
cuantificarea definitivă a
pigmenŃilor necesită de obicei realizarea unor standarde, care sunt decisive în analiza pigmenŃilor
din produsele alimentare. [6]
Studiul experimental 1
Referitor la un astfel de studiu, în timpul perioadei pre-experimentale, 32 de vaci aflate la
lactaŃie medie au fost hrănite cu furaje şi apoi au fost împărŃite în 4 grupe; la 2 grupe s-a
menŃinut dieta cu furaje iar 2 grupe au fost trecute pe o dietă cu fân uscat. Din grupele hrănite cu
furaje, un grup a fost hrănit în funcŃie de energia netă pentru lactaŃie şi necesarul de azot, iar
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
97
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
celălalt grup a fost supus unei subnutriŃii energetice, cu furaje similare şi un aport de carotenoizi
între cele două grupuri. S-a monitorizat, timp de 8 săptămâni, variaŃia carotenoizilor şi indexul
de culoare din plasmă şi din lapte. Carotenoizii şi retinolul din lapte au fost identificaŃi prin
metoda HPLC. Pentru aceasta a fost necesară o prelucrare iniŃială a probelor de lapte, aşa cum
este prezentată în continuare.
Realizarea probelor de lapte
• 1 ml de lapte a fost amestecat cu 1 ml de etanol, care conŃinea ca standard intern
echinenonă, şi cu 1 ml de hexan.
• Probele au fost centrifugate (1,200*g, 2 min) iar faza organică superioară a fost colectată.
AcŃiunea a fost repetată de două ori.
• Stratul etanolic a fost evaporat încet la sec, sub azot pur.
• S-au combinat extractele organice, şi s-a adăugat încă 1 ml de etanol şi apă (90/10
%vol.).
• Fiolele au fost agitate (5 min) şi centrifugate (1,200*g, 2 min).
• Faza de hexan a fost evaporată la sec cu azot pur.
• După ce s-au adăugat peste reziduu 2 ml KOH 10% amestecul a fost mixat 1 min. şi
incubat la 37°C timp de 120 de minute.
• Saponificarea a fost oprită prin adăugarea 1 ml de apă.
• Carotenoizii şi retinolul au fost extraşi de două ori cu 1 ml hexan.
• Faza organică a fost spălată de două ori cu 1 ml de apă, colectată şi, în final, a fost
adăugată în fiola care conŃinea reziduul uscat de la faza fenolică iniŃială.
• Amestecul a fost mixat, centrifugat şi evaporat la sec sub azot pur.
• Reziduurile au fost dizolvate în 200 µl diclormetan şi acetonitril (50/50 %vol.) iar 80 µl
au fost injectaŃi pentru analiza HPLC.
Echipamente, materiale si metode
• Echipamentul HPLC care a fost utilizat în experiment era compus din: un sistem Waters
echipat cu o pompă, un regulator, un autosampler care răceşte probele, şi o serie de
fotodiode folosite ca detectori (care prezintă o capacitate de înregistrare între 280 şi 600
nm).
• A fost folosit softul Millenium 32 pe post de instrument de control, la înregistrarea şi
procesarea datelor.
• Carotenoizii şi vitamina A au fost detectaŃi la 450 şi 325 nm şi fiecare în parte a fost
identificat prin comparaŃie cu timpul lor de retenŃie şi analizele spectrale ale
standardelor pure (>95%).
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
98
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Rezultate
Carotenoizii din lapte au constat în toŃi β-carotenii trans. S-au detectat urme de luteină, dar nu s-
au putut cuantifica. ConcentraŃia de β-caroten din lapte [0.133 vs. 0.062 µg/ml (3.64 vs 1.77
µg/g de grăsime)] la fel şi cantitatea secretată în lapte (2.45 vs. 1.33mg/d), a fost mai mare la
vacile care au fost hrănite cu furaje decât la cele hrănite cu fân. În timpul hrănirii animalelor cu
furaje, a avut loc o creştere a concentraŃiei de carotenoide între 1 şi 50 de la 0.081 la 0.168 µg/ml
(2.17 la 4.53 µg/g de grăsime), la fel şi cantitatea secretată în lapte de la 1.68 la 2.95 mg/d, cum
este reprezentat în figura 4.5.
Figura 4.5 EvoluŃia concentraŃiei de β-caroten, şi indexul de culoare, în plasma şi în lapte, în hrănirea vacilor cu
nutreŃuri diferite şi la nivele diferite de alimentare
(sursa: [4])
Legenda:
■ iarbă intens conservată
iarbă conservată puŃin
▲fân superior
∆ fân inferior.
La animalele hrănite cu fân, concentraŃia din lapte şi cantitatea secretată în lapte a variat
puŃin, între zilele 1 şi 50. DiferenŃele concentraŃiilor de β-caroten din lapte, dintre dieta cu fân şi
dieta cu furaje, au fost semnificative după ziua 10. [4].
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
99
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Tabel 4.2
ConcentraŃiile de carotenoizi, vitamina A şi vitamina E din lapte
Studiul experimental 2
AlŃi cercetători au realizat dozarea spectofotometrică a carotenoizilor şi a retinolului,
bazându-se pe proprietatea carotenoizilor de a absorbi radiaŃia luminoasă în domeniul vizibil, cu
un maxim de absorbŃie situat în jurul valorii de 450 nm. Studiul a fost realizat pe lapte recoltat de
la vaci de lapte aparŃinând rasei Bruna austriaca, exploatate în regim ecologic. Laptele a fost
prelevat de la o exploataŃie ecologică din depresiunea Dornelor.
Prepararea probelor a fost realizată astfel
• Un volum de 20 ml de lapte a fost tratat cu 5 ml soluŃie de amoniac 25% şi 20 ml de
etanol 96%.
• Pentru extracŃia carotenoizilor şi a retinolului s-a adăugat un amestec de 40 ml eter etilic
(ce conŃinea 0.0025% BHT) şi s-a agitat timp de 5 min.
• Faza superioară eterică a fost reluată într-un balon şi evaporată la un rotavapor, la
temperatura de 35°C.
• Saponificarea probelor s-a realizat prin adăugarea la reziduul obŃinut a unui volum de 30
ml hidroxid de potasiu 5% în etanol 96%.
• Probele au fost agitate folosind un agitator magnetic timp de 3 h la întuneric.
• Probele au fost transferate într-o pâlnie de separare de 30 ml de apă şi 30 ml hexan.
• Hexanul a fost îndepărtat şi faza re-extrasă cu hexan.
• Fazele hexanice au fost reunite, spălate în pâlnia de separare cu apă, apoi evaporate la
sec.
• Probele au fost păstrate la congelator până la analiza ulterioară.
• Un volum măsurat de hexan s-a adăugat reziduului obŃinut după saponificare şi se citeşte
absorbanŃa la 450 nm.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
100
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
101
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Legenda:
luteină-zeaxantină (tr= 6.8-7.5 min)
β-criptoxantină (tr= 13.7 min)
licopina (tr= 17.4 min)
β- carotenă (tr= 22.8 min)
Rezultate
În urma injectării probelor de lapte de vacă s-au constatat unele diferenŃe în ceea ce priveşte
cantitatea de carotenoizi în sezoanele de iarnă şi de vară supuse investigaŃiei [10], aşa cum
este prezentat în tabelul 4.3
Tabel 1.3
ConŃinutul în carotenoizi al laptelui de vacă
Studiul experimental 3
Altă determinare a carotenoizilor a fost făcută de Lucas şi co., care au realizat un studiu
corelaŃional în vederea:
• caracterizării compoziŃiei brânzeturilor de vacă, din punct de vedere al
conŃinutului şi variabilităŃii acizilor graşi, retinolului, α-tocoferolului, folatului,
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
102
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Studiul experimental 4
În alt studiu, Lucas şi co. au analizat 5 varietăŃi de brânzeturi franŃuzeşti: Abondance,
Tomme de Savoie, Cantalet, Salers şi Rocamadour, care se obŃin prin 4 tehnologii de procesare.
În vederea analizării substanŃei uscate, acizilor graşi, vitaminelor, carotenoizilor,
mineralelor şi capacităŃii antioxidante totale, probele de lapte recoltate în tuburi de plastic învelite
în folie de aluminiu pentru a fi protejate de lumină, au fost depozitate la o temperatură de -20°C.
Liofilizarea probelor de lapte şi de brânză. Probele de lapte şi de brânză au fost liofilizate
cu ajutorul unui liofilizator TS-12, pentru a favoriza stabilitatea pe termen lung a
micronutrienŃilor. Câte 3 ml (părŃi alicote) din fiecare probă de lapte au fost liofilizate, timp de 48
h, direct în tuburile de plastic şi apoi depozitate la -20°C. Apoximativ 200 g din fiecare probă de
brânză, ăn stare îngheŃată (corespunzător la 2-3 felii de brânză Abondance, Tomme de Savoie,
Cantalet şi Salers, şi 5 felii din varietatea Rocamadour), au fost tăiate în bucăŃi foarte mici şi
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
103
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
liofilizate timp de 72 h. Probele au fost apoi mixate şi depozitate în tuburi de plastic învelite în
aluminiu la -20°C.
Determinarea compoziŃiei probelor de lapte şi brânză. Profilul acizilor graşi din probele
de lapte şi brânză liofilizate, a fost determinat prin gaz-cromatografie, imediat după
transesterificarea acestora în metil ester, cu ajutorul metoxidului de sodiu.
Carotenoizii (β-caroten, luteină, zeaxantină), vitamina A (toŃi retinolii trans) şi vitamina
E (α-tocoferol) au fost analizaŃi prin HPLC.
Carotenoizii şi vitaminele liposolubile au fost extrase din probe, imediat după adăugarea
standardului intern de echinenonă, cu 2x2 volume de hexan. Xantofilele au fost separate din faza
hexanică prin adăugarea a 2x2 volume de soluŃie de etanol în apă (90/10 % vol). După evaporarea
hexanului, reziduul a fost saponificat timp de 2 h la 37°C, cu o soluŃie de KOH (10% în etanol) şi
pirogalol. FracŃia nesaponificabilă a fost apoi extrasă cu hexan, adăugat reziduului cu xantofile,
rămas după evaporarea etanolului. După evaporare, reziduul uscat a fost în final redizolvat într-un
amestec de acetonitril şi dicloretan (50/50 % vol.) şi supus analizei HPLC.[2]
Rezultatele obŃinute sunt prezentate în tabelele 4.4, 4.5 si 4.6.
Tabel 4.4
Caracteristicile nutriŃionale ale probelor de lapte
Lapte de vacă
Min. Mean ± SD Max.
β-caroten (µg/L) 34.0 118 ± 77 290
xantofile (µg/L) 5.16 14.2 ± 8.2 41.0
vitamina A (µg/L) 128 323 ± 138 764
vitamina E (µg/L) 169 642 ± 396 1437
Tabel 4.5
Efectele procesului tehnologic asupra caracteristicilor nutriŃionale
(Sursa: [2])
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
104
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Tabel 4.6
ConŃinutul de vitamine şi carotenoizi al brânzeturilor analizate
(rezultatele sunt exprimate per kg de materie proaspătă)
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
105
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
CONCLUZII
1) Această etapă de raportare a avut ca obiectiv realizarea unei analize critice,
documentară, a referintelor bibliografice, cu privire la metodica utilizată pentru
selectarea şi determinarea markerilor de tip carotenoizi şi importanŃa acestora pentru
organism.
2) Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea
referinŃelor bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea
markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de
la furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vacă.
3) Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmenŃi vegetali
naturali, galbeni, portocalii sau roşii, răspândiŃi, în principal, în regnul vegetal (în
morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya, mango) şi
în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon).
4) Privarea organismului animal de hrana care conŃine aceşti pigmenŃi poate duce la
dispariŃia culorii caracteristice. FuncŃia fiziologică a carotenoizilor în plante nu este
încă bine cunoscută dar în organismul animal aceşti pigmenŃi au rol esenŃial prin
relaŃiile lor cu vitamina A şi cu substanŃele de pe retină, importante în procesul
vederii.
5) Deoarece pot fixa oxigenul, formând compuşi oxigenaŃi puŃin stabili, pigmenŃii
carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere.
6) Carotenoizii sunt implicaŃi în caracterizarea nutriŃională şi senzorială a produselor
lactate şi pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri pentru managementului trasabilităŃii
creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă.
7) Din studiul efectuat s-a constatat că s-au identificat aproape 10 carotenoizi (ex.
xantofile, carotenoizi) în furaje, concentraŃia lor variind foarte mult în funcŃie de
stadiul de dezvoltare şi durata conservării acestora.
8) Diferitele studii realizate au relevat faptul că animalul şi factorii care Ńin de
hrănirea/alimentaŃia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă), atât din punct de
vedere cantitativ cât şi din punct de vedere calitativ, prin variaŃia concentraŃiei în
carotenoizi.
9) Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de
carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de
măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte
permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor
lactate.
10) Carotenoizii din plante sunt transferaŃi în produsele animale, uneori în concentraŃie
mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută, cum ar fi în
produsele rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a
stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele
diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este
asociată cu păşunatul care, în multe Ńări europene, are conotaŃii de hrană
„naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi ca indicatori ai păşunatului verde.
11) CompoziŃia carotenoizilor în fructe şi legume este mult mai complexă şi variabilă, cu
variaŃii chiar şi la carotenoizii principali si pot fi identificate opt modele principale.
12) Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este
necesară pentru a minimiza pierderile. Modificarea, reducerea conŃinutului sau
pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării alimentelor poate avea loc
şi prin transportul fizic, izomerizarea geometrică sau prin oxidarea enzimatică sau
ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptată spre procesarea industrială,
prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de carotenoizi. La
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
106
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
BIBLIOGRAFIE
[1] Lucas, A. si colab., 2006a. Relationship between thw conditions of cow’s milk production
and the contents of components of nutritional interest in raw milk farmhouse cheese,
INRA, 86, p. 177 – 202
[2] Lucas, A. si colab., 2006b. Respective effects of milk composition and the cheese-making
process on cheese compositional variability in components of nutritional interest, INRA,
86, p. 21-41
[3] Noziere, P. si colab., 2006a. Carotenoids for ruminants: From forages to dairy products,
Animal Feed Sc. and Tech., vol 131 (3-4), p. 418-450
[4] Noziere, P. si colab., 2006b. Variation in fat-soluble micronutrients in milk, Journal of
Dairy Science, vol. 89, 7, p.2634-2648
[5] Rodriguez-Amaya, B., Delia, Kimura, Mieko, 2004. HarvestPlus Handbook for Carotenoid
Analysis, HarvestPlus Technical Monograph 2, IFPRI si CIAT, SUA
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
108
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
[6] Schoefs, B., 2002. Chlorophyll and carotenoid analysis in food products. Properties of the
pigments and methods of analysis, Trends in F. Sc. & Tech., 13 , p. 361-371
[7] Stan R., 2007. Aditivi alimentari - Produsi naturali si de sinteza, Ed. Printech, Bucuresti
[8] *** ebooks.unibuc.ro/biologie/ProgreseVolumul2/Articolul9a.doc
[9] *** http://cabcab.home.ro/carte.html 6.10.08 9:45
[10] *** http://www.usamvcluj.ro/html/doctorat/data/Pentelescu_Ovidiu_ro.pdf (accesat
1.02.2009)
1. Rezumatul etapei
Vaca de lapte este o „masinarie animala” din ce in ce mai performanta a carei
eficacitate si productivitate este dependenta de fondul genetic pe care-l are de modul de
alimentatie si de management.
Genetica a facut, in ultimul timp, progrese rapide chiar spectaculoase, obitnandu-
se animale de mare potential. Crescatorii de vaci trebuie sa beneficieze de animale cat
mai bune, dar sa nu creada ca pot obtine performante numai cu vaci de valoare,
subestimand conditiile de mediu.
Alimentatia incearca sa raspunda, dar din ce in ce mai dificil, dificultatilor legate
de cresterea performantelor genetice ale vacilor de lapte. Vacile de mare potential au
exigente nutritionale foarte ridicate si sunt din ce in ce mai putin tolerante la orice eroare
de alimentatie. Cunoasterea caracteristicilor nutreturilor utilizate in hrana acestora are o
insemnatate speciala.
Se considera astfel ca aprecierea valorii energetice şi proteice a nutreŃurilor la
rumegătoare are un caracter dinamic, care Ńine atât de procesul continuu de ameliorare a
capacităŃii acestora de a ingera şi valorifica nutreŃurile, cât şi de factorii exogeni, ce au în
vedere natura furajelor, tehnologia de preparare şi conservare a lor, în general
tehnologiile de exploatare.
Valoarea nutritivă a nutreŃurilor reprezintă capacitatea acestora de a satisface
cerinŃele de substanŃe nutritive ale animalelor, fie pentru întreŃinere, fie pentru sinteza
diferitelor produse zootehnice, care se măsoară prin experienŃe de bilanŃ energetic şi al
azotului.
NutreŃurile diferă între ele prin compoziŃia lor chimică şi conŃinutul în calorii şi
sunt utilizate de către animale în funcŃie de specie, iar în cadrul speciei de categoria de
producŃie, starea fiziologică etc.
Ca urmare a acestor diferenŃe, care Ńin atât de natura furajului, cât şi de natura
animalelor care le utilizează, s-a ivit încă de la început dificultatea comparării valorii
nutritive a nutreŃurilor atunci când s-a pus problema substituirii unui furaj cu altul în
raŃiile de hrană.
S-a constatat ca element comun de legătură conŃinutul nutreŃurilor în energie, care
ca energie brută, raportat la kg substanŃă uscată este asemănător la cea mai mare parte din
furajele utilizate în mod obişnuit şi s-a considerat că exprimarea valorii nutritive prin
acest parametru rezolvă problema, cu atât mai mult cu cât gradul de conversie a furajului
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
109
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
în produse animaliere se poate face cu mai mare uşurinŃă şi precizie tot prin etalonul
energetic.
Compararea energetică a nutreŃurilor s-a făcut, la început, ca energie digestibilă,
corespunzătoare măsurării digestibilităŃii furajelor; apoi, ca energie metabolizabilă, când
a fost posibilă şi măsurarea energiei urinei şi a gazelor de fermentaŃie (metanul) şi în
sfârşit, ca energie netă, fie pentru întreŃinerea vieŃii, fie pentru sinteza diferitelor produse
animaliere, când a fost posibilă şi măsurarea energiei calorice corespunzătoare
metabolismului energetic de întreŃinere şi a extracaloriilor proceselor de asimilaŃie ş i
dezasimilaŃie din organismele animale.
În prezent, în sistemele moderne de apreciere a valorii nutritive a nutreŃurilor,
acestea se compară sub aspectul efectului lor productiv, iar unitatea de măsură, diferită de
la sistem la sistem, are comună energia netă, fie pentru îngrăşare, fie pentru producŃia de
lapte, fie pentru întreŃinere + îngrăşare sau pentru toate acestea la un loc, pentru moment
fiind soluŃia cea mai bună.
Ultimele cercetări de fiziologie a nutriŃiei, relevă rolul important pe care îl are
echilibrarea raŃiilor de hrană în energie şi în substanŃe azotate. Astfel, la rumegătoare, la
care după cum se cunoaşte, 60-70% din necesarul proteic este asigurat de masa
microbiană, care se dezvoltă în rumen, acesta se apreciază nu numai în funcŃie de
cantitatea de proteină brută a nutreŃului ingerat, ci şi de cantitatea de substanŃă organică
fermentescibilă (SOF), utilizată de către microorganisme pentru dezvoltarea lor, în aşa fel
încât, proteina real digestibilă la nivel intestinal este reprezentată de două valori ş i
anume: proteina digestibilă intestinală de origine alimentară (PDIA) şi proteina
digestibilă intestinală de origine microbiană (PDIM), care la rândul ei este potenŃial
permisă de conŃinutul de azot (PDIN), dar şi de cel în energie al raŃiei (PDIE).
Aşadar, în acest mod, fiecare nutreŃ este caracterizat prin două valori potenŃiale ca
proteină digestibilă, modalitate care asigură posibilitatea echilibrării raŃiei cu substanŃe
azotate, în situaŃia în care la unul din furaje prevalează cantitativ substanŃele organice
fermentescibile.
Calculul raŃiilor furajere la vacile de lapte este o operaŃiune complexă care
necesită mai multe etape dată fiind variabilitatea mare a producŃiilor fiecarui animal în
parte. De aceea, numai prin alcătuirea grupelor de producŃie în cadrul unei cirezi sau, mai
bine, prin dozarea individuală a nutreŃurilor concentrate pentru fiecare animal, adăugate
la raŃia de bază de nutreŃuri de volum, se poate asigura hrănirea acestora în condiŃii
optime de exploatare.
Mai întâi, trebuie să se parcurgă mai multe etape şi anume:
- calculul normelor de hrană;
- estimarea valorii nutritive a nutreŃurilor;
- aprecierea raŃiei de bază – nutreŃuri de volum;
- completarea raŃiei de bază cu nutreŃuri concentrate.
Pentru formularea raŃiilor care să asigure nivelul producŃiilor planificate inclusiv a
funcŃiei de reproducere şi a stării de sănătate sunt necesare următoarele elemente:
InformaŃii despre animal:
- greutatea vacii;
- producŃia posibilă maximă zilnică;
- conŃinutul în grăsime al laptelui;
- saptamâna / luna de lactaŃie;
- luna de gestaŃie (ultimele 3 luni).
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
110
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
112
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cea mai mică dintre aceste valori este valoarea proteică efectivă a unui nutreŃ
atunci când el este distribuit singur animalelor. Valoarea cea mai mare poate fi
considerată valoare potenŃială, valoare maximală, care nu poate fi atinsă decât dacă
nutreŃul respectiv este asociat cu alte nutreŃuri.
Pentru alcatuirea raŃiilor de hrana la orice specie de animale este necesar mai
întâi cunoaşterea potenŃialului productiv al nutreŃurilor, mai precis conŃinutul în elemente
nutritive, în energie, vitamine şi elemente minerale ce de altfel presupune estimarea
valorii nutritive a acestora.
În cazul nostru, constituirea raŃiilor pentru vacile de lapte care vor reprezenta
loturile experimentale în cadrul protocolului din acest proiect se va face pe baza
următoarelor nutreŃuri :
- fân de lucernă
- siloz de porumb
- masă verde (lucernă + golomăŃ)
- nutreŃ combinat V1
- nutreŃ combinat V2
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
113
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
g PB/kg SU x g SU 78 x 1000
2. g PB/kg SO = --------------------------- = ---------------- = 83,96 g
g SO 929
EB /1000 g SU = 18,52
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
114
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
EM
EM = ED x ------ = 12,78 x 0,83 = 10,61 MJ/kg SU
ED
EM 10,61
10. q = ------- = ---------- = 0,57
EB 18,52
Kl = 0,24 x q + 0,463
= 0,24 x 0,57 + 0,463 = 0,600
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
115
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
116
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cunoscându-se valoarea nutritivă a nutreŃurilor s-au putut alcătui raŃii pentru vaci
de lapte în plină lactaŃie, pe perioada de iarnă şi pentru perioada de vară.
În cazul acestei raŃii ( R2) deşi se asigură aproape perfect necesarul energetic
(UNL) în corelaŃie strânsă cu proteina dictată de efectul substanŃelor fermentescibile din
întreaga raŃie (PDIE), proteina digestibilă intestinală permisă de conŃinutul în azot
(PDIN) depăşeşte valoarea dictată de normă, lucru care nu poate fi uşor evitat, cele câteva
sute de grame de proteină consumându-se cu o eficienŃă scăzută. Deşi, asistăm la
acumularea unui surplus al unei componente proteice, aceptăm această situaŃie tocmai
pentru a nu înregistra minusuri la altele. Deci, se consideră suficiente elementele
constitutive ale unei raŃii atunci când fiecare dintre ele atinge cantitatea impusă de normă.
Pentru această raŃie care propune şi o cantitate de lapte de cel puŃin 35 l zilnic pe lângă
raŃia de bază care a solicitat şi un fân de leguminoase se cere adăugat şrot de soia (liznă ş i
metionină) într-o proporŃie aproape egală cu porumbul, care până la urmă să asigure
proteina digestibilă intestinală tot printr-un surplus de PDIN.
Tabel 5.
Specificare SU UNL PDIN PDIE Ca P
Porumb 1000 1,45 86 116 0,3 2,9
860
Srot soia 1000 1,37 328 180 3,7 7,6
900
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
118
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
4. Concluzii
Pentru satisfacerea cerinŃelor nutriŃionale ale vacilor de lapte se impun
următoarele:
- cunoaşterea normelor de hrană: - norma de substanŃă uscată (kg);
- norma de energie netă lapte (UNL);
- norma de proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g);
- normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g);
- normele de microelemente şi vitamine (mg; UI);
- capacitatea de ingerare a hranei (USV);
- raportul dintre PDIE/UNL.
- cunoaşterea valorii nutritive a nutreŃurilor:
- conŃinutul în substanŃă uscată (g/kg SN);
- conŃinutul în energie netă lapte (UNL/kg SU);
- conŃinutul în proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g/kg SU);
- conŃinutul în macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g/kg SU);
- conŃinutul în microelemente şi vitamine (mg/kg SU sau UI/kg SU);
- ingestibilitatea nutreŃului (USV/kg SU).
- date despre animal: - greutatea potenŃială a vacii, G (kg);
- producŃia potenŃială maximă zilnică de lapte PlM (kg/zi);
- conŃinutul în grăsime al laptelui GrL (%);
- săptămâna de lactaŃie “n”;
- luna de gestaŃie ( se iau în consideraŃie numai lunile 8 şi 9).
Bibliografie
1. Alderman G. (1993) – Energy and protein requirements of ruminants, CAB International
Wallingsford, UK.
2. Burlacu Gheorghe (1991) – Metode şi tehnici pentru masurarea valorii nutritive a nutreŃurilor.
Editura CERES, Bucureşti.
3. Burlacu Gh., Cavache A. şi Burlacu R. (2002) – PotenŃialul productiv al nutreŃurilor şi
utilizarea lor. Editura Ceres, Bucureşti.
4. Crista Nicolae (1985) – Digestia, metabolismul şi producŃiile la rumegătoare. Editura
CERES, Bucureşti
5. R. Jarrige (1993) – AlimentaŃia bovinelor, ovinelor şi caprinelor. Ed. INRA, Paris.
6. Nicolae Mircea, Petroman Ioan (1999) – Nutritia vacilor de lapte , Editura Mirton,
Timisoara.
7. Stoica Ioan şi Liliana Stoica (2001) – Bazele nutriŃiei şi alimentaŃiei animalelor, Editura
Coral Sanivet, Bucureşti.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
119
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
CONCLUZII
A:
1. Majoritatea procedurilor de preparare a probelor pentru determinarea compuşilor din
plante sunt dezvoltate în aşa fel încât extractul final introdus în coloanle GC şi HPLC sau
capilarele CE să conŃină numai analitul cu toate interferenŃele eliminate.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
120
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
PLANTE
Pregătirea probei
• congelare - uscare
• omogenizare
Extractie
• SE • MSPD
• Soxhlet • SPME
ANALIZA INSTRUMENTALĂ
GC LC Altele
SE: solvent extraction; MSPD: matrix solid-phase extraction; SPME: solid-phase micro-
extraction; MS/MS: tandem mass spectrometry; TLC: thin layer chromatography; FID:
flame ionization detection; ECD: electron capture detection; Q: quadrupole; IT: ion-trap,
NMR, nuclear magnetic resonance; TOF, time-of-flight.
B:
1. ProducŃia cea mai ridicată s-a înregistrat în varianta D şi anume 4372 l/ha urmată
de celelalte două variante AC şi B.
2. FaŃă de animalele care au păscut în turmă vacile din variantele îmbunătătite au dat
cu 230-268% mai mult lapte, cea ce confirmă eficienŃa măsurilor de îmbunătăŃire.
3. În ce priveşte conversia furajelor de pajişti în productie de lapte se constată un
consum ridicat de SU şi anume 1,20 kg SU la varianta AC, 1,00 kg SU la var B şi
1,45 kg US la var D , fiind destul de mari faŃă de alte condiŃii cu climat mai
blând.
4. Aceste experimentări urmează a fi aprofundate pe viitor cu analize mai
amănunŃite asupra calităŃii laptelui în funcŃie de calitatea furajului.
5. În prezent se fac analize chimice la probele de plantă şi sinteza altor date care se
vor prezenta în etapa următoare a proiectului.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
121
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
C:
1. InvestigaŃiile de laborator astfel efectuate au permis ca pe baza screeningului
hematologic să poată fi diagnosticate o serie de tulburări metabolice (subclinice) între
care amintim îndeosebi anemia. Valorile semnificativ scăzute ale hematocritului
(tabel 1, 5 şi 9) pot fi atribuite deficienŃei de aport al unor microelemente în materiile
prime furajere folosite, de regulă carenŃate în fier, cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a
fost demonstrat şi prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evidenŃiat
nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru.
2. Creşterea valorilor ureei serice indică aport proteic ridicat în raŃie, în special pe seama
furajelor concentrate. Aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii renale fără exprimare
clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop energetic sau
plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a ureogenezei.
3. Valorile scăzute ale glicemiei indică deficit energetic, în special la vacile aflate în
perioada de stabulaŃie. În timpul lactaŃiei, vacile au nevoie cu 40-60% mai multă
energie decât în perioada de repaus mamar. Dacă lactaŃia se realizează în timpul
sezonului rece, capacitatea vacii de a-şi menŃine condiŃia corporală şi de continua
să producă lapte va fi serios compromisă dacă nivelul de energie din raŃie nu este
suficient. Ca regulă generală, pentru fiecare scădere a temperaturii cu 10°C sub
pragul de -20°C, vacile vor avea nevoie, în plus, de 4-6 Mcal energie digestibilă
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
122
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
pe zi. Vara, consumul nutreŃului verde prin păşunat are o influenŃă favorabilă
asupra rezistenŃei organice, asupra sănătăŃii şi productivităŃii, datorită acŃiunii
favorabile a mişcării, razelor solare şi a aerului curat. Creşterea colesterolemiei
indică stări de suprasolicitare.
4. Modificările activităŃii unor enzime serice TGO, Pal, GGT indică evoluŃia la vaci
a unor organopatii, cum ar fi hepatopatii (creşterea activităŃii TGO),
osteoartropatii evolutive (creşterea activităŃii Pal) (tabel 3, 7 şi 11).
5. Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar şi
hipomagneziemie destul de serioasă (tabel 4, 8 şi 12). Valorile macroelementelor
serice analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii.
6. Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe
toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană.
Erorile de alimentaŃie determină afecŃiuni metabolice şi funcŃionale. Acestea se
înregistrează cu precădere in perioada de repaus mamar, cit şi in perioada de
început de lactaŃie. Pe ansamblu, erorile alimentare provoacă nu numai stare de
boala, determinând şi scăderea producŃiei de lapte.
7. CarenŃele alimentare prelungite duc la modificări metabolice importante ale
proteinelor, lipidelor şi în dinamica hormonală, ducând în cele din urmă la
sindrom de infecunditate şi sterilitate, boli ale oaselor. Toate aceste tulburări
nutriŃionale pot fi prevenite prin adoptarea unei strategii raŃionale în hrănirea
bovinelor, respectiv respectarea cerinŃelor nutriŃionale în funcŃie de starea
fiziologică a animalului, de anotimp (furajele de sezon), vârsta animalului şi zona
geografică.
D:
1) Această etapă de raportare a avut ca obiectiv realizarea unei analize critice,
documentară, a referintelor bibliografice, cu privire la metodica utilizată pentru
selectarea şi determinarea markerilor de tip carotenoizi şi importanŃa acestora
pentru organism.
2) Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea
referinŃelor bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea
markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate,
de la furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vacă.
3) Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmenŃi vegetali
naturali, galbeni, portocalii sau roşii, răspândiŃi, în principal, în regnul vegetal (în
morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya,
mango) şi în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon).
4) Privarea organismului animal de hrana care conŃine aceşti pigmenŃi poate duce la
dispariŃia culorii caracteristice. FuncŃia fiziologică a carotenoizilor în plante nu
este încă bine cunoscută dar în organismul animal aceşti pigmenŃi au rol esenŃial
prin relaŃiile lor cu vitamina A şi cu substanŃele de pe retină, importante în
procesul vederii.
5) Deoarece pot fixa oxigenul, formând compuşi oxigenaŃi puŃin stabili, pigmenŃii
carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
123
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
124
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
125
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII
24) Alegerea celei mai adecvate metode pentru analiza carotenoizilor este, de
obicei, determinată de tipul de informaŃii necesare a fi obtinuŃe. În general,
pigmentul carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o
matrice foarte complexă.
25) Principiul metodelor de determinare se bazeaza pe separarea cromatografica
si pot fi: separarea cu coloană cromatografică în curent de apă – metoda clasica de
separare a carotenoizilor, pentru analiza cantitativă; cromatografia în strat subŃire
(TLC), deşi este eficientă în monitorizarea testelor chimice în vederea identificării
rezultatelor, nu este adecvată pentru analizele cantitative, din cauza pericolului de
degradare şi izomerizare la expunerea îndelungată pe masa de lucru;
cromatografia cu gaze este, de asemenea, neadecvată, datorită instabilităŃii
termice şi a volatilităŃii reduse pe care o prezintă marea majoritate a
carotenoizilor; determinarea prin HPLC pe coloane C18 poate fi modul preferat
pentru separarea carotenoizilor pentru analizele cantitative.
26) Din cauza variaŃiilor cantitative şi calitative a carotenoizilor din compoziŃia
alimentelor, este discutabil dacă poate fi stabilit un singur sistem cromatografic
care să poată fi aplicat mai multor tipuri de alimente.
27) Schiedt şi co. au definit criteriile minime necesare pentru identificarea
carotenoizilor:
o spectrul de absorbŃie în regiunea UV, obŃinut în cel puŃin 2 solvenŃ i
diferiŃi, trebuie să fie compatibil cu cromoforul sugerat;
o proprietăŃile cromatografice obŃinute trebuie să fie identice, atât prin
metoda TLC cât şi prin HPLC; co-eluŃiile trebuie făcute cu probe
autentice;
o trebuie obŃinut un spectru de masă care să permit ă cel puŃin confirmarea
masei moleculare.
În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brută a pigmenŃilor prezenŃ i
într-un extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exactă a
pigmenŃilor dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea ş i
cuantificarea definitivă a pigmenŃilor necesită, de obicei, realizarea unor standarde, care
sunt decisive în analiza pigmenŃilor din produsele alimentare.
E.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
127