Sunteți pe pagina 1din 128

CONTRACT 52-117/2008

CERCETARI COMPLEXE PRIVIND


STABILIREA DE MARKERI BIOCHIMICI
SPECIFICI PENTRU PRODUSE LACTATE
REGIONALE IN VEDEREA IMBUNATATIRII
TRASABILITATII ACESTORA PE LANTUL
ALIMENTAR TOTAL (TRASAREG)

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC


ETAPA II – 15.12.2009
CONTRACT 52-117/2008

CERCETARI COMPLEXE PRIVIND STABILIREA DE


MARKERI BIOCHIMICI SPECIFICI PENTRU PRODUSE
LACTATE REGIONALE IN VEDEREA IMBUNATATIRII
TRASABILITATII ACESTORA PE LANTUL ALIMENTAR
TOTAL (TRASAREG)

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC

ETAPA II – 15.12.2009

Cercetari preliminare privind elaborarea modelelor experimentale in


vederea identificarii markerilor biochimici regionali care determina
specificitatea regionala a laptelui.
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CUPRINS
Cuprins................................................................................................................................................... 2
Obiective generale ale proiectului si obiectivele etapei …........................................... ........................ 4
Rezumatul etapei de execuŃie.................................................................................... ............................ 6
Descrierea ştiinŃifică şi tehnică.............................................................................................................. 11
A. Activitate II.1.1. – USAMV Bucuresti
Model conceptual privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici de tip
carotenoide, flavonoide sau terpene în plante………………………………………………………… 12
1. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip carotenoide…….......................................... 12
2. Metode de determinare a carotenoidelor…………………………………………………………… 13
2.1 Etapa de extracŃie.................................................................................................................... 14
2.2. Saponificarea……………………………………………………………………………….. 17
2.3. Analiza cromatografică …………………………………………………………………….. 19
2.4. Alte metode…………………………………………………………………………………. 24
3. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip flavonoide………………………………… 24
4. Metode de determinare a flavonoidelor……………………………………………………………. 26
4.1. Pregătirea probei……………………………………………………………………………. 26
4.2. Spectrometria de masă în analiza flavonoidelor……………………………………………. 27
4.3. Cromatografia de înaltă performanŃă pentru analiza flavonoidelor………………………… 30
4.4. Alte metode…………………………………………………………………………………. 31
5. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip terpene……………………………………. 32
6. Metode de determinare a terpenelor………………………………………………………………... 33
6.1. ExtracŃia probei şi concentrarea…………………………………………………………….. 33
6.2. Separarea cromatografică a constituienŃilor………………………………………………... 33
6.3. Detectarea şi caracterizarea constituienŃilor………………………………………………... 34
7. Concluzii……………………………………………………………………………………. 35
B. Activitate II.1.2. – ICDP Braşov
Stabilirea arealelor pastorale şi a tehnicilor de valorificare a pajiştilor; prelevarea şi condiŃionarea
probelor de nutreŃuri şi de lapte din zona Blana Bucegi……………………………………………... 43
1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………………… 43
2. Prezentarea parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……………………………... 44
2.1. Faza I de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……………... 44
2.2. Faza a II-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi………… 46
2.3. Faza a III-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi………. 47
2.4. Faza a IV-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……….. 48
3. Rezultate obtinute in cadrul experimentarilor realizate la Baza de Cercetări Pajişti Montane
(B.C.P.M.) Blana Bucegi……………………………………………………………………………... 51
3.1. Productia de substanta uscata……………………................................................................. 51
3.2. Productia de lapte …………………...................................................................................... 51
C. Activitate II.1.3. – ICDCB Baloteşti
Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregătirea cadrului experimental…………... 53
1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………………… 53
2. Descrierea ştiinŃifică şi tehnică…………………………………………………………………….. 54
3. Evaluarea stării de sănătate a animalelor din loturi experimentale………………………………… 54
3.1. Materiale si metode…………………………………………………………………………. 54
3.2. Rezultate şi discuŃii…………………………………………………………………………. 56
4. Concluzii…………………………………………………………………………………………… 63

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

2
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

D. Activitate II.1.4. –IBA Bucuresti


Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizată pentru selectarea şi determinarea
markerilor biochimici - Cercetări preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de
determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) în produsele
lactate…………………………………………………………………………………………………. 66
Rezumatul etapei de execuŃie.................................................................................... ............................ 66
1. Caracterizarea generală a markerilor biochimici de tip carotenoizi .................................................. 69
1.1 Introducere.............................................................................................................................. 69
1.2 NoŃiuni generale despre markerii biochimici de tip carotenoizi............................................. 71
1.3 Efectele procesării asupra carotenoizilor................................................................................ 77
2. Identificarea markerilor biochimici in diverse tipuri de furaje......................................................... 81
2.1 ExistenŃa carotenoizilor în diverse tipuri de furaje................................................................ 81
3. Digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor........................................................................... 84
3.1 Digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor................................................................ 84
3.2 InfluenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra variaŃiei concentraŃiei de markeri
biochimici de tip carotenoizi în lapte...................................................................................... 86
3.3 Transferul carotenoizilor şi retinolului din laptele materie primă în produsele lactate.......... 88
3.4 InfluenŃa dintre carotenoizii din lapte şi proprietăŃile senzoriale ale produselor lactate........ 89
4. Metode experimentale de determinare a markerilor biochimici........................................................ 89
4.1 Proceduri generale de analiză a carotenoizilor....................................................................... 89
4.2 Separarea cromatografică....................................................................................................... 90
4.3 Identificarea carotenoizilor..................................... ............................................................... 94
Concluzii ............................................................................................................................................... 106
Bibliografie............................................................................................................................................ 108
E. Activitate II.1.5. – IBNA
Estimarea valorii nutritive a nutreŃurilor şi elaborarea raŃiilor pentru vacile de lapte………………... 109
1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………. 109
2. ImportanŃa structurii raŃiei asupra digestiei ruminale şi a producŃiei…………………….. 111
3. Necesarul vacilor de lapte………………………………………………………………… 111
3.1. Necesarul de energie............................................................................................................ 111
3.2. Necesarul de proteină. ………………………… ………………........................................ 112
3.3. Exprimarea valorii proteice a nutreŃurilor în PDI………………………………………… 112
3.4. Etapele de determinare a valorii nutritive energetice a silozului de porumb……………... 114
4. Concluzii…………………………………………………………………………………………… 119
Bibliografie…………………………………………………………………………………………… 119
CONCLUZII………………………………………………………………………………... 120

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

3
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

OBIECTIVE GENERALE ALE PROIECTULUI

Etapa 1:
Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregatirea cadrului experimental.

Etapa 2:
Cercetari preliminare privind elaborarea modelelor experimentale in vederea identificarii
markerilor biochimici regionali care determina specificitatea regionala a laptelui.

Etapa 3:
Studierea comparativa a influentei markerilor biochimici din plante asupra
caracteristicilor fizico-chimice si senzoriale a produselor lactate din diferite zone
geografice

Etapa 4:
Integrarea şi interpretarea rezultatelor. Transferul tehnologic al soluŃiilor propuse,
promovarea rezultatelor. Identificarea si atribuirea drepturilor de proprietate intelectuala
asupra rezultatelor. Intocmirea documentatiei pentru dobandirea protectiei unei indicatii
geografice sau denumirea de origine a produselor lactate din regiunile luate in studiu.

OBIECTIVELE ETAPEI DE EXECUTIE

Obiectiv general al etapei 2/ 15.12.2009


Cercetări preliminare privind elaborarea modelelor experimentale în vederea identificării
markerilor biochimici regionali care determină specificitatea regională a laptelui.

Activitate II.1
Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizată pentru selectarea şi
determinarea markerilor biochimici.

Activitate II.1.1. – USAMV Bucuresti


Cercetari preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a
markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) în plante.

Activitate II.1.2. – ICDP Brasov


Stabilirea arealelor pastorale şi a tehnicilor de valorificare a pajiştilor; Prelevarea şi
condiŃionarea probelor de nutreŃuri şi de lapte din zona Blana Bucegi.

Activitate II.1.3. – ICDB Balotesti


Evaluarea starii de sanatate a animalelor din loturi experimentale prin examene de profil
metabolic in functie de modul de furajare (stabulatie/pasunat)
Activitate II.1.4. –IBA
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

4
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Cercetări preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a


markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) în produsele lactate.

Activitate II.1.5. – IBNA


Estimarea valorii nutritive a nutreŃurilor şi elaborarea raŃiilor pentru vacile de lapte.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

5
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

REZUMATUL ETAPEI DE EXECUTIE

Prezentul raport stiintific si tehnic prezinta rezultatele obtinute in cadrul etapei


2/termen de predare 15.12.2009, al carui obiectiv general are titlul „Cercetări
preliminare privind elaborarea modelelor experimentale în vederea identificării
markerilor biochimici regionali care determină specificitatea regională a laptelui.”
Rezultatele prezentate se refera la activitatile prezentate mai sus si realizate de
catre partenerii consortiului din proiectul finantat prin contractul de finantare 52-117/
1.10.2008.
Prezentul raport este organizat in 5 parti (A,B,C,D,E) care corespund activitatilor
prezentate in conformitate cu planul de realizare conform AA 2/2009 de catre partenerii
din consortiul de realizare a proiectului.
Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea
referinŃelor bibliografice, legate de modele experimentale utilizate în identificarea
markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de la
furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vacă. In acest sens, s-a realizat un
studiu de documentare privind caracterizarea, din punct de vedere biochimic, a
markerilor biochimici de tip carotenoizi, analiza criteriilor de clasificare a tipurilor de
carotenoizi şi, nu în ultimul rând, importanŃa carotenoizilor în sănătatea oamenilor.
Aceste studii au fost realizate in cadrul parteneriatului, de catre USAMV
Bucuresti pentru markerii biochimici din plante si IBA Bucuresti pentru markerii
biochimici din produsele lactate.
Datele bibliografice menŃionează că au fost identificaŃi peste 600 de carotenoizi
naturali şi se poate estima că natura produce anual peste 100 de milioane de astfel de
pigmenŃi. Cei mai răspândiŃi pigmenŃi cu această structură sunt: fucoxantina (alge
marine), luteina (plante ierboase), β-carotenul, licopina, violaxantina şi apocarotenoidele
(compuşi cu mai puŃin de 40 de atomi de carbon în moleculă).
In plus, au fost analizate implicaŃiile carotenoizilor asupra produselor lactate, din
punct de vedere nutriŃional şi senzorial şi faptul că pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri
pentru managementului trasabilităŃii creşterii animalelor, de la care se colectează laptele
materie primă (ex. lapte de vacă, lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliŃă).
Carotenoizii din laptele de vacă sunt, în special, toŃi β-carotenii trans, şi la o concentraŃie
mai mică, luteina.
Carotenoizii determină culoarea portocalie la fructe şi legume (exemplu: morcov,
cartofi dulci şi pepenele galben), la frunzele uscate şi, în concentraŃie redusă, determină
nuanŃele de galben la alimente de origine animala precum smântână, unt şi gălbenuş de
ou.
Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de
carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de
măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte
permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate.
Carotenoizii din plante sunt transferaŃi în produsele animale, uneori în
concentraŃie mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută,
cum ar fi în produsele rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

6
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

lactate şi a stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi


preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune. O culoare galbenă a
laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńări europene, are conotaŃii de hrană
„naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi ca indicatori ai păşunatului verde.
Din punct de vedere al factorilor care afectează compoziŃia carotenoizilor în
alimente, studiile arată că alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de
vedere al conŃinutului de carotenoizi. ProporŃiile relative ale acestor carotenoizi sunt
destul de constante, dar concentraŃiile absolute variază considerabil. Pot fi deosebite opt
modele principale privind nivelele de carotenoizi în diferite resurse alimentare.
S-a analizat in cadrul acestei etape stadiul cercetărilor privind existenŃa
carotenoizilor în diverse tipuri de furaje proaspete şi conservate/ concentrate;
diversitatea carotenoizilor în furaje şi metodele de determinare disponibile si adecvate.
În ciuda faptului că există o mare varietate de carotenoizi în plante, în furaje nu se
găsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importanŃi, din punct de vedere cantitativ,
sunt β-carotenii şi luteina. Ca urmare a interesului limitat pentru conŃinutul de
carotenoizi în dieta rumegătoarelor, analizele chimice sunt, de obicei, nespecifice şi
privesc „carotenul”, care este un amestec de mai multe molecule şi izomeri. Au fost
realizate o serie de experimente, în care s-a determinat concentraŃia de luteină sau
xantofilii totali. Nu au fost determinate experimental alte molecule deoarece metodele de
analiză nu au fost optimizate, fiind dezvoltate pentru alte matrici (cum ar fi laptele sau
sângele) sau pentru alimentele oamenilor. Până acum, metodele adecvate pentru furaje
au inclus metode care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin
Layer Chromatography- Cromatografie în strat subŃire]). In ultima perioadă au fost puse
la punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure Liquid
Chromatography).
Studiul a fost concentrat si pe aspecte legate de digestia, absorbŃia şi
metabolizarea carotenoizilor, procese deosebit de importante în stabilirea modelului
conceptual de determinare a markerilor biochimici specifici pentru caracteristicile
regionale a produselor lactate. Numeroase date arată faptul că există o dependenŃă a
concentraŃiei de carotenoizi din laptele de vacă faŃă de natura şi cantitatea de suplimente
dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj, precum şi prin transferul acestora din
matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea scăzută a carotenoizilor din
lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer şi se estimează că etapele diferite
de transfer ale carotenoizilor, din hrană în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în
glandele mamare.
Prima etapă în procesul de digestie al carotenoizilor îl reprezintă degradarea
matricei vegetale, care eliberează aceste substanŃe în faza lichidă a rumenului. Gradul de
degradare al carotenoizilor în rumen, de către microorganisme, variază în funcŃie de
diferite rezultate obŃinute în modele experimentale in vitro sau in vivo, majoritatea în ceea
ce priveşte β-carotenul. Chiar dacă unii autori nu au raportat nici o degradare a acestora,
alŃii au raportat o degradare moderată sau o dispariŃie totală a β-carotenului. Starea
suplimentelor de carotenoizi poate explica discrepanŃele dintre experimente, deoarece
gradele de degradare au fost mai mari în situaŃiile în care carotenoizii au fost furnizaŃi ca
produse purificate faŃă de furnizarea lor sub formă de furaje.
In acest capitol a fost analizată şi influenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra
variaŃiei concentraŃiei de markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

7
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în


componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul care
determină variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui.
MulŃi cercetători au demonstrat că, în afară de aspectele legate de conŃinutul de
substanŃă uscată din brânză, variabilitatea compoziŃională a acesteia în acizi graşi, β-
caroten, xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compoziŃia „laptelui original”.
CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi
carotenoizi, este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compoziŃia biologică,
stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de rasă, de modul
de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles, de stagiul de lactaŃie în care se află animalul.
Un alt obiectiv al acestei etape a fost studiul metodlore experimentale de
determinare a markerilor biochimici (carotenoide sau flavonoide sau terpene).
In acest sens au fost analizate o serie de metode de analiză şi proceduri
generale utilizate în identificarea calitativă şi cantitativă a acestor tipuri de markeri
biochimic. Pentru analiza lor pot fi utilizate diferite metode. Alegerea celei mai
adecvate metode este, de obicei, determinată de tipul de informaŃii necesare a fi
obtinute. În general, pentru determinare, acesti markeri biochimici trebuie extrasi
înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complexă. Cu toate acestea,
este absolut necesară extracŃia eficientă şi respectarea tuturor protocoalelor
analitice.
In conformitate cu activitatile prevazute a se realize in cadrul acestei etape s-a
urmarit aprecierii stării de sănătate a vacilor de lapte, în strânsă legătură cu modul de
furajare (stabulaŃie/păşunat). In aceste sens au fost efectuate teste hematologice şi teste
biochimice serice. Astfel, în perioada de stabulaŃie au fost prelevate şi analizate 13 probe,
iar în perioada de păşunatv14 probe. Probele au provenit de la vacile de lapte din lotul
experimental din Biobaza ICDCB Baloteşti.
Screeningul hematologic a scos în evidenŃă evoluŃia anemiei. Valorile scăzute ale
hematocritului pe toată durata anului au fost atribuite deficitului de aport al unor
microelemente în materiile prime furajere folosite în fermă, de regulă carenŃate în cupru,
cobalt, seleniu. Acest lucru a fost susŃinut şi prin rezultatul examenelor biochimice serice,
care au evidenŃiat nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru.
Testele biochimice serice au indicat, de asemenea, creşterea valorilor ureei serice
în ambele perioade, fapt care a fost pus pe seama unui aport proteic ridicat în raŃie, în
special pe baza furajelor concentrate. Totodată, aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii
renale fără exprimare clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop
energetic sau plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a
ureogenezei.
Valorile scăzute ale glicemiei în perioada de stabulaŃie au indicat deficit energetic
în raŃie.
Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar şi
hipomagneziemie destul de serioasă. Valorile macroelementelor serice analizate se
corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii.
Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe
toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană.
Obiectivul principal al proiectului ”Cercetari complexe privind stabilirea de
markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale in vederea imbunatatirii
trasabilitatii acestora pe lantul alimentar total” esta acela de a găsii metodologii de
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

8
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

analiză care să servească la diferenŃierea produselor lactate regionale de alte produse


similare. În cadrul acestui obiectiv generos, partenerul 2 al consortiului acestui proiect,
ICDP BRASOV, îşi propune să participe la scoaterea in evidenŃă a acelor caracteristici
tehnologice şi fizico-chimice care să conducă la ideea că laptele şi produsele lactate
obŃinute pe Platoul MunŃilor Bucegi pot fi considerate ca produse regionale (lapte de
Bucegi, brânză de Bucegi, etc.), de o calitate şi savoare deosebită.
S-a ales ca areal de studiu platoul munŃilor Bucegi deoarece ICDP Braşov deŃine
aici o Baza pentru Cercetări Pajişti Montane situată între Vârfurile Blana (1875 m) şi
Nucet (1863 m).
Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi este situată la 1800
m altitudine, pe un teren uşor înclinat cu expoziŃie estică.
VegetaŃia primară a fost dominată de jneapăn (Pinus mugo) şi rarişte de molid
(Picea abies) după a căror defrişare s-a instalat o vegetaŃie ierboasă dominată de Festuca
nigrescens, F. ovina şi Agrostis rupestris, care la rândul lor au fost invadate de specia
nevaloroasă Nardus stricta.
Substratul litologic este format de conglomerate tipice de Bucegi. Solurile sunt
brune acide şi podzoluri, puternic debazificate, foarte sărace în elemente fertilizante.
CondiŃiile climatice sunt cele specifice etajului alpin inferior în care temperatura
medie anuala a aerului este de 4,9°C.
Vântul bate cu viteze medii anuale de peste 6 metri/secundă. Cantitatea de
precipitaŃii căzute în perioada de vegetaŃie (iunie – septembrie) este în jur de 400 mm, iar
cea anuală este de aproximativ 1200 mm.
La BCPM Blana Bucegi s-au iniŃiat iniŃiat cercetări privind valorificarea cu vaci
de lapte a păşunilor subalpine în anul 1995 sub coordonarea domnului dr. ing. Teodor
Maruşca. Atunci au fost înfiinŃate si 5 parcele experimentale care au fost utilizate în mai
multe ”faze” de cercetare .
De asemenea partenerul IBNA a estimat valoarea nutritiva a nutreŃurilor şi a
elaborat raŃii pentru vacile de lapte care sa asigure indeplinirea obiectivelor propuse. In
urma studiului realizat s-au stabilit cateva criterii care vor fi luate in considerare la
stabilirea acestor ratii.
Pentru satisfacerea cerinŃelor nutriŃionale ale vacilor de lapte se impun
următoarele:

- cunoaşterea normelor de hrană: - norma de substanŃă uscată (kg);


- norma de energie netă lapte (UNL);
- norma de proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g);
- normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g);
- normele de microelemente şi vitamine (mg; UI);
- capacitatea de ingerare a hranei (USV);
- raportul dintre PDIE/UNL.
- cunoaşterea valorii nutritive a nutreŃurilor:
- conŃinutul în substanŃă uscată (g/kg SN);
- conŃinutul în energie netă lapte (UNL/kg SU);
- conŃinutul în proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g/kg SU);
- conŃinutul în macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g/kg SU);
- conŃinutul în microelemente şi vitamine (mg/kg SU sau UI/kg SU);
- ingestibilitatea nutreŃului (USV/kg SU).
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

9
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

- date despre animal: - greutatea potenŃială a vacii, G (kg);


- producŃia potenŃială maximă zilnică de lapte PlM (kg/zi);
- conŃinutul în grăsime al laptelui GrL (%);
- săptămâna de lactaŃie “n”;
- luna de gestaŃie ( se iau în consideraŃie numai lunile 8 şi 9).

Adresa de site a proiectului: http://www.monapopa.usamv.ro/TRASAREG.html

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

10
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

DESCRIEREA ŞTIINłIFICĂ ŞI TEHNICĂ

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

11
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

A. Activitate II.1.1. – USAMV Bucuresti


Model conceptual privind dezvoltarea metodelor de determinare a
markerilor biochimici de tip carotenoide, flavonoide sau terpene în
plante.

MetaboliŃii plantelor sunt întâlniŃi de obicei sub forma unui amestec complex de
mai multe substanŃe cu polaritate şi hidrofobicitate diferite. Cele mai importante grupe de
substanŃe în materialul plantelor sunt împărŃite în: substanŃe cu polaritate scăzută
(terpene), semi-polare (flavonoide, lipide) şi polare (unele carotenoide, glicozide polare,
proteine).

1. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip carotenoide

Carotenoidele reprezintă un grup de pigmenŃi naturali prezenŃi în fructe şi legume,


având culori de la galben la roşu. Din punct de vedere chimic, carotenoidele sunt compuşi
poliizoprenici şi pot fi clasificate în două clase principale [1]:
a) carotene sau carotenoide care conŃin în structura lor doar atomi de carbon şi
hidrogen
b) xantofile care sunt derivaŃi hidrocarbonaŃi oxigenaŃi ce conŃin cel puŃin un atom
de oxigen, precum grupări hidroxi, ceto, epoxi, metoxi sau carboxil.
Caracteristica lor structurală este sistemul de duble legături conjugate, care influenŃează
proprietăŃile lor chimice, biochimice şi fizice. În figura 1 sunt prezentate structurile unor
carotenoide.
Această clasă de compuşi naturali este foarte răspândită în natură. Carotenoidele
sunt sintetizate de către plante şi multe microorganisme, deci animalele trebuie să le
obŃină din alimente. ConŃinutul de carotenoide în fructe şi vegetale depinde de mai mulŃi
factori precum, varietatea genetică, maturitate, depozitare, prelucrare şi preparare.
Interesul pentru studiul acestor compuşi este datorat funcŃiilor lor fiziologice şi
biologice care au fost intens studiate şi prezentate în detaliu de către van Berg şi
colab.[2]. Pe lângă activitatea provitaminei A a unor carotenoide, acestea prezintă şi alte
funcŃii, precum antioxidanŃi şi de intensificare a răspunsului imun.
Studiile epidemiologice au indicat o asociere între consumul ridicat de vegetale şi
o reducere a riscului unor boli cronice degenerative, precum anumite tipuri de cancer,
boli cardiovasculare [3, 4].

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

12
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

β- caroten

OH
luteina

HO

OH
zeaxantina

HO
O
OH
astaxantina

HO
O

licopen

Figura 1. – Structura chimică a unor carotenoide.

2. Metode de determinare a carotenoidelor

În ceea ce priveşte analiza carotenoidelor, iniŃial, a fost folosită cromatografia cu


coloană deschisă la presiune atmosferică [5], dar această metodă a necesitat cantităŃi mari
de probă. Totuşi, Rodriguez-Amaya [6] a subliniat că utilizând această tehnică, în ciuda
dezavantajelor ei, o bună separare poate fi realizată pentru probele alimentare cu
compoziŃie complexă de carotenoide.
Almeida-Muradin şi colab. [7] au găsit rezultate similare când metodologia HPLC
a fost comparată cu cea a cromatografiei cu coloană deschisă pentru determinarea
carotenoidelor cu activitatea provitaminei A din frunzele de sfeclă, precum şi din frunzele
verzi ale unor plante.
Odată cu dezvoltarea cromatografiei de lichide de înaltă performanŃă (High-
Performance Liquid-Chromatography HPLC), multe metode atât cu fază normală, cât şi
cu fază inversă au fost descrise pentru a separa xantofilele şi carotenoidele. În analiza
HPLC a carotenoidelor, cel mai utilizat detector este cel ultraviolet – vizibil (UV-Vis) şi,
recent detectorul fotodiodă (photodiode array detector DAD), care permite o colectare
continuă de date spectrofotometrice în timpul analizei [8]. Când este necesară o
sensibilitate ridicată, detecŃia electrochimică reprezintă o alternativă bună [9].
În matrici complexe, când DAD nu este suficient pentru identificare din cauza
interferenŃelor spectrale, cromatografia de lichide cuplată cu spectrometria de masă
reprezintă o alternativă bună.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

13
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

2.1. Etapa de extracŃie


2.1.1. ExtracŃia lichid –lichid a carotenoidelor

Datorită structurii complexe a carotenoidelor şi a varietăŃii mari a acestor compuşi


prezenŃi în vegetale şi fructe, nu există o metodă de referinŃă pentru analiza lor.
Numeroşi solvenŃi organici precum acetona [10, 11], tetrahidrofuran (THF) [12],
n-hexan [13], pentan [14], etanol (EtOH) [15], metanol (MeOH) [16], cloroform [9],
precum şi amestecuri de solvenŃi, precum diclormetan (DCM) : MeOH (6:1, v/v) [17],
acetonă : eter de petrol (50:50, v/v) [18], THF : MeOH (1:1, v/v) [8], [19], [20], n-hexan :
toluen (5:4, v/v) [21], n-hexan : acetonă (6:4, v/v) [22], 2-propanol : DCM (2 :1, v/v)
[23], n-hexan : acetat de etil (85 : 15, v/v) [24] au fost mult utilizaŃi. Astfel,
Taungbodhitham şi colab. [25] au evaluat 6 combinaŃii diferite de solvent: acetonă :
hexan (4:6, v/v), EtOH : hexane (4:3, v/v), cloroform : MeOH (2:1, v/v), DCM : MeOH
(2:1, v/v), hexan : izopropanol (3:2, v/v) şi acetonă : eter de petrol (50:50, v/v) pentru a
extrage licopen şi α- şi β-caroten din sucul de roşii conservat, şi cele mai bune recuperări
au fost obŃinute cu amestecul EtOH : hexan. Rezultate similare au fost găsite de către Lin
şi Chen [26] care au utilizat 5 sisteme de solvenŃi, EtOH : hexan (4:3, v/v), acetonă :
hexan (3:5, v/v), EtOH : acetonă : hexan (2:1:3, v/v/v), acetat de etil : hexan (1:1, v/v) şi
acetat de etil (100%), pentru a compara eficienŃa extracŃiei carotenoidelor din sucul de
roşii. Ei au concluzionat că extracŃia cu eficienŃa cea mai bună a fost realizată cu
amestecul EtOH : hexan (4:3, v/v).
Deli şi colab. [27] au folosit MeOH urmat de dietil eter pentru a extrage
carotenoidele din ardei (Capsicum annuum var. lycopersiciforme rubrum). Gandul-Rojas
şi colab. [13] au extras clorofilele şi xantofilele libere şi monoesterificate cu
dimetilformamidă şi carotenoidele cu hexan din măsline.
O metodă pentru determinarea izomerilor luteină şi zeaxantină din crăiŃă (Tagetes
erecta) utilizând ca solvent de extracŃie hexan şi eter de etil fost raportată de Hadden şi
colab. [28]. AlŃi autori [29], au utilizat un amestec mai complex, hexan : acetonă : EtOH
pentru a extrage majoritatea carotenoidelor din sucul de portocale.
Un amestec de THF : MeOH a fost ales de Murkovic şi colab. [19] pentru a izola
α- şi β-caroten şi luteina din dovleac (Cucurbita pepo, C. maxima şi C. moschata). Rozzi
şi colab. [9] au raportat o metodă pentru a determina licopen, α- şi β-caroten, α-, γ- şi δ-
tocoferol din coaja şi seminŃele de roşii folosind cloroform ca solvent de extracŃie.
În ciuda faptului că THF şi eterul de etil au fost larg utilizaŃi datorită solubilităŃii
ridicate pe care carotenoidele o prezintă în acestea, unii cercetători [14Error! Bookmark
not defined.] au atras atenŃia asupra faptului că aceşti solvenŃi pot forma peroxizi care
pot degrada rapid β-carotenul, contribuind la formarea de compuşi secundari. De aceea
este recomandată adăugarea de antioxidanŃi, precum butilatul de hidroxitoluen (BHT) în
solvent. Trebuie evitată utilizarea antioxidanŃilor puternici care pot contribui la
autooxidarea β-carotenulului.
ExtracŃia β-carotenoidelor trebuie realizată foarte rapid, evitând expunerea la
lumină, oxigen, temperaturi ridicate şi la metale prooxidante (precum fier, cupru) pentru
a minimiza autooxidarea şi izomerizarea cis-trans [2]. Mai mult, pentru a preveni
pierderile de carotenoide în timpul procedurii de extracŃie, adăugarea de antioxidanŃi,
precum acid ascorbic, pirogalol este recomandată [30].
Următoarea etapă din cadrul procedurii de extracŃie este omogenizarea
amestecului şi separarea extractului de carotenoide rezultat. Acest proces trebuie repetat
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
14
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

până ce filtartul este incolor. Filtratul este concentrat, şi carotenoidele sunt separate într-
un solvent organic corespunzător şi apă. Faza organică este îndepărtată şi evaporată; în
timpul evaporării nu este recomandată atingerea unor temperaturi de peste 400C, pentru a
evita degradarea, şi în final reziduul este dizolvat într-o cantitate corespunzătoare de
solvent [26], [30].

2.1.2. ExtracŃia cu fluide supercritice (SFE)

SFE este folosită ca o metodă alternativă la extracŃia tradiŃională lichid – lichid


pentru izolarea carotenoidelor din probe alimentare, deoarece această metodă prezintă
câteva avantaje. De exemplu, viteza mai mare în extracŃie, etapa de evaporare nu este
necesară, şi dioxidul de carbon nu este toxic, costul lui este scăzut, este neinflamabil şi
acceptabil din punct de vedere al mediului [31]. În plus, CO2 prezintă o temperatură
critică joasă (310C), fiind astfel ideal pentru extracŃia compuşilor instabili termic. Totuşi,
CO2 prezintă o polaritate scăzută, ceea ce determină ca extracŃia compuşilor polari să fie
foarte greu de realizat. Această limitare poate fi rezolvată prin adăugarea unui
modificator organic, precum MeOH sau EtOH, în scopul creşterii puterii lui de solvatare
[32]. În ceea ce priveşte prelucrarea probei, unii cercetători au raportat că îndepărtarea
apei din materialele vegetale facilitează SFE şi probele omogenizate sunt extrase mult
mai rapid datorită micşorării dimensiunii particulelor [14].
Gomez-Prieto şi colab. [33] au extras all-trans-licopen din roşii folosind CO2 fără
modificator. Ei au studiat efectul densităŃii CO2 fluid asupra randamentului de extracŃie,
realizând mai multe extracŃii la diferite densităŃi (0,25, 0,35, 0,45, 0,55, 0,60, 0,70, 0,75,
0,80, 0,85 şi 0.90 g/mL). Rezultatele cele mai bune au fost obŃinute pentru 0,9 g/mL.
O comparaŃie între extracŃia Soxhlet utilizând n-hexan şi EtOH ca solvenŃi şi SFE
pentru determinarea clorofilelor şi carotenoidelor din maghiran (Origanum marojana L.)
a fost prezentată de Vagi şi colab. [31]. Trei temperaturi diferite (40, 50 şi 600C) şi trei
presiuni diferite (100, 250 şi 400 bar) au fost testate; condiŃiile optime pentru extracŃie
observate fiind 500C şi 450 bar. În plus, cantitatea de β-caroten extrasă cu EtOH a fost
jumătate din cantitatea obŃinută cu fluide supercritice.
Ferreira de Franca şi colab. [34] au aplicat SFE pentru a determina lipidele şi
carotenoidele din fructele unei specii de palmier ce creşte în zonele tropicale (Mauritia
flexuosa). A fost studiat efectul presiunii şi temperaturii, condiŃiile optime finnd 200 bar
şi 39,90C. Intr-un alt studiu, realizat de Baysal şi colab. [35] câteva condiŃii de extracŃie,
precum temperatura extractorului (35, 45, 55 şi 650C) presiunea fluidului de extracŃie
(200, 250 şi 300 bar), adăugarea de cosolvent (5%, 10% şi 15% EtOH), timpul de
extracŃie (1, 2 şi 3 ore) şi debitul CO2 (2, 4 şi 8 kg/h) au fost optimizate pentru
determinarea licopenului şi β-carotenului din reziduul rezultat la fabricarea pastei de
roşii. Rezultatele au demonstrat că temperatura cea mai mare folosită pentru extracŃie a
condus la un randament de extracŃie maxim; totuşi, autorii au atras atenŃia asupra faptului
că, temperaturi mai mari de 650C ar determina un randament de extracŃie mai bun, dar
aceasta ar putea cauza degradarea carotenului. Nu au fost observate diferenŃe
semnificative în ceea ce priveşte randamentul de extracŃie al licopenului şi β-carotenului,
atunci când presiunea a fost modificată de la 200 la 300 bar.
AlŃi autori [31] au arătat că presiuni de extracŃie mai mari de 400 bar pot
determina randamente mai mari. În ceea ce priveşte timpul de extracŃie şi debitul,
randamentul cel mai bun a fost obŃinut pentru un timp de extracŃie de 2 ore. S-a observat
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
15
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

că o oră nu este suficient pentru extracŃia carotenoidelor, iar la 3 ore procesul de


degradare creşte. Debitul optim atât pentru licopen, cât şi pentru β-caroten a fost 4 kg/h.
Adăugarea de 5% EtOH drept cosolvent a îmbunătăŃit recuperările celor două
carotenoide.
Recent, diferite temperaturi şi presiuni de extracŃie au fost testate de Rozzi şi
colab. [9] pentru a determina licopenul din produsele secundare rezultate în urma
procesării tomatelor. Rezultatele au indicat că recuperarea maximă este realizată la 860C
şi 345 bar.
Barth şi colab. [22] au comparat extracŃia clasică cu solvent şi SFE pentru
determinarea carotenoidelor din morcov (Daucus carota L.). Ei au observat că activitatea
provitaminei A a fost cu 7% mai mare cu SFE decât în probele extrase cu solvenŃi.
O metodă pentru separarea selectivă a izomerilor β-carotenului din alga
Dunaliella bardawil a fost cercetată de Gamlieli-Bonshtein şi colab. [36]. Separarea
izomerilor a fost posibilă datorită vitezei lor de dizolvare diferită în CO2 supercritic.
CâŃiva modificatori ai CO2 (apă, EtOH, clorură de metilen, hexan) au fost testaŃi pentru a
îmbunătăŃii eficienŃa extracŃiei α- şi β-carotenului din diferite vegetale [14Error!
Bookmark not defined.]. Adăugarea de hexan nu a contribuit semnificativ la creşterea
solubilităŃii β-carotenului în CO2 supercritic. În cazul clorurii de metilen, solubilitatea β-
carotenului creşte, dar ea provoacă degradarea β-carotenului. În final, deşi β-carotenul a
fost mai puŃin solubil în EtOH decât în hexan, când EtOH a fost adăugat drept
modificator, solubilitatea β-carotenului în CO2 a crescut semnificativ [14].
Mendes şi colab. [37] au raportat metoda extracŃiei supercritice cu CO2 a
compuşilor cu importanŃă farmaceutică din microalge. Cantaxantina şi astaxantina au fost
extrase din Chlorella vulgaris. Mai multe condiŃii de presiune şi temperatură au fost
comparate şi rezultatele cele mai bune au fost obŃinute la 275 şi 350 bar şi 550C.
β-carotenul produs de Dunaliella salina a fost un amestec de izomeri cis şi trans,
izomerul cis fiind mult mai solubil decât izomerul trans în CO2 supercritic. CondiŃiile
optime pentru extracŃia celor doi izomeri au fost îndeplinite la 300 bar şi 400C.
În tabelul 1 sunt prezentate câteva exemple de condiŃii ale extracŃiei cu fluide supercritice
în analiza carotenoidelor.

Tabelul 1 – Exemple de condiŃii ale extracŃiei cu fluide supercritice utilizate în analiza


carotenoidelor.

Proba Analit Fluid supercritic CondiŃii SFE (temperatură,


presiune, debit)
Roşii [33] All-trans-licopen CO2 fără T=40 0C
modificator p=281 bar
D=4 mL/min
SeminŃe de roşii [9] Licopen, β-caroten, α- CO2 fără T=86 0C
tocoferol, γ-tocoferol, δ- modificator p=345 bar
tocoferol D=2.5 mL/min
Alga Dunaliella Izomeri geometrici ai β- CO2 fără T=40 0C
bardawil [36] carotenului modificator p=448 bar
D=0.5-1 mL/min
Reziduuri de la Licopen, β-caroten CO2 şi 5% EtOH T=55 0C (licopen)
pasta de roşii [35] ca modificator T=65 0C (, β-caroten)
p=300 bar
D=4 kg/h
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
16
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Proba Analit Fluid supercritic CondiŃii SFE (temperatură,


presiune, debit)
Vegetale(morcovi, α-caroten, β-caroten CO2 şi EtOH ca T=40 0C
rapiŃă,varză, modificator p=342 bar
broccoli, muştar, D=1.5 mL/min
dovlecel) [14Error!
Bookmark not
defined.]
Alga Spirulina β-caroten, β-criptoxantina, CO2 şi 15% EtOH T=80 0C (zeaxantina)
Pacifica [32Error! β-zeaxantina ca modificator T=760C (β-criptoxantina)
Bookmark not T=60 0C (β-caroten)
defined.] p=350 bar
D=2 mL/min
Morcovi (Daucus α-caroten, β-caroten, CO2 şi 5% T=40 0C
carota L.) [38] cloroform ca p=606 bar
modificator D=1 mL/min

2.2. Saponificarea

Înaintea analizei HPLC, procedura de saponificarea este de obicei utilizată ca


etapă în simplificarea separării prin îndepărtarea substanŃelor, precum clorofile şi lipide,
care ar putea interfera cu detecŃia cromatografică. Mai mult, prin procesul de
saponificare, pot fi obŃinute informaŃii utile despre natura şi distribuŃia carotenelor
prezente în probă prin evaluarea profilului lor cromatografic înainte şi după tratamentul
alcalin [39]. Totuşi, o pierdere a conŃinutului total de carotenoide a fost prezentată în
literatură [40]. Fernandez şi colab. [41] au comparat efectele saponificării alcaline şi
hidrolizei enzimatice asupra concentraŃiei totale de carotenoide din uleiul de palmier din
Costa Rica. Rezultatele au arătat o concentraŃie mai mare a carotenoidelor utilizând
hidroliza enzimatică. Compuşii cei mai sensibili la tratamentele alcaline sunt xantofilele,
în special epoxicarotenoidele. De aceea, daca proba ce urmează a fi analizată conŃine
aceşti pigmenŃi în compoziŃie, această etapă de purificare ar trebui să fie evitată. Ca o
regulă generală, pentru probele cu conŃinut scăzut de grăsime, trebuie să fie aplicate
condiŃii mai blânde în etapa de saponificare, şi pentru probele cu conŃinut ridicat de
grăsimi trebuie utilizate condiŃii mai severe [39]. Totuşi, saponificarea ar trebui utilizată
pentru a estima prezenŃa esterilor carotenoidici care altfel pot fi nedetectaŃi. În tabelul 2
sunt prezentate diferite condiŃii de saponificare aplicate pentru diverse probe.

Tabelul 2 – Diferite condiŃii de saponificare utilizate în analiza carotenoidelor

Proba Analit CondiŃii de saponificare


Suc de portocale [29] Neoxantina, violaxantina, 10% sol. metanolică de
luteoxantina, anteraxantina, KOH (peste noapte,
mutatoxantina, luteina, temperatura camerei,
izoluteina, zeaxantina, α- şi β- întuneric)
criptoxantina, licopen, α-, β- şi
γ-caroten
Legume crude şi preparate (lăptuca, Luteina, zeaxantina, licopen, β- sol. saturată de KOH (sub
fasole verde, sparanghel, sfeclă, ardei, criptoxantina, α-β- şi γ-caroten atmosferă de azot, 30 min,
spanac, roşii, morcovi, varză, castravete, întuneric)
dovlecel, cartof, ceapă, conopidă) [40]
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
17
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Proba Analit CondiŃii de saponificare


Vegetale săbatice comestibile (Urtica Luteina şi izomeri, β-caroten şi sol. metanolică de KOH
dioica L.) [42] izomeri, neoxantina, (temperatura camerei)
violaxantina, licopen,
Ulei de măsline [24 α-tocoferol, β-caroten sol. etanolică de KOH (sub
atmosferă de azot, 30 min,
700C)
Cereale [15] Luteina, zeaxantina, β- 80% sol. etanolică de KOH
criptoxantina (în baie de apă la punctul de
fierbere, 10 min)
Legume proaspete şi prelucrate (broccoli, Trans-β-caroten 100% sol. etanolică de KOH
morcovi, fasole verde) [43] (30 min, 700C)
Cartofi dulci (Ipomoea batatas L.) [44] α-caroten, β-caroten 10% etanol:apă (50:50, v/v)
1 oră, 800C
Alimente fortificate (cereale pentru micul Acetat de α-tocoferol, palmitat 60% sol. apoasă de KOH
dejun, unt de arahide, margarină) [45] de retinil, β-caroten conŃinând pirogalol ca
antioxidant (sub atmosferă
de azot, 30 min, 700C)
Varză (Brassica oleracea var. Acephala Luteina, β-caroten, retinol, 80% sol. apoasă de KOH
cv. Vates) [21] filochinona (15 min, 700C)

După etapa de saponificare, carotenoidele sunt extrase cu eter de etil, dietil eter
[46], n-hexan [43], clorură de metilen [16], eter de petrol [47] sau amestecuri, precum n-
hexan : eter de etil (70:30, v/v) [48], dietil eter : eter de petrol (1:1, v/v) [30], n-hexan :
acetat de etil (85:15, v/v) [24], n-hexan : toluen [21] şi apoi, extractul este spălat până
când KOH este îndepărtat.
Khachik şi colab. [49] au observat o pierdere importantă în conŃinutul de xantofile
din broccoli după aplicarea unui tratament cu 30% hidroxid de potasiu metanolic sub
atmosferă de azot la temperatura camerei timp de 3 ore. Contrar, pierderea de carotene nu
a fost semnificativă.
Ye şi colab. [45] au raportat că metoda extracŃiei directe cu solvent reprezintă o
tehnică alternativă saponificării în analiza vitaminelor şi β-carotenului din diferite
alimente fortifiate.
Hart şi Scoot [47] au determinat conŃinutul de carotenoide din legumele şi fructele
consumate în mod obişnuit în Marea Britanie. Următoarea procedură de saponificare a
extractului de carotenoide a fost aplicată pentru fructe şi unele legume, precum ardei:
10% hidroxid de potasiu metanolic sub atmosferă de azot, la întuneric timp de o oră la
temperatura camerei.
Unii cercetători au observat o extracŃie mai bună a carotenoidelor când sunt utilizate
temperaturi ridicate în etapa de saponificare, dar în ceea ce priveşte conŃinutul de
xantofile [50].
Procedurile de extracŃie lichidă descrise în literatură necesită timp îndelungat şi
implică utilizarea de cantităŃi mari de solvenŃi organici volatili, care au impact negativ
asupra mediului şi asupra sănătăŃii umane.
De aceea, interesul în dezvoltarea de noi metode pentru extracŃia carotenoidelor este în
continuă creştere.
Fish şi colab. au dezvoltat [51] o metodă pentru determinarea cantitativă a
licopenului care utilizează cantităŃi reduse de solvenŃi organici.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
18
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

2.3. Analiza cromatografică

Numeroase metode pentru determinarea carotenoidelor din probe vegetale şi nu


numai au fost prezentate în literatură. Unele exemple recent publicate sunt prezentate în
continuare.
Lin şi Chen [26] au dezvoltat o metodă pentru a determina diferite carotenoide
prezente în sucul de roşii, incluzând all-trans-luteina, all-trans-β-caroten, all-trans-
licopen şi cei 13 cis-izomeri ai lor. Separarea a fost realizată utilizând o coloană C30 (250
mm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea particulelor) şi un gradient a doi
eluenŃi, (A) acetonitril (ACN) : 1-butanol (70:30, v/v) şi (B) clorură de metilen. Analiza a
fost completă în 55 de minute la un debit de 2 mL/min şi lungimea de undă a fost setată
la 476 nm.
Metoda HPLC pentru determinarea clorofilelor, carotenoidelor şi derivaŃilor lor în
unele legume proaspete şi prelucrate a fost descrisă de Gokmen şi colab. [52]. O coloană
C8 MikroPak din oŃel inoxidabil (150 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea
particulelor) şi un amestec de MeOH : apă ca fază mobilă la un debit de 0,75 mL/min a
fost folosită. Cromatogramele au fost înregistrate simultan la 432, 450, 470, 652 şi 666
nm folosind DAD.
Un amestec cuaternar de MeOH : ACN : clorură de metilen : apă (50:30:15:5,
v/v/v/v) conŃinând 0,1% BHT ca antioxidant şi 0,1% TEA ca modificator, şi o coloană
C18 Kromasil (250 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea particulelor) a fost
folosită de Melendez şi colab. [16] pentru a analiza profilul carotenoidelor din sucul de
portocale congelat. O lungime de undă mai specifică de 486 nm a fost selectată şi un
debit de 2,5 mL/min. Carotenoidele au fost identificate prin comparaŃie cu spectrele
standardelor obŃinute cu un DAD de la 350 la 800 nm.
O altă metodă pentru determinarea pigmenŃilor clorofilici şi carotenoidici din
mazărea prelucrată (Pisum sativum L.) a fost propusă de Edelenbos şi colab. [10]. Un
gradient de solvent binar constând din (A) MeOH : apă (80:20, v/v) şi (B) 100% acetat de
etil la un debit de 1 mL/min a fost folosit ca fază mobilă. Separările au fost realizate pe o
coloană LiChrospher 100 RP-18 (244 mm x 4 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea
particulelor) şi temperatura a fost menŃinută la 300C. Cromatogramele au fost înregistrate
la 440 nm cu un detector DAD şi spectrele de absorbŃie ale carotenoidelor şi clorofilelor
au fost înregistrate între 300 şi 600 nm.
Recent, Gomez-Prieto şi colab. [33] au realizat o separare optimă a următoarelor
carotenoide: fitoen, fitofluen, β-caroten şi licopen, precum şi a izomerilor all-trans-
licopen din probele de roşii. Un gradient liniar din eluenŃii (A) MeOH : apă (96:4, v/v) şi
(B) metil-terŃ-butil eter (MTBE) a fost folosit şi debitul a fost setat la 1 mL/min. O
coloană C30 Develosil UG (250 mm x 4,6 mm diametru interior) menŃinută la 200C a fost
utilizată şi β-apocarotenal a fost folosit ca standard intern. Pentru a determina diferite
carotenoide, în aceeaşi injectare, au fost selectate 4 lungimi de undă (285, 347, 450 şi 472
nm).
Vagi şi colab. [31] au dezvoltat o metodă HPLC izocrată şi cu fază inversă pentru
a detrmina clorofilele şi carotenoidele din maghiran (Origanum majorana L.). În acest
sudiu, s-a utilizat o coloană C18 Nucleosil 5 din oŃel inoxidabil (250 mm x 4 mm diametru
interior) şi ca fază mobilă amestecul ACN : MeOH : alcoolizopropilic (39:43:18, v/v/v) la
un debit de 0,9 mL/min. Cromatogramele au fost înregistrate la lungimea de undă de 430
nm.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
19
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Analiza xantofilelor din cereale utilizând un sistem de gradient din doi eluenŃi (A)
MeOH : MTBE : apă (81:15:4, v/v/v) şi (B) MeOH : MTBE (9:91, v/v) şi o coloană C30
(250 mm x 4,6 mm) a fost descriză de Moros şi colab. [Error! Bookmark not defined.].
Debitul a fost 1 mL/min şi cromatogramele au fost monitorizate la 450 şi 445 nm
utilizând detectorul DAD.
Două coloane cu fază normală şi una cu fază inversă au fost folosite pentru a
analiza carotenoidele din extractul de obŃinut de la florile de crăiŃă (Tagetes erecta) [28].
O coloană Zorbax SIL 5 µm (250 mm x 4,6 mm diametru interior) şi n-hexan : acetat de
etil (75:25, v/v) ca fază mobilă la un debit de 2 mL/min a fost utilizată pentru a separa
all-trans-luteina, izomerii cis ai luteinei, precum şi all-trans-zeaxantina. Celălalt sistem
cu fază normală a inclus o coloană β Cyclobond 5 µm (250 mm x 4,6 mm diametru
interior) cu n-hexan : acetat de etil (87:13, v/v) ca fază mobilă şi un debit de 2 mL/min a
fost utilizat pentru a identifica all-trans şi cis izomerii luteinei şi all-trans-zeaxantina. Cu
ajutorul cromatografiei cu fază inversă, o separare mai completă a cis izomerilor luteinei
a fost realizată. A fost utilizată o coloană silica C30 YMC S3-SIL200 3 µm cu o fază
mobilă constând din 3% MTBE în MeOH la un debit de 1 mL/min. All-trans-luteina,
izomerii 9- şi 9᾿-cis-luteina, izomerii 13- şi 13᾿-cis-luteina şi all-trans-zeaxantina au
fost identificaŃi. În toate cazurile, carotenoidele au fost detectate la 450 nm.
Într-un studiu realizat de Lee şi colab. [29], mai mult de 25 de carotenoide dintr-o
probă de portocală dulce (Earlygold) au fost separate în 40 minute utilizând un gradient
de eluŃie ternar constând din: eluent (A) ACN : MeOH (75:25, v/v), eluent (B) 100%
MTBE şi eluent (C) apă conŃinând 0,01% BHT şi 0.05% TEA la un debit de 1 mL/min.
Separarea a fost realizată pe o coloană C30 (150 mm x 4,6 mm diametru interior)
menŃinută la 250C. Într-un alt experiment descris de Lee, aceleaşi condiŃii au fost aplicate
pentru identificarea a 29 de carotenoide în sucul obŃinut dintr-un alt tip de portocală (Red
Navel orange Cara Cara). Carotenoidele au fost detectate la 450 nm.
A fost dezvoltată o metodă pentru a difernŃia citricele din portocală, mandarină şi
amestec pe baza profilului lor carotenoidic. Un sistem de eluŃie compus din MeOH, apă şi
MTBE şi o coloană C30 (25 cm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm) a fost utilizată pentru
separare. Analiza a fost completă în 50 minute, la un debit de 1 mL/min. Pentru a
maximiza absorbanŃa în domeniul roşu/portocaliu din spectrul vizibil, a fost selectată o
lungime de undă de 486 nm [46].

2.3.1. Cromatografia de lichide de înaltă performanŃă

Analiza carotenoidelor din alimente este în principal realizată prin HPLC.


Separările cu fază inversă [9], [11], [15], [20], [27], [32], [33], [53], au fost des utilizate
în determinarea acestor compuşi, deşi câteva metode cu fază normală [54] au fost de
asemenea prezentate în literatură. Ambele sisteme izocratic [36], [55] şi gradient de eluŃie
au fost utilizate. În general, prin utilizarea metodelor cu gradient de solvent rezoluŃia
obŃinută este mai bună decât în cazul sistemelor izocratice. Totuşi, prima metodă prezintă
unele dezavantaje, precum timpul de analiză mai mare deoarece este necesară
reechilibrarea coloanei după fiecare injectare, ceea ce reprezintă o problemă seroasă
pentru analiza de rutină [16].

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
20
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

2.3.1.1. Faza mobilă

ACN, MeOH sau amestecurile din aceşti solvenŃi sunt constituenŃii majoritari ai
fazei mobile utilizate în analiza carotenoidelor. Pentru a optimiza separarea unor
carotenoide (de exemplu izomerii geometrici), faza mobilă este de obicei modificată prin
adăugarea unor cantităŃi mici din alt solvent organic [2]; de exemplu: DCM [19], [56],
apă [52], [55], n-hexan [57], [58], acetonă [54], cloroform [8], THF [12], [35], [59],
propanol [9], [20], [31], acetat de etil [10], [28], clorură de metilen [16], [22] sau diferiŃi
eteri [15], [33], [60]. MeOH a fost recomandat în diferite lucrări [61] deoarece furnizează
o recuperare mai bună decât ACN sau solvenŃii pe bază de ACN. În acelaşi mod, THF a
asigurat o recuperare uşor mai mare decât acetatul de etil [62]. Utilizarea cloroformului
trebuie evitată pe cât de mult posibil din cauza toxicităŃii ridicate; în plus, solvenŃii
cloruraŃi sunt asociaŃi cu pierderile de carotenoide. AntioxidanŃii, precum acidul ascorbic
sau BHT [8], [16], [47], sunt de obicei adăugaŃi în faza mobilă pentru a o stabiliza.
Gueguen şi colab. [63] au observat o scădere a conŃinutului de carotenoide în timp când
acidul ascorbic a fost adăugat fazei mobile. Contrar, în soluŃii standard, BHT a protejat
eficient carotenoidele de procesele de degradare.
Carotenoidele sunt susceptibile la oxidare şi pot suferi degradări în coloană.
Diferite studii [8], [47], au demonstrat că adăugarea de solvenŃi modificatori, de exemplu
TEA sau acetat de amoniu, în faza mobilă reduce pierderile sau degradarea. TEA
acŃionează ca un modificator puternic, şi micşorează timpul de retenŃie. Totuşi, a fot testat
că la concentraŃii în jur de 0,05% nu modifică semnificativ timpul de eluŃie, şi o separare
bună poate fi realizată [47].
Huck şi colab. [8] au investigat factorii de selectivitate pentru luteină/zeaxantină
şi zeaxantină/β-caroten pentru evaluarea unor sisteme diferite de fază mobilă. O fază
mobuilă cuaternară ACN : MeOH (conŃinând 0,05% TEA şi 0,05 M acetat de amoniu) :
cloroform : n-heptan a fost dezvoltată pentru a îmbunătăŃii recuperarea şi separarea
carotenoidelor.

2.3.1.2. Tipurile de coloane

HPLC cu fază inversă este larg utilizată pentru a separa carotenoidele din diverse
probe. Coloanele C8 [52] şi mai ales C18 [8], [11], [12], [19], [27], [48], [64], [65], [66],
[67], au fost deseori selectate de cercetători pentru a efectua analize.
Epler şi colab. [61] au comparat 65 de coloane cromatografice cu fază inversă
pentru a determina selectivitatea şi recuperarea unui amestec din următoarele
carotenoide: luteina, zeaxantina, β-criptoxantina, licopen, α- şi β-caroten utilizând ACN
şi MeOH modificat cu THF sau acetat de etil ca fază mobilă. Fazele staŃionare au fost în
general C18 şi au fost clasificate ca monomerice, intermediare sau polimerice. S-a
demonstrat că separarea luteinei şi zeaxantinei este realizată doar prin utilizarea coloanei
C18 polimerice şi unele coloane intermediare, dar aceste coloane au furnizat recuperări
mai mici decât coloanele C18 monomerice. Autorii au observat, de asemenea că,
dimensiunea porilor coloanei poate afecta selectivitatea carotenoidelor cu dimensiuni
diferite, precum zeaxantina şi β-caroten, dar nu afectează dacă dimensiunea este
asemănătoare (de exemplu, α- şi β-caroten).

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
21
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

A fost raportat în literatură [39] că, coloanele C18 prezintă o rezoluŃie slabă în
separarea izomerilor geometrici (cis – trans) ai carotenoidelor. Sander şi colab. [68] au
dezvoltat o coloană C30 polimerică, special proiectată pentru separarea izomerilor
carotenoidici. De atunci, numeroase metode analitice au utilizat coloanele C30 polimerice
[15], [20], [21], [33], [60], [69].
Separări satisfăcătoare pentru all-trans-licopen din roşii utilizând o coloană C30 au
fost obŃinute de Gomez-Prieto şi colab [33].
Marsili şi Callahan [14] au testat 3 coloane C18 comerciale cu fază inversă:
coloana Waters Novo-Pak (4 µm dimensiunea particulelor, 3,9 mm x 150 mm), coloana
Supelcosil (5 µm dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) şi coloana Vydac 201TP
(5 µm dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) pentru a investiga care este cea mai
potrivită coloană pentru a separa α- caroten de β-caroten. Rezultatele au indicat că
rezoluŃia cea mai bună a fost realizată utilizând coloana Vydac 201TP şi a fost selectată
pentru determinarea β-carotenului din vegetale.
Principalele xantofile din cereale (luteina, zeaxantina şi β-criptoxantina) au fost
determinate în mai puŃin de 25 minure utilizând o coloană C30 [15].
Un număr important de carotenoide a fost identificat în uleiul vegetal de palmier
[70], precum: fitoen, ε-caroten, neurosporen, α-zeacaroten, β-zeacaroten, licopen, δ-
caroten, α-caroten, β-caroten şi γ-caroten, din care α- şi β-carotenul reprezintă mai mult
de 90%. Înainte de presarea fructelor în scopul obŃinerii uleiului, acestea sunt supuse unui
tratament termic utilizând abur presurizat. Încălzirea cauzează izomerizare cis/trans a
carotenoidelor. Astfel, un amestec complex de carotenoide apolare şi cis-izomerii lor este
obŃinut, ceea ce determină ca separarea să fie dificil de realizat. Acest amestec este
analizat prin HPLC utilizând o coloană C30. Această coloană, pe lângă faptul că produce
o separare foarte bună a carotenoidelor asemănătoare, precum α- şi β-caroten, contribuie
şi la separarea cis-izomerilor, ceea ce nu este posibil utilizând o coloană C18.

2.3.1.3. Temperatura coloanei

Un alt factor important care trebuie luat în considerare pentru a realiza o separare
satisfăcătoare a carotenoidelor este temperatura coloanei. Diverşi autori [8], [71] au
afirmat că modificări ale temperaturii cauzează schimbări semnificative în răspunsul
cromatografic al carotenoidelor; deci, este important a lucra la temperaturi constante.
Scott şi Hart [71] au studiat efectul temperaturii coloaei în separarea unui amestec
de carotenoide dintr-o soluŃie de referinŃă standard şi dintr-un extract al unui aliment
uscat. Au fost testate 4 temperaturi diferite (15, 20, 22,5, 25 şi 300C) şi rezultatele au
indicat că schimbările de temperatură afectează timpul de eluŃie şi profilul. Cea mai bună
separare a fost realizată la 20 – 22,50C.
Asemănător, Huck şi colab. [8] au optimizat temperatura coloanei pentru a realiza o
separare eficientă a luteinei, zeaxantinei, β-criptoxantinei şi β-carotenului. Temperatura a
fost variată în intervalul 21 – 800C. Cea mai bună selectivitate a fost realizată la 210C şI
la temperaturi mai mari de 600C degradarea carotenoidelor a fost semnificativă.

2.3.2. Cromatografia de lichide – spectrometria de masă (LC – MS)

LC – MS poate fi folosită în identificarea carotenoidelor deoarece furnizează


informaŃii despre structură şi în plus, este o metodă foarte sensibilă. Metodele LC – MS
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
22
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

dezvoltate pentru analiza carotenoidelor include în principal ionizarea la presiune


atmosferică (APCI – atmospheric pressure chemical ionization) [8], [19], [21], [72],
[73], [74] sau ionizare electrospray (ESI – electrospray ionization) [28].
Lacker şi colab. [60] au dezvoltat o metodă pentru identificarea unui amestec de
carotenoide, incluzând astaxantina, cantaxantina, zeaxantina şi β-caroten, precum şi cis-
trans izomerii β-carotenului utilizând LC – MS în modul APCI. Analiza a fost realizată
pe o coloană 25 cm x 4,6 mm, umplută cu ProntoSil silicagel 3 µm, modificată cu
triacontiltriclorosilan C30, iar ca fază mobilă a fost utilizat amestecul MeOH : MTBE
(70:30, v/v). Spectrele de masă au fost realizate în intervalul m/z 200 – 700.
O metodă HPLC – MS – MS (APCI) pentru identificarea carotenoidelor din
diferite vegetale a fost descrisă de Huck şi colab. [Error! Bookmark not defined.]. O
coloană C18 Phenomenex Luna (25 cm x 2 mm, 5 µm) a fost utilizată ca fază staŃionară şi
sistemul de faze mobile a constat din ACN (0,1% BHT) : MeOH (conŃinând 0,05 M
acetat de amoniu şi 0,05% TEA) : CHCl3 (conŃinând 0,1% BHT) : n-heptan (conŃinând
0,1% BHT) (50:40:5:5, v/v/v/v) la un debit de 0,2 mL/min. Spctrele de masă au fost
înregistrate în domeniul m/z 300 – 2000. Limita de detecŃie a fost la nivel de nanograme.
Unii autori au utilizat spectrometria de masă pentru a asigura identificarea corectă
a peak-ului şi puritatea în matricea complexă. Murkovic şi colab. [19] au utilizat LC –
MS – APCI pentru a confirma prezenŃa carotenoidelor în diferite varietăŃi de dovleac.
HPLC – MS (ESI) a fost utilizată de Hadden şi colab. [28] pentru a confirma prezenŃa
carotenoidelor în extractul de crăiŃă.
Careri şi colab. [32] au utilizat cromatografia de lichide cu fază inversă –
spectrometria de masă (electrospray) pentru separarea β-carotenului şi xantofilelor.
Separarea a fost realizată pe două coloane ODS Hypersil conectate în serie (200 x 2,1
mm, 5 µm şi 100 x 2,1 mm, 5 µm) şi faza mobilă ACN : MeOH (0,1 M acetat de amoniu)
: DCM. Determinările au fost realizate prin operarea spectrometrului de masă în
domeniul m/z 500 – 650.
Breithaupt şi colab. [74] au utilizat LC – APCI – MS pentru identificarea a 8
monoesteri ai luteinei produşi de diesterii luteinei din crăiŃă (Tagetes erecta L.) după o
saponificare enzimatică incompletă a diesterilor luteinei. Separarea a fost realizată pe o
coloană C30 (250 x 4,6 mm diametru interior) şi faza mobilă constituită din doi eluenŃi
(A) MeOH : MTBE : apă (81:15:4, v/v/v) şi (B) MeOH : MTBE : apă (6:90:4, v/v/v).
Spectrele de masă au fost înregistrate în domeniul m/z 80 – 1200.
A fost descrisă o metodă pentru separarea şi identificarea esterilor zeaxantinei din
anumite extracte de plante utilizând LC – APCI – MS [73]. Pentru separare, o coloană
C30 (250 x 4,6 mm diametru interior, 5 µm) menŃinută la 300C a fost utilizată. Spectrele
de masă ale esterilor zeaxantinei au fost înregistrate în domeniul m/z 400 – 1200. Limita
de detecŃie a diesterilor zeaxantinei a fost 0,4 µg/mL.
Carotenoidele prezente în mango, all-trans-β-caroten, all-trans- şi cis-β-
criptoxantina, all-trans-zeaxantina, all-trans- şi cis-violaxantina, all-trans şi cis-
neoxantina au fost identificate utilizând spectrometru de masă cuplat la un cromatograf
de lichide într-un experiment realizat de Mercadante şi colab. [75].
În tabelul 3 au fost selectate câteva metode HPLC recent utilizate în analiza
carotenoidelor.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
23
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabelul 3 – Câteva metode HPLC recente utilizate pentru analiza carotenoidelor din
diverse surse
Proba ExtracŃie Coloana Faza mobilă DetecŃia
Fructe şi legume Eter de petrol 100 x 4,6 mm, 5 ACN:MeOH:DCM, UV-Vis
tradiŃionale din µm cuplată cu 75:20:5 DAD
Portugalia [76] C18-RP (250 x 4,6
mm, 5 µm)
Cartof dulce Hexan:acetonă:EtOH, C30 A: MeOH:ACN:apă, DAD
(Ipomoea 2:1:1 250 x 4,6mm, 84:12:2
batatas) [77] 5µm B: DCM
Caise, dovleac Acetonă:hexan, 1:1 C30-RP A: ACN:MTBE:apă, DAD –
[78] 150 x 3 mm 81:15:4 MS
3 µm B:MeOH:MTBE:apă,
4:92:4
Vegetale [79] Acetonă rece C18 250 x 4,6 ACN:DCM:MeOH, UV-Vis –
mm, 5 µm 6:2:2 DAD
Planta ierbacee Eter de petrol:acetonă, 150 x 4,6 mm A: MeOH:apă, 90:10 LC – MS
Potamogeton 1:1 B: acetat de etil
crispus [80]
Cartofi acetonă C30 MeOH:MTBE (diferite UV-Vis
(Solanum 250 x 4,6 mm procente)
phureja) [81] 3 µm
Diferite fructe, MeOH C30 A:MeOH:MTBE:apă, DAD
legume [82] 150 x 4,6 mm 95:3:2
3 µm B:MeOH:MTBE:apă,
8:90:2

2.4. Alte metode

O altă metodă de analiză folosită în determinarea conŃinutului de carotenoide este


spectroscopia cu reflexie în infraroşu apropiat (NIRS – Near Infrared Reflectance
Spectroscopy), considerată a fi o metodă rapidă, precisă şi nepoluantă pentru analiza
calitativă şi cantitativă în domeniul alimentar [83]. A fost utilizată la determinarea
conŃinutului total de carotenoide din morcovi [84] şi boabe de grâu [85], şi în special
unele carotenoide, precum licopen şi luteina din produsele pe bază de roşii [86],
zeaxantina şi luteina în boabele de porumb [87]. Studiul realizat de X. Chen şi colab. [88]
a folosit NIRS pentru a determina conŃinutul de luteină şi β-caroten din varza furajeră
(Brassica oleracea).

3. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip flavonoide

Flavonoidele sunt în mare parte molecule plane şi variaŃia lor structurală derivă de
la modelul de substituŃie: hidroxilare, metoxilare, prenilare sau glicozilare.
Flavonoidele sunt împărŃite în: flavone, flavonoli, flavanone şi flavanoli în funcŃie de
prezenŃa grupării carbonil în poziŃia C-4, grupării OH în poziŃia C-3, legăturii simple
saturate între C-2 şi C-3, şi o combinaŃie între absenŃa grupării carbonil din C-4 cu o
grupare OH în poziŃia C-3 (figura 2 ).
Deşi câteodată se găsesc în formă agliconă, majoritatea flavonoidelor din plante
sunt prezente ca O-glicozide, în care una sau mai multe grupări hidroxil ale agliconei sunt
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
24
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

legate la un zahar, formând o legătură O – C glicozidică. Există anumite grupări hidroxil


în flavonoide care sunt de obicei glicozilate, acestea fiind: gruparea 7-hidroxil din
flavone, flavanone şi izoflavone şi grupările 3- şi 7- hidroxil din flavonoli şi flavanoli.
Izoflavonoidele sunt flavonoide cu inelul B ataşat în poziŃia C-3 a inelului C.
Aceasta exclude posibilitatea existenŃei unei legături de hidrogen în poziŃia 3, ceea ce
determină ca activitatea antioxidantă a izoflavonei să fie redusă [89].
Toate au ca structura de bază flavona (2-fenil benzopirona).
În tabelul 4 sunt prezentate câteva exemple de flavonoide şi surse ale acestora.

HO 7 O HO O
2
A C 2'
5 4
B
OH O O
4' OH OH
Genisteina Daidzeina
(Izoflavona) (Izoflavona)

OH
OH
OH
HO O
HO O

OH O OH
OH
Apigenina Catechina
(Flavona) (Flavanol)

OH OH

HO O HO O
OH

OH
OH O OH O

Narigenina Quercetina
(Flavanona) (Flavonol)

Figura 2 – Structura chimică a unor flavonoide

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
25
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Această clasă de compuşi influenŃează sănătatea umană şi a animalelor, datorită


importanŃei lor în dietă, care este atribuită proprietăŃilor lor antioxidante. Un număr mare
de publicaŃii referitoare la efectele benefice ale flavonoidelor asupra sănătăŃii, precum
cancer, boli de inimă au fost prezentate [90].

Tabelul 4 – Câteva exemple de flavonoide şi surse ale acestora


Tipul de flavonoide Surse
Flavonoli
quercitina ceapă, măr, struguri negrii, ceai, broccoli
caempferol andivă, praz, broccoli, grapefrui, ceai
Flavone
rutina ceapă, măr, struguri negrii, ceai, broccoli
luteolina lămâie, măsline, Ńelină, gogoşar
apigenina Ńelină, pătrunjel
Flavanoli
(Epi)catechina struguri negrii, mere
Flavanone
naringenina citrice
hesperidina suc de portocale
Antocianidine
cianidina struguri, căpşuni, zmeură
delfinidina vinete
Izoflavone boabe de soia, legume

4. Metode de determinare a flavonoidelor

4.1. Pregătirea probei

Pregătirea probei în cazul plantelor şi alimentelor începe cu etapa de mărunŃire,


înaintea extracŃiei cu etanol apos sau metanol. Câteva studii au urmat procedura descrisă
de Coward şi colab. [91]. O probă alimentară congelată-uscată (0,5 g) şi 5 µg de daidzein
deuterat (standard intern) au fost dispersate prin sonicare şi extrase cu 80% metanol apos
(5 mL) prin agitare timp de o oră la 600C. Amestecul a fost răcit şi centrifugat timp de 5
minute, extractul de solvent a fost îndepărtat şi reziduurile redizolvate în etanol apos (2 x
2,5 mL). Extractul rezultat a fost concentrat şi lipidele îndepărtate prin extracŃie în mai
multe părŃi cu hexan. După uscarea fazei apoase alcoolice sub azot, reziduul a fost
redizolvat în 50% metanol apos (10%) înaintea analizei LC. Recent, flavonoidele
glicozilate acilate au fost caracterizate din conopidă [92]. Utilizând această metodă
această metodă, conopida congelată-uscată (70 g) a fost extrasă prin fiebere cu 3 L de apă
distilată timp de o oră. Extractul a fost mai departe amestecat cu particule de Amberlite
XAD-2 şi agitat pentru a reŃine compuşii fenolici pe suprafaŃa particulelor neionice de
Amberlite. Particulele de Amberlite au fost introduse în coloana cromatografică, spălate
cu apă distilată (5 L), şi eluate cu metanol. Extractul metanolic a fost uscat şi redizolvat
în 50% metanol apos pentru a fi analizat mai departe.
Trebuie notat că extracŃia glicozidelor flavonoidelor în solvenŃi încălziŃi poate
conduce la modificări de compoziŃie. Aceasta este o problemă mai ales pentru esterii
malonil ai glicozidelor flavonoidelor. Aceştia suferă hidroliză puternică la gruparea
malonil chiar şi la temperatura camerei. Acest lucru se poate întâmpla şi în autosampler
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
26
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

în timpul analizei. Esterii malonil pot de asemenea suferi decarboxilări generate de


căldură (pentru a forma acetilglicozide) în stare uscată. Pentru câteva alimente care
conŃin flavonoide, aceasta poate avea loc în timpul prelucrării, deci înaintea analizei lor
în experiment [91].
Pentru a depăşi aceste probleme, alte metode noi de pregătire a probei precum extracŃia
cu fluide supercritice în contracurent şi extracŃia cu lichide presurizate au fost utilizate în
analiza flavonoidelor din plante [93], [94]. În tehnica în contracurent, o probă lichidă este
introdusă în mijlocul coloanei umplute, printr-un orificiu care este localizat peste orificiul
de intrare a CO2, creând un contracurent între debitul de probă (descendent) şi debitul de
CO2 (ascendent). CO2 supercritic a fost des utilizat în metodele de prelucrare a citricelor
[95]. Această metodă este potrivită pentru extracŃia componenŃilor volatili.
Un avantaj particular al cromatografiei de lichide – spectrometriei de masă (LC –
MS) constă în capacitatea acestei metode de a determina atât formele libere, cât şi cele
conjugate ale flavonoidelor. Spre deosebire de GC – MS, când se utilizează LC – MS
etapa de extracŃie nu este de obicei necesară.

Printre metodele analitice folosite în analiza flavonoidelor sunt prezentate în


literatură: HPLC [96] , HPLC – MS [97], GC – MS [98], LC multidimensională [99].

4.2. Spectrometria de masă în analiza flavonoidelor

Datorită importanŃei flavonoidelor şi glicozidelor lor în organismele vii,


identificarea şi/sau determinarea structurală a acestor compuşi în Ńesutul plantelor joacă
un rol important.
Spectrometria de masă este una din metodele fizico-chimice aplicată în
determinarea structurală a compuşilor organici. Caracteristica MS este utilizarea unor
diferite principii fizice, atât pentru ionizarea probei, cât şi pentru separarea ionilor,
produşi conform raportului m/z (m – masă, z – sarcină).
Aplicarea MS în analiza glicozidelor flavonoidelor s-a dezvoltat odată cu apariŃia
aşa numitelor tehnici de ionizare “blânde”. Compuşii acestei clase sunt polari, nevolatili
şi instabili termic. Efectul electronului (EI – electron impact), cu energii ale electronului
cuprinse între 10 – 100 eV, şi ionizarea chimică (CI – chemical ionization) nu sunt
potrivite pentru analiza MS a glicozidelor flavonoidelor. Ambele metode necesită ca
analitul să fie în fază gazoasă pentru ionizare, şi derivatizarea grupărilor hidroxil
(metilare, trimetilsilare şi acetilare) este necesară. Prin introducerea tehnicii de ionizare
prin desorbŃie, analiza glicozidelor flavonoidelor fără derivatizare este posibilă. De-
alungul timpului au fost introduse şi alte tehnici: FAB (fast atom bombardment), LSIMS
(liquid secondary ions mass spectrometry). Cele mai interesante şi utilizate metode din
punct de vedere al studiilor structurale ale glicozidelor flavonoidelor sunt: ESI şi APCI
[100].
Din spectrele de masă pot fi obŃinute următoarele informaŃii cu privire la
glicozidele flavonoidelor:
a) masa moleculară
b) strucrura agliconei (modelul de hidroxilare, poziŃia inelului B în inelul C)
c) informaŃii despre acilarea grupărilor hidroxil ale zaharului şi posibila metilare a
hidroxidului agliconic
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
27
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

d) numărul de inele de zaharuri şi configuraŃia lor.

Aşa cum a fost prezentat mai sus, flavonoidele sunt diferite din punct de vedere
structural şi în general fac parte dintr-un amestec complex izolat din extractul de plante.
Deşi, GC –MS a fost principala metodă folosită în analiza moleculelor mici în
ultimii 20 de ani, în prezent nu este aşa de des folosită în analiza flavonoidelor datorită
volatilităŃii limitate a glicozidelor flavonoidelor care se găsesc în fructe şi vegetale. Odată
cu apariŃia surselor API, LC – MS a devenit cea mai utilizată metodă pentru analiza
flavonoidelor în amestecuri complexe. Deoarece LC –MS furnizează masa moleculară a
fiecărui component cu timpul lui de retenŃie, este folosită pentru identificarea compuşilor
cunoscuŃi. O caracterizare adiŃională a componentelor cunoscute sau necunoscute poate fi
realizată prin cuplarea LC cu spectrometria de masă. Este utilizată, de asemenea, şi
pentru analiza cantitativă.
EficienŃa ionizării unor diferite surse API, de exemplu ESI şi APCI, a fost revizuită
anterior de Rauha şi colab. [101]. ESI – MS în modul ion-negativ cu tampon acetat de
amoniu acid ca fază mobilă a furnizat cea mai bună sensibilitate. De Rijke şi colab. [102]
au prezentat un studiu comparativ în ceea ce priveşte performanŃele analitice ale
tehnicilor APCI şi ESI, atât în modul ion-pozitiv, cât şi în cel negativ. Cele mai bune
răspunsuri MS au fost în modurile ion-negativ, în general tehnica APCI mai bună decât
ESI. Rezultatele obŃinute cu APCI şi ESI negativ au fost similare pentru toate
flavonoidele aglicone.
Claeys şi colab. au publicat o serie de lucrări despre utilizarea spectrometriei de
masă în determinarea structurii glicozidelor flavonoidelor din plante [103], [104], [105].
Recent, ei au raportat aplicaŃia LC – ESI –MS şi disocierea prin ciocnire indusă (CID) în
caracterizarea structurală a O-glicozidelor flavonolilor acilaŃi din semintele de
Carrichtera annua [104]. Grupările acil produc ioni caracteristici în spectrele [M + H]+ ş i
[M + Na]+. Cuplarea cu spectrometria de masă a fost utilizată pentru caracterizarea
tipului legăturii interglicozidice a izomerilor O-diglicozidici ai flavonoidelor. Scindarea
legăturii O-glicozidice concomitent cu o aranjare a hidrogenilor conduce la eliminarea
reziduurilor de monozaharide dehidratate, de exemplu: pierderea a 162 u (hexoză), 146 u
(deoxihexoză), 132 u (pentoză). Flavonoidele metilate sunt caracterizate de o pierdere de
15 u, având drept rezultat [M – H – CH3]- [106]. Metoda ESI – MS/MS este destul de
bună pentru a deosebi câŃiva izomeri ai flavonoidelor metilate pe baza spectrelor de ioni.
Cuyckens şi Claeys [103] au studiat optimizarea cromatografiei de lichide pe baza
detecŃiei ESI –MS şi a detectorului DAD pentru analiza glicozidelor flavonoidelor. În
modul ion-pozitiv, analiza ESI –MS în metanol conŃinând 1% acid acetic a fost pe
departe cea mai sensibilă, în timp ce faza mobilă ACN / apă conŃinând 0,5% acid formic
a prezentat cea mai bună sensibilitate în analiza LC/ESIMS/UV – DAD.
În modul ion-negativ, cea mai bună sensibilitate a fost obŃinută cu o fază mobilă ce
conŃine 0,1% acid formic, în timp ce adăugarea de baze a redus sensibilitatea. S-a
observat de asemenea că prezenŃa acidului acetic în faza mobilă determină creşterea
sensibilităŃii, reducând timpul de retenŃie în coloana LC.
Hvattum [107] a raportat identificarea în extractul de măceş a unui antocian şi a
câtorva glicozide ale quercetinei.
Determinarea stereochimică a resturilor de hexoză şi pentoză în flavonoidele acetilate a
fost realizată utilizând spectrometria de masă [108].

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
28
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Pe lângă O-glicozidele flavonoidelor, în multe plante medicinale şi vegetale se găsesc ş i


C-glicozidele flavonoidelor [109].
În cazul C-glicozidelor, zaharul este direct legat de partea flavonoidică prin intermediul
unei legături C – C rezistentă la acid. Tehnica MS –MS cu CID permite caracterizarea C-
glicozidelor atât în modul ion-pozitiv, cât şi în cel negativ.
Wang şi Sporns [110], [111] au fost primii care au utilizat tehnica MALDI –TOF
(matrix-assisted laser desorption – time-of-flight) în analiza izoflavonelor în produsele
din soia. Izoflavonele au fost predominant ionizate în forma protonată cu cantităŃi foarte
mici de ioni de sodiu şi potasiu. În analiza, a fost observată pierderea restului glicozidic.
Aceeaşi tehnică a fost folosită în analiza cantitativă a glicozidelor flavonolilor din
migdale [112].
Yang şi Chien [113] au demonstrat detecŃia oligomerilor: catechină, epicatechină ş i
derivaŃii lor galoilaŃi în seminŃele de struguri utilizând MALDI – TOF.
În tabelul 5 sunt prezentate câteva comparaŃii în cea ce priveşte tehnicile de
ionizare în spectrometria de masă în cazul analizei flavonoidelor.

Tabelul 5 – ComparaŃii privind tehnicile de ionizare în spectrometria de masă pentru


analiza flavonoidelor
Tehnica de AplicaŃia principală Avantaje Dezavantaje
ionizare
EI În principal analiza Poate fi cuplată uşor cu GC Necesită derivatizare
agliconelor (calitativă şi Sensibilitate ridicată Domeniu de masă limitat
cantitativă) Identificarea compuşilor Posibilă descompunere termică
necunoscuŃi Fragmentări mari
FAB Glicozidele flavonoidelor Domeniu de masă extins Sensibilitate redusă
până la 7000 Da Necesită solubilitatea probei în
Metodă de ionizare blândă matrice
Picuri ale matricei de bază
mari
MALDI- Glicozidele flavonoidelor, Limite mari de masă RezoluŃie scăzută
TOF proantocianidine Suportă concentraŃii la nivel Semnalele de bază ale matricei
mM ale sărurilor sunt mari, puŃin folosită pentru
molecule mici
APCI Agliconele flavonoidelor Domeniu de masă până la Sensibilitatea poate varia cu
2000 Da tipul compusului
Foarte sensibilă (femtomoli) Posibilitatea unei
Susceptibilă pentru descompuneri termice
HPLC/MS
ESI Diferite flavonoide Domeniu mare de masă ToleranŃă relativ scăzută la
(calitativă şi cantitativă) Susceptibilă pentru săruri
HPLC/MS Analiza poate fi dificilă pentru
RezoluŃia sarcinii ~ 2000 compuşii neionizabili
Sensibilitate de la femtomol ToleranŃă mică sau chiar
la picomol absentă pentru amestecurile
neomogene
EI – electron impact; FAB – fast-atom bombardment; MALDI-TOF – Matrix-assisted
laser desorption ionization-time-of-flight; APCI – atmospheric pressure chemical
ionization ESI – electrospray ionization

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
29
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

4.3. Cromatografia de înaltă performanŃă pentru analiza flavonoidelor

Pentru separarea flavonoidelor, condiŃiile cromatografice ale metodei HPLC


includ utilizarea unei coloane C18 cu fază inversă; detector diodă UV-Vis şi un sistem de
solvent binar conŃinând apă acidifiată (solvent A) şi un solvent organic polar (solvent B).
Separarea necesită un timp de 1 oră la un debit de 1.0 – 1.5 mL/min. De obicei, solventul
A este un acid sau un aditiv, precum fosfatul. Solventul B este pur sau metanol sau
acetonitril acidifiat.
Separarea şi determinarea cantitativă a flavonoidelor din trestia de zahăr a fost
realizată folosind HPLC – UV [114].
O metodă cu separare bună a flavonoidelor a fost descoperita de R. Tsao şi colab. [115]
care au utilizat o fază mobilă binară constând din 6% acid acetic în 2mM soluŃie apoasă
de acetat de sodiu (v/v, pH final 2,55) (solvent A) şi acetonitril (solvent B) şi coloana C18
cu fază inversă. Utilizarea acetatului de sodiu a reprezentat cheia pentru separarea a 25 de
flavonoizi din fructe.
LC – MS a fost utilizată pentru a demonstra prezenŃa glicozidelor flavonoidelor în
miere şi posibila utilizare a acestora ca markeri florali [116].
LC – UV –MS a fost folosită pentru identificarea flavonoidelor din fructele
arborelui de papaya Vasconcellea pubescens [117].

În tabelele 6 şi 7 sunt prezentate câteva publicaŃii recente referitoare la analiza GC


şi LC a flavonoidelor.

Tabel 6 – PublicaŃii recente privind analiza GC a flavonoidelor


Metoda Derivatizare Proba
GC – MS [118] TMS Diferite extracte de ierburi
GC – MS [119] TMS Ginkgo biloba
HT – HRGC – MS [120] none Vellozia graminifolia
GC – MS [121] TBDMS Fructe şi alune
GC – MS [122] Propolis
HT – HRGC – MS şi FID[123] Lonchocarpus urucu
TMS: trimetilsilil; HT: high-temperature; HR: high-resolution; TBDMS: N-(terŃ-
butildimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamidă;

Tabel 7 – PublicaŃii recente privind analiza LC a flavonoidelor


Coloane SolvenŃi DetecŃie Proba
25 x 2,0 mm, 5µm MeOH : acid formic apos 0,01% HPLC – ESI Boabe de soia
coloană C18 [124] Izocratic
0,5 mL/min
150 x 3,9 mm, 5µm Apă : ACN, acidifiat cu acid HPLC Soia, trifoi roşu
coloană C18 [125] acetic (0,1%), 1 mL/min
150 x 3,0 mm, 5µm A: apă : acid formic, 95:5 HPLC- struguri
coloană C18 [126] B: MeOH : acid formic, 95:5 DAD-MS
(ESI+)
250 x 4,6 mm, 5µm A: apă, 1% acid formic HPLC- Mure, căpşuni,
coloană C18 [127] B: ACN DAD-MS afine
(ESI+)
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
30
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Coloane SolvenŃi DetecŃie Proba


150 x 3,9 mm, A: apă : acid formic, 90:10 HPLC-DAD Cojile de struguri
Novapack C18 [128] B: apă : MeOH : acid formic, MS (ESI+)
45:45:10
150 x 4,6 mm, 5µm A: apă : acid trifluoracetic 0,1% LC–DAD afine
Capcell Pak C18 [129] B: acetonitril : apă, 50:50 MS (ESI +)
250 x 4,6 mm, 5µm A: apă : acid formic, 99:1 HPLC-DAD Ceai verde
coloană C18 [130] B: ACN : acid formic, 99:1 -MS (ESI±)
100 x 1 mm, 1,7µm A: apă : acid formic, 99:1 UPLC- Ceai verde
UPLC BEH C18 [131] B: ACN : acid formic, 99:1 (ESI±)-TOF
125 x 3 mm, 5µm A: apă : acid formic, 99:1 HPLC–ESI Afine
LichroCart Purospher B: ACN : acid formic, 99:1 (±) –ITMS
RP-18 [132]
125 x 3 mm, 5µm A: apă : acid acetic, 99:1 HPLC – ESI Linte
Lichrospher 100 RP-18 B: ACN : acid acetic, 90:10 – MS
[133]

4.4. Alte metode

Electroforeza capilară este o tehnică economică şi printre avantaje menŃionăm:


volumul de injectare al probei redus, randament ridicat, timp redus al analizei, care pot fi
folositoare în determinarea rapidă şi eficientă a flavonoidelor din sisteme complexe.
Metoda electroforezei capilare a fost aplicată pentru determinarea a nouă flavonoide
(inclusiv două rare) în planta medicinală Anaphalis margaritacea [134].
De asemenea, metoda electroforezei capilare cuplată cu detecŃia electrochimică
(CE – ED) a fost dezvoltată pentru identificarea şi determinarea a cinci flavonoide din
planta chinezească Portulaca oleracea L. [135]. DetecŃia electrochimică, bazată pe
reacŃia electrochimică a analiŃilor la suprafaŃa electrodului, furnizează una dintre cele mai
selective şi sensibile metode de detecŃie pentru CE. Majoritatea flavonoidelor sunt
compuşi electroactivi, deci CE – ED a fost de asemenea utilizată pentru determinarea
unor flavonoide din plante [136].
Studiul realizat de Y. Peng şi colab. [137] a utilizat CE – ED pentru analiza
cantitativă şi calitativă a markerilor flavonoidici din Frucus aurantii din diferire zone
geografice. Autorii au concluzionat că metoda CE – ED reprezintă o tehnică importantă
pentru markerii chimici, fiind o metodă alternativă, competitivă şi suplimentară metodei
HPLC.
O altă metodă descrisă în literatură [138] este detecŃia amperometrică a
flavonoidelor din plante utilizând un electrod modificat cu lacază (o oxidoreductază ce
conŃine cupru şi care se găseşte în multe plante şi microorganisme). Lacaza catalizează
îndepărtarea atomului de hidrogen din gruparea hidroxil din poziŃia orto- şi para- a
substratului fenolic.
Principiul metodei constă în imobilizarea enzimei prin adsorbŃie pe suprafaŃa unui
electrod de grafit. În acest studiu electrodul a fost testat pentru măsurători electrochimice
a unor flavonoide, precum catechina, epicatechina, prodelfinidina.
Metoda HPLC reprezintă cea mai potrivită alegere pentru identificarea
flavonoidelor, deoarece metodele de separare sunt deja bine stabiliate şi cuplarea cu MS
este uşor de realizat. Recent, dezvoltarea de noi tehnici, precum UPLC contribuie la
reducerea timpului de analiză fără a compromite rezoluŃia [139].
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
31
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

5. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip terpene

Terpenele reprezintă o clasă de compuşi organici produse de un număr variat de


specii de plante. Din punct de vedere al scheletului hidrocarbonat, pot fi împărŃite în
monoterpene (C10) ce conŃin două unităŃi izoprenice, diterpene (C20) şi triterpene (C30)
[140].
În figura 3 sunt prezentate structurile chimice a unor terpene.

OH

OH

geraniol linalool mircen β-ocimen

O
OH

α-pinen camfor mentol limonen

Figura 3 – Structura chimică a unor terpene.

Cromatografia de gaze a fost folosită încă de la început pentru separarea


diferitelor terpene din produse naturale [141], cât şi în caracterizarea de noi uleiuri
esenŃiale.
Datorită volatilităŃii terpenelor, informaŃia cea mai utilă este obŃinută utilizând
tehnici succesive, care implică în prealabil metode cromatografice sau spectroscopice. În
unele cazuri poate fi aleasă metoda HPLC fiind potrivită pentru analiza glicozidelor
terpenelor care nu sunt volatile.
Au fost folosite o serie de metode pentru extracŃia şi concentrarea probei,
separarea cromatografică a constituienŃilor şi caracterizarea acestora.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
32
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

6. Metode de determinare a terpenelor

6.1. ExtracŃia probei şi concentrarea

ExtracŃia terpenoidelor volatile din plante este de obicei realizată utilizând


distilarea cu abur. Au fost recent raportate posibile probleme referitoare la această
metodă, deoarece poate avea loc degradarea unor monoterpene din cauza hidratării
catalitice acide [142]. O modificarea a acestei metode implică extracŃia cu apă
supraîncălzită [143], şi în acest caz substanŃele dizolvate pot fi extrase cu hexan. De
asemenea a fost folosită simultan distilarea cu abur şi extracŃia cu diclormetan [144].
MicroextracŃia în fază solidă [145], [146] a fost utilizată, dar recuperările monoterpenelor
nu au fost aşa de mari precum în cazul celorlalte metode.
ExtracŃia cu microunde a fost folosită pentru extracŃia volatilă a terpenelor din
diverse plante [147]. Comparând recuperările relative a distilării cu abur, distilării ş i
extracŃia cu diclormetan, extracŃia cu microunde şi extracŃia cu fluide supercritice
folosind CO2, cel mai mare număr de compuşi identificaŃi, 79, a fost în cazul metodei
SFE, comparativ cu 67 pentru extracŃia cu microunde , 61 pentru distilarea şi extracŃia cu
DCM, şi doar 43 utilizând distilarea cu abur.
CantităŃi mici de constituienŃi din materialul plantelor au fost colectate utilizând
metoda headspace-ului, care implică volatilizarea terpenoidelor din probă într-un spaŃiu
închis, şi apoi analizarea constituienŃilor în această fază gazoasă. Headspace-ul oferă
anumite avantaje: este o metodă nedistructivă a probei, concentrează compuşii volatili
permiŃând detecŃia acestora chiar şi la nivel de urme şi deci, necesită cantităŃi mici de
probă, compuşii nevolatili (grăsimi, polizaharide, parafine) nu sunt extraşi printr-o astfel
de metodă, evitând astfel o procedură dificilă de pregătire a probei necesară analizei GC
– MS.
Mono- şi sescviterpenele sunt compuşi foarte volatili, putând fi uşor captate în headspace,
diterpenele prezintă volatilitate redusă, iar triterpenele foarte scăzută.
Terpenoidele volatile pot exista şi în formă glicozidică în majoritatea plantelor, şi
această formă nevolatilă reprezintă precursorul biosintetic al terpenelor libere. Pentru
extracŃie, se efectuează hidroliza glicozidei fie enzimatic cu β-glucozidază, fie o hidroliză
acidă [148]. Agliconele libere rezultate (terpenele volatile) pot fi analizate prin GC.
Pentru separarea terpenelor hidrocarbonate de compuşii oxigenaŃi este folosită
extracŃia în fază solidă cu silicagel ca fază staŃionară şi hexan şi dietil eter ca fază mobilă.
O altă posibilitate ar fi utilizarea detectorului ionizare în flacără cu oxigen (O-FID)
pentru determinarea selectivă a compuşilor oxigenaŃi [149].

6.2. Separarea cromatografică a constituienŃilor

GC este cea mai eficientă metodă cromatografică pentru separarea terpenelor.


Coloanele capilare cu dimetil polisiloxan (fază nepolară) şi Carbowax 20M (fază polară)
sunt folosite. Faza Carbowax 20M include DB-Wax, BP-20, PEG 20M, HP 20, în timp ce
faza dimetil polisiloxan, SE-30, SF-96, OV-1, OV-101, CPSil 5, BP 1, DB1, DB 5, HP 1
[149].
Lungimea coloanei poate fi cuprinsă între 25 şi 100 m, şi grosimea filmului din
faza staŃionară între 0,2 – 0,7 µm. Temperaturile de operare sunt de obicei între 500 (700)

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
33
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

– 2800, la 50/min. Odată cu descoperirea fazelor chirale a fost posibilă identificarea


enantiomerilor terpenelor volatile.
Câteodată selectivitatea unei singure coloane nu este suficientă, în special când
amestecul este foarte complex. Au fost folosite un număr de tehnici cuplate, precum GC
– GC şi HPLC – GC, care furnizează o rezoluŃie mai bună. Ambele permit utilizarea de
tehnici cu diferite capacităŃi de separare, combinând coloane chirale şi achirale, polare şi
nepolare, sau HPLC cu fază inversă cu GC cu temperatura programată. Analiza GC-GC a
fost folosită pentru a separa amestecul complex de enantiomeri din lămâie [150]. Faza
staŃionară butildietilsilil-β-ciclodextrina a fost capabilă de a evalua enantiomerii:
limonen, linalool, β-pinen, sabinen, α-terpineol. Comparativ cu separarea cu o singură
coloană numărul de constituieŃi identificaŃi este mai mare [151]. RezoluŃia crescută în
cazul HPLC – GC permite deosebirea între uleiuri provenite de la acelaşi material, dar
preparate diferit.
Deci, analiza enantiomerilor este realizată cu coloane ce conŃin ca fază staŃionară
ciclodextrine modificate, care sunt foarte eficiente şi stabile la temperatura comparativ cu
cele nemodificate. Mecanismul separării chirale implică interacŃii ale analiŃilor în
cavitatea chirală a ciclodextrinelor modificate. În prezent există trei ciclodextrine
disponibile comercial, α-, β-, γ- în funcŃie de dimensiunea cavităŃii [152].

6.3. Detectarea şi caracterizarea constituienŃilor

Detectorul ionizare în flacără (flame ionization detector – FID) este cel mai
utilizat pentru detecŃia şi cuantificarea terpenelor. Un alt detector este detectorul
fotoionizare.
ConstituienŃii separaŃi pot fi identificaŃi prin cromatografie utilizând standarde
dacă ei sunt bine separaŃi şi caracterizaŃi, sau identificarea este realizată prin compararea
cu indicii de retenŃie Kovats (Kovats retention indices RI). Utilizarea acestor date de
retenŃie obŃinute de la două coloane GC cu polarităŃi diferite, permite identificarea sigură
a unui număr mai mare de terpene dintr-o anumită probă.
Cel mai utilizat sistem pentru caracterizarea terpenelor eluate este GC cuplată cu
MS.
GC – MS poate implica folosirea unui detector MS cvadrupol sau a unui detector obişnuit
cu trapă ionică [153].
Combinarea metodei GC cu diferite tehnici MS (EI-MS, CI-MS, MS-MS) oferă
rezultatele cele mai bune în rezoluŃia unui amestec complex.
Câteodată poate fi folositor a confirma printr-o metodă analitică suplimentară
rezultatele obŃinute prin GC şi GC – MS. Acest lucru se poate face prin 13C-RMN care
urmează analizei GC pentru a confirma determinarea structurii propusă prin intermediul
spectrelor de masă şi a datelor de retenŃie.
Pentru deosebirea izomerilor, ceea ce se întâmplă des în grupul terpenelor, metoda GC –
FTIR oferă completări utile [149]. Avantajul spectroscopiei FTIR îl constituie rezoluŃia şi
sensibilitatea mare. Interpretarea destul de lungă şi absenŃa unei baze de date a spectrelor
fazei de vapori determină ca această metodă să nu fie general acceptată în analiza
compuşilor volatili.
HPLC poate fi folosită atunci când analiza GC a compuşilor termolabili şi/sau a
compuşilor polari este dificilă de realizat. Cuplarea cu detectorul DAD este folosită.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
34
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Studiul realizat de Hamm şi colab. [154] a avut ca scop stabilirea conŃinutului de terpene
(în special biomarkeri diterpenici) caracteristici unor specii diferite de tămâie (Boswellia)
utilizând SPME şi GC – MS.

7. Concluzii

Majoritatea procedurilor de preparare a probelor pentru determinarea compuşilor


din plante sunt dezvoltate în aşa fel încât extractul final introdus în coloanle GC şi HPLC
sau capilarele CE să conŃină numai analitul cu toate interferenŃele eliminate.
O comparaŃie a tehnicilor de extracŃie descrise anterior pentru izolarea
componenŃilor din materialul plantelor este prezentata în tabelul 8 [155].

Tabelul 8 – ComparaŃie între diferite tehnici de extracŃie lichid – lichid utilizate în


analiza metaboliŃilor plantelor.
ExtracŃie Soxhlet USE ASE MAE SFE
Cost scăzut scăzut ridicat mediu ridicat
Timp de 6 – 48 h < 30 min < 30 min < 30 min < 60 min
extracŃie
Solvent 200 – 600 < 50 < 100 < 40 <10
utilizat (mL)
USE – ultrasonic extraction; ASE – accelerated solvent extraction; MAE – microwave-
assisted extraction; SFE – supercritical fluid extraction

În lucrarea realizată de G. Romanik şi colab. [156] sunt prezentate tehnicile de


pregătire a materialului plantelor în vederea separării şi analizei cromatografice, printre
acestea: extracŃia Soxhlet, extracŃia cu ultrasunete (sonicare), extracŃia accelerată cu
solvent, distilare cu abur, procese de membrană, extracŃia cu fluide supercritice,
microextracŃia în fază solidă.

În figura 4 sunt reprezentate schematic etapele pentru determinarea compuşilor


din plante.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
35
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

PLANTE

Pregătirea probei

• congelare - uscare
• omogenizare

Extractie

• SE • MSPD
• Soxhlet • SPME

ANALIZA INSTRUMENTALĂ

GC LC Altele

Altele GC - MS Altele LC-UV-MS/MS CE TLC


• FID • Q-MS • UV • IT-MS • UV • UV
• ECD • IT-MS • NMR • TOF-MS • ED • chemical
• MS

Figura 4 – Rerezentarea schematică a etapelor în determinarea compuşilor din plante


SE: solvent extraction; MSPD: matrix solid-phase extraction; SPME: solid-phase micro-
extraction; MS/MS: tandem mass spectrometry; TLC: thin layer chromatography; FID:
flame ionization detection; ECD: electron capture detection; Q: quadrupole; IT: ion-trap,
NMR, nuclear magnetic resonance; TOF, time-of-flight.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
36
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Legendă generală

APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization


BHT: butilat de hidroxi toluen
CE: Capillary Electrophoresis
CI: Chemical ionization mode
DAD: Photodiode array detector
DCM: diclometan
EI: Electron Impact
ED: Electrochemical Detection
ESI – Electrospray Ionization
EtOH: etanol
GC: Gas Chromatography
LC: Liquid Chromatography
THF: tetrahidrofuran
MeOH: metanol
MS: Mass Spectrometry
MTBE: metil-terŃ-butil eter
RP: Reversed Phase
SFE: Supercritical Fluid Extraction
TEA: trietilamina

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
37
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Bibliografie
1. F. Mattea, A. Martín, M.J. Cocero, J. Food Eng., 2009, 93, 255
2. H. van den Berg, R. Faulks, H.F. Granado, J. Hirschberg, B. Olmedilla, G. Sandmann,
S. Southon, W. Stahl, J. Sci. Food Agric., 2000, 80, 880
3. R.A. Bone, J.T. Landrum, Z. Dixon, Y. Chen, C.M Llerena, Experimental Eye
Research, 2000, 71, 239
4. N.I. Krinsky, E.J. Johnson, Molecular Aspects of Medicine, 2005, 26, 459
5. L.B. Almeida, M.V.C. Penteado, J. Food Comp. Anal., 1988, 1, 341–352
6. D.B. Rodriguez-Amaya, J. Food Comp. Anal., 1996, 9, 196
7. L.B. Almeida-Muradian, M.D.G. Rios, R. Sasaki, R., Bolletino Chimico Farmaceutico,
1998, 137, 290
8. C.W. Huck, M. Popp, H. Scherz, G.K. Bonn, J. Chromatogr. Sci., 2000, 38, 441
9. N.L. Rozzi, R.K. Singh, R.A. Vierling, B.A. Watkins, J. Agric. Food Chem., 202, 50,
2638
10. M. Edelenbos, L.P. Christensen, K. Grevsen, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 4768
11. C.H. Azevedo-Meleiro, D.B. Rodriguez-Amaya, J. Food Comp. Anal., 2004, 17, 385
12. P.J.M. Hulshof, C. Xu, P. van de Bovenkamp, C.E. West, J. Agric. Food Chem.,
1997, 45, 1174
13. B. Gandul-Rojas, M.R.L. Cepero, M.I. Minguez-Mosquera, J. Agric. Food Chem.,
1999, 47, 2207
14. R. Marsili, D. Callahan, J. Chromatogr. Sci., 1993, 31, 422
15. E.E. Moros, D. Darnoko, M. Cheryan, E.G. Perkins, J. Jerrell, J. Agric. Food Chem.,
2002, 50, 5787
16. A.J. Melendez-Martinez, I.M. Vicario, F.J. Heredia, J. Agric. Food Chem., 2003, 51,
4219
17. F. Markus, H.G. Daood, J. Kapitany, P.A. Biacs, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 100
18. Y.P.C. Hsieh, M. Karel, J. Chromatogr., 1983, 259, 515
19. M. Murkovic, U. Mulleder, H. Neunteufl, Analysis, 2002, 15, 633
20. V. Hentschel, K. Kranl, J. Hollmann, M.G. Lindhauer, V. Bohm, R. Bitsch, J. Agric.
Food Chem., 2002, 50, 6663
21. A.C. Kurilich, S.J. Britz, B.A. Clevidence, J.A. Novotny, J J. Agric. Food Chem.,
2003, 51, 4877
22. M.M. Barth, C. Zhou, K.M. Kute, G.A. Rosenthal, J. Agric. Food Chem., 1995, 43,
2876
23. A.B. Barua, J.A. Olson, J. of Chromatogr.B, 1998, 707, 69
24. E. Gimeno, E. Calero, A.I. Castellote, R.M. Lamuela-Raventos, M.C. de la Torre,
M.C. Lopez-Sabater, J.Chromatogr. A., 2000, 881, 255
25. A.K. Taungbodhitham, G.P. Jones, M.L. Wahlqvist, D.R. Briggs, Food Chem., 1998,
63, 577
26. C.H. Lin, B.H. Chen, J. Chromatogr. A, 2003, 1012, 103
27. J. Deli, P. Molnar, Z. Matus, G. Toth, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1517
28. W.L. Hadden, R.H. Watkins, L.W. Levy, E. Regalado, D.M. Rivadeneira, R.B. van
Breemen, S.J. Schwartz, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 4189
29. H.S. Lee, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 2563
30. K.E. Sharpless, M. Arce-Osuna, J.B. Thomas, L.M. Gill, J. AOAC Internat., 1999,
82, 288

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
38
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

31. E. Vagi, B. Simandi, H.G. Daood, A. Deak, J. Sawinsky, J. Agric. Food Chem., 2002,
50, 2297
32. M. Careri, L. Furlattini, A. Mangia, M. Musci, E. Anklam, A. Theobald, C. von
Holst, J. Chromatogr.A, 2001, 912, 61
33. M.S. Gomez-Prieto, M.M. Caja, M. Herraiz, G. Santa-Maria, J. Agric. Food Chem.,
2003, 51, 3
34. L. Ferreira de Franca, G. Reber, M.A.A. Meireles, N.T. Machado, G. Brunner, J.
Supercrit. Fluids, 1999, 14, 247
35. T. Baysal, S. Ersus, D.A.J. Starmans, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 5507
36. I. Gamlieli-Bonshtein, E. Korin, S. Cohen, Biotechnol. Bioeng., 2002, 80, 169
37. R.L. Mendes, B.P. Nobre, M.T. Cardoso, A.P. Pereira, A.F. Palavra, Inorg. Chim.
Acta, 2003, 356, 328
38. A. Chandra, M.G. Nair, Phytochem. Analysis, 1997, 8, 244
39. F. Khachik, G.R. Beecher, M.B. Goli, W.R. Lusby, Methods in Enzymology, 1992,
213, 347
40. F. Granado, B. Olmedilla, I. Blanco, E. Rojas-Hidalgo, J. Agric. Food Chem., 1992.
40, 2135
41. R.X.E. Fernandez, N.W. Shier, B.A. Watkins, J. Food Compo. Anal., 2001, 13, 179–
187
42. J.L. Guil-Guerrero, M.M. Rebolloso-Fuentes, M.E.T. Isasa, J. Food Comp.Anal.,
2003, 16, 111
43. L.A. Howard, A.D. Wong, A.K. Perry, B.P. Klein, J. Food Sci., 1999, 64, 929
44. A.S. Huang, L. Tanudjaja, D. Lum, J. Food Comp. Anal., 1999, 12, 147
45. L. Ye, W.O. Landen, R.R. Eitenmiller, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 4003
46. K.L. Goodner, R.L. Rouseff, H.J. Hofsommer, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1146
47. D.J. Hart, K.J. Scott, Food Chem., 1995, 54, 101
48. S. Otles, Y. Atli, American Laboratory, 2000, 32, 22
49. F. Khachik, G.R. Beecher, N.F. Whittaker, J. Agric. Food Chem., 1986, 34, 603
50. K.J. Scott, Food Chem., 1992, 45, 357
51. W.W. Fish, P. Perkins-Veazie, J.K. Collins, J. Food Comp. Anal., 2002, 15, 309
52. V. Gokmen, S. Bahceci, J. Acar, J. Liquid Chromatography and Related
Technologies, 2002, 25, 1201
53. C.H. Lin, B.H. Chen, J. Chromatogr. A, 2003, 1012, 103
54. L. Englberger, J. Schierle, G.C. Marks, M.H. Fitzgerald, J. Food Comp. Anal., 2003,
16, 3
55. L. Mathiasson, C. Turner, H. Berg, L. Dahlberg, A. Theobald, E. Anklam, R. Ginn,
M. Sharman, F. Ulberth, R. Gabernig, Food Additives Contaminants, 2002, 19, 632
56. E. Bako, J. Deli, G. Toth, J. Biochem. Biophysical Methods, 2002, 53, 241
57. F. Khachik, M.B. Goli, G.R. Beecher, J. Holden, W.R. Lusby, M.D. Tenorio, M.R.
Barrera, J. Agric. Food Chem., 1992, 40, 390
58. U.G. Chandrika, E.R. Jansz, S.M.D.N. Wickramasinghe, N.D. Warnasuriya, J. Sci.
Food Agric., 2003, 83, 1279
59. L. Englberger, W. Aalbersberg, P. Ravi, E. Bonnin, G.C. Marks, M.H. Fitzgerald, J.
Elymore, J. Food Comp.Anal., 2003, 16, 219
60. T. Lacker, S. Strohschein, K. Albert, J. Chromatogr.,A, 1999, 854, 37
61. K.S. Epler, L.C. Sander, R.G. Ziegler, S.A. Wise, N.E. Craft, J. Chromatogr., 1992,
595, 89
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
39
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

62. K.S. Epler, R.G. Ziegler, N.E. Craft, J. Chromatogr., 1993, 619, 37
63. S. Gueguen, B. Herbeth, G. Siest, P. Leroy, J. Chromatogr. Sci., 2002, 40, 69
64. L.R. Howard, S.T. Talcott, C.H. Brenes, B. Villalon, J. Agric. Food Chem., 2000, 48,
1713
65. G.A.G. Kiss, E. Forgacs, T. Cserhati, T. Mota, H. Morais, A. Ramos, J. Chromatogr.
A, 2000, 889, 41
66. E. Darko, B. Schoefs, Y. Lemoine, J.Chromatogr. A, 2000, 876, 111
67. R.B. Assuncao, A.Z. Mercadante, J. Food Comp. Anal., 2003, 16, 647
68. L.C. Sander, K.E. Sharpless, N.E. Craft, S.A. Wise, Anal. Chem., 1994, 66, 1667
69. P.P. Mouly, E.M. Gaydou, J. Corsetti, J. Chromatogr. A, 1999, 844, 149
70. A. Mortensen, Food Research International, 2005, 38, 847
71. K.J. Scott, D.J. Hart, Food Chem., 1993, 47, 403
72. A. Lienau, T. Glaser, G. Tang, G.G. Dolnikowski, M.A. Grusak, K. Albert, J. Nutrit.
Biochem., 2003, 14, 663
73. P. Weller, D.E. Breithaupt, J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 7044
74. D.E. Breithaupt, U. Wirt, A. Bamedi, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 66
75. A.Z. Mercadante, D.B. Rodriguez-Amaya, G. Britton, J. Agric. Food Chem., 1997,
45, 120
76. M.G. Dias, M.F.G.F.C. Camoes, L. Oliveira, Food Chem., 2009, 113, 808
77. S.C. Liu, J.T. Lin, D.J. Yang, Food Chem., 2009, 116, 605
78. C. Kurz, R. Carle, A. Schieber, Food Chem., 110, 2008, 522
79. G. Aruna, B.S. Mamatha, V. Baskaran, J. Food Comp. Anal., 2009, 22, 632
80. D. Ren, S. Zhang, Food Chem., 2008, 106, 410
81. G. Burgos, E. Salas, W. Amoros, M. Auqui, L. Munoa, M. Kimura, M. Bonierbale, J.
Food Comp. Anal., 2009, 22, 503
82. A. Perry, H. Rasmussen, E.J. Johnson, J. Food Comp. Anal., 2009, 22, 9
83. H. Cen, Y. He, Trends Food Sci. Technol., 2007, 18, 72
84. H. Schulz, H.H. Drews, R. Quilitzsch, H. Kruger, J. Near Infrared Spectrosc., 1998,
6, 125
85. S.G. Atienza, C.M Avila, M.C. Ramirez, A. Martin, Aust. J. Agric. Res.. 2005, 56, 85
86. A.M.K. Pedro, M.M.C. Ferreira, Anal. Chem., 2005, 77, 2505
87. O.V. Brenna, N. Berardo, J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 5577
88. X. Chen, J. Wu, S. Zhou, Y. Yang, X. Ni, J. Yang, Z. Zhu, C. Shi, J. Food
Comp.Anal., 2009, 22, 148
89. R.A. Larson, Phenolic and enolic antioxidants. Naturally Occurring Antioxidants.
Boca Raton: CRC press LLC; 1997, 100
90. J.B. Harborne, C.A. Williams, Phytochemistry, 2000, 55, 481
91. L. Coward, M. Smith, M. Kirk, S. Barnes, Am. J. Clin. Nutr., 1998, 68, 1486S
92. R. Llorach, A. Gil-Izquierdo, F. Ferreres, F. Tomas-Barberan, J. Agric. Food
Chem., 2003, 51, 3895
93. C. Yang, Y.R. Xu, W.X Yao, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 846
94. F.J. Senorans, A. Ruiz-Rodriguez, S. Cavero, A. Cifuentes, E. Ibanez, G. Reglero, J.
Agric. Food Chem., 2001, 49, 6039
95. A.N. Giannuzzo, H.J. Boggetti, M.A. Nazareno, H.T. Mishima, Phytochem. Anal.,
2003, 14, 221
96. K. Ishii, T. Furuta, Y. Kasuya, J. Chromatogr. B, 2003, 794, 49
97. W.Wu, C.Y. Yan, L. Li, Z.Q. Liu, S.Y. Liu, J. Chromatogr. A, 2004, 1047, 213
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
40
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

98. Y.C. Fiamegos, C.G.Nanos, J. Vervoort, C.D. Stalikas, J. Chromatogr. A, 2004, 1041,
11
99. P. Dugo, F. Cacciola, M. Herrero, P. Donato, L. Mondello, J. Sep. Sci., 2008, 31,
3297
100. M. Stobiecki, Phytochemistry, 2000, 54, 237
101. J.P. Rauha, H. Vuorela, R. Kostiainen, J. Mass Spectrom., 2001, 36, 1269
102. E. De Rijke, H. Zappey, F. Ariese, C. Gooijer, U.A. Brinkman, J. Chromatogr., A,
2003, 984, 45
103. F. Cuyckens, M. Claeys, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 2341
104. F. Cuyckens, A.A. Shahat, H. Van den Heuvel, K.A. Abdel-Shafeek, M.M. El-
Messiry, M.M. Seif-El Nasr, L. Pieters, A.J. Vlietinck, M. Claeys, Eur.J. Mass Spectrom,
2003, 9, 409
105. Y.L. Ma, F. Cuyckens, H. Van den Heuvel, M. Claeys, Phytochem. Anal., 2001,
12, 159
106. U.J. Justesen, Mass Spectrom., 2001, 36, 169
107. E. Hvattum, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 655
108. F. Cuyckens, A.A. Shahat, L. Pieters, M. Claeys, J. Mass Spectrom., 2002, 37, 1272
109. B.S. Yu, X. Yan, G.B. Zhen, Y.P. Rao, J. Pharm. Biomed. Anal., 2002, 30, 843
110. J. Wang, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 5887
111. J. Wang, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 1657
112. S. Frison-Norrie, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 2782
113. Y. Yang, M. Chien, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 3990
114. R. Colombo, F.M. Lancas, J.H. Yariwake, J. Chromatogr A, 2006, 1103, 118
115. R. Tsao, R. Yang, J. Chromatogr. A, 2003, 1018, 29
116. P. Truchado, F. Ferreres, F.A. Tomas-Barberan, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 7241
117. M.J. Simirgiotis, P.D.S. Caligari, G. Schmeda-Hirschmann, Food Chem., 2009, 115,
775
118. Y.C. Fiamegos, C.G. Nanos, J. Vervoort, C.D. Stalikas, J. Chromatogr. A, 2004,
1041, 11
119. F. Deng, S.W. Zito, J. Chromatogr. A, 2003, 986, 121
120. A. Branco, A.D. Pereira, J.N. Cardoso, F.R.D. Neto, A.C. Pinto, R.Braz,
Phytochem. Anal., 2001, 12, 266
121. J. Liggins, L.J.C. Bluck, S. Runswick, C. Atkinson, W.A. Coward, S.A. Bingham, J.
Nutr. Biochem., 2000, 11, 326
122. M. Medic-Saric, I. Jasprica, A. Mornar, A. Smolcic-Bubalo, P. Golja, J. Planar
Chromatogr., 2004, 17, 459
123. A.D.S. Pereira, M.C. Padilha, F.R.D.A. Neto, Microchem. J., 2004, 77, 141
124. M. Careri, C. Corradini, L. Elviri, A. Mangia, J. Chromatogr. A, 2007, 1152, 274
125. P. Delmonte, J. Perry, J.I. Rader, J. Chromatogr. A, 2006, 1107, 59
126. Z. Huang, B. Wang, P. Williams, R.D. Pace, Food Sci. Technol, 2009, 42, 819
127. N.P. Seeram, L.S. Adams, Y. Zhang, R. Lee, D. Sand, H.S. Scheuller, D. Heber,
J.Agric. Food Chem, 2006, 54, 9329
128. V. Nunez, M. Monagas, M.C. Gomez-Cordoves, B. Bartolome, Postharvest Biol.
Technol., 2004, 31, 69
129. J.-I. Nakajima, I. Tanaka, S. Seo, M. Yamazaki, K. Saito, J. Biomed. Biotechnol.,
2004, 5, 241
130. L.-Z. Lin, P. Chen, J.M. Harnly, J. Agric. Food Chem, 2008, 56, 8130
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
41
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

131. W. Pongsuwan, T. Bamba, K. Harada, T. Yonetani, A. Kobayashi, E. Fukusaki,


J.Agric. Food Chem., 2008, 56, 10705
132. K.R. Maeaettae-Riihinen, M.P. Kaehkoenen, A.R. Toerroenen, I.M. Heinonen, J.
Agric. Food Chem., 2005, 53, 8485
133. M. Duenas, B. Sun, T. Hernandez, I. Estrella, M.I. Spranger, J. Agric. Food Chem.,
2003, 51, 7999
134. Z.Y. Ren, Y. Zhang, Y.P. Shi, Talanta, 2009, 78, 959
135. X. Xu, L. Yu, G. Chen, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006,
41, 493
136. X.J. Li, Y.P. Zhang, Z.B. Yuan, Chromatographia, 2002, 55, 243
137. Y. Peng, F. Liu, J. Ye, J. Chromatogr. B, 2006, 830, 224
138. A. Jarosz-Wilkołazka, T. Ruzgas, L. Gorton, Enzyme and Microbial Technology,
2004, 35, 238
139. J. Valls, S. Millan, M. P. Marti, E. Borras, L. Arola, J.Chromatography A, 2009,
1216, 7143
140. J. Degenhardt, T.G. Kollner, J. Gershenzon, Phytochemistry, 2009, 70, 1621
141. A.M. Committee, Analyst, 1993, 118, 1089
142. H.S. Song, M. Sawamura, K. Ito, K. Kawaskimo, H. Ukeda, Flavour Fragrance J.,
2000, 15, 245
143. A. Basile, M.M. JimenezCarmona, A.A. Clifford, J. Agric. Food Chem., 1998, 46,
5205
144. E.E. Stashenko, M.A. Puertas, M.Y. Combariza, J. Chromatogr. A, 1996, 752, 223
145. F. Angusto, A.L.P. Valente, E. dos Santos Tada, S.R. Rivellino, J. Chromatogr. A,
2000, 873, 117
146. F. de Angelis, A. Di Tullio, G. Mellerio, R. Quaresima, R. Volpe, Rap. Commun.
Mass Spectrom., 1999, 13, 895
147. E.E. Stashenko, M. Cervantes, Y. Combariza, H. Fuentes, J.R. Martinez, J. High
Resolut. Chromatogr., 1999, 22, 343
148. J.J. Mateo, M. Jimenez, J. Chromatogr. A, 2000, 881, 557
149. I. Merfort, Journal of Chromatography A, 2002, 967, 115
150. L. Mondello, M. Catalfamo, A. Cotroneo, G. Dugo, G. Dugo, H. McNair, J. High
Resolut. Chromatogr., 1999, 22, 350
151. J.D. Dimandja, S.B. Stanfill, J. Grainger, D.G. Patterson, J. High Resolut.
Chromatogr., 2000, 23, 208
152. N. Yassaa, J. Williams, Atmospheric Environment, 2005, 39, 4875
153. G.B. Lockwood , Journal of Chromatography A, 2001, 936, 23
154. S. Hamm, J. Bleton, J. Connan, A Tchapla, Phytochemistry, 2005, 66, 1499
155. M.J. Leach, Complement Ther Nurs, 2004, 10
156. G. Romanik, E. Gilgenast, A. Przyjazny, M. Kamiński, J. Biochem. Biophys.
Methods, 2007, 70, 253

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
42
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

B. Activitate II.1.2. – ICDP Braşov


Stabilirea arealelor pastorale şi a tehnicilor de valorificare a pajiştilor;
prelevarea şi condiŃionarea probelor de nutreŃuri şi de lapte din zona Blana
Bucegi.

1. Rezumatul etapei

Obiectivul principal al proiectului ”Cercetari complexe privind stabilirea de


markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale in vederea imbunatatirii
trasabilitatii acestora pe lantul alimentar total” esta acela de a găsii metodologii de
analiză care să servească la diferenŃierea produselor lactate regionale de alte produse
similare.
În cadrul acestui obiectiv generos, partenerul 2 al consortiului acestui proiect,
ICDP BRASOV, îşi propune să participe la scoaterea in evidenŃă a acelor caracteristici
tehnologice şi fizico-chimice care să conducă la ideea că laptele şi produsele lactate
obŃinute pe Platoul MunŃilor Bucegi pot fi considerate ca produse regionale (lapte de
Bucegi, brânză de Bucegi, etc.), de o calitate şi savoare deosebită.
S-a ales ca areal de studiu platoul munŃilor Bucegi deoarece ICDP Braşov deŃine
aici o Baza pentru Cercetări Pajişti Montane situată între Vârfurile Blana (1875 m) ş i
Nucet (1863 m).
Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi este situată la 1800
m altitudine, pe un teren uşor înclinat cu expoziŃie estică.
VegetaŃia primară a fost dominată de jneapăn (Pinus mugo) şi rarişte de molid
(Picea abies) după a căror defrişare s-a instalat o vegetaŃie ierboasă dominată de Festuca
nigrescens, F. ovina şi Agrostis rupestris, care la rândul lor au fost invadate de specia
nevaloroasă Nardus stricta.
Substratul litologic este format de conglomerate tipice de Bucegi. Solurile sunt
brune acide şi podzoluri, puternic debazificate, foarte sărace în elemente fertilizante.
CondiŃiile climatice sunt cele specifice etajului alpin inferior în care temperatura
medie anuala a aerului este de 4,9°C.
Vântul bate cu viteze medii anuale de peste 6 metri/secundă. Cantitatea de
precipitaŃii căzute în perioada de vegetaŃie (iunie – septembrie) este în jur de 400 mm, iar
cea anuală este de aproximativ 1200 mm.
La BCPM Blana Bucegi s-au iniŃiat iniŃiat cercetări privind valorificarea cu vaci
de lapte a păşunilor subalpine în anul 1995 sub coordonarea domnului dr. ing. Teodor
Maruşca. Atunci au fost înfiinŃate si 5 parcele experimentale care au fost utilizate în mai
multe ”faze” de cercetare .

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
43
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

2. Prezentarea parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi

2.1. Faza I de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi

Variantele experienŃei din 1995 au fost:


1. Parcela (lotul) A: Păşune naturală (nardet) fertilizat chimic (3 ani) cu
50 kg/ha P2O5 şi 50 kg/ha K2O anual
2. Parcela (lotul) B: Păşune naturală (nardet) fertilizat chimic (3 ani) cu
150 (100+50) kg/ha N + 50 kg/ha P2O5 şi 50 kg/ha K2O anual
3. Parcela (lotul) C: Păşune naturală (nardet) amendată la 2/3 din Ah, fertilizată (3
ani) cu 150 (100+50) kg/ha N + 50 kg/ha P2O5 şi 50 kg/ha K2O anual
4. Parcela (lotul) D: Păşune semănată după erbicidare totală cu Roundup (5 l/ha),
amendare 2/3 din Ah şi fertilizare (3 ani) cu 150 (100+50)
kg/ha N + 50 kg/ha P2O5 şi 50 kg/ha K2O anual
5. Păşune naturală (lotul) T din afara câmpului experimental, nardete nefertilizate
(varianta martor cca. 0,4 UVM / ha).

Animale (vaci cu lapte) la păşunat:


- rasa: Bruna de Maramureş, adaptată la munte
- data fătării: martie – aprilie
- încărcare medie: 4 vaci în lot, respectiv 2 UMV / ha în parcela A şi 5,3 în restul
parcelelor (B, C şi D)
- producŃie iniŃială cât mai uniformă pe o vacă: ( 12 – 14 l/cap lapte 3,5 %
grăsime)
- stare de sănătate corespunzătoare
- au fost excluse primiparele şi vacile prea avansate în vârstă (peste 8 ani).

Detalii tehnice ale experienŃei:


- suprafaŃa unei parcele: 0,75 ha pentru fiecare din loturile B, C, D şi 2,00 ha pentru
lotul A;
- suprafaŃa totală îngrădită cu gard fix: 42.500 m2 ( 7.500 m2 x 3 parcele + 20.000
m2).

Mod de folosire:
- Păşunat liber (continuu) extensiv (lot T), semiintensiv (lot A) şi intensiv (loturile
B, C şi D);
- Prelevare probe pentru determinat producŃia de iarbă, sub cuşti metalice, pe 2 m2
în trei repetiŃii pe fiecare parcelă;
- Cosire resturi neconsumate, toamna, dacă este cazul.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
44
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Fig.1. Aspect general Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
45
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Fig. 2. Aspect al pasunatului liber in cadrul experimentelor realizate la Baza de


Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi

ObservaŃii şi determinări:
- compoziŃia floristică a covorului ierbos;
- producŃia de substanŃă uscată a păşunii;
- analize de calitate a furajelor şi analize agrochimice de sol;
- producŃia pe cap de vacă determinată săptămânal;
- analiza calităŃii laptelui, grăsime şi proteină din 2 în 2 săptămâni;
- comportamentul alimentar al vacilor pe păşune;
- stabilirea efectului remanent alo îmbunătăŃirii după anul al-III-lea;

2.2. Faza a II-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana
Bucegi (2000 – 2002)
ExistenŃa unei experienŃei cu vaci de lapte, înfiinŃată în anul 1995 a permis
alăturarea a unor variante noi după care să se cerceteze în paralel productivitatea
păşunilor îmbunătăŃite prin târlire (fertilizare organică) sau prin fertilizare chimică, faŃă
de o păşune îmbunătăŃită în urmă cu 2 ani, considerată ca martor.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
46
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Variantele experienŃei:
1. Parcela (lotul) AT: Păşune naturală (nardet) târlit ă cu taurine 1 vacă (6 m2/6
zile în 1999)
2. Parcela (lotul) AC: Păşune naturală (nardet) fertilizată cu îngrăşăminte
chimice
- Anul I (2000) - N200 P100 K100 kg/ha
- Anul II (2001) - N150 P75 K75 kg/ha
- Anul III (2002) - N100 P50 K50 kg/ha
3. Parcela (lotul) B: (martor): Păşune naturală (nardet) fertilizată în perioada
1996-1998, respectiv 3 ani consecutivi cu N150 P75 K75 kg/ha, diminuarea
Ńăpoşicii şi dominarea păiuşului roşu, după care s-a încetat fertilizarea (1999 şi în
continuare), urmărindu-se efectul remanent.
MenŃiune:
- Parcela B a fost martor şi pentru experienŃa 3 unde se urmăreşte efectul remanent
al fertilizării chimice + amendare (parcela C) şi al înfiinŃării de pajişti semânate +
fertilizare chimică + amendare (parcela D).
- Pe locul foste parcele martor A (fertilizare PK) s-au instalat cele două variante
(parcelele) AT şi AC, prezentate mai sus.
Detalii tehnice ale experienŃei:
- suprafaŃa unei parcele: 7.500 m2
- suprafaŃa totală a experienŃei: 22.500 m2
Animale (vaci cu lapte) la păşunat: au caracterele identice cu cea anterioară
Modul de folosinŃă: - păşunat liber intensiv (continuu) în toate parcelele: AT, AC şi B
ObservaŃii şi determinări: aceleaşi ca la experienŃa anterioară

2.3. Faza a III-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana
Bucegi (2003-2008)
Profitând de baza materială bună existentă la experienŃele anterioare cu vaci de
lapte, după 2002 s-au continuat experimentările pe acelaşi amplasament urmărindu-se
efectul remanent după târlire.
Variantele experienŃei privind folosirea păşunilor subalpine cu vaci de lapte au
fost:
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
47
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

1. Parcela (lotul) M (Martor), păşune naturală,( fost AC, după 2 ani de la


încetarea fertilizării chimice cu NPK).
2. Parcela AT, păşune naturală târlită în 1999 şi repetare târlire cu vacile în
2005.
3. Parcela B, păşune naturală fertilizată chimic cu NPK în perioada 1996 – 1998,
târlită cu vacile în anul 2004.
4. Parcela C, păşune naturală, amendată la 2/3 din Ah în 1995, fertilizată chimic
cu NPK între 1996-1998, târlită cu vacile în 2003.
5. Parcela D, păşune semănată şi amendată în 1995, fertilizată chimic cu NPK
între 1996-1998, târlită cu vacile în 2003 şi 2006.
Înainte sau imediat după târlire cu vacile au fost aplicate îngrăşăminte chimice –
superfosfat, în doză de 100 kg/ha P2O5.
ObservaŃiile şi determinările la noua experienŃă cu vaci de lapte sunt identice cu
cele existente la experimentările precedente.

2.4. Faza a IV-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM


Blana Bucegi (2009 – 2012)
În continuare pe acelaşi amplasament al experienŃei de lungă durată se va urmării
efectul metodelor principale de îmbunătăŃire aplicate până în prezent constând din
fertilizare chimică (NPK) şi organică şi organică pe fond neamendat sau amendat pe
pajiştea cu covor ierbos natural sau pajişte reînsămânŃată cu specii din afară.
Variantele târlite cu vacile de lapte au fost următoarele:
o Parcela D în anul 2008
o Parcela C în anul 2009
În anul viitor (2010) se va târlii cu vacile parcela B. Tot în anul următor se va
fertiliza cu îngrăşăminte chimice parcela AC cu doze de 150 kg/ha N, 150 kg /ha P2O5 ş i
100 kg/ha K2O.
În anii 2010-2012 vor fi disponibile pentru cercetări complexe în relaŃia sol –
plantă – animal –produs animalier, parcelele:
AC - fertilizare chimică pajişte permanentă
B – fertilizare organică pajişte permanentă
C – fertilizare organică pajişte permanentă pe fond amendat
D - fertilizare organică pajişte semănată pe fond amendat
Amplasarea dispozitivului experimental este prezentată în fotografia şi schiŃa
alăturate.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
48
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Fig. 3. Amplasarea dispozitivului experimental la Baza de Cercetări Pajişti Montane


(B.C.P.M.) Blana Bucegi

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
49
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
50
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

3. Rezultate obtinute in cadrul experimentarilor realizate la Baza de


Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi

În continuare se prezintă câteva rezultate privind producŃia de substanŃă uscată a


pajiştii şi producŃia de lapte.

3.1. ProducŃia de substanŃă uscată

În anul 2009 au fost obŃinute următoarele rezultate de producŃie de substanŃă


uscată pe variantele îmbunătăŃite:

Tabel 1. Productia de substanta uscata obtinuta pe diferite parcele ale B.C.P.M.


Blana Bucegi
Varianta RepetiŃia
Media t/ha %
I II III IV
AC (fertilizare NPK – 2002) 3,42 4,96 2,84 6,82 4,51 91
B târlire 2004 3,80 4,96 2,24 4,88 3,97 80
D târlire 2008 4,94 6,08 4,62 9,70 6,34 128
Media * * * * 4,94 100

Din datele prezentate se remarcă varianta D – pajiştea semănată, amendată în anul


înfiinŃării târlită cu vacile anul trecut (2008) pe care se obŃin 6,34 t/ha SU, cu 28% mai
mult decât producŃia medie. Rezultate mai slabe s-au obŃinut în varianta B ce urmează a fi
târlită în anul viitor şi AC care de asemenea va fi fertilizată cu îngrăşăminte chimice.

3.2. ProducŃia de lapte

Păşunatul a început în data de 14 iunie şi s-a încheiat în data de 6 septembrie,


respectiv 85 de zile. ProducŃia medie pe cap de vacă la începutul păşunatului a fost de
14,6 litri scăzând până la 7,9 litri la sfârşitul sezonului, cu o produc᾿ie medie de
aproape 11,5 l/cap/zi (tabel).

Tabel 2. ProducŃia medie de lapte de vacă (3,5 % grăsime) realizată de rasa


Brună (Schwyz) pe păşunile subalpine din MunŃii Bucegi
- l / cap /zi
Nr. GRUPA
Luna Decada Media
zile AC B T
Iunie II (14-20) 7 14,5 14,6 15,0 14,3 14,6
III (21-30) 10 13,8 13,8 15,8 13,5 14,2
Media 17 14,2 14,2 15,4 13,9 14,4
Iulie I (1-10) 10 12,9 12,3 15,7 13,1 13,5
II (11-20) 10 12,6 12,4 14,2 13,2 13,1
III (21-31) 11 12,3 12,0 12,6 10,2 11,8
Media 31 12,6 12,2 14,2 12,2 12,8
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
51
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

August I (1-10) 10 9,7 10,2 11,6 9,0 10,1


II (11-20) 10 8,4 9,1 11,1 8,8 9,4
III (21-31) 11 8,3 8,5 10,4 8,3 8,9
Media 31 8,8 9,3 11,0 87 9,5
Sept. I (1-6) 6 7,4 7,6 9,3 7,3 7,9
Medie (Total) 85 11,10 11,17 12,86 10,86 11,49
Incarcatura UVM /ha 4 4 4 1,5 *
ProducŃia de lapte pe 85 zile 3774 3798 4372 1629 *

ProducŃia cea mai ridicată s-a înregistrat în varianta D şi anume 4372 l/ha urmată
de celelalte două variante AC şi B.
FaŃă de animalele care au păscut în turmă vacile din variantele îmbunătătite au dat
cu 230-268% mai mult lapte, cea ce confirmă eficienŃa măsurilor de îmbunătăŃire.
În ce priveşte conversia furajelor de pajişti în productie de lapte se constată un
consum ridicat de SU şi anume 1,20 kg SU la varianta AC, 1,00 kg SU la var B şi 1,45 kg
US la var D , fiind destul de mari faŃă de alte condiŃii cu climat mai blând.
Aceste experimentări urmează a fi aprofundate pe viitor cu analize mai
amănunŃite asupra calităŃii laptelui în funcŃie de calitatea furajului.
În prezent se fac analize chimice la probele de plantă şi sinteza altor date care se
vor prezenta în etapa următoare a proiectului.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
52
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

C. Activitate II.1.3. – ICDCB Baloteşti


Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregătirea
cadrului experimental.

1. Rezumatul etapei

În vederea aprecierii stării de sănătate a vacilor de lapte, în strânsă legătură cu


modul de furajare (stabulaŃie/păşunat), au fost efectuate teste hematologice şi teste
biochimice serice. Astfel, în perioada de stabulaŃie au fost prelevate şi analizate 13 probe,
iar în perioada de păşunatv14 probe. Probele au provenit de la vacile de lapte din lotul
experimental din Biobaza ICDCB Baloteşti.
Screeningul hematologic a scos în evidenŃă evoluŃia anemiei. Valorile scăzute ale
hematocritului pe toată durata anului au fost atribuite deficitului de aport al unor
microelemente în materiile prime furajere folosite în fermă, de regulă carenŃate în cupru,
cobalt, seleniu. Acest lucru a fost susŃinut şi prin rezultatul examenelor biochimice serice,
care au evidenŃiat nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru.
Testele biochimice serice au indicat, de asemenea, creşterea valorilor ureei serice
în ambele perioade, fapt care a fost pus pe seama unui aport proteic ridicat în raŃie, în
special pe baza furajelor concentrate. Totodată, aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii
renale fără exprimare clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop
energetic sau plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a
ureogenezei.
Valorile scăzute ale glicemiei în perioada de stabulaŃie au indicat deficit energetic
în raŃie.
Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar ş i
hipomagneziemie destul de serioasă. Valorile macroelementelor serice analizate se
corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii.
Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe
toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
53
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

2. Descrierea ştiinŃifică şi tehnică

Păşunatul este o formă superioară şi economică de utilizare a nutreŃurilor verzi de


pe pajiştile naturale şi cultivate. După o perioadă de stabulaŃie prelungită (oct-aprilie), se
are în vedere, pe de o parte, pregătirea animalelor pentru păşunat ca mijloc biologic al
producŃiei, iar pe de altă parte pregătirea şi organizarea păşunilor ca sursă de nutrienŃ i
pentru animale. Dat fiind faptul că este consumată direct, iarba de pe păşune reprezint ă
unul din cele mai economice nutreŃuri, fără cheltuieli de recoltare, transport, depozitare şi
administrare.
Păşunatul, ca mod de furajare, prezintă numeroase avantaje si anume:
• Animalele consumă un furaj de calitate superioară complet (sub aspectul
principiilor nutritive, în funcŃie de compoziŃia botanică şi de raportul dintre
graminee şi leguminoase) şi uşor de asimilat.
• Prin păşunat se asigură mişcarea în aer liber, iar expunerea la acŃiunea directă a
razelor solare duce la o fortificare a organismului, la o consolidare a scheletului ş i
un metabolism mai activ.
• Prin mişcarea la păşune se realizează aşa numitul mecanism al copitei,
producându-se uzura (tocirea) fiziologică a ongloanelor.
• FuncŃia de reproducŃie este stimulată, căldurile sunt evidente, ciclul sexual şi
gestaŃia se desfăşoară normal.
Odată cu scăderea temperaturii mediului şi epuizarea surselor de masă verde de pe
păşune este necesară protejarea, pe o perioadă de câteva luni, a vacilor în adăposturi. În
perioada de stabulaŃie, taurinele sunt întreŃinute în adăposturi închise, cu acces
permanent la furaj, la apă, sare, loc de odihnă şi loc de mişcare, asigurându-se toŃi
parametrii determinanŃi ai stării de bine a animalelor.

3. Evaluarea stării de sănătate a animalelor din loturi experimentale

3.1. Materiale si metode


Pentru aprecierea stării de sănătate a animalelor din loturile experimentale din
Biobaza ICDCB Baloteşti au fost efectuate teste hematologice şi teste biochimice serice,
în raport cu modul de furajare (stabulaŃie/păşunat).

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
54
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

3.1.1. EXAMENE HEMATOLOGICE


Pentru efectuarea examenelelor hematologice, animalele au fost supuse
prelevărilor de probe de sânge, prin puncŃia venei jugulare, la 2 - 4 ore după furajarea de
dimineaŃă. Cantitatea de sânge recoltată pentru examenul hematologic a fost de 1 - 2 ml
pentru fiecare probă. Probele au fost recoltate în tuburi conŃinând anticoagulant -
Na2EDTA. După recoltare acestea au fost imediat refrigerate la + 40C.
Parametrii hematologici urmăriŃi în timpul analizelor au fost următorii: numărul
de eritrocite (mil/mm3), numărul de leucocite (mii/mm3), concentraŃia de hemoglobină
(g/dl), concentraŃia de hematocrit (%), precum şi formula leucocitară – conŃinutul
procentual de limfocite, monocite şi neutrofile totale.
Ca tehnică analitică s-a folosit analizorul automat ABACUS JUNIOR VET 5,
destinat diagnosticului in vitro.

3.1.2. EXAMENE BIOCHIMICE SERICE


Recoltarea probelor pentru examenul biochimic seric s-a făcut în eprubete
obişnuite, în condiŃii de sterilitate. Pentru efectuarea examenului biochimic a fost
prelevată o cantitate de sânge de aproximativ 12 ml. După recoltare, probele de sânge au
fost Ńinute la temperatura camerei (aproximativ 22 - 240C), până la exprimarea serului,
după care s-au decolat. Serul a fost separat de coagul, a fost centrifugat şi păstrat la
temperatura de refrigerare (+40C) sau la congelator cel mult 48 de ore, până la examinare.
Parametri biochimici serici urmăriŃi pe timpul analizelor, au fost: proteina totală,
albumina, ureea, glucoza, colesterolul total, alanin amino transferaza (TGO), glutamat
piruvat transaminaza (TGP), gama-glutamil transferaza (GGT), fosfataza alcalină, calciul
(Ca), fosforul (P), magneziul (Mg), fierul (Fe), cuprul (Cu), seleniul (Se).
Marea majotitate a parametrilor biochimici (exceptând fier, cupru şi selsniu) au
fost determinaŃi cu analizorul STARDUST MC 15, un spectrofotometru echipat cu
microprocesor, destinat testelor specifice de biochimie clinică. Aceştia au fost analizaŃ i
cu ajutorul kit-urilor dedicate, truse de reactivi produse de firma DiaSys. Controlul
preciziei analizelor s-a făcut prin control intern, folosindu-se în acest scop, ca material de
referinŃă, sânge de control furnizat de firma DiaSys. ConŃinutul seric de fier şi cupru a
fost determinat prin spectrofotometrie de absorbŃie atomică cu flacără, iar cel de seleniu
prin metoda fluorimetrică cu 2,3 diaminonaftalină.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
55
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

3.1.3. Prelucrarea şi interpretarea analizelor


După efectuarea analizelor s-au calculat principalele mărimi caracteristice :
valoarea medie (X), deviaŃia standard (ds), coeficientul de variabilitate (CV). Aceste
mărimi statistice au fost folosite pentru evaluarea şi compararea rezultatelor analitice
obŃinute.

3.2. Rezultate şi discuŃii


În vederea aprecierii stării de sănătate a vacilor de lapte în perioada de stabulaŃie,
în luna februarie au fost recoltate 6 probe de sânge pe anticoagulant şi 6 probe de sânge
pentru prelevarea de ser sanguin. În urma efectuării examenului hematologic s-au obŃinut
valorile redate în tabelul nr.1. Se observă că hematocritul a avut concentraŃii sub limitele
de referinŃă la 5 probe din 6, ceea ce reprezintă un procent de 83,33%.
În ceea ce priveşte examenele biochimice serice, valorile individuale ale profilului
proteic şi energetic sunt prezentate în tabelul nr. 2. Din datele astfel prezentate, se poate
constata că proteina serică totală s-a situat sub limitele de referinŃă la 2 din cele 6 probe
analizate, ureea a fost crescută la 4 probe, glicemia s-a situat sub valorile normale la 3
probe, o singură probă fiind peste limitele de referinŃă, iar colesterolul a fost scăzut în
raport cu lumitele de referinŃă la o singură probă. Albumina serică s-a situat în limite
normale.
Tabelul 1. Rezultatul examenului hematologic efectuat la 6 de probe de sânge prelevate
de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1) – valori individuale.
Nr crt Nr Hemoglobi Hematocr Nr. Formula leucocitară (%)
eritrocite nă it Leucocite Limfoci Monocit Neutrofile
(mil/mm3) (g/dL) (%) (mii/mm3) te e totale
1 6.56 11.60 29.08 14.47 31.8 0.6 67.6
2 6.40 11.30 32.41 8.65 55.1 0.8 44.1
3 6.05 11.50 28.99 8.73 58.3 0.6 41.1
4 6.67 10.40 25.11 9.34 53.7 0.6 45.7
5 6.27 10.70 27.44 5.52 69.4 1.2 29.4
6 5.37 9.8 23.16 9.84 53.7 9.4 36.9
X 6.22 10.88 27.70 9.43 53.67 2.20 44.13
ds 0.47 0.71 3.26 2.90 12.24 3.53 12.90
CV, % 7.56 6.51 11.77 30.74 22.81 160.68 29.22
Valori de 5.0-8.0 9.0-11.0 32-38 6.5-9.5 45-61 0-1 15-41
referinŃă

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
56
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabelul 2. Rezultatul examenului biochimic seric (profil proteic şi energetic) efectuat la


6 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1) – valori
individuale

Nr. crt Proteine Albumină Uree Glicemie Colesterol


totale (g/dl) (mg/dl) (mg/dl) total
(g/dl) (mg/dl)
1. 7.76 3.3 50 69.87 88
2. 6.44 3.7 35 42.03 117
3. 7.10 3.4 37 28.17 130
4. 7.47 3.4 59 72.39 137
5. 8.19 3.2 55 40.08 141
6 6.24 3.7 47 82.41 125
X 7.20 3.45 47.17 55.83 123.00
ds 0.76 0.21 9.60 21.82 19.15
CV, % 10.53 6.01 20.35 39.09 15.57
Valori de 7 - 8,2 3,04-3,84 20-40 48-72 124-224
referinŃă

În ceea ce priveşte profilul enzimatic, valorile individuale obŃinute sunt prezentate în


tabelul 3.
Valorile enzimelor serice în perioada de stabulaŃie s-au prezentat astfel: TGO şi
fosfataza alcalină au fost crescute la toate cele 6 probe analizate; GGT a înregistrat valori
crescute la 50% din cazuri; TGP a fost în limitele de referinŃă la toate cele şase probe
analizate.
Valorile individuale ale macro şi microelementelor în serul sanguin sunt trecute în
tabelul 4. Din datele experimentale astfel obŃinute se constată urmatoarele: calciul ş i
fosforul s-au situat în limitele de referinŃă la toate probele; magneziul a fost scăzut la
două probe; fierul a fost crescut peste valorile de referinŃă la două probe; cuprul s-a situat
sub limita minimă de referinŃă la 3 probe din 6; seleniul s-a situat sub valoarea minimă de
referinŃă la toate probele.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
57
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabelul 3. Rezultatul examenului biochimic seric (profil enzimatic) efectuat la 6


de probe de
sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1) – valori
individuale
Nr. crt TGO TGP Fosfataza GGT
(U/L) (U/L) alcalină (U/L)
(U/L)
1. 45.5 19.2 81.1 21
2. 52.3 33.3 80.3 22
3. 70.9 32.6 116.4 19
4. 56.7 38.9 103.5 28
5. 68.1 37.3 51.3 27
6. 55.3 55.1 140.4 24
X 58.13 36.07 95.50 23.50
ds 9.65 11.63 31.33 3.51
CV, % 16.61 32.24 32.81 14.92
Valori de referinŃă 19-39 < 60 10-36 13-23

Tabelul 4. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 6 de


probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1)
– valori individuale
Nr. crt Calciu Fosfor Magneziu Fier Cupru Seleniu
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (ppm)
1. 9.3 6.76 2.22 137.58 81.01 0.01
2. 9.6 6.05 1.79 207.73 80.45 0.02
3. 8.8 5.29 1.98 122.19 72.86 0.03
4. 9.3 6.28 2.12 158.25 75.12 0.009
5. 9.0 6.60 2.66 140.72 68.78 0.03
6. 10.0 5.70 2.51 115.23 73.63 0.01
X 9.33 6.11 2.21 146.95 75.31 0.02
ds 0.43 0.55 0.33 33.37 4.70 0.01
CV, % 4.58 9.06 14.71 22.71 6.24 55.09
Valori de 8-11 5-7,2 2,1-2,8 100-164 75-97 0.04-0.10
referinŃă

La sfârşitul perioadei de stabulaŃie a fost efectuat un nou test privind starea de


sănătate a animalelor din lotul experimental. Astfel, la începutul lunii aprilie au fost
recoltate 7 probe de sânge integral. Rezultatele obŃinute in urma examenului hematologic
sunt prezentate in tabelul nr. 5.
Se observă că şi în acest caz hematocritul s-a situat sub limitele de referinŃă la
toate probele analizate, iar formula leucocitară a evidenŃiat valori crescute ale limfocitelor
şi monocitelor la 4 din cele 7 probe testate.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
58
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Examenul biochimic de profil proteic şi energetic efectuat la sfârşitul perioadei de


stabulaŃie a condus la valorile prezentate în tabelul 6.
Se observă că albumina a înregistrat valori depăşite în raport cu limita maximă
admisă la marea majoritate a probelor, în timp ce glicemia a fost scăzută la 5 din cele 7
probe analizate. Proteinele totale, ureea serică (cu o singură excepŃie când s-a depăşit
valoarea maximă admisă) şi colesterolul total (exceptând o depăşire a valorii maxime
admise), s-au situat în limitele de referinŃă.
Tabelul 5. Rezultatul examenului hematologic efectuat la 7 de probe de sânge prelevate
de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) – valori individuale.
Nr crt Nr eritrocite Hemoglobin Hematocri Nr. Formula leucocitară (%)
(mil/mm3) ă t Leucocite Limfocit Monocit Neutrofil
(g/dL) (%) (mii/mm3) e e totale
1 6.86 11.3 29.98 11.72 44.8 9.9 45.4
2 6.50 10.6 28.06 8.01 71.1 1.0 27.9
3 6.29 10.3 26.45 7.15 38.6 10.4 51.0
4 5.86 9.3 23.75 10.14 76.2 0.8 22.9
5 5.96 8.2 22.23 8.06 68.3 1.2 30.5
6 5.56 9.1 23.94 7.04 58.6 1.2 40.2
7 5.72 9.5 26.93 6.67 72.6 0.8 26.6
X 6.11 9.76 25.91 8.40 61.46 3.61 34.93
ds 0.46 1.04 2.73 1.86 14.66 4.47 10.64
CV, % 7.58 10.68 10.53 22.13 23.85 123.68 30.45
Valori de 5.0-8.0 9.0-11.0 32-38 6.5-9.5 45-61 0-1 15-41
referinŃă

Tabelul 6. Rezultatul examenului biochimic seric (profil proteic şi energetic) efectuat la


7 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) –
valori individuale
Nr. crt Proteine totale Albumină Uree Glicemie Colesterol
(g/dl) (g/dl) (mg/dl) (mg/dl) total
(mg/dl)
1. 7.20 4.46 27.35 61.77 150.0
2. 7.37 3.97 44.38 68.43 259.0
3. 7.48 4.61 30.72 22.82 203.2
4. 7.25 4.12 27.06 24.16 221.9
5. 7.83 4.25 27.76 34.62 192.2
6 7.25 3.81 28.64 33.42 191.0
7 7.20 4.39 32.16 29.62 144.5
X 7.37 4.23 31.15 39.26 194.54
ds 0.23 0.28 6.13 18.28 39.76
CV, % 3.09 6.68 19.67 46.55 20.44
Valori de referinŃă 7 - 8,2 3,04-3,84 20-40 48-72 124-224
În ceea ce priveşte profilul enzimatic, valorile individuale obŃinute sunt prezentate în
tabelul 7.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
59
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Valorile enzimelor serice la sfârşitul perioadei de stabulaŃie se prezintă astfel:


TGO şi fosfataza alcalină au fost crescute la toate probele analizate; GGT a depăşit limita
maximă admisă la 4 probe; TGP a fost în limitele de referinŃă la toate cele 7 probe
analizate.
Valorile individuale ale macro şi microelementelor în serul sanguin sunt trecute în
tabelul 8.
Valorile unor minerale serice au evidenŃiat uşoară hipofosforemie, hipocuproză la
4 din 7 cazuri investigate, precum şi hipomagneziemie şi hiposelenoză în proporŃie de
100%.
Tabelul 7. Rezultatul examenului biochimic seric (profil enzimatic) efectuat la 7 de
probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) – valori
individuale
Nr. crt TGO TGP Fosfataza GGT
(U/L) (U/L) alcalină (U/L)
(U/L)
1. 69.0 20 69.7 24
2. 62.0 17 193.5 23
3. 60.0 24 92.1 20
4. 52.0 25 114.3 25
5. 56.0 24 83.2 21
6. 42.0 23 110.60 24
7 49.0 21 111.0 24
X 55.71 22.00 110.63 23.00
ds 8.96 2.83 43.94 1.83
CV, % 16.08 12.86 39.71 7.94
Valori de referinŃă 19-39 < 60 10-36 13-23

Tabelul 8. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 7 de


probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) –
valori individuale
Nr. crt Calciu Fosfor Magneziu Fier Cupru Seleniu
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (ppm)
1. 8.9 3.8 1.69 160.13 80.29 0.013
2. 9.0 5.5 1.77 181.12 79.9 0.016
3. 9.0 5.8 1.60 147.63 69.23 0.016
4. 8.9 6.1 1.49 133.44 59.84 0.010
5. 8.5 4.9 1.49 192.59 68.07 0.014
6. 9.2 4.9 1.95 146.49 60.73 0.013
7. 9.0 5.3 1.68 108.83 78.02 0.016
X 8.93 5.19 1.67 152.89 70.87 0.01
ds 0.21 0.75 0.16 28.32 8.72 0.00
CV, % 2.39 14.53 9.75 18.53 12.31 15.97
Valori de 8-11 5-7,2 2,1-2,8 100-164 75-97 0.04-0.10
referinŃă
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
60
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

În perioada de hrănire cu furaje de pe păşune s-au recoltat probe de sânge integral


de la un număr de 14 vaci de lapte. Testele de laborator au evidenŃiat, ca şi la celelalte
investigaŃii, valori sc ă zute ale concentraŃ iei de hematocrit în propor Ń ie de
90,61%, dar ş i cre ş teri ale conŃinutului de leucocite în proporŃie destul de mare –
71,43%. Formula leucocitară a scos în evidenŃă cazuri de creşteri ale neutrofilelor (9 din
14 cazuri), ale monocitelor (3 din 14 cazuri) şi ale limfocitelor (3 din 14 cazuri), dar ş i
valori scăzute ale limfocitelor (4 din 14 cazuri).

Datele examenelor de profil proteic şi energetic obŃinute la acelaşi grup de vaci


lactante sunt prezentate în tabelul nr. 10.

Din examinarea valorilor experimentale astfel obŃinute se observă creşterea


valorilor proteinelor serice totale într-o proporŃie destul de mare – 85,72%.

Tabelul 9. Rezultatul examenului hematologic efectuat la 14 de probe de sânge prelevate


de la vaci lactante în perioada de pasunat – valori individuale.
Nr crt Nr Hemoglobi Hemato Nr. Formula leucocitară (%)
eritrocite nă crit Leucocite Limfo Mono Neutrofile
(mil/mm3) (g/dL) (%) (mii/mm3) cite cite segmentate
1 5,56 9,1 24,61 13,45 35,8 1,1 63,1
2 5,71 9,5 25,98 13,81 42,9 0,9 56,1
3 5,86 9,1 24,65 6,36 66,5 1,0 32,6
4 5,46 9,5 24,95 10,36 55,5 1,0 43,6
5 6,64 9,8 26,80 11,12 57,3 1,0 41,6
6 6,23 8,9 25,01 10,34 68,8 0,9 30,3
7 7,31 12,7 33,83 5,89 52,2 8,9 38,9
8 5,78 8,3 23,64 12,79 38,8 9,4 51,8
9 5,69 8,5 23,01 16,60 46,4 0,6 52,9
10 5,69 8,5 23,01 16,60 46,4 0,6 52,9
11 6,85 10,5 28,60 11,68 47,4 1,0 51,6
12 5,92 9,5 28,03 7,73 71,7 1,1 27,3
13 5,03 7,8 21,91 9,68 43,2 9,6 47,3
14 6,84 10,9 29,23 10,72 63,8 1,0 35,2
X 5.97 9.14 25.35 12.26 51.10 3.33 45.57
ds 0.66 1.18 3.12 3.36 11.95 4.22 10.22
CV, % 11.05 12.94 12.32 27.43 23.39 126.81 22.43
Valori de 5.0-8.0 9.0-11.0 32-38 6.5-9.5 45-61 0-1 15-41
referinŃă

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
61
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabelul 10. Rezultatul examenului biochimic seric (profil proteic şi energetic) efectuat
la 14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada
de păşunat – valori individuale
Nr. crt Proteine totale Albumină Uree Glicemie Colesterol
(g/dl) (g/dl) (mg/dl) (mg/dl) total
(mg/dl)
1. 4.1 3.4 40 60.2 244.7
2. 9.3 3.0 27 74.23 344.7
3. 4.3 2.9 32 53.22 297.9
4. 10.5 2.9 44 50.80 224.3
5. 8.8 3.7 37 51.62 294.8
6. 8.4 3.5 142 46.81 316.8
7. 9.9 3.4 34 60.80 225.8
8. 9.9 3.1 45 82.70 389.5
9. 9.4 3.8 61 74.60 240.1
10. 9.3 3.5 53 43.71 246.8
11. 9.6 3.5 44 79.82 238.3
12. 10.2 2.8 32 64.54 262.2
13. 8.5 4.2 51 60.21 249.9
14. 10.3 4.3 70 58.74 223.4
X 9.60 3.60 50.86 66.33 264.31
ds 0.62 0.55 12.32 13.71 56.46
CV, % 6.42 15.21 24.23 20.67 21.36
Valori de referinŃă 7 - 8,2 3,04-3,84 20-40 48-72 124-224

De asemenea, ureea serică a depăşit maxima admisă la 57,14% din probe, iar
colesterolul total a excedat valoarea maximă admisă în proporŃie de 100%. ConŃinutul
seric de albumină şi glucoză a oscilat, înregistrându-se atât cazuri cu deficit de
biocomponente (3, respectiv 2 cazuri din 14), cât şi cazuri de depăşiri ale pagului maxim
admis (2, respectiv 3 cazuri din 14 investigate).
Profilul enzimatic a fost caracterizat prin valorile individuale prezentate în tabelul
11 şi care au evidenŃiat valori crescute ale activităŃii TGO la toate probele analizate, dar şi
ale fosfatazei alcaline în proporŃie de 50%. Activitatea TGP a fost în limite normale.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
62
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabelul 11. Rezultatul examenului biochimic seric (profil enzimatic) efectuat la


14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de
păşunat – valori individuale
Nr. crt TGO TGP Fosfataza
(U/L) (U/L) alcalină
(U/L)
1. 70 24 46
2. 107 25 46
3. 88 17 46
4. 90 31 44
5. 71 31 32
6. 44 31 24
7. 95 31 47
8. 79 25 33
9. 85 32 26
10. 78 29 24
11. 114 35 18
12. 92 27 37
13. 106 29 35
14. 99 34 84
X 93.29 30.14 36.71
ds 13.73 3.67 21.91
CV, % 14.72 12.18 59.67
Valori de referinŃă 19-39 < 60 10-36

Valorile individuale ale macro şi microelementelor în serul sanguin sunt trecute în


tabelul 12.
În acest caz s-au obŃinut frecvente deficienŃe de calciu (42,86% din probe),
magneziu (64,29% din probe), cupru (57,14% din probe), si în mod special seleniu, unde
deficitul a fost de 100%.

4. Concluzii

InvestigaŃiile de laborator astfel efectuate au permis ca pe baza screeningului


hematologic să poată fi diagnosticate o serie de tulburări metabolice (subclinice) între
care amintim îndeosebi anemia. Valorile semnificativ scăzute ale hematocritului (tabel 1,
5 şi 9) pot fi atribuite deficienŃei de aport al unor microelemente în materiile prime
furajere folosite, de regulă carenŃate în fier, cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a fost

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
63
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

demonstrat şi prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evidenŃiat nivele


scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru.
Creşterea valorilor ureei serice indică aport proteic ridicat în raŃie, în special pe seama
furajelor concentrate. Aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii renale fără exprimare
clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop energetic sau plastic,
catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a ureogenezei.

Tabelul 12. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 14 de


probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de păşunat – valori
individuale
Nr. crt Calciu Fosfor Magneziu Fier Cupru Seleniu
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (ppm)
1. 7.2 5.9 2.17 211.46 80.60 0.010
2. 8.9 5.1 1.68 176.56 79.10 0.008
3. 8.1 5.5 1.84 137.50 71.14 0.010
4. 7.8 6.7 1.57 133.11 68.66 0.012
5. 7.9 8.3 1.60 200.17 66.17 0.008
6. 7.9 5.0 2.0 116.21 63.18 0.013
7. 8.5 4.8 1.95 126.96 76.62 0.009
8. 8.2 6.0 1.87 129.31 81.09 0.016
9. 6.5 6.8 1.87 165.52 61.43 0.013
10. 9.2 5.0 2.07 117.55 61.90 0.022
11. 8.1 6.0 2.34 106.74 57.62 0.020
12. 9.5 7.3 2.41 107.91 61.76 0.015
13. 8.8 5.4 2.29 211.46 80.60 0.021
14. 7.5 3.7 1.88 176.56 79.10 0.024
X 8.26 5.74 2.10 145.01 69.07 0.02
ds 1.03 1.19 0.24 40.15 10.59 0.00
CV, % 12.52 20.75 11.39 27.69 15.33 21.75
Valori de referinŃă 8-11 5-7,2 2,1-2,8 100-164 75-97 0.04-0.10

Valorile scăzute ale glicemiei indică deficit energetic, în special la vacile aflate în
perioada de stabulaŃie. În timpul lactaŃiei, vacile au nevoie cu 40-60% mai multă energie
decât în perioada de repaus mamar. Dacă lactaŃia se realizează în timpul sezonului rece,
capacitatea vacii de a-şi menŃine condiŃia corporală şi de continua să producă lapte va fi
serios compromisă dacă nivelul de energie din raŃie nu este suficient. Ca regulă generală,
pentru fiecare scădere a temperaturii cu 10°C sub pragul de -20°C, vacile vor avea
nevoie, în plus, de 4-6 Mcal energie digestibilă pe zi. Vara, consumul nutreŃului verde

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
64
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

prin păşunat are o influenŃă favorabilă asupra rezistenŃei organice, asupra sănătăŃii ş i
productivităŃii, datorită acŃiunii favorabile a mişcării, razelor solare şi a aerului curat.
Creşterea colesterolemiei indică stări de suprasolicitare.
Modificările activităŃii unor enzime serice TGO, Pal, GGT indică evoluŃia la vaci a
unor organopatii, cum ar fi hepatopatii (creşterea activităŃii TGO), osteoartropatii
evolutive (creşterea activităŃii Pal) (tabel 3, 7 şi 11).
Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar ş i
hipomagneziemie destul de serioasă (tabel 4, 8 şi 12). Valorile macroelementelor serice
analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii.
Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe
toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană.
Erorile de alimentaŃie determină afecŃiuni metabolice şi funcŃionale. Acestea se
înregistrează cu precădere in perioada de repaus mamar, cit şi in perioada de început de
lactaŃie. Pe ansamblu, erorile alimentare provoacă nu numai stare de boala, determinând
şi scăderea producŃiei de lapte.

CarenŃele alimentare prelungite duc la modificări metabolice importante ale


proteinelor, lipidelor şi în dinamica hormonală, ducând în cele din urmă la sindrom de
infecunditate şi sterilitate, boli ale oaselor. Toate aceste tulburări nutriŃionale pot fi
prevenite prin adoptarea unei strategii raŃionale în hrănirea bovinelor, respectiv
respectarea cerinŃelor nutriŃionale în funcŃie de starea fiziologică a animalului, de anotimp
(furajele de sezon), vârsta animalului şi zona geografică.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
65
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

D. Activitate II.1.4. – IBA Bucuresti


Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizată pentru selectarea ş i
determinarea markerilor biochimici - Cercetări preliminare documentare privind
dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau
carotenoizi sau terpene) în produsele lactate.

REZUMATUL ETAPEI DE EXECUłIE


Prezentul referat prezintă rezultatele obŃinute în cadrul etapei nr. 2/ termen de predare
15.12.2009, al cărui obiectiv general are titlul ” Cercetări preliminare privind elaborarea
modelelor experimentale în vederea identificării markerilor biochimici regionali care determină
specificitatea regională a laptelui.” Rezultatele prezentate se referă strict la activitatea II.1
realizată de partenerul P4 (Institutul de Bioresurse Alimentare), din consorŃiul proiectului
finanŃat prin contractul de finanŃare 52-117/ 1.10.2008.

Titlul activităŃii II.1/ P4:


Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizată pentru selectarea şi determinarea
markerilor biochimici.

Prezentul raport este organizat în 4 capitole, după cum urmează:

Capitolul 1 - Caracterizarea generală a markerilor biochimici de tip carotenoizi


Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea
referinŃelor bibliografice, legate de modele experimentale utilizate în identificarea markerilor
biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de la furaje la lapte şi
produse lactate, obŃinute din lapte de vacă. In acest sens, în capitolul 1 s-a realizat un studiu de
documentare privind caracterizarea, din punct de vedere biochimic, a markerilor biochimici de tip
carotenoizi, analiza criteriilor de clasificare a tipurilor de carotenoizi şi, nu în ultimul rând,
importanŃa carotenoizilor în sănătatea oamenilor.
Datele bibliografice menŃionează că au fost identificaŃi peste 600 de carotenoizi naturali
şi se poate estima că natura produce anual peste 100 de milioane de astfel de pigmenŃi. Cei mai
răspândiŃi pigmenŃi cu această structură sunt: fucoxantina (alge marine), luteina (plante ierboase),
β-carotenul, licopina, violaxantina şi apocarotenoidele (compuşi cu mai puŃin de 40 de atomi de
carbon în moleculă).
In plus, au fost analizate implicaŃiile carotenoizilor asupra produselor lactate, din punct de
vedere nutriŃional şi senzorial şi faptul că pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri pentru
managementului trasabilităŃii creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă
(ex. lapte de vacă, lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliŃă). Carotenoizii din laptele de vacă
sunt, în special, toŃi β-carotenii trans, şi la o concentraŃie mai mică, luteina.
Carotenoizii determină culoarea portocalie la fructe şi legume (exemplu: morcov, cartofi
dulci şi pepenele galben), la frunzele uscate şi, în concentraŃie redusă, determină nuanŃele de
galben la alimente de origine animala precum smântână, unt şi gălbenuş de ou.
Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de carotenoizi,
sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a trasabilităŃii
condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte permite un control eficient al
concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate.
Carotenoizii din plante sunt transferaŃi în produsele animale, uneori în concentraŃie mai
mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută, cum ar fi în produsele
rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a stratului adipos.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
66
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de
la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńări
europene, are conotaŃii de hrană „naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi ca indicatori ai
păşunatului verde.
Din punct de vedere al factorilor care afectează compoziŃia carotenoizilor în alimente,
studiile arată că alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de vedere al
conŃinutului de carotenoizi. ProporŃiile relative ale acestor carotenoizi sunt destul de constante,
dar concentraŃiile absolute variază considerabil. Pot fi deosebite opt modele principale privind
nivelele de carotenoizi în diferite resurse alimentare.

Capitol 2 - Identificarea markerilor biochimici în diverse tipuri de furaje


In acest capitol s-a analizat stadiul cercetărilor privind existenŃa carotenoizilor în diverse
tipuri de furaje proaspete şi conservate/ concentrate; diversitatea carotenoizilor în furaje şi
metodele de determinare disponibile si adecvate. În ciuda faptului că există o mare varietate de
carotenoizi în plante, în furaje nu se găsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importanŃi, din
punct de vedere cantitativ, sunt β-carotenii şi luteina. Ca urmare a interesului limitat pentru
conŃinutul de carotenoizi în dieta rumegătoarelor, analizele chimice sunt, de obicei, nespecifice şi
privesc „carotenul”, care este un amestec de mai multe molecule şi izomeri. Au fost realizate o
serie de experimente, în care s-a determinat concentraŃia de luteină sau xantofilii totali. Nu au fost
determinate experimental alte molecule deoarece metodele de analiză nu au fost optimizate, fiind
dezvoltate pentru alte matrici (cum ar fi laptele sau sângele) sau pentru alimentele oamenilor.
Până acum, metodele adecvate pentru furaje au inclus metode care necesitau un consum foarte
mare de timp (folosind TLC [Thin Layer Chromatography- Cromatografie în strat subŃire]). In
ultima perioadă au fost puse la punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure
Liquid Chromatography).

Capitol 3 - Digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor


Capitolul 3 a fost concentrat pe aspecte legate de digestia, absorbŃia şi
metabolizarea carotenoizilor, procese deosebit de importante în stabilirea modelului
conceptual de determinare a markerilor biochimici specifici pentru caracteristicile
regionale a produselor lactate. Numeroase date arată faptul că există o dependenŃă a
concentraŃiei de carotenoizi din laptele de vacă faŃă de natura şi cantitatea de suplimente
dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj, precum şi prin transferul acestora din
matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea scăzută a carotenoizilor din
lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer şi se estimează că etapele diferite
de transfer ale carotenoizilor, din hrană în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în
glandele mamare.
Prima etapă în procesul de digestie al carotenoizilor îl reprezintă degradarea matricei
vegetale, care eliberează aceste substanŃe în faza lichidă a rumenului. Gradul de degradare al
carotenoizilor în rumen, de către microorganisme, variază în funcŃie de diferite rezultate obŃinute
în modele experimentale in vitro sau in vivo, majoritatea în ceea ce priveşte β-carotenul. Chiar
dacă unii autori nu au raportat nici o degradare a acestora, alŃii au raportat o degradare moderată
sau o dispariŃie totală a β-carotenului. Starea suplimentelor de carotenoizi poate explica
discrepanŃele dintre experimente, deoarece gradele de degradare au fost mai mari în situaŃiile în
care carotenoizii au fost furnizaŃi ca produse purificate faŃă de furnizarea lor sub formă de furaje.
In acest capitol a fost analizată şi influenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra variaŃiei
concentraŃiei de markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte.
Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în
componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul care determină
variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
67
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

MulŃi cercetători au demonstrat că, în afară de aspectele legate de conŃinutul de


substanŃă uscată din brânză, variabilitatea compoziŃională a acesteia în acizi graşi, β-caroten,
xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compoziŃia „laptelui original”.
CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi carotenoizi,
este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compoziŃia biologică, stadiul de maturitate,
modul de conservare etc.), de specia animalului, de rasă, de modul de recoltare a laptelui şi,
bineînŃeles, de stagiul de lactaŃie în care se află animalul.

Capitol 4 - Metode experimentale de determinare a markerilor biochimici


In acest capitol au fost analizate o serie de metode de analiză şi proceduri generale
utilizate în identificarea calitativă şi cantitativă a carotenoizilor. Pentru analiza
carotenoizilor pot fi utilizate diferite metode. Alegerea celei mai adecvate metode este, de
obicei, determinată de tipul de informaŃii necesare a fi obtinuŃe. În general, pigmentul
carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complexă.
Cu toate acestea, este absolut necesară extracŃia eficientă şi respectarea tuturor
protocoalelor analitice.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
68
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CAPITOL 1

1. CARACTERIZAREA GENERALĂ A MARKERILOR


BIOCHIMICI DE TIP CAROTENOIZI

1. 1 Introducere

Termenul „carotenoide” este utilizat pentru o grupă de substanŃe asemănătoare, care au


formula C40H56, şi care sunt sintetizate doar de plante. Carotenul este un pigment fitosintetic, de
culoare portocalie, cu rol extrem de important pentru fotosinteză. Carotenoizii determină culoarea
portocalie la fructe şi legume (exemplu: morcov, cartofi dulci şi pepenele galben), la frunzele
uscate şi, în concentraŃie redusă, determină nuanŃele de galben la alimente de origine animala
precum smântână, unt şi gălbenuş de ou.
Carotenoizii sunt implicaŃi în caracterizarea nutriŃională şi senzorială a produselor lactate şi
pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri pentru managementului trasabilităŃii creşterii animalelor,
de la care se colectează laptele materie primă (ex. lapte de vacă, lapte de oaie, lapte de capră,
lapte de bivoliŃă).
Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea referinŃelor
bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea markerilor biochimici
regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de la furaje la lapte şi produse lactate,
obŃinute din lapte de vacă. Din studiul efectuat s-a constatat că s-au identificat aproape 10
carotenoizi (ex. xantofile, caroten) în furaje, concentraŃia lor variind foarte mult în funcŃie de
stadiul de dezvoltare şi durata conservării acestora. Sensibilitatea β-carotenului în timpul
rumegării variază foarte mult în funcŃie de sursa de hrană. Dintre rumegătoare, doar bovinele
acumulează concentraŃii ridicate de carotenoizi, mai ales β-caroten, cel mai probabil datorită
eficienŃei reduse de sintetiză a vitaminei A în enterocite. Plutirea carotenoizilor în plasmă şi în
Ńesuturile vacilor de lapte, în special abilitatea Ńesutului adipos de a elibera β-caroten, în cazul
animalelor epuizate sau subnutrite, reprezintă aspecte la care cercetarea trebuie să dea un răspuns.
Carotenoizii din laptele de vacă sunt, în special, toŃi β-carotenii trans, şi la o concentraŃie
mai mică, luteina. În lapte concentraŃia variază mai mult în cazul β-carotenului decât pentru
retinol, a cărui concentraŃie plasmatică este bine reglată / adaptată. ConcentraŃia β-carotenului în
lapte depinde de suplimentele dietetice consumate. Animalul şi factorii care Ńin de
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
69
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

hrănirea/alimentaŃia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă). In general, controlul concentraŃiei
de β-caroten din lapte se efectuează prin mecanisme de concentrare/ diluare şi prin eficienŃa
extracŃiei din plasmă. ConcentraŃia de β-caroten din brânză este în strânsă legătură cu concentraŃia
de β-caroten din lapte, având în vedere că în timpul producerii brânzei au loc pierderi importante
de retinol. Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de
carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a
trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte permite un control
eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate [3].
Carotenoizii din plante sunt transferaşi în produsele animale, uneori în concentraŃie mai
mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută, cum ar fi în produsele
rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a stratului adipos.
Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de
la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńări
europene, are conotaŃii de hrană „naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi ca indicatori
ai păşunatului verde.
La rumegătoare, ca şi la alte animale, carotenoizii (mai ales β-carotenul), sunt precursori
ai retinolului (vitamina A). Printre rolurile retinolului la rumegătoare, ca şi la alte mamifere, s-a
studiat intens influenŃa sa asupra reproducerii/ înmulŃirii. O deficienŃă în retinol poate reduce
eficienŃa reproducerii la vacile de lapte, în special prin funcŃionarea defectuoasă a ovarelor şi
frecvenŃa producerii avorturilor. Retinolul este, de asemenea, implicat în mai multe funcŃii vitale,
cum ar fi vederea, creşterea şi fertilitatea masculină. Alături de vitamina E şi de polifenoli,
carotenoizii sunt antioxidanŃi naturali în dietele rumegătoarelor. Aceştia joacă un rol important în
comunicarea celulelor şi funcŃia imunologică, prin protejarea celulelor faŃă de radicalii liberi. S-a
demonstrat capacitatea carotenoizilor şi a retinolului de a reduce mastita/mamita la vacile de
lapte, chiar dacă efectul β-carotenului nu a fost sistematic. Carotenoizii au, de asemenea, un rol
pozitiv asupra fertilităŃii, independent de rolul retinolului. În plus, pe lângă rolul pe care îl au în
sănătatea vacilor, concentraŃii ridicate de carotenoizi în lapte contribuie la o îmbunătăŃire a valorii
nutriŃionale a produselor lactate.
Chiar dacă este evident că, în multe Ńări, aportul de carotenoizi în dieta oamenilor
provine, în mare măsură, din morcovi, precum şi din alte fructe şi vegetale, se estimează că o
concentraŃie mai ridicată este disponibilă în produsele lactate, conferindu-i laptelui o imagine mai
bună în acceptabilitatea consumatorilor. În plus, carotenoizii pot juca un rol şi în stabilirea
componentelor oxidabile din lapte. De asemenea, o concentraŃie mai ridicată de retinol în lapte
poate avea efecte benefice în îmbunătăŃirea aportului de vitamina A la oameni, în zone în care

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
70
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

această deficienŃă este des întâlnită. În ciuda diferitelor roluri benefice ale carotenoizilor, trebuie
acordată atenŃie transferului lor, de la dietă până la laptele de vacă [3].

1. 2 NoŃiuni generale despre markerii biochimici de tip carotenoizi

Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmenŃi vegetali, care
prezintă efecte protectoare atât la nivelul Ńesuturilor vegetale cât şi a celor animale. Carotenoizii
reprezintă un grup de coloranŃi naturali, galbeni, portocalii sau roşii, răspândiŃi, în principal, în
regnul vegetal (în morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya,
mango) şi în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon). Sunt compuşi care au 40 de
atomi de carbon (8 resturi de izopren), cu structură de izoprenoide, rezultaŃi prin unirea “cap-
coadă” a unor unităŃi de izopren.
O caracteristică principală este localizarea centrală a sistemului de duble legături
conjugate, care constituie grupările cromofore. Acestea conferă carotenoizilor proprietatea de a
absorbi radiaŃia luminoasă în domeniul vizibil, fiind baza identificării şi cuantificării lor.
Scheletul de bază poate fi modificat în multe feluri, incluzând ciclizarea, hidrogenarea,
dehidrogenarea, introducerea oxigenului, rearanjarea, micşorarea catenei sau combinarea acesteia,
rezultând o multitudine de structuri.
Din punct de vedere chimic, carotenul este o terpenă, sintetizată biochimic din 8 unităŃi
izopren. Ca hidrocarburi care nu contin oxygen, carotenoizii sunt liposolubili, insolubili în apă, în
contrast cu alŃi carotenoizi, precum xantofilele (care sunt mai puŃin hidrofobe).
β-carotenul este compus din două grupări retinyl, care sunt scindate în mucoasa
intestinului subŃire de β-carotene-dioxigenază, în retinal (o formă de vitamina A). Carotenul se
poate acumula în ficat şi Ńesutul adipos şi poate fi convertit în retinal când este nevoie, care este o
forma de vitamina A pentru oameni şi alte specii de mamifere.
Au fost identificate peste 600 de carotenoizi naturali şi se poate estima că natura produce
anual peste 100 de milioane de astfel de pigmenŃi. Cei mai răspândiŃi pigmenŃi cu această
structură sunt: fucoxantina (alge marine), luteina (plante ierboase), β-carotenul, licopina,
violaxantina şi apocarotenoidele (compuşi cu mai puŃin de 40 de atomi de carbon în moleculă).
Carotenoizii de culoare galbenă şi portocalie sunt cunoscuŃi sub numele de caroten iar cei
de culoare roşie sub numele de licopină. Carotenoizii se comportă ca şi antioxidanŃi, şi unii sunt
precursori ai vitaminei A (din ele se sintetizează vitamina A), de aceea sunt numite provitamine.
Carotenoizii sunt folositi în alimentaŃie pentru colorarea untului, margarinei, cremelor lactate etc.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
71
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Au utilizări numeroase în industria farmaceutică, cosmetică, industria alimentară (ca antioxidanŃi


şi coloranŃi naturali), zootehnie (furajarea animalelor) etc. [7].
Datorită proprietăŃilor lor puternic antioxidante, unii carotenoizi au potenŃial
anticancerigen iar alŃii ajută la protejarea împotriva bolilor cardiovasculare şi a afecŃiunilor
oculare. Privarea organismului animal de hrana care conŃine aceşti pigmenŃi poate duce la
dispariŃia culorii caracteristice. FuncŃia fiziologică a carotenoizilor în plante nu este încă bine
cunoscută dar în organismul animal aceşti pigmenŃi au rol esenŃial prin relaŃiile lor cu vitamina A
şi cu substanŃele de pe retină, importante în procesul vederii.
PigmenŃii carotenoizi intervin în procesul de fotosinteză, având un rol important atât în
absorbŃia energiei luminoase cât şi în protejarea faŃă de autofotodistrugerea moleculelor de
clorofilă sau a altor substanŃe active (citocromi, peroxidaze, catalaze, pigmenŃi flavonoidici,
vitamina B12, vitaminele E, vitaminele K etc.). Deoarece pot fixa oxigenul, formând compuşi
oxigenaŃi puŃin stabili, pigmenŃii carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere. Pot forma
metaboliŃi intermediari care să stimuleze sau să inhibe dezvoltarea plantelor. În organismul
animal, aceşti pigmenŃi îndeplinesc rolul de provitamine A. Sunt importanŃi, de asemenea, pentru
acŃiunea ce o pot avea în fototropii şi fotoaxii [8].

1.2.1 Tipuri de carotenoide


Cei mai mulŃi carotenoizi au structuri compuse din 40 atomi de carbon şi se împart în:
Hidrocarburi carotenoidice
Cel mai cunoscut este α-carotenul, care se găseşte alături de clorofilă în plantele verzi, utilizat
drept colorant alimentar, sub numele de Natural Yellow sau licopină. Se găseşte în tomate şi în
ficat.

α-caroten
α-carotenul este o substanŃă cristalină de culoarea cuprului, solubilă în solvenŃii organici.
Prin încălzire, α-carotenul este posibil să se transforme în β-caroten. În plante se găseşte în
cantităŃi mai mici decât β-carotenul.
β-carotenul se prezintă sub formă de cristale violete, de asemenea solubile în solvenŃii
organici. Este foarte răspândit în tot regnul vegetal, însoŃind permanent clorofila. Prin hidroliză
enzimatică oxidativă, β-carotenul se transformă în două molecule de vitamină A1.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
72
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

γ-carotenul se prezintă sub formă de cristale roşii cu reflexe albastre, solubile în solvenŃi
organici. γ-carotenul este puŃin răspândit în regnul vegetal, însă, în morcov se găseşte în
cantitatea cea mai ridicată.
Licopina (E160d) este o substanŃă cristalină, de culoare roşu-violet, insolubilă în apă,
solubilă în solvenŃi organici.

licopina
DerivaŃi oxigenaŃi ai hidrocarburilor carotenoidice (alcooli, epoxizi, cetone)
Sunt cunoscuŃi sub numele de xantofile. Acest termen, introdus de Berzelius, defineşte grupa
alcoolilor cu schelet carotenoidic. Se cunosc mai multe xantofile, dintre care cele mai importante
sunt luteina şi zeaxantina. Luteina este o substanŃă cristalizată de culoare galbenă cu luciu violet,
însoŃeşte β-carotenul şi clorofila în toate plantele verzi. Este colorantul galben al florilor. Se
găseşte, de asemenea, în gălbenuşul de ou şi în Ńesuturile animale. Zeaxantina se prezintă sub
formă de cristale portocalii. Structural se deosebeşte de luteină prin poziŃia unei duble legături (2
cicluri β-ionice).
Dintre cetonele carotenoidice se pot menŃiona rodoxantina, cantaxantina şi astaxantina.
Rodoxantina - dicetonă carotenoidică, este o substanŃă de culoare roşie-albăstruie, răspândită în
plantele acvatice şi în conifere.
Produşii reprezentativi utilizaŃi drept coloranŃi alimentari sunt luteina şi citraurina,
principiul colorat din coaja de portocale.

luteina

citraurina

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
73
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Acizi carboxilici cu mai puŃin de 40 de atomi de carbon în moleculă


Cei mai utilizaŃi din această categorie sunt norbixina, extrasă din planta tropicală Bixa Orellana,
şi crocina, care se găseşte în stigmatele florilor plantei orientale Crocus Sativus (şofran).

norbixina

crocina
Din 1971, majoritatea Ńărilor permit folosirea pigmenŃilor carotenoidici ca pigmenŃi
alimentari pentru colorarea unor produse ca unt, margarină, brânză, îngheŃată, macaroane, frişcă,
gelatină, supe, sucuri de fructe. Compuşii sunt stabili la lumină şi în medii reducătoare şi prezintă
avantajul că sunt compatibili cu alte tipuri de coloranŃi, ceea ce permite nuanŃarea lor.
Datorită solubilităŃii scăzute în grăsimi, pentru mărirea caracterului lipofil, aceştia se
supun esterificării cu acizi graşi. Metodele de realizare a extractelor nu diferă foarte mult, chiar
Ńinând cont de varietatea şi de aria de răspândire în regnul vegetal şi animal. Spre exemplu,
pigmentul galben din cojile de portocale se poate extrage la cald cu eter de petrol. Extractul se
concentrează iar apoi se antrenează carotenoizii cu abur supraîncălzit. FracŃiunea uleioasă
rezultată se extrage din nou cu eter de petrol şi se concentrează rezultând prin răcire pigmentul
care se filtrează şi se usucă [9].

1.2.2 ImportanŃa carotenoizilor în sănătatea oamenilor

Principalii carotenoizi întâlniŃi în alimente sunt:


β-carotenul,
α-carotenul,
β-criptoxantina,
luteina şi
licopenul,
aceştia fiind şi carotenoizii cel mai des întâlniŃi în plasma umană. S-a demonstrat că aceşti
carotenoizi, împreună cu zeaxantina, au efecte benefice asupra sănătăŃii.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
74
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

β-carotenul, α-carotenul şi β-criptoxantina sunt provitamine A. Din punct de vedere


structural, vitamina A (retinolul) reprezintă o jumătate din molecula de β-caroten. În consecinŃă,
β-carotenul este cea mai puternică provitamină A, fiind şi cel mai răspândit. CondiŃia obligatorie
pentru ca un carotenoid să aibă activitate vitaminică A, este existenŃa unui inel β nesubstituit cu o
catenă polienă de 11 carboni. Astfel, α-carotenul şi β-criptoxantina manifestă aproximativ 50%
din activitatea vitaminei A din β-caroten.
Carotenoizii, provitamine A sau nu, au fost consideraŃi a avea efecte benefice asupra sănătăŃii
oamenilor, şi anume sporesc imunitatea şi reduc riscul progresării bolilor degenerescente, cum ar
fi cancerul, bolile cardiovasculare, cataracta şi degenerările maculei. AcŃiunea carotenoizilor
împotriva bolilor a fost atribuită unei proprietăŃi antioxidante, mai precis, abilităŃii lor de a anihila
oxigenul liber şi de a interacŃiona cu radicalii liberi. Au mai fost declarate/raportate şi alte
mecanisme, cum ar fi:
modulaŃia metabolismului carcinogen,
inhibarea înmulŃirii celulelor,
sporirea/intensificarea diferenŃierii celulelor,
stimularea comunicării celulă - celulă (cell - to - cell) şi
filtrarea luminii albastre.
Capacitatea carotenoizilor de a anihila oxigenul liber a fost relaŃionată de sistemul de
legături duble conjugate, eficienŃa maximă fiind dovedită de carotenoide cu 9 sau mai multe
legături duble. Carotenoidul aciclic (licopenul) s-a dovedit a fi mult mai eficient decât β-carotenul
biciclic, în ciuda faptului că ambii compuşi au 11 legături duble conjugate. Efectele licopenului
asupra sănătăŃii oamenilor au stârnit un interes considerabil în ultimii ani, prin efectele puternic
protective impotriva cancerului de plămâni, stomac şi prostată.
Luteina şi zeaxantina realizează pigmentul galben în macula retinei umane. S-a
demonstrat că aportul dietetic sau nivelul plasmatic al acestor carotenoizi au un efect semnificatv
în reducerea riscului de degenerare a maculei, cauza principală a orbirii ireversibile a bătrânilor.
Acesti carotenoizi au fost, de asemenea, asociaŃi cu reducerea riscului de apariŃie a cataractei [5].
1.2.3 Factorii care afectează compoziŃia carotenoizilor

Alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de vedere al conŃinutului de
carotenoizi. Legumele verzi, cu sau fără frunze, au un model/ tipar calitativ de luteină definit, cu
β-caroten, violaxantină şi neoxantină, ca şi carotenoizi principali. ProporŃiile relative ale acestor
carotenoizi sunt destul de constante, dar concentraŃiile absolute variază considerabil. În plus,
legumele verzi conŃin şi carotenoizi mai puŃin importanŃi cum sunt: α-carotenul, α sau β-
criptoxantina, zeaxantina, antheraxantina şi 5, 6-epoxiluteina.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
75
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CompoziŃia carotenoizilor în fructe şi legume este mult mai complexă şi variabilă, cu


variaŃii chiar şi la carotenoizii principali. În general, fructele conŃin mai puŃini carotenoizi
principali, împreună cu o serie de carotenoizi mai puŃin importanŃi, la nivele foarte scăzute.
Pot fi deosebite opt modele principale:
1) nivele nesemnificative de carotenoizi (de ex. în pere);
2) cantităŃi mici, în general, de carotenoizi de tip cloroplaste (de ex. în struguri);
3) cantităŃi considerabile de licopen (de ex. în roşii, pepene verde, guave cu pulpă roşie,
papaya);
4) predominanŃa β-carotenului şi/sau β-criptoxantinei (de ex. în caise, piersici);
5) cantităŃi mari de epoxide (de ex. în mango, carambola);
6) preponderenŃa unor specii de carotenoizi rari (de ex. în ardei iute roşu);
7) cantităŃi substanŃiale de poli-cis-carotenoide (de ex. în roşii cherry);
8) nivele semnificative de apocarotenoide (carotenoizi cu mai puŃin de 40 de atomi de
carbon în moleculă; de ex. în speciile de citrice).
Câteva îmbinări ale acestor modele/structuri sunt întâlnite în câteva fructe. În fructele
coapte, carotenoizii se întâlnesc în cromoplaste, hidroxicarotenoizii fiind esterificati în special cu
acizi graşi.
Carotenoizii predomină în câteva culturi de rădăcinoase carotenogenice (de ex. morcovi,
cartofi dulci) iar xantofilele predomină în porumb (boabe). Pentru o calitate dată alimentelor,
există în special, diferenŃe cantitative, datorită unor factori, ca:
modul de cultivare,
varietatea,
stadiul de maturitate,
clima,
aşezarea geografică a producŃiei,
partea utilizată din plantă,
condiŃiile din timpul producŃiei agricole,
manipularea post-recoltare,
procesarea şi
condiŃiile de depozitare.
Există referinŃe cu privire la diferenŃele, calitative şi cantitative sau numai cantitative, în
ceea
ce priveşte carotenoizii în acelaşi tip de alimente (exemplu: conŃinutul mediu de β-caroten din
cartofii dulci cultivaŃi, variază de exemplu de la 10 la 26,6 µg/100g).

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
76
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Stadiul de maturitate este un factor care afectează în mod decisiv compoziŃia


carotenoizilor. Maturizarea legumelor şi coacerea fructelor sunt, în general, procese însoŃite de
intensificarea carotenogenezei (producere de caroteni). Frunzele tinere sau mature au, în general,
modele calitative similare de carotenoizi, dar au concentraŃii diferite (exemplu: nivelele
concentraŃiilor de carotenoizi în frunzele de lăptucă şi andive cresc de 3 până la 4 ori în timpul
maturizării). În fructe, continutul in carotenoizi creste considerabil, atât ca număr cât şi
cantitativ, pe parcursul procesului de coacere.
Temperatura ridicată şi expunerea îndelungată la soare sporeşte formarea carotenoizilor
în fructe. Astfel, în zonele de climă tropicală este favorizată biosinteza carotenoizilor iar fructele
obŃinute în asemenea zone prezintă concentraŃii superioare distincte de carotenoizi. În mod
similar, legumele frunzoase obŃinute în sere sau în parcele acoperite cu folii de plastic prezintă
concentraŃii mai mari de carotenoizi în timpul verii. În schimb, nivelele carotenoizilor din
legumele frunzoase cultivate în câmp deschis sunt semnificativ mai ridicate iarna decât vara,
sugerând astfel, că fotodegradarea este superioară carotenogenezei. Multe fructe şi legume
prezintă cantităŃi mai ridicate de carotenoiyi în coajă decât în pulpă, excepŃie făcând fructe ca
guavele cu pulpă roz, unde licopenul este mai concentrat în pulpă.
Practicile agricole reprezintă un factor important în influenŃa asupra compoziŃiei
carotenoizilor. Comparând varză recoltată la acelaşi grad de maturitate, produsă la ferme
învecinate, una fiind o fermă naturală iar cealaltă convenŃională, care foloseşte substante chimice
de sinteză agricole, s-au obŃinut concentraŃii semnificativ mai mari pentru toŃi constituenŃii
carotenoizilor în probele de la ferma naturală. În schimb, comparând lăptuca frunzoasă produsă
convenŃional şi lăptuca frunzoasă produsă hidroponic (creşterea plantelor în soluŃii minerale,
fără sol), nu au fost identificate diferenŃe semnificative ale constituenŃilor carotenoizilor [5].
CompoziŃia biologică, stadiul de maturitate şi modul de conservare a furajelor destinate
hrănirii vacilor sunt factori ce influenŃează compoziŃia laptelui în acizi graşi, vitamine şi
carotenoizi.
În afară de factorii biologici, compoziŃia nutriŃională a laptelui depinde de specie, rasă,
cantitatea de lapte recoltată şi de stadiul de lactaŃie al animalelor [1].
1.3 Efectele procesării asupra carotenoizilor

Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este necesară
pentru a minimiza pierderile, pentru a face ca produsele să fie disponibile pe tot parcursul anului,
şi pentru a permite transportarea în alte locuri decât zona de producŃie. Modificarea, reducerea
conŃinutului sau pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării alimentelor poate
avea loc şi prin transportul fizic (ex. decojire neintenŃionată), izomerizarea geometrică sau prin

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
77
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

oxidarea enzimatică sau ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptată spre procesarea
industrială, prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de carotenoizi.
Procentul reŃinut sau pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării
alimentelor au fost studiate în numeroase articole. Oricum, datele obŃinute, sunt adesea
contradictorii şi dificil de interpretat, din următoarele motive:
a) condiŃiile de procesare şi depozitare nu sunt/ sunt doar parŃial descrise;
b) alimente diferite sunt procesate în mod diferit, făcând compararea metodelor de procesare
dificilă;
c) condiŃii diferite (ex. timp şi temperatură) sunt folosite pentru aceeaşi metodă de procesare;
d) procedura urmată pentru calcularea pierderilor de carotenoizi nu este specifică sau calculul
este greşit.
În plus, trebuie avută o grijă deosebită pentru a asigura că orice izomerizare sau oxidare a
carotenoizilor din timpul analizei şi/sau din timpul depozitării probei, anterior analizei, nu este
atribuită eronat procesării sau depozitării alimentelor.
Chiar dacă astfel de date experimentale sunt puŃine, insuficiente şi discrepante, pot fi
conturate unele concluzii:
a) Biosinteza carotenoizilor poate avea loc în fructe, legume, şi în culturile de rădăcinoase,
chiar după recoltare, cu condiŃia ca plantele să fie păstrate intacte, conservând enzimele
responsabile de carotenogeneză. În frunze şi alte legume, degradarea carotenoizilor post-
recoltare poate predomina, în special la temperaturi ridicate de depozitare şi în condiŃii de
favorizare a veştejirii.
b) Carotenoizii sunt protejaŃi în mod natural în Ńesuturile plantei dar procese ca tăierea,
ruperea, lovirea şi decorticarea fructelor şi legumelor sporesc, prin expunerea la acŃiunea
oxigenului, reacŃia de oxidare dintre carotenoizi şi enzime.
c) Stabilitatea carotenoizilor diferă în diferite alimente, chiar şi când sunt folosite aceleaşi
condiŃii de procesare şi depozitare. Astfel, condiŃiile optime pentru reŃinerea
carotenoizilor în timpul procesului de procesare variază de la un aliment la altul.
Carotenoizii ca atare prezintă susceptibilitate diferită la degradare.
d) Principala cauză a distrugerii carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării este
oxidarea enzimatică şi ne-enzimatică. Izomerizarea trans-carotenoizilor în cis-
carotenoizi, în special în timpul tratamentului termic, alterează activitatea şi modifică
culoarea alimentelor, dar nu în aceeaşi măsură ca oxidarea. În multe alimente, degradarea
enzimatică a carotenoizilor poate fi mai accentuată decât descompunerea termică.
e) La prepararea alimentelor în casă, pierderea carotenoizilor are loc în felul următor:
microunde<abur<fierbere<prăjire. Tigaia adâncă, gătirea prelungită, combinarea
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
78
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

preparatelor şi metodelor diferite de gătit, coacerea şi murarea, toate au ca rezultat


pierderea substanŃială a carotenoizilor.
f) Indiferent de metoda de procesare, conŃinutul în carotenoizi descreşte proporŃional cu
timpul de procesare (exemplu: temperatura mare de procesare, tăierea şi transformarea în
pastă a alimentelor). In scopul evitării pierderii carotenoizilor se pot ajusta parametrii de
procesare în sensul scăderii timpului de procesare, temperaturii de preparare, timpului
dintre decojire, tăiere sau transformare în pastă şi procesare. Procesarea rapidă la o
temperatură mare poate fi considerata o alternativă bună în acest scop.
g) Opărirea poate determina pierderi de carotenoizi, iar inactivarea enzimelor oxidative, care
are loc în acest tip de tratament termic, previne pierderea lor viitoare, în timpul folosirii
după procesarea termică, procesarea lentă şi/sau depozitarea.
h) Răcirea (în special răcirea rapidă) şi congelarea sunt procese care, în general, conservă
carotenoizii. In schimb dezgheŃarea lentă poate reduce continutul in carotenoizi.[5].

1.3.1 Efectele tratamentelor termice asupra carotenoizilor din produse lactate

Diferitele referinŃe arată că tratamentele termice din timpul prelucrării laptelui nu au


efecte negative sau determină doar pierderi mici ale carotenoizilor şi retinolului din lapte. S-a
observat că pasteurizarea laptelui (72ºC/30’’) determină pierderea retinolului din grăsimea
laptelui cu de 6%, dar nu se pierd β-carotenul şi luteina. În schimb, în urma pasteurizării are loc
izomerizarea totală a retinolului, care trece din forma trans în forma cis, direct dependentă de
intensitatea tratamentului termic. Panfili şi co., nu au detectat 13-cis-retinol în laptele brut de
vacă, chiar dacă reprezintă 25g/kg din retinolul total din laptele de vacă pasteurizat la temperatură
moderată, şi 57g/kg în laptele pasteurizat timp de 72º-76º/C15’’. In concluzie, laptele supus unui
tratament termic mai sever are un grad de izomerizare mai mare. β-carotenul pare să fie mai puŃin
sensibil decât retinolul la inducerea izomerizării prin temperatură. După o procesarea termică la
80-90ºC/10’, 13-cis-β-carotenul este detectabil cantitativ şi reprezintă doar 10 g/kg din β-carotenii
totali.

1.3.2 Efectul procesului de fabricare a brânzei asupra conŃinutului de carotenoizi

O serie de studii au relevat că în timpul maturării sau păstrării brânzei pe parcursul anului
nu apar modificări sau apar doar modificări minore în ceea ce priveşte concentraŃia de retinol şi
carotenoizi, aşa cum este prezentat în figura 1.1

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
79
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

β-caroten Xantofil
Xantofile Retinol

Brânză µg/g grăsime

Figura 1.1 Legătura dintre compoziŃia în β-caroten, xantofile şi retinol a laptelui şi brânzei

Legenda:
∆ Tomme de Savoaie
■ Abondance
▲ Rocamadour
x Cantal

În schimb, la fabricarea brânzei Gruyere s-a observat că apare o pierdere mare a


retinolului în timpul fierberii laptelui şi a maturării. S-a evaluat rata de transfer a retinolului, β-
carotenului şi xantofilelor din grăsimea din lapte în grăsimea din brânză, Ńinând cont de patru
tehnologii de fabricare a brânzei şi laptelui autentic.
Din figura de mai sus s-a concluzionat că există o valoare medie de 950 g/kg de β-
caroten, dar numai 660 g/kg de retinol şi 640 g/kg de xantofile, prezente iniŃial în grăsimea din
lapte pot fi determinate din grăsimea brânzei. În plus, în ciuda variaŃiei dintre tehnologiile de
fabricare a tipului de brânza studiat (de exemplu temperatura de încălzire, nivelul de acidifiere şi
timpul de maturare), s-a constatat că proporŃiile de retinol şi carotenoizi care se pierd nu variază
în funcŃie de procedeul tehnologic de fabricare al brânzei. Aceste rezultate sugerează că β-
carotenul este foarte stabil, în timp ce retinolul şi xantofilele sunt parŃial degradate şi/sau pierdute
în zer în timpul fabricării brânzei. Kon şi co., au raportat că grăsimea din zer este mai bogată în
carotenoide decât grăsimea din laptele iniŃial (+50%), ceea ce poate fi explicat prin dimensiunea
mică a globulelor de grăsime din zer faŃă de lapte. Sensibilitatea mare a retinolului la foto-
izomerizare urmată de expunerea laptelui la lumină, poate explica pierderea acestei vitamine în
timpul procesului de fabricare a brânzei. Procedeul de fabricare a brânzei, nu duce însă, la o
creştere a proporŃiei de 13-cis-β-caroten, care are o medie de 150 g/kg atât în lapte cât şi în
grăsimea din brânză.[1]

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
80
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CAPITOL 2

IDENTIFICAREA MARKERILOR BIOCHIMICI IN


DIVERSE TIPURI DE FURAJE

2.1 ExistenŃa carotenoizilor în diverse tipuri de furaje


În ciuda faptului că există o mare varietate de carotenoizi în plante, în furaje nu se găsesc
mai mult de 10, dintre care cei mai importanŃi, din punct de vedere cantitativ, sunt β-carotenii şi
luteina. Ca urmare a interesului limitat pentru conŃinutul de carotenoizi în dieta rumegătoarelor,
analizele chimice sunt, de obicei, nespecifice şi privesc „carotenul”, care este un amestec de mai
multe molecule şi izomeri. Au fost realizate o serie de experimente, în care s-a determinat
concentraŃia de luteină sau xantofilii totali. Nu au fost determinate experimental alte molecule
deoarece metodele de analiză nu au fost optimizate, fiind dezvoltate pentru alte matrici (cum ar fi
laptele sau sângele) sau pentru alimentele oamenilor. In această situaŃie este dificilă evitarea
contaminării probei de clorofilă. Până acum, metodele aecvate pentru furaje au inclus metode
care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin Layer Chromatography-
Cromatografie în strat subŃire]). In ultima perioadă au fost puse la punct metode mult mai rapide,
folosind HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Este important să se pună accentul pe
faptul că cele mai multe metode de depozitare a probelor (ex. liofilizarea, îngheŃarea-dezgheŃarea,
refrigerarea), precum şi depozitarea pe termen lung, înaintea analizării, au efect de degradare a
acestor molecule [3].

2.1.1 Diversitatea carotenoizilor

ConcentraŃia de carotenoizi în furaje depinde de sinteza şi de gradul de degradare al


acestora. Sinteza se realizează din unităŃile de izopren din plastide şi are loc, în special, în frunze.
În funcŃie de tipul lor, frunzele conŃin de 5-10 ori mai mulŃi carotenoizi decât tulpina. Degradarea
are loc rapid prin oxidare, în special datorită expunerii la lumină şi la radiaŃia solară. Cu metode
de analiză potrivite, s-a demonstrat că furajele cultivate conŃin patru categorii majore de
carotenoide: luteină, zeaxantină, epiluteină şi toŃi β-carotenii trans. În piciorul cocoşului (Dactylis
glomerata), iarba perenă (Lolium perene) şi trifoiul roşu (Trifolium pratense), proporŃiile de
luteină, zeaxantină, epiluteină şi β-caroten sunt 630, 120, 80 şi respectiv 170 g/kg, proporŃiile
variind foarte puŃin în diferitele specii de furaje. În lucernă au fost detectate neoxantină şi

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
81
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

violaxantină, în timp ce în nutreŃul natural verde au fost detectate violaxantină, anteraxantină şi


13 cis-β caroten. S-au găsit cantităŃi foarte mici de α-caroten în nutreŃul natural verde.

2.1.2 Carotenoizii în furaje proaspete

DiferenŃele concentraŃiilor de carotenoizi din speciile de furaje verzi sunt mai puŃin
semnificative faŃă de diferenŃele acestora din speciile de furaje uscate. Park şi co., au găsit cu
50% mai mulŃi carotenoizi în Bromus (Bromus inermis) şi trestie (Phalaris arundinacea) decât în
Agropyron (Agropyron repens), în timp ce Chauveau-Duriot şi co. au demonstrat că trifoiul roşu
conŃine cu 25% mai multi carotenoizi decât piciorul cocoşului sau iarba perenă. În ierburile
tropicale, Reynoso şi co. nu au găsit nici o diferenŃă în ce priveşte concentraŃiile de β-caroten şi
luteină din iarba de gazon (Cynodom dactylon) şi iarba Pangola (Digitaria decumbens). Pe baza
datelor din literatură şi pe baza datelor nepublicate, este dificil să se tragă o concluzie în ce
priveşte diferenŃele sistematice dintre speciile de iarbă cultivată şi cele de iarbă naturală, sau
dintre iarbă şi legume. Mai mult, fertilizarea cu N creşte concentraŃia de carotenoizi din ierburi şi
legume. Aceasta se poate datora activării biosintezei carotenoizilor de către proteine.
Efectul stadiului de maturitate şi/sau anotimpului asupra conŃinutului de carotenoizi în
furaje rămâne încă un subiect controversat. Prache şi co. au raportat că pe o păşune din FranŃa
concentraŃia totală de carotenoizi a variat foarte puŃin între luna mai şi sfârşitul lunii iunie (650-
700 mg/kg DM), apoi a scăzut la 430 mg/kg DM la începutul lunii august. În FranŃa, în timpul
unei veri foarte secetoase, Calderon şi co. nu au observat o influenŃă a gradului de maturitate în
concentraŃia de carotenoizi din iarba verde naturală pe parcursul lunii iunie. În urma studiilor
efectuate s-a observat că, concentraŃia de carotenoizi scade cu vârsta furajului, indiferent de
sezon, de numărul cositorilor sau de numărul regenerărilor.
ConcentaŃiile de luteină şi β-caroten în furajele verzi sunt de 2-3 ori mai mari pentru
aceeaşi specie de iarbă umedă tropicală, comparativ cu cea uscată. Unii autori au pus acest
rezultat pe seama proporŃiei ridicate de frunze la tropicele umede, dar este foarte probabil ca alŃi
factori, cum ar fi de exemplu temperatura sau radiaŃia solară, să modifice gradul de sinteză al
carotenoizilor.

2.1.3 Carotenoizii în furajele conservate

Uscarea furajelor la soare scade puternic concentraŃia de carotenoizi, în special când


plouă în timpul întoarcerii şi stângerii/adunării fânului cosit. Studiile realizate de Chauveau-
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
82
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Duriot şi co. au arătat că din momentul cosirii fânului şi până în momentul însilozării fânului
uscat se înregistrează o pierdere medie a carotenoizilor de până la 83%, aşa cum este reprezentat
în figura 2.1.

Figura 2.1 Efectele metodelor de conservare a furajelor cultivate, asupra concentraŃiilor de xantofile şi β-
caroten

Legenda:
(□) xantofile
(■) β-caroten
C - piciorul cocoşului (Dactilys glomerata)
PR - iarbă perenă (Lolium perenne)
RC - trifoi roşu (Trifolium pratense)]

Pierderile de luteină şi epiluteină au loc mai lent decât cele de zeaxantină şi caroten.
Această pierdere a carotenoizilor se datorează, în special, radiaŃiilor solare, deoarece prin
expunerea la razele UV pe întuneric poate fi distrusă întreaga cantitate de carotenoizi. Oricum,
pierderi moderate de carotenoizi apar şi în timpul depozitării în interiorul şopronului, probabil
datorită prezenŃei oxigenului.
Independent de veştejire, procesul de însilozare determină scăderea concentraŃiei de
carotenoizi. Pierderile de carotenoizi depind de pH şi sunt favorizate de condiŃiile aerobe. Aceste
pierderi sunt mai mari în cazul legumelor decât în cazul ierbii, când pH-ul este mare (~ 5) şi când
sigilarea silozului este întârziată, crescând proporŃional cu timpul de depozitare. Pierderile
maxime pot ajunge până la 80% din concentraŃia iniŃială, dar în silozurile bine construite
pierderile sunt, în general, mai mici de 20%.
În cazul deshidratării lucernei, rezultă o pierdere a carotenilor şi a xantofilelor, extinderea
pierderii depinzând de proces. Această pierdere este mai mare pentru procesele în care se
foloseşte temperatură mare, în special pentru xantofile, când produsul finit are o concentaŃie mare
a umidităŃii. La o temperatură de 120ºC, şi o umiditate a produsului final de 8%, deshidratarea are
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
83
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

un efect limitat asupra carotenoizilor, cu toate că în condiŃii mai drastice (mai mult de 150ºC, şi
mai puŃin decât 3% umiditate finală) pot rezulta pierderi mai mari de 33% caroteni şi 73%
xantofile. În oricare din cele două cazuri, deshidratarea are un efect negativ mai redus decât
însilozarea sau întoarcerea şi strângerea/adunarea fânului cosit.

2.1.4 Carotenoizii în concentrate

Majoritatea nutreŃurilor concentrate folosite în hrana vacilor au un conŃinut foarte scăzut


de carotenoizi. Porumbul conŃine luteină şi zeaxantină, şi cantităŃi scăzute de multe alte xantofile,
cum sunt de exemplu criptoxantină şi zeinoxantină, care sunt concentrate în masa de gluten din
cereale. Procesarea nutreŃurilor pentru obŃinerea de concentrate implică, adesea,încălzirea care,
probabil, distruge cea mai mare parte din conŃinutul de carotenoizi. Produsele secundare rezultate
din tomate (prezente în unele zone ca siloz de pastă de tomate), produsele pe bază de grapefruit
roşu (care este consumat proaspăt sau sub formă de pastă citrică însilozată), conŃin licopen, cu
toate că, prin procesare concentraŃia acestuia în pastă de citrice uscată, este redusă. În aceste tipuri
de nutreŃuri sub formă de pastă, concentaŃiile de β-caroten sunt scăzute [3].

CAPITOL 3

DIGESTIA, ABSORBłIA ŞI METABOLIZAREA


CAROTENOIZILOR

3.1 Digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor


ConcentraŃia de carotenoizi din laptele de vacă este determinată de natura şi de cantitatea
de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj, precum şi prin transferul
acestora din matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea scăzută a carotenoizilor din
lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer şi se estimează că etapele diferite de
transfer ale carotenoizilor, din hrană în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în glandele
mamare.
Prima etapă în procesul de digestie al carotenoizilor îl reprezintă degradarea matricei
vegetale, care eliberează aceste substanŃe în faza lichidă a rumenului. Gradul de degradare al
carotenoizilor în rumen, de către microorganisme, variază în funcŃie de diferite rezultate obŃinute
în modele experimentale in vitro sau in vivo, majoritatea în ceea ce priveşte β-carotenul. Chiar
dacă unii autori nu au raportat nici o degradare a acestora, alŃii au raportat o degradare moderată

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
84
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

sau o dispariŃie totală a β-carotenului. Starea suplimentelor de carotenoizi poate explica


discrepanŃele dintre experimente, deoarece gradele de degradare au fost mai mari în situaŃiile în
care carotenoizii au fost furnizaŃi ca produse purificate faŃă de furnizarea lor sub formă de furaje.
Această ipoteză a fost confirmată recent de INRA, într-un studiu in vitro unde, aparent, nu a fost
detectată nici o degradare a luteinei din furaj, chiar dacă 50% din conŃinutul iniŃial a dispărut în
momentul în care, aceeaşi cantitate de luteină a fost adăugată ca sursă comercială disponibilă in
stare pură. Nu au fost raportate efecte ale compoziŃiei dietei, deşi raŃiile care conŃineau soia,
cereale şi seminŃe de bumbac (care sunt bogate în lipo-oxigenaze) pot stimula degradarea în
rumen a carotenoizilor. Carotenoizii din laptele de vacă sunt reprezentaŃi, în principal, din toŃi β-
carotenii trans şi în proporŃii mai mici luteină, zeaxantină, β-criptoxantină. În laptele de vacă au
fost detectate urme 13-cis-β caroten, dar originea lor (naturală sau rezultată în urma izomerizării
pe parcursul conservării sau extracŃiei) a rămas neclară. ProporŃia de β-caroten din totalul de
carotenoizi din lapte este cuprinsă între 750 şi 850 g/kg.
ConcentraŃiile de carotenoizi şi retinol în laptele de vacă, raportate în literatură, variază
foarte mult între diferite studii, de la 1  17 pentru carotenoizi şi, respectiv, de la 1  12 µg/g
grăsime, pentru retinol, aşa cum sunt reprezentate datele, atât în tabelul 1 cât şi în figura 3.1.

Figura 3.1 Studierea relaŃiei dintre β-carotenul dietetic şi concentraŃia β-carotenului din grăsimea laptelui la
lactaŃia medie a vacilor

Legenda:
1
Carotenoizi
2
β-caroten
3
Grăsimea din unt estimată la 40 g/kg
4
Date nepublicate de la INRA, Theix, France

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
85
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabel 3.1
InfluenŃa rasei vacilor asupra carotenoizilor 1,2 şi retinolului din lapte şi produse lactate

ReferinŃe Rasa Numărul de Carotenoizi Retinol


vaci Lapte Plasmă Lapte Plasmă
µg/g grăsime µg/ml µg/g grăsime µg/ml
Morris şi col. 100% Jersey 7.5 16.1
(2002)1 62% Jersey 720 (lapte) 8.1 14.5
62% Friesian 7.3 13.0
100% Friesian 3501(plasmă) 5.2 12.4
Martin şi co. Montbeliarde 28 2.9 2.4 3.5 0.49
(2004)2,3,4 Terentaise 28 3.1 2.7 3.5 0.46
Noziere şi col. Holstein 12 2.8 3.6 4.2 0.68
(2006)2 Montbeliarde 20 2.6 3.4 4.2 0.46
Coulon şi Holstein 14 2.3 2.0
Grolier Montbeliarde 24 2.3 1.9
(nepublicat)2,3 Terentaise 4 2.8 1.7
Coulon şi Montbeliarde 20 2.8 3.8
Grolier Terentaise 12 2.5 3.0
(nepublicat)2,3,4

O variaŃie mare apare şi în cazul β-carotenului din plasmă (de la 1 la 16 µg/ml), în timp
ce concentraŃiile de retinol sunt mai puŃin variabile (de la 0.1 la 0.6 µg/ml). Au fost identificati
câŃiva factori atât dietetici cât şi nedietetici care influenŃează această variabilitate. In aceste studii
s-au utilizat numeroase tehnici pentru extracŃie şi/sau cuantificare prin spectrofotometrie sau
cromatografie. In studii mai vechi, rezultatele sunt exprimate diferit (de exemplu: carotină,
carotenoizi, carotene sau caroten), în timp ce importanŃa biochimică pentru fiecare termen nu a
fost specificată. Aceasta se datorează, probabil, variaŃiilor mari ale valorilor absolute raportate, în
diferite publicaŃii [1].
3.2 InfluenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra variaŃiei concentraŃiei de
markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte

ConcentraŃia de carotenoizi din lapte diferă în funcŃie de:


Specie
Laptele de capră şi de oaie, în contrast cu laptele de vacă, conŃine numai retinol şi xantofile şi nu
conŃine β-caroten, explicându-se, astfel, diferenŃele majore care apar între produsele lactate
obŃinute din lapte de la bovine şi de la rumegătoare mici.
Rasă
ConcentraŃia de β-caroten în laptele de vacă diferă, în mare măsură în funcŃie de rasa vacii.
Faza de lactaŃie
ConcentraŃiile de β-caroten şi retinol sunt mult mai mari în colostru decât în lapte, acestea
scăzând rapid pe parcursul primei săptămâni după fătare. La lactaŃia mijlocie, s-a observat o
creştere în timp a concentraŃiei de β-caroten în lapte şi mai puŃin în plasmă.
Starea de sănătate
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
86
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

ConcentraŃiile scăzute de β-caroten sau retinol din plasmă au fost asociate cu o creştere a
incidenŃei infecŃiei la uger. Vacile care sufereau de mastită severă aveau tendinŃa de a produce
lapte care conŃinea mai puŃin β-caroten şi mai mult retinol decât vacile sănătoase, dar diferenŃele
au fost neînsemnate la lactaŃiile medie şi timpurie.
ProducŃia de lapte şi grăsimea din lapte
Efectul nivelului producŃiei de lapte asupra concentraŃiilor de carotenoizi şi retinol din lapte a fost
evaluat indirect prin intermediul factorilor care o afectează, de exemplu rasa, stadiul de lactaŃie
sau nivelul de alimentare. Mai exact, prin comparare, o singură mulgere pe zi induce o scădere a
producŃiei de lapte şi o creştere a a conŃinutului de grăsime din lapte, în timp ce două mulgeri pe
zi, determină producerea unei brânze mult mai galbene.
Variabilitatea individuală
ConcentraŃia de carotenoizi din plasmă şi din lapte este variabilă între indivizi.

Factorii din dietă care influenŃează concentraŃiile de carotenoizi şi retinol din lapte sunt:
Natura furajelor
ConentraŃia de β-caroten din lapte este direct dependentă de concentraŃia de β-caroten din dietă.
ConcentraŃia de β-caroten variază în funcŃie de maturitatea ierbii şi scade pe parcursul uscării şi
conservării acesteia, proporŃional cu gradul de expunere la lumină, deoarece β-carotenul este
foarte sensibil la radiaŃiile UV.
Gradul de maturitate şi managementul nutreŃului verde
Hrănirea cu nutreŃ verde a fost asociată pentru mult timp cu concentaraŃii mari de β-caroten în
lapte, cu variaŃii mari funcŃie de sezon, când gradul de maturitate şi perioada de lactaŃie sunt
confundate.
β-carotenul şi suplimentarea cu vitamine
Unele studii au demonstrat că β-carotenul are un rol specific în eficienŃa reproducerii la bovine,
pe lângă activitatea sa de provitamină A. La vaci, prin suplimentarea dietei cu vitamina A, are loc
o creştere a concentraŃiei de retinol în plasmă, colostru şi lapte, dar se reduce concentraŃia de
carotenoizi, atât în lapte cât şi în plasmă. Când se suplimentează cu vitamina E furajele pentru
vaci, are loc o scădere a concentraŃiei de β-caroten în plasmă şi în Ńesutul celular.
Durabilitatea şi întârzierea stării de latenŃă
În timpul lactaŃiei medii, schimbarea alimentaŃiei de la iarbă verde la o dietă pe bază de fân,
induce rapid o scădere a concentraŃiei de β-caroten şi a culorii, atât în plasmă cât şi în lapte.
Schimbările apar din prima zi, iar diferenŃa maximă în concentraŃia de β-caroten din lapte, între
dieta pe bază de iarbă verde şi dieta pe bază de fân apare după 10-15 zile de la transferul acestora
din furaje în lapte şi în plasmă.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
87
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

BilanŃul energetic
Cu o cantitate fixă de β-caroten şi retinol ingerată, limitarea energiei consumate pe parcursul
lactaŃiei medii, induce o creştere a concentraŃiei de β-caroten şi retinol din lapte, deşi concentraŃia
din plasmă rămâne neschimbată. Deoarece concentraŃia din plasmă rămâne neschimbată,
creşterea secreŃiei de retinol în lapte, poate fi raportată mai exact la o transmitere a β-carotenului
din rezervele de Ńesut adipos.

3.3 Transferul carotenoizilor şi retinolului din laptele materie primă în


produsele lactate

Carotenoizii şi retinolul sunt sensibili la diferiŃii factori fizico-chimici, cum ar fi: aerul,
agenŃii de oxidare şi razele UV. Degradarea lor este accelerată de temperatură ridicată şi este
catalizată de ionii anorganici. Retinolul poate fi instabil la valori ale pH-ului mai mici de 4. Un
pH scăzut cauzează izomerizarea parŃială a retinolului de la toate formele trans la mai puŃin
eficientele forme cis, iar prin hidroliza esterilor retinolului rezultă un retinol mult mai instabil.
Prin urmare, tratamentele tehnologice, cum sunt încălzirea sau acidifierea aplicate la procesarea
laptelui (pentru obŃinerea de produse lactate) ca si procesarea imediată (fără repaus după
recoltare) şi mediul de depozitare (lumină, temperatură), sunt factori care degradează/permit
degradarea acestor micronutrienŃi şi influenŃează carenŃa vitaminică a produselor lactate rezultate.
În plus, procesarea unor produse lactate (brânză, unt) implică transferul selectiv al constituenŃilor
din lapte în produse lactate. Oricum, o proporŃie scăzută de retinol şi carotenoizi este asociată cu
proteinele din zer sau este concentrată în membrana globulelor laptelui gras. Ca rezultat, o
anumită cantitate a acestor micronutrienŃi, poate fi pierdută prin zer, în timpul producerii brânzei
şi untului [3].
Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în
componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul care determină
variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui.
MulŃi cercetători au demonstrat că, în afară de aspectele legate de conŃinutul de
substanŃă uscată din brânză, variabilitatea compoziŃională a acesteia în acizi graşi, β-caroten,
xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compoziŃia „laptelui original”.
CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi carotenoizi,
este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compoziŃia biologică, stadiul de maturitate,
modul de conservare etc.), de specia animalului, de rasă, de modul de recoltare a laptelui şi,
bineînŃeles, de stagiul de lactaŃie în care se află animalul [1].

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
88
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

3.4 InfluenŃa dintre carotenoizii din lapte şi proprietăŃile senzoriale ale


produselor lactate

Carotenoizii din lapte influenŃează proprietăŃile senzoriale ale produselor din lapte fie
indirect, prin intermediul proprietăŃilor antioxidante, fie direct, prin proprietăŃile lor de
îngălbenire.

a) ProprietăŃile antioxidante
Lipidele din produsele lactate pot suferi procese de oxidare, determinând schimbări ale calităŃii
produselor finite lactate şi, uneori, un impact negativ asupra calităŃii acceptabile apreciată de
consumatori. Autooxidarea lipidelor, similar cu oxidarea indusă de lumină, este afectată de un
complex de pro- şi antioxidanŃi. Principalii compuşi antioxidanŃi din lapte sunt enzimele (adică
superoxid-dismutaza, catalaza, glutation-peroxidaza), lactoferina, vitaminele C şi E, şi
carotenoizii. Vitamina E şi carotenoizii acŃionează ca antioxidanŃi solubili în grăsime (de
exemplu, β-carotenul este implicat în prevenirea foto-oxidării).

b) Culoarea produselor lactate


Evaluarea culorii în produsele lactate este realizată, în majoritatea studiilor, cu ajutorul
instrumentelor de măsurare a culorii tricromatice, care dau rezultate exprimate în sistemul Hunter
L, a, b, unde “L” defineşte poziŃia probei pe axa luminii întunecate, “a” pe axa luminii verde-
roşie şi “b” pe axa luminii albastră-galbenă. În lipsa unor probe etalon, procedurile de preparare
şi condiŃiile de iluminare ridică probleme majore relatate în studiile din literatură [1].

CAPITOL 4

METODE EXPERIMENTALE DE DETERMINARE A


MARKERILOR BIOCHIMICI

4.1 Proceduri generale de analiză a carotenoizilor


Pentru analiza carotenoizilor pot fi utilizate diferite metode. Alegerea celei mai adecvate
metode este, de obicei, determinată de tipul de informaŃii necesare a fi obtinuŃe. În general,
pigmentul carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte
complexă. Cu toate acestea, este absolut necesară extracŃia eficientă şi respectarea tuturor
protocoalelor analitice [5].
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
89
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

łinând cont de faptul că moleculele carotenoidice prezintă un lung lanŃ de legături duble
conjugate, acestea reacŃionează foarte uşor cu acizii, bazele, oxigenul şi lumina, motiv pentru care
trebuie avută o grijă deosebită când se analizează produse cu un conŃinut scăzut de carotenoizi (de
exemplu uleiul din seminŃe de dovleac) [6].
În general, analiza carotenoizilor constă în urmatoarele etape:
a) selecŃia şi prepararea probei,
b) extracŃia,
c) separarea cu un solvent compatibil, imediat după pasul cromatografic,
d) saponificarea şi spălarea,
e) concentrarea sau evaporarea solventului,
f) separarea cromatografică,
g) identificarea şi
h) cuantificarea.

4.2 Separarea cromatografică


łinând cont de regulile pe care le impune separarea cromatografică, probele trebuie
introduse în sistemul cromatografic în volum cât mai mic, iar soluŃia de carotenoizi, după
divizare (pentru a realiza saponificarea probei), este uscată cu sulfat de sodiu anhidru şi apoi
concentrată sau evaporată la sec.
Probele caracteristice de alimente conŃin substanŃe de tip carotenoizi, conjugate, nepolare,
dar şi multe xantofile polare. Oricare ar fi metoda utilizată, procesarea cromatografică trebuie să
fie capabilă să facă faŃă tipurilor de polaritate.
a) În esenŃă, coloana cromatografică deschisă, de „scurgere gravitaŃională”,
cunoscută ca OCC (open column chromatography - coloană cromatografică
deschisă), reprezintă metoda clasică de separare a carotenoizilor, pentru analiza
cantitativă. Este, de asemenea, utilizată pentru izolarea şi purificarea
carotenoizilor, şi apoi ca standarde pentru HPLC. Separarea pigmenŃilor
carotenoidici este urmărită vizual. De asemenea, trebuie aplicată o presiune mică
în vârful coloanei (ex. cu N2 gaz). Această tehnică este denumită coloană
cromatografică în curent de apă.
b) Cromatografia în strat subŃire (TLC), deşi este eficientă în monitorizarea testelor
chimice în vederea identificării rezultatelor, nu este adecvată pentru analizele
cantitative, din cauza pericolului de degradare şi izomerizare la expunerea
îndelungată pe masa de lucru.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
90
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

c) Cromatografia cu gaze este, de asemenea, neadecvată, datorită instabilităŃii termice


şi a volatilităŃii reduse pe care o prezintă marea majoritate a carotenoizilor.
În ceea ce priveşte separarea şi/sau analiza cu ajutorul unei OCC, aceasta trebuie realizată
pentru fiecare analiză în parte. Avantajul major al metodei HPLC faŃă de OCC constă în faptul
că pot fi realizate separări reproductibile prin simpla folosire a unei coloane reutilizabile, în
condiŃii controlate, fără expunerea excesivă la aer sau lumină.
Faza inversă a HPLC pe coloane C18 poate fi modul preferat pentru separarea
carotenoizilor pentru analizele cantitative. PreferinŃa pentru coloana C18 derivă din interacŃiunile
hidrofobice slabe pe care le exercită cu analiŃii (acest aspect face această coloană mai puŃin
distructivă decât forŃa polară exercitată în faza normală a OCC), compatibilitatea cu majoritatea
solvenŃilor carotenoidici şi cu catena polară a carotenoizilor precum şi disponibilitatea
comercială.
Majoritatea separărilor de carotenoizi au fost realizate cu particule sferice C18 de 5µm, în
coloane de 250x4,6 mm. Cu toate acestea, sunt utilizate din ce în ce mai mult coloane, mai
scurte şi mai înguste, cu particule mai mici şi cu faze staŃionare C30.
Fazele monomerice sunt mai uşor de utilizat şi sunt mult mai reproductibile.
S-a dovedit că fazele polimerice, ca C18, au selectivitate excelentă pentru carotenoizi cu
structuri similare, cum ar fi izomerii geometrici ai β-carotenului, luteinei şi zeaxantinei.
Carbonul total reŃinut este redus în fazele polimerice cu pori mari, având ca efect un timp de
retenŃie foarte scurt, pentru carotenoizi. În plus, comparând rezultatele obŃinute pe acest tip de
coloane cu cele obŃinute pe coloanele monomerice, se observă că picurile tind să fie largi.
Coloanele de reŃinere, care trebuie schimbate frecvent, sunt utilizate pentru a preveni
pătrunderea particulelor fizice şi a impurităŃilor în coloana analitică, prelungindu-se, astfel, viaŃa
întregii coloane. Coloanele de reŃinere pot, totuşi, determina mărirea benzii şi astfel, reŃinerea
carotenoizilor.
Cele mai importante proprietăŃi care trebuie luate în considerare pentru selectarea fazei
mobile sunt polaritatea, vâscozitatea, volatilitatea şi toxicitatea. În plus, faza mobilă trebuie să
fie inertă faŃă de carotenoizi. Multe sisteme de solvenŃi sunt propuse ca faze mobile pentru
carotenoizi iar cele mai multe dintre acestea sunt uşor modificate de câteva combinaŃii bazice,
dar ca solvenŃi principali sunt acetonitrilul şi metanolul. Acetonitrilul este utilizat pe o scară
foarte largă, datorită vâscozităŃii reduse şi selectivităŃii mult mai bune pentru xantofile, când se
utilizează o coloană C18. S-a demonstrat că sistemele de solvenŃi pe bază de metanol oferă o
recuperare mai bună a carotenoizilor faŃă de sistemele pe bază de acetonitril. Metanolul este, de
asemenea, mult mai accesibil, mai ieftin şi mai puŃin toxic decât acetonitrilul. Prin adăugarea de
trietilamină la solvenŃii pe bază de acetonitril s-a obŃinut o mai bună recuperare a carotenoizilor.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
91
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Din cauza variaŃiilor cantitative şi calitative a carotenoizilor din compoziŃia alimentelor,


este discutabil dacă poate fi stabilit un singur sistem cromatografic care să poată fi aplicat mai
multor tipuri de alimente.
Pentru separarea carotenoizilor s-au utilizat diferite tipuri de faze, cum ar fi: zaharoză
pudră, sefaroză DEAE, celuloză sau MgO/Hyfluosupercel. ToŃi β-caroteni trans pot fi separaŃi de
izomerii 9-cis şi 13-cis, utilizând o coloană deschidă umplută cu hidroxid de calciu.

Cromatografia în strat subŃire (Thin Layer Chromatography - TLC)


TLC şi HPTLC (High Performance TLC) sunt utilizate pentru separarea şi izolarea
claselor de molecule individuale, deoarece TLC este o metodă rapidă, eficientă şi relativ ieftină.
AtenŃie deosebită trebuie acordată când separarea se face pe silica-gel. Atunci este necesară
neutralizarea prealabilă a acidităŃii siliciului, pentru a se evita rearanjarea epoxid-furanoxid, în
moleculele de carotenoizi. Din păcate, separarea compuşilor cu structuri similare este foarte
dificilă. Acest fapt este ilustrat foarte bine în figura 4.1, prin compararea cromatogramelor
obŃinute prin metodele TLC şi HPLC, pentru uleiul din seminŃe de dovleac.

Figura 4.1 Cromatograma pigmenŃilor din uleiul


din seminŃe de dovleac

Legenda:
TLC - eter de petrol/acetonă (80/20 % vol.)
HPLC - metanol, acetonitril, clorură de metilen

Metoda TLC permite separarea a 4 benzi, în timp ce prin metoda HPLC s-au obŃinut 14
picuri. Metodologia TLC poate fi completată de tehnici de separare mult mai eficiente, cum este
de exemplu metoda HPLC cuplată cu UV-Vis şi/sau detecŃie fluorometrică.

Cromatografia lichidă de înaltă performanŃă (High-performance liquid chromatography - HPLC)

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
92
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Având un caracter clar hidrofob, pentru analiza carotenoizilor se preferă o coloană C18 cu
inversie de fază (RP - reversed phase). De curând, a apărut pe piaŃă coloana C30-RP, care este, în
mod special, foarte potrivită pentru separarea carotenoizilor, Ńinând cont de faptul că interacŃiile
dintre pigmenŃi şi faza staŃionară sunt maximizate datorită mărimii lor, similare. EficienŃa unei
asemenea coloane este foarte ridicată, permiŃând diferenŃierea mai multor izomeri cis ai aceluiaşi
carotenoid. Această metodă a fost aplicată, cu succes, pentru determinarea carotenoizilor
saponificaŃi din sucul de portocale. Cu toate acestea, când se analizează un amestec foarte
complex, co-eluŃiile devin limitate foarte repede. O fază staŃionară mai puŃin selectivă, cum este
C18-RP, este utilizată, de preferat, pentru analize mai puŃin detaliate. Faza mobilă este alcătuită de
obicei din solvenŃi organici, cu excepŃia cazului în care trebuie separate molecule foarte polare de
carotenoizi, cum sunt glicozil esterii. În acest caz este recomandat un amestec dintre un solvent
organic polar cu o cantitate mică de apă.
În vederea îmbunătăŃirii separării pigmenŃilor, câteodată este utilă încălzirea coloanei.
Această procedură nu este, însă, recomandată, deoarece poate declanşa izomerizarea
carotenoizilor, modificare care nu este detectată foarte exact de metodele HPLC. AtenŃie
deosebită trebuie acordată pentru asigurarea condiŃiilor cromatografice potrivite, pentru ca
pigmenŃii să nu treacă prin coloană neseparaŃi.
Suplimentarea HPLC cu un detector cu diode înseriate, împreună cu nişte computere
puternice, contribuie enorm la îmbunătăŃirea puterii analitice a HPLC. Utilizând asemenea
detectori este posibilă urmărirea simultană a eluŃiei pe întreaga zonă UV-Vis (190-800 nm), ceea
ce garantează că fiecare pigment poate fi urmărit la absorbŃia sa maximă (cu maximă
sensibilitate).

HPLC supercritic şi subcritic


ExtracŃia supercritică a fluidelor a fost sugerată ca metodă alternativă pentru izolarea
selectivă a carotenoizilor într-o singură etapă, situaŃie în care degradarea pigmenŃilor este evitată.
Favati, King, Friedrich şi Eskins (1988) au fost cei care au izolat, pentru prima dată, β-carotenul
şi luteina din concentrate de frunze, la 40°C şi un interval de presiune între 29 şi 70 MPa. Din
punct de vedere analitic, extracŃia supercritică a fluidelor este compatibilă cu cromatografia
supercritică a fluidelor, din moment ce, cele două tehnici pot împărŃi aceeaşi fază mobilă şi
aceleaşi aparate, favorizând, astfel, dezvoltarea metodologiilor de extracŃie şi separare. Deoarece
puterea de eluŃie a CO2 este relativ scăzută, în ceea ce priveşte carotenoizii, este necesară
adăugarea unor co-solvenŃi care să mărească solubilitatea carotenoizilor în CO2. Teoria
parametrilor de solubilitate prevede că solubilitatea maximă a unui compus este atinsă când
parametrul de solubilitate al solventului este egal cu cel al solutului. De exemplu, β-carotenul
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
93
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

poate fi extras la 43°C şi la aproximativ 70 MPa. Cu toate acestea, unele tipuri de echipamente nu
permit eluŃia la o asemenea presiune. Trebuie găsite noi condiŃii de temperatură şi presiune,
folosind o diagramă care să reprezinte variaŃiile de presiune vs. densitate pentru diferite
temperaturi. Prin intermediul unei temperaturi mai scăzute, densităŃile similare celor atinse la
temperaturi înalte pot fi obŃinute pentru presiuni mai scăzute, acestea fiind, de fapt, densităŃile
corespunzătoare condiŃiilor subcritice. Utilizând această tehnică, Ibanez, Lopez-Sebastian, Tabera
şi Reglero (1998) au separat cu succes β-carotenul din licopen în mai puŃin de 10 minute. Cea mai
bună separare a fost obŃinută la 10°C, sub o presiune de aproximativ 35 MPa, cu o coloană
capilară ce conŃinea grupe de siloxan dezactivat cu reactiv ciclo-octametil-tetrasiloxan. Structura
este „spartă” la o temperatură înaltă, formându-se legături O-Si-CH3 cu fază de silicaŃi.
Nici una din metodele descrise mai sus nu este în întregime potrivită pentru o separare
completă a unui amestec complex de pigmenŃi. Amprenta tetrapirolului, de exemplu, este
adeseori suficientă pentru identificarea cromoforului său, dar nu conŃine informaŃii destule
pentru identificarea structurii complete a pigmentului. Această observaŃie poate fi parŃial dedusă
din comportamentul cromatografic şi din compararea datelor de retenŃie obŃinute cu cele din
literatură. Alte metode, cum ar fi spectrometria de masă (Mass Spectrometry - MS), se aplică
pentru caracterizarea completă a structurii moleculei. Progresele recente făcute în domeniul MS
permit analiza unor cantităŃi de genul sub-nanogramelor şi au făcut această tehnică atractivă
pentru cercetarea din domeniul alimentar [6].

4.3 Identificare carotenoizilor

Comportamentul cromatografic şi spectrul de absorbŃie în UV-Vis furnizează primele


indicii pentru identificarea carotenoizilor. Atât lungimile de undă ale absorbŃiei maxime (λmax) cât
şi forma spectrului (structura spectrală fină) sunt caracteristici ale cromoforului. In tabelul 4.1
sunt menŃionate valorile λmax ale carotenoizilor, care au fost determinate frecvent în alimente.

Tabel 4.1
AbsorbŃia UV-Vis pentru carotenoizii găsiŃi frecvent în alimente

Carotenoidul Solventul λmax (nm)


α - caroten acetonă, 424 448 476
cloroform, 433 457 484
etanol, 423 444 473
hexan, eter de petrol 422 445 473
β - caroten acetonă, (429) 452 478
cloroform, (435) 461 485
etanol, (425) 450 478
hexan, eter de petrol (425) 445 477
α- cloroform, 435 459 487
riptoxantină/zeinoxantină etanol, 423 446 473
hexan 421 445 475
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
94
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

β - criptoxantină cloroform, (435) 459 485


etanol, (428) 450 478
eter de petrol (425) 449 476
luteină cloroform, 435 458 485
etanol, 422 445 474
eter de petrol 421 445 474
licopen acetonă, 448 474 505
cloroform, 458 484 518
etanol, 446 472 503
eter de petrol 444 470 502
zeaxantină acetonă, (430) 452 479
cloroform, (433) 462 493
etanol, (428) 450 478
eter de petrol (424) 449 476

Cei mai mulŃi carotenoizi absorb maxim 3 lungimi de undă, rezultând, astfel, un spectru
în 3 picuri. Pe măsură ce numărul legăturilor duble conjugate creşte, λmax se schimbă/modifică la
lungimi de undă mai mari. Cei mai mulŃi carotenoizi sunt nesaturaŃi, aciclici, precum licopenul,
care are 11 legături duble conjugate, este de culoare roşie şi absoarbe la lungimi de undă foarte
mari (λmax = 444, 470 sau 502 nm), aşa cum este reprezentat în figura 4.2.

Figura 4.2 Spectrul de absorbŃie în vizibil al licopenului (___ ), β-carotenului (-.-.-), γ-carotenului (----) şi α-
carotenului în eter de petrol

ζ-carotenul (galben deschis) care este, de asemenea, aciclic, prezintă 3 picuri bine
definite, dar la lungimi de undă mult mai mici (λmax = 378, 400 sau 425 nm), proporŃional cu cele
7 legături duble conjugate. Cei doi carotenoizi mai puŃin coloraŃi, care îi preced ζ-carotenului în
etapa de desaturare a căii biosintetice, phytoenul (cu 3 legături duble conjugate) şi phytofluenul
(cu 5 legături duble conjugate) prezintă o absorbŃie maximă în regiunea UV (la 276, 286, 297 şi,
respectiv, la 331, 348 şi 367), cum este reprezentat în figura 4.3. [5]

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
95
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Figura 4.3 Spectrul de absorbŃie în vizibil al ζ-carotenului (__), phytoenului (….) şi phytofluenului(--).
Faza mobilă: acetonitril/acetat de etil/metanol (85:10:5)

4.3.1 Criteriile pentru identificarea carotenoizilor

Schiedt şi co. au definit criteriile minime necesare pentru identificarea carotenoizilor:


a) spectrul de absorbŃie în regiunea UV, obŃinut în cel puŃin 2 solvenŃi diferiŃi, trebuie să fie
compatibil cu cromoforul sugerat;
b) proprietăŃile cromatografice obŃinute trebuie să fie identice, atât prin metoda TLC cât şi
prin HPLC; co-eluŃiile trebuie făcute cu probe autentice;
c) trebuie obŃinut un spectru de masă care să permită cel puŃin confirmarea masei
moleculare.
Spectrul de absorbŃie reflectă organizarea sistemului de legături duble conjugate şi constituie
„amprenta” pigmenŃilor. Spectroscopia de absorbŃie pare a fi cea mai simplă metodă de
identificare a componenŃilor majori prezenŃi într-un amestec. Odată identificaŃi, pentru a estima
concentraŃia acestora este posibilă utilizarea unui set de ecuaŃii. În figura 4.4, reprezentată în
continuare, se poate observa acest lucru în spectrul de absorbŃie al uleiului de măsline.

Figura 4.4 Spectrul de absorbŃie al


uleiului de măsline,
la temperatura
camerei

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
96
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Compararea acestui spectru cu cel al unor pigmenŃi puri, permite identificarea familiilor
de pigmenŃi care compun, în cazul de faŃă, uleiul (carotenoizi şi pheophytină). Deoarece mediul
înconjurător în care se găseşte pigmentul (solvent, temperatură etc.) influenŃează puternic poziŃia
şi forma spectrului, un spectru de absorbŃie brut este total inutil pentru măsurarea directă a
concentraŃiei pigmentului. Măsurătorile necesită extracŃia pigmentului cu un solvent potrivit,
pentru care a fost stabilit, în prealabil, setul de ecuaŃii sau pentru care au fost determinaŃi, cel
puŃin, coeficienŃii de absorbŃie. Cu aceste date, este întotdeauna posibilă stabilirea unui nou set de
ecuaŃii, adaptat la o situaŃie particulară. Precizia metodei depinde de tipul de aparat utilizat, de
capacitatea acestuia de a determina cu precizie absorbanŃa maximă şi, bineînŃeles, de acurateŃea
coeficientului de absorbŃie utilizat pentru calcule. Este recomandată, oricum, verificarea cu
regularitate a literaturii de specialitate pentru valori şi seturi de ecuaŃii noi.
Suprapunerea parŃială a benzilor de absorbŃie a pigmenŃilor prezenŃi în amestec complică
estimarea concentraŃiei unui pigment individual, aceasta fiind şi mai puŃin eficientă dacă numărul
de pigmenŃi este mai mare ca 3.
Se mai poate adăuga că, izomerii cis-carotenoidici, pot fi recunoscuŃi deoarece spectrul
lor de absorbŃie prezintă o bandă adiŃională în regiunea UV. PoziŃia legăturii duble din forma cis,
este redată prin raportul Acis/AMAX.
În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brută a pigmenŃilor prezenŃi
într-un extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exactă a
pigmenŃilor dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea şi
cuantificarea definitivă a
pigmenŃilor necesită de obicei realizarea unor standarde, care sunt decisive în analiza pigmenŃilor
din produsele alimentare. [6]

4.3.2 Metode de determinare a carotenoizilor

Unii cercetători au determinat variaŃia carotenoizilor, a micronutrienŃilor graşi solubili şi


culoarea lor în plasmă şi în laptele de vacă. Au urmărit şi schimbările care apar în funcŃie de
furajele cu care au fost hrănite vacile şi nivelul de alimentare.

Studiul experimental 1
Referitor la un astfel de studiu, în timpul perioadei pre-experimentale, 32 de vaci aflate la
lactaŃie medie au fost hrănite cu furaje şi apoi au fost împărŃite în 4 grupe; la 2 grupe s-a
menŃinut dieta cu furaje iar 2 grupe au fost trecute pe o dietă cu fân uscat. Din grupele hrănite cu
furaje, un grup a fost hrănit în funcŃie de energia netă pentru lactaŃie şi necesarul de azot, iar
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
97
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

celălalt grup a fost supus unei subnutriŃii energetice, cu furaje similare şi un aport de carotenoizi
între cele două grupuri. S-a monitorizat, timp de 8 săptămâni, variaŃia carotenoizilor şi indexul
de culoare din plasmă şi din lapte. Carotenoizii şi retinolul din lapte au fost identificaŃi prin
metoda HPLC. Pentru aceasta a fost necesară o prelucrare iniŃială a probelor de lapte, aşa cum
este prezentată în continuare.
Realizarea probelor de lapte
• 1 ml de lapte a fost amestecat cu 1 ml de etanol, care conŃinea ca standard intern
echinenonă, şi cu 1 ml de hexan.
• Probele au fost centrifugate (1,200*g, 2 min) iar faza organică superioară a fost colectată.
AcŃiunea a fost repetată de două ori.
• Stratul etanolic a fost evaporat încet la sec, sub azot pur.
• S-au combinat extractele organice, şi s-a adăugat încă 1 ml de etanol şi apă (90/10
%vol.).
• Fiolele au fost agitate (5 min) şi centrifugate (1,200*g, 2 min).
• Faza de hexan a fost evaporată la sec cu azot pur.
• După ce s-au adăugat peste reziduu 2 ml KOH 10% amestecul a fost mixat 1 min. şi
incubat la 37°C timp de 120 de minute.
• Saponificarea a fost oprită prin adăugarea 1 ml de apă.
• Carotenoizii şi retinolul au fost extraşi de două ori cu 1 ml hexan.
• Faza organică a fost spălată de două ori cu 1 ml de apă, colectată şi, în final, a fost
adăugată în fiola care conŃinea reziduul uscat de la faza fenolică iniŃială.
• Amestecul a fost mixat, centrifugat şi evaporat la sec sub azot pur.
• Reziduurile au fost dizolvate în 200 µl diclormetan şi acetonitril (50/50 %vol.) iar 80 µl
au fost injectaŃi pentru analiza HPLC.
Echipamente, materiale si metode
• Echipamentul HPLC care a fost utilizat în experiment era compus din: un sistem Waters
echipat cu o pompă, un regulator, un autosampler care răceşte probele, şi o serie de
fotodiode folosite ca detectori (care prezintă o capacitate de înregistrare între 280 şi 600
nm).
• A fost folosit softul Millenium 32 pe post de instrument de control, la înregistrarea şi
procesarea datelor.
• Carotenoizii şi vitamina A au fost detectaŃi la 450 şi 325 nm şi fiecare în parte a fost
identificat prin comparaŃie cu timpul lor de retenŃie şi analizele spectrale ale
standardelor pure (>95%).
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
98
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

• ConcentraŃiile carotenoizilor şi ale vitaminei A, au fost calculate folosind curba unui


standard extern şi apoi au fost ajustate prin transformarea în procent, adăugat la
standardele interne.

Rezultate
Carotenoizii din lapte au constat în toŃi β-carotenii trans. S-au detectat urme de luteină, dar nu s-
au putut cuantifica. ConcentraŃia de β-caroten din lapte [0.133 vs. 0.062 µg/ml (3.64 vs 1.77
µg/g de grăsime)] la fel şi cantitatea secretată în lapte (2.45 vs. 1.33mg/d), a fost mai mare la
vacile care au fost hrănite cu furaje decât la cele hrănite cu fân. În timpul hrănirii animalelor cu
furaje, a avut loc o creştere a concentraŃiei de carotenoide între 1 şi 50 de la 0.081 la 0.168 µg/ml
(2.17 la 4.53 µg/g de grăsime), la fel şi cantitatea secretată în lapte de la 1.68 la 2.95 mg/d, cum
este reprezentat în figura 4.5.

Figura 4.5 EvoluŃia concentraŃiei de β-caroten, şi indexul de culoare, în plasma şi în lapte, în hrănirea vacilor cu
nutreŃuri diferite şi la nivele diferite de alimentare
(sursa: [4])

Legenda:
■ iarbă intens conservată
iarbă conservată puŃin
▲fân superior
∆ fân inferior.

La animalele hrănite cu fân, concentraŃia din lapte şi cantitatea secretată în lapte a variat
puŃin, între zilele 1 şi 50. DiferenŃele concentraŃiilor de β-caroten din lapte, dintre dieta cu fân şi
dieta cu furaje, au fost semnificative după ziua 10. [4].

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
99
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabel 4.2
ConcentraŃiile de carotenoizi, vitamina A şi vitamina E din lapte

Fân uscat Furaj verde


Ridicat Scăzut Ridicat Scăzut
trans β-caroten, µg/ml 0.056 0.068 0.123 0.008
trans β-caroten, µg/g de grăsime 1.64 1.90 3.21 0.20
trans β-caroten secretat, mg/zi 1.20 1.42 2.44 0.14
indexul de culoare 428 433 540 9
vitamina E, µg/ml 0.555 0.650 0.887 0.045
vitamina E, µg/g de grăsime 14.2 17.4 21.4 1.3
vitamina E secretată, mg/zi 12.6 14.0 18.8 1.2
vitamina A, µg/ml 0.130 0.162 0.170 0.016
vitamina A, µg/g de grăsime 2.97 4.17 4.08 0.37
vitamina A secretată, mg/zi 2.86 3.53 3.60 0.36

Studiul experimental 2
AlŃi cercetători au realizat dozarea spectofotometrică a carotenoizilor şi a retinolului,
bazându-se pe proprietatea carotenoizilor de a absorbi radiaŃia luminoasă în domeniul vizibil, cu
un maxim de absorbŃie situat în jurul valorii de 450 nm. Studiul a fost realizat pe lapte recoltat de
la vaci de lapte aparŃinând rasei Bruna austriaca, exploatate în regim ecologic. Laptele a fost
prelevat de la o exploataŃie ecologică din depresiunea Dornelor.
Prepararea probelor a fost realizată astfel
• Un volum de 20 ml de lapte a fost tratat cu 5 ml soluŃie de amoniac 25% şi 20 ml de
etanol 96%.
• Pentru extracŃia carotenoizilor şi a retinolului s-a adăugat un amestec de 40 ml eter etilic
(ce conŃinea 0.0025% BHT) şi s-a agitat timp de 5 min.
• Faza superioară eterică a fost reluată într-un balon şi evaporată la un rotavapor, la
temperatura de 35°C.
• Saponificarea probelor s-a realizat prin adăugarea la reziduul obŃinut a unui volum de 30
ml hidroxid de potasiu 5% în etanol 96%.
• Probele au fost agitate folosind un agitator magnetic timp de 3 h la întuneric.
• Probele au fost transferate într-o pâlnie de separare de 30 ml de apă şi 30 ml hexan.
• Hexanul a fost îndepărtat şi faza re-extrasă cu hexan.
• Fazele hexanice au fost reunite, spălate în pâlnia de separare cu apă, apoi evaporate la
sec.
• Probele au fost păstrate la congelator până la analiza ulterioară.
• Un volum măsurat de hexan s-a adăugat reziduului obŃinut după saponificare şi se citeşte
absorbanŃa la 450 nm.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
100
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

• Înregistrarea spectrului de absorbŃie şi citirea absorbanŃei s-a realizat cu un


Spectrofotometru Jasco. S-a înregistrat spectrul de absorbŃie şi s-a citit absorbanŃa la 450
nm. În figura 4.6 este exemplificată diagrama obŃinută.

Figura 4.6 Spectru de absorbŃie în cazul unei probe de lapte de vacă

Echipamente, materiale si metode


SoluŃiile standard şi probele au fost injectate într-un sistem HPLC prevăzut cu sistem de pompe
Shimadzu LC-20 AT, detector Waters 990 cu softul de prelucrare a datelor, injector Rheodyne cu
buclă de 20 µl şi coloană Sherisorb RP-18 cu lungime de 25 cm, diametrul interior 4,6 nm şi
dimensiunea particulelor de 5 µm. Faza mobilă a constat în acetonitril: metanol 85:15, în sistem
izocratic. Astfel s-a obŃinut separarea HPLC a carotenoizilor din laptele de vacă (aşa cum este
reprezentat în figura 4.7).

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
101
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Figura 4.75 Separarea HPLC a carotenoizilor din lapte de vacă

Legenda:
luteină-zeaxantină (tr= 6.8-7.5 min)
β-criptoxantină (tr= 13.7 min)
licopina (tr= 17.4 min)
β- carotenă (tr= 22.8 min)

Rezultate
În urma injectării probelor de lapte de vacă s-au constatat unele diferenŃe în ceea ce priveşte
cantitatea de carotenoizi în sezoanele de iarnă şi de vară supuse investigaŃiei [10], aşa cum
este prezentat în tabelul 4.3

Tabel 1.3
ConŃinutul în carotenoizi al laptelui de vacă

Produsul Data recoltării Carotenoide (mg/100ml)


N Media DeviaŃia standard
Lapte de Februarie 15 18.84 4.96
vacă
Iunie 15 22.35 4.23

Studiul experimental 3
Altă determinare a carotenoizilor a fost făcută de Lucas şi co., care au realizat un studiu
corelaŃional în vederea:
• caracterizării compoziŃiei brânzeturilor de vacă, din punct de vedere al
conŃinutului şi variabilităŃii acizilor graşi, retinolului, α-tocoferolului, folatului,

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
102
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

β-carotenului, calciului, fosforului, magneziului, potasiului, zincului, clorurii de


sodiu şi a capacităŃii antioxidante totale;
• identificării caracteristicilor cirezii şi a practicilor de alimentare a vacilor,
asociate diferenŃelor obŃinute în compoziŃia brânzeturilor.
În urma studiului efectuat, brânza obŃinută de la vacile alimentate cu fân proaspăt (la
păşunat) sau furaje conservate, s-a dovedit a fi mai bogată în C4:0, C18:0, cis-9 C18:1, trans-11
C18:1, cis-9 trans-11 C18:2 (CLA), β-caroten, xantofile, retinol, α-tocoferol şi TAC şi mai săracă
în C10:0, C14:0 şi C16:0. În perioada de păşunat la şes, comparativ cu păşunatul montan, brânza
obŃinută a fost mult mai săracă în C6:0 - C14:0, β-caroten şi retinol, şi mai bogată în cis-9 C18:1,
C18:2 n-6 şi C18:3 n-3.
În perioada alimentării interne (în interiorul grajdului), cu raŃii bazate pe porumb,
grăsimea brânzei prezenta o cantitate mai săracă de trans-11 C18:1, CLA, β-caroten şi xantofile,
în timp ce cantităŃile mai ridicate ale vitaminelor A şi E au fost asociate cu un conŃinut foarte
ridicat de retinol şi α-tocoferol.
Probele de brânză s-au recoltat direct de la producătorii individuali (fermieri). Pentru
fiecare varietate de brânză, probele colectate au fost produse în 6 perioade ale anului: 2 în timpul
alimentării interne când vacile au avut o dietă bazată pe furaje conservate şi 4 în timpul perioadei
de păşunat. In total s-au colectat 306 brânzeturi.
Probele de brânză colectate au fost îngheŃate imediat după colectare. ConŃinutul de retinol
(vitamina A), α-tocoferol (vitamina E), β-caroten şi xantofile (luteină şi zeaxantină) au fost
măsurate simultan prin HPLC, cu un detector fotodiodic UV-Vis, imediat după saponificarea şi
extracŃia fiecărei probe cu hexan.

Studiul experimental 4
În alt studiu, Lucas şi co. au analizat 5 varietăŃi de brânzeturi franŃuzeşti: Abondance,
Tomme de Savoie, Cantalet, Salers şi Rocamadour, care se obŃin prin 4 tehnologii de procesare.
În vederea analizării substanŃei uscate, acizilor graşi, vitaminelor, carotenoizilor,
mineralelor şi capacităŃii antioxidante totale, probele de lapte recoltate în tuburi de plastic învelite
în folie de aluminiu pentru a fi protejate de lumină, au fost depozitate la o temperatură de -20°C.
Liofilizarea probelor de lapte şi de brânză. Probele de lapte şi de brânză au fost liofilizate
cu ajutorul unui liofilizator TS-12, pentru a favoriza stabilitatea pe termen lung a
micronutrienŃilor. Câte 3 ml (părŃi alicote) din fiecare probă de lapte au fost liofilizate, timp de 48
h, direct în tuburile de plastic şi apoi depozitate la -20°C. Apoximativ 200 g din fiecare probă de
brânză, ăn stare îngheŃată (corespunzător la 2-3 felii de brânză Abondance, Tomme de Savoie,
Cantalet şi Salers, şi 5 felii din varietatea Rocamadour), au fost tăiate în bucăŃi foarte mici şi
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
103
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

liofilizate timp de 72 h. Probele au fost apoi mixate şi depozitate în tuburi de plastic învelite în
aluminiu la -20°C.
Determinarea compoziŃiei probelor de lapte şi brânză. Profilul acizilor graşi din probele
de lapte şi brânză liofilizate, a fost determinat prin gaz-cromatografie, imediat după
transesterificarea acestora în metil ester, cu ajutorul metoxidului de sodiu.
Carotenoizii (β-caroten, luteină, zeaxantină), vitamina A (toŃi retinolii trans) şi vitamina
E (α-tocoferol) au fost analizaŃi prin HPLC.
Carotenoizii şi vitaminele liposolubile au fost extrase din probe, imediat după adăugarea
standardului intern de echinenonă, cu 2x2 volume de hexan. Xantofilele au fost separate din faza
hexanică prin adăugarea a 2x2 volume de soluŃie de etanol în apă (90/10 % vol). După evaporarea
hexanului, reziduul a fost saponificat timp de 2 h la 37°C, cu o soluŃie de KOH (10% în etanol) şi
pirogalol. FracŃia nesaponificabilă a fost apoi extrasă cu hexan, adăugat reziduului cu xantofile,
rămas după evaporarea etanolului. După evaporare, reziduul uscat a fost în final redizolvat într-un
amestec de acetonitril şi dicloretan (50/50 % vol.) şi supus analizei HPLC.[2]
Rezultatele obŃinute sunt prezentate în tabelele 4.4, 4.5 si 4.6.

Tabel 4.4
Caracteristicile nutriŃionale ale probelor de lapte

Lapte de vacă
Min. Mean ± SD Max.
β-caroten (µg/L) 34.0 118 ± 77 290
xantofile (µg/L) 5.16 14.2 ± 8.2 41.0
vitamina A (µg/L) 128 323 ± 138 764
vitamina E (µg/L) 169 642 ± 396 1437

Tabel 4.5
Efectele procesului tehnologic asupra caracteristicilor nutriŃionale

Procesul tehnologic de obŃinere a tipului de brânză


Abondance Tomme de Cantalet/ Rocamadour
Savoie Salers
β-caroten (mg/kg grăsime) 1.97 1.98 2.17 nestimabilă
xantofile (mg/kg grăsime) 0.16 0.26 0.23 0.19
vitamina A (mg/kg grăsime) 5.09 5.29 4.96 5.82
vitamina E (mg/kg grăsime) 5.67 5.67 5.07 5.71

(Sursa: [2])

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
104
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabel 4.6
ConŃinutul de vitamine şi carotenoizi al brânzeturilor analizate
(rezultatele sunt exprimate per kg de materie proaspătă)

Categoria1 Media ± SD1,2 % RDA1,3


A T C A T C A T C
β-caroten 0.23 - 0.22 - 0.32 - 0.97 ± 1.10 ± 1.41 ± - - -
(µg/kg) 2.14 2.55 3.01 0.5 0.6 0.6
xantofile 22.8 - 28.0 - 23.8 - 72.1 ± 91.6 ± 39 93.2 ± - - -
(µg/kg) 208 189 196 34 36
retinol 0.88 - 0.78 - 1.04 - 1.70 ± 1.60 ± 1.63 ± - - -
(µg/kg) 4.92 4.64 2.30 0.6 0.5 0.3
vitamina A 0.94 - 0.84 - 1.10 - 1.86 ± 1.79 ± 1.86 ± 9.3 8.9 9.3
totală 4.95 4.70 2.64 0.6 0.6 0.3
3
(*10 RE/kg)
α-tocoferol 0.47 - 0.25 - 0.31 - 1.73 ± 1.87 ± 2.06 ± 0.6 0.6 0.7
(µg/kg) 3.62 4.10 4.83 0.9 0.9 0.9
folat 62.8 - 137 - 380 75.2 - 176 ± 269 ± 83 178 ± 2.1 3.3 2.2
(µg/kg) 388 291 85 60
(Sursa: [1])
Legenda:
A - Abondance cheese
T - Tomme de Savoie cheese
C - Cantal-type cheese
SD - Standard Deviation
RDA - Recommended Dietary Allowances.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
105
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CONCLUZII
1) Această etapă de raportare a avut ca obiectiv realizarea unei analize critice,
documentară, a referintelor bibliografice, cu privire la metodica utilizată pentru
selectarea şi determinarea markerilor de tip carotenoizi şi importanŃa acestora pentru
organism.
2) Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea
referinŃelor bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea
markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de
la furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vacă.
3) Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmenŃi vegetali
naturali, galbeni, portocalii sau roşii, răspândiŃi, în principal, în regnul vegetal (în
morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya, mango) şi
în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon).
4) Privarea organismului animal de hrana care conŃine aceşti pigmenŃi poate duce la
dispariŃia culorii caracteristice. FuncŃia fiziologică a carotenoizilor în plante nu este
încă bine cunoscută dar în organismul animal aceşti pigmenŃi au rol esenŃial prin
relaŃiile lor cu vitamina A şi cu substanŃele de pe retină, importante în procesul
vederii.
5) Deoarece pot fixa oxigenul, formând compuşi oxigenaŃi puŃin stabili, pigmenŃii
carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere.
6) Carotenoizii sunt implicaŃi în caracterizarea nutriŃională şi senzorială a produselor
lactate şi pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri pentru managementului trasabilităŃii
creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă.
7) Din studiul efectuat s-a constatat că s-au identificat aproape 10 carotenoizi (ex.
xantofile, carotenoizi) în furaje, concentraŃia lor variind foarte mult în funcŃie de
stadiul de dezvoltare şi durata conservării acestora.
8) Diferitele studii realizate au relevat faptul că animalul şi factorii care Ńin de
hrănirea/alimentaŃia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă), atât din punct de
vedere cantitativ cât şi din punct de vedere calitativ, prin variaŃia concentraŃiei în
carotenoizi.
9) Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de
carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de
măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte
permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor
lactate.
10) Carotenoizii din plante sunt transferaŃi în produsele animale, uneori în concentraŃie
mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută, cum ar fi în
produsele rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a
stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele
diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este
asociată cu păşunatul care, în multe Ńări europene, are conotaŃii de hrană
„naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi ca indicatori ai păşunatului verde.
11) CompoziŃia carotenoizilor în fructe şi legume este mult mai complexă şi variabilă, cu
variaŃii chiar şi la carotenoizii principali si pot fi identificate opt modele principale.
12) Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este
necesară pentru a minimiza pierderile. Modificarea, reducerea conŃinutului sau
pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării alimentelor poate avea loc
şi prin transportul fizic, izomerizarea geometrică sau prin oxidarea enzimatică sau
ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptată spre procesarea industrială,
prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de carotenoizi. La
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
106
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

prepararea alimentelor în casă, pierderea carotenoizilor are loc în felul următor:


microunde<abur<fierbere<prăjire.
13) O serie de studii au relevat că în timpul maturării sau păstrării brânzei pe parcursul
anului nu apar modificări sau apar doar modificări minore în ceea ce priveşte
concentraŃia de retinol şi carotenoizi.
14) În ciuda faptului că există o mare varietate de carotenoizi în plante, în furaje nu se
găsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importanŃi, din punct de vedere cantitativ,
sunt β-carotenii şi luteina.
15) Până acum, metodele adecvate pentru determinarea carotenoizilor din furaje au inclus
metode care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin Layer
Chromatography- Cromatografie în strat subŃire]). In ultima perioadă au fost puse la
punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure Liquid
Chromatography). Este important să se pună accentul pe faptul că cele mai multe
metode de depozitare a probelor (ex. liofilizarea, îngheŃarea-dezgheŃarea,
refrigerarea), precum şi depozitarea pe termen lung, înaintea analizării, au efect de
degradare a acestor substante.
16) DiferenŃele concentraŃiilor de carotenoizi din speciile de furaje verzi sunt mai puŃin
semnificative faŃă de diferenŃele acestora din speciile de furaje uscate.
17) Uscarea furajelor la soare scade puternic concentraŃia de carotenoizi, în special când
plouă în timpul întoarcerii şi strângerii/adunării fânului cosit. Studiile realizate de
Chauveau-Duriot şi co. au arătat că din momentul cosirii fânului şi până în momentul
însilozării fânului uscat se înregistrează o pierdere medie a carotenoizilor de până la
83%.
18) Independent de veştejire, procesul de însilozare determină scăderea concentraŃiei de
carotenoizi. Pierderile de carotenoizi depind de pH şi sunt favorizate de condiŃiile
aerobe. Aceste pierderi sunt mai mari în cazul legumelor decât în cazul ierbii, când
pH-ul este mare (~ 5) şi când sigilarea silozului este întârziată, crescând proporŃional
cu timpul de depozitare. Pierderile maxime pot ajunge până la 80% din concentraŃia
iniŃială, dar în silozurile bine construite pierderile sunt, în general, mai mici de 20%.
19) Majoritatea nutreŃurilor concentrate folosite în hrana vacilor au un conŃinut foarte
scăzut de carotenoizi. Procesarea nutreŃurilor pentru obŃinerea de concentrate implică,
adesea, încălzirea care, probabil, distruge cea mai mare parte din conŃinutul de
carotenoizi.
20) ConcentraŃia de carotenoizi din laptele de vacă este determinată de natura şi de
cantitatea de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj, precum şi
prin transferul acestora din matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea
scăzută a carotenoizilor din lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer
şi se estimează că etapele diferite de transfer ale carotenoizilor, din hrană în lapte, pot
influenŃa disponibilitatea acestora în glandele mamare. ConcentraŃiile de carotenoizi
şi retinol în laptele de vacă, raportate în literatură, variază foarte mult între diferite
studii, de la 1  17 pentru carotenoizi şi, respectiv, de la 1  12 µg/g grăsime,
pentru retinol.
21) ConcentraŃia de carotenoizi din lapte diferă în funcŃie de: specie, rasă, faza de
lactaŃie, starea de sănătate, producŃia de lapte şi grăsimea din lapte, variabilitatea
individuală.
22) Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în
componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul care
determină variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui. MulŃi
cercetători au demonstrat că, în afară de aspectele legate de conŃinutul de
substanŃă uscată din brânză, variabilitatea compoziŃională a acesteia în acizi graşi,
β-caroten, xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compoziŃia „laptelui
original”. CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
107
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

şi carotenoizi, este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compoziŃia


biologică, stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de
rasă, de modul de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles, de stagiul de lactaŃie în care se
află animalul.
23) Carotenoizii din lapte influenŃează proprietăŃile senzoriale ale produselor din lapte fie
indirect, prin intermediul proprietăŃilor antioxidante, fie direct, prin proprietăŃile lor
de îngălbenire.
24) Alegerea celei mai adecvate metode pentru analiza carotenoizilor este, de obicei,
determinată de tipul de informaŃii necesare a fi obtinuŃe. În general, pigmentul
carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte
complexă.
25) Principiul metodelor de determinare se bazeaza pe separarea cromatografica si pot fi:
separarea cu coloană cromatografică în curent de apă – metoda clasica de separare a
carotenoizilor, pentru analiza cantitativă; cromatografia în strat subŃire (TLC), deşi
este eficientă în monitorizarea testelor chimice în vederea identificării rezultatelor, nu
este adecvată pentru analizele cantitative, din cauza pericolului de degradare şi
izomerizare la expunerea îndelungată pe masa de lucru; cromatografia cu gaze este,
de asemenea, neadecvată, datorită instabilităŃii termice şi a volatilităŃii reduse pe care
o prezintă marea majoritate a carotenoizilor; determinarea prin HPLC pe coloane C18
poate fi modul preferat pentru separarea carotenoizilor pentru analizele cantitative.
26) Din cauza variaŃiilor cantitative şi calitative a carotenoizilor din compoziŃia
alimentelor, este discutabil dacă poate fi stabilit un singur sistem cromatografic care
să poată fi aplicat mai multor tipuri de alimente.
27) Schiedt şi co. au definit criteriile minime necesare pentru identificarea carotenoizilor:
o spectrul de absorbŃie în regiunea UV, obŃinut în cel puŃin 2 solvenŃi diferiŃi,
trebuie să fie compatibil cu cromoforul sugerat;
o proprietăŃile cromatografice obŃinute trebuie să fie identice, atât prin metoda TLC
cât şi prin HPLC; co-eluŃiile trebuie făcute cu probe autentice;
o trebuie obŃinut un spectru de masă care să permită cel puŃin confirmarea masei
moleculare.
În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brută a pigmenŃilor prezenŃi într-un
extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exactă a pigmenŃilor
dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea şi cuantificarea
definitivă a pigmenŃilor necesită, de obicei, realizarea unor standarde, care sunt decisive în
analiza pigmenŃilor din produsele alimentare.

BIBLIOGRAFIE

[1] Lucas, A. si colab., 2006a. Relationship between thw conditions of cow’s milk production
and the contents of components of nutritional interest in raw milk farmhouse cheese,
INRA, 86, p. 177 – 202
[2] Lucas, A. si colab., 2006b. Respective effects of milk composition and the cheese-making
process on cheese compositional variability in components of nutritional interest, INRA,
86, p. 21-41
[3] Noziere, P. si colab., 2006a. Carotenoids for ruminants: From forages to dairy products,
Animal Feed Sc. and Tech., vol 131 (3-4), p. 418-450
[4] Noziere, P. si colab., 2006b. Variation in fat-soluble micronutrients in milk, Journal of
Dairy Science, vol. 89, 7, p.2634-2648
[5] Rodriguez-Amaya, B., Delia, Kimura, Mieko, 2004. HarvestPlus Handbook for Carotenoid
Analysis, HarvestPlus Technical Monograph 2, IFPRI si CIAT, SUA
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
108
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

[6] Schoefs, B., 2002. Chlorophyll and carotenoid analysis in food products. Properties of the
pigments and methods of analysis, Trends in F. Sc. & Tech., 13 , p. 361-371
[7] Stan R., 2007. Aditivi alimentari - Produsi naturali si de sinteza, Ed. Printech, Bucuresti
[8] *** ebooks.unibuc.ro/biologie/ProgreseVolumul2/Articolul9a.doc
[9] *** http://cabcab.home.ro/carte.html 6.10.08 9:45
[10] *** http://www.usamvcluj.ro/html/doctorat/data/Pentelescu_Ovidiu_ro.pdf (accesat
1.02.2009)

E. Activitate II.1.5. – IBNA


Estimarea valorii nutritive a nutreŃurilor şi elaborarea raŃiilor pentru
vacile de lapte.

1. Rezumatul etapei
Vaca de lapte este o „masinarie animala” din ce in ce mai performanta a carei
eficacitate si productivitate este dependenta de fondul genetic pe care-l are de modul de
alimentatie si de management.
Genetica a facut, in ultimul timp, progrese rapide chiar spectaculoase, obitnandu-
se animale de mare potential. Crescatorii de vaci trebuie sa beneficieze de animale cat
mai bune, dar sa nu creada ca pot obtine performante numai cu vaci de valoare,
subestimand conditiile de mediu.
Alimentatia incearca sa raspunda, dar din ce in ce mai dificil, dificultatilor legate
de cresterea performantelor genetice ale vacilor de lapte. Vacile de mare potential au
exigente nutritionale foarte ridicate si sunt din ce in ce mai putin tolerante la orice eroare
de alimentatie. Cunoasterea caracteristicilor nutreturilor utilizate in hrana acestora are o
insemnatate speciala.
Se considera astfel ca aprecierea valorii energetice şi proteice a nutreŃurilor la
rumegătoare are un caracter dinamic, care Ńine atât de procesul continuu de ameliorare a
capacităŃii acestora de a ingera şi valorifica nutreŃurile, cât şi de factorii exogeni, ce au în
vedere natura furajelor, tehnologia de preparare şi conservare a lor, în general
tehnologiile de exploatare.
Valoarea nutritivă a nutreŃurilor reprezintă capacitatea acestora de a satisface
cerinŃele de substanŃe nutritive ale animalelor, fie pentru întreŃinere, fie pentru sinteza
diferitelor produse zootehnice, care se măsoară prin experienŃe de bilanŃ energetic şi al
azotului.
NutreŃurile diferă între ele prin compoziŃia lor chimică şi conŃinutul în calorii şi
sunt utilizate de către animale în funcŃie de specie, iar în cadrul speciei de categoria de
producŃie, starea fiziologică etc.
Ca urmare a acestor diferenŃe, care Ńin atât de natura furajului, cât şi de natura
animalelor care le utilizează, s-a ivit încă de la început dificultatea comparării valorii
nutritive a nutreŃurilor atunci când s-a pus problema substituirii unui furaj cu altul în
raŃiile de hrană.
S-a constatat ca element comun de legătură conŃinutul nutreŃurilor în energie, care
ca energie brută, raportat la kg substanŃă uscată este asemănător la cea mai mare parte din
furajele utilizate în mod obişnuit şi s-a considerat că exprimarea valorii nutritive prin
acest parametru rezolvă problema, cu atât mai mult cu cât gradul de conversie a furajului

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
109
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

în produse animaliere se poate face cu mai mare uşurinŃă şi precizie tot prin etalonul
energetic.
Compararea energetică a nutreŃurilor s-a făcut, la început, ca energie digestibilă,
corespunzătoare măsurării digestibilităŃii furajelor; apoi, ca energie metabolizabilă, când
a fost posibilă şi măsurarea energiei urinei şi a gazelor de fermentaŃie (metanul) şi în
sfârşit, ca energie netă, fie pentru întreŃinerea vieŃii, fie pentru sinteza diferitelor produse
animaliere, când a fost posibilă şi măsurarea energiei calorice corespunzătoare
metabolismului energetic de întreŃinere şi a extracaloriilor proceselor de asimilaŃie ş i
dezasimilaŃie din organismele animale.
În prezent, în sistemele moderne de apreciere a valorii nutritive a nutreŃurilor,
acestea se compară sub aspectul efectului lor productiv, iar unitatea de măsură, diferită de
la sistem la sistem, are comună energia netă, fie pentru îngrăşare, fie pentru producŃia de
lapte, fie pentru întreŃinere + îngrăşare sau pentru toate acestea la un loc, pentru moment
fiind soluŃia cea mai bună.
Ultimele cercetări de fiziologie a nutriŃiei, relevă rolul important pe care îl are
echilibrarea raŃiilor de hrană în energie şi în substanŃe azotate. Astfel, la rumegătoare, la
care după cum se cunoaşte, 60-70% din necesarul proteic este asigurat de masa
microbiană, care se dezvoltă în rumen, acesta se apreciază nu numai în funcŃie de
cantitatea de proteină brută a nutreŃului ingerat, ci şi de cantitatea de substanŃă organică
fermentescibilă (SOF), utilizată de către microorganisme pentru dezvoltarea lor, în aşa fel
încât, proteina real digestibilă la nivel intestinal este reprezentată de două valori ş i
anume: proteina digestibilă intestinală de origine alimentară (PDIA) şi proteina
digestibilă intestinală de origine microbiană (PDIM), care la rândul ei este potenŃial
permisă de conŃinutul de azot (PDIN), dar şi de cel în energie al raŃiei (PDIE).
Aşadar, în acest mod, fiecare nutreŃ este caracterizat prin două valori potenŃiale ca
proteină digestibilă, modalitate care asigură posibilitatea echilibrării raŃiei cu substanŃe
azotate, în situaŃia în care la unul din furaje prevalează cantitativ substanŃele organice
fermentescibile.
Calculul raŃiilor furajere la vacile de lapte este o operaŃiune complexă care
necesită mai multe etape dată fiind variabilitatea mare a producŃiilor fiecarui animal în
parte. De aceea, numai prin alcătuirea grupelor de producŃie în cadrul unei cirezi sau, mai
bine, prin dozarea individuală a nutreŃurilor concentrate pentru fiecare animal, adăugate
la raŃia de bază de nutreŃuri de volum, se poate asigura hrănirea acestora în condiŃii
optime de exploatare.
Mai întâi, trebuie să se parcurgă mai multe etape şi anume:
- calculul normelor de hrană;
- estimarea valorii nutritive a nutreŃurilor;
- aprecierea raŃiei de bază – nutreŃuri de volum;
- completarea raŃiei de bază cu nutreŃuri concentrate.
Pentru formularea raŃiilor care să asigure nivelul producŃiilor planificate inclusiv a
funcŃiei de reproducere şi a stării de sănătate sunt necesare următoarele elemente:
InformaŃii despre animal:
- greutatea vacii;
- producŃia posibilă maximă zilnică;
- conŃinutul în grăsime al laptelui;
- saptamâna / luna de lactaŃie;
- luna de gestaŃie (ultimele 3 luni).
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
110
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

InformaŃii despre nutreŃuri:


- tipul şi stocurile de nutreŃuri din depozit sau din culturi (masa verde);
- potenŃialul productiv energetic, proteic, vitaminic şi mineral al nutreŃurilor;
La aprecierea normelor de hrana pentru vacile de lapte se iau în calcul :
- normele de întreŃinere;
- normele pentru gestaŃie;
- normele pentru producŃia de lapte;
- normele pentru sporul (creşterea, respectiv pierderea ) de greutate;
- normele pentru activitate fizică suplimentară.
2. ImportanŃa structurii raŃiei asupra digestiei ruminale şi a producŃiei.

Un rol important asupra mersului normal al digestiei ruminale îl are tipul


alimentaŃiei. Atât structura raŃiei, echilibrarea ei cît şi modul de preparare şi programul
de furajare pot influenŃa procesele ruminale şi prin aceasta funcŃia de reproducŃie şi
producŃia animalelor.
Un indiciu al mersului proceselor digestiei îl constituie pH-ul rumunal. Valorile
normale ale lui, cuprinse între 6,3 şi 6,9 sunt realizate la o raŃie pe bază de fibroase
strucrurate (fân, paie, porumb siloz recoltat în faza de lapte, lapte – ceară) în care
celuloza să reprezinte minimum 14% din substanŃa uscată la vaci şi 12% la juninci ş i
tauri. La o raŃie pe bază de fibroase se realizează o secreŃie salivară abundentă care prin
proprietatea tampon, menŃine pH-ul ruminal la valori ridicate.
NutreŃurile concentrate, rădăcinoasele şi chiar nutreŃul murat, bogat în apă
reduc secreŃia salivară, astfel că, în funcŃie de proporŃia acestora în raŃie, pH-ul ruminal
scade până la valori de 5,5. Trecerea rapidă de la raŃii cu cantităŃi mari de concentrate sau
rădăcinoase (mai ales sfecla de zahăr) pot reduce pH-ul la valori sub 4,6 ca o consecinŃă a
transformării rapide a glucidelor uşor digestibile în acid lactic, ce se resoarbe mai slab la
nivelul rumenului.
O scădere a pH-ului ruminal până la limitele valorilor critice atrage după sine
apariŃia acidozei cu consecinŃe asupra consumului, reducerea procentului de grăsime din
lapte, modificarea calităŃii laptelui, tulburări de reproducŃie. Pe de altă parte, raŃiile sărace
în glucide şi bogate în proteine reduc concentraŃia AGV în paralel cu creşterea valorii
amoniacului în rumen. Apare în acest caz alcaloza ruminală care este de asemenea
dăunătoare.
Cunoaşterea factorilor care intervin în digestia ruminală se impune atât în scopul
menŃinerii sănătăŃii animalelor cât şi în cel al dirijării metabolismului corespunzător
tipului de producŃie urmărit.

3. Necesarul vacilor de lapte


Pentru menŃinerea vieŃii, pentru producerea laptelui, pentru dezvoltarea fetuşilor
şi pentru depunerea rezervelor corporale vacile solicită un anumit necesar (apă, energie,
proteină, minerale, vitamine). Acest necesar este acoperit prin aporturile nutreŃurilor.
Teoretic, aporturile nutreŃurilor ar trebui să fie egal cu necesarul de hrana, de aceea
necesrul se ajustează cu un coeficient de siguranŃă variabil in funcŃie de natura
necesarului.

3.1. Necesarul de energie.


Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
111
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CerinŃele de energie ale animalelor corespund energiei fixate în producŃii ş i


energiei pierdute prin căldură, în urma activităŃilor organismului.
Se pot distinge trei tipuri de cerinŃe energetice:
-cerinŃe energetice pentru întretinere, pentru menŃinerea vieŃii animalelor si bunei
funcŃionări a organismului;
-cerinŃe energetice pentru producŃie (în cazul vacilor producŃia de lapte, fetuşii ş i
rezervele corporale);
- cerinŃe energetice consecutive utilizării nutreŃurilor, care se manifestă prin
producŃia de căldură denumit şi extracăldură.
Deoarece necesarul energetic al vacilor nu poate fi asigurat numai prin furaje de
volum, folosesc în raŃii şi concentrate, uneori în cantităŃi mari ce antrenează unele
interacŃiuni digestive. Aceasta înseamna că, prin folosirea concentratelor se induce
modificarea parametrilor de funcŃionare ai rumenului (limitarea florei celulozolitice,
scăderea ph-ului, care perturbă digestia furajelor de volum şi scade digestibilitatea raŃiei
totale.
Aportul energetic total al raŃiei este, în aceste condiŃii, inferior sumei aporturilor
energetice ale furajelor de volum şi ale concentratelor, care compun raŃia. Pentru a Ńine
seama de aceste fenomene se face o corecŃie a necesarului de energie pe baza unor tabele
care indică coeficienŃi crescând de la 0,1 până la 2,2 pentru producŃii de lapte de la 15 la
40 l lapte pe cap şi pe zi.

3.2. Necesarul de proteină.


NutriŃia proteică a rumegătoarelor se bazează pe două aspecte:
- celulele, Ńesuturile au acelaşi necesar în aminoacizi ca la monogastrice;
- aminoacizii absorbiŃi la nivelul intestinului subŃire au o dublă origine: proteină
alimentară nedegradată în rumen şi proteină microbienă formată în rumen-reŃea. Dacă la
monogastrice este posibilă exprimarea necesarului în proteină brută şi aminoacizi
esenŃiali, la rumegătoare sistemul proteinei brute şi chiar al proteinei brute digestibile nu
mai este suficient.
Un sistem care să coresundă exigenŃelor trebuie să ia în consideraŃie tot ce se poate
şti în legătură cu utilizarea digestivă şi metabolică a proteinelor. Un asemenea sistem
este sistemul proteinei digestibile la nivel intestinal (PDI) care exprimă aporturile
nutreŃurilor şi necesarul animalelor la nivelul absorbŃiei aminoacizilor în intestinal
subŃire – proteină real digestibilă.

3.3. Exprimarea valorii proteice a nutreŃurilor în PDI.


Valoarea proteică a nutreŃurilor în sistemul PDI este suma a două fracŃiuni:
- proteină real digestibilă în intestinal subŃire de origine alimentară sau PDIA;
- proteina real digestibilă în intestinul subŃire de origine microbiană sau PDIM.
PDI = PDIA + PDIM
łinând cont de cei doi factori limitanŃi ai proteosintezei, energia fermentescibilă şi
proteina degradabilă, se pot distinge două valori PDIM:
- cantitatea de proteină microbienă care poate fi obŃinută pornind de la azotul
degradabil disponibil este valoarea PDIMN ( proteină digestibilă la nivel
intestinal, de origine microbienă permisă de azotul din raŃie);

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
112
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

- cantitatea de proteină microbienă care poate fi obŃinută pornind de la energia


fermentescibilă disponibilă este valoarea PDIME (proteină digestibilă la nivel
intestinal, de origine microbienă permisă de energia din raŃie).
Deci, fiecare nutreŃ are două valori PDI:

PDIN= PDIA+ PDIMN


PDIE = PDIA +PDIME

Cea mai mică dintre aceste valori este valoarea proteică efectivă a unui nutreŃ
atunci când el este distribuit singur animalelor. Valoarea cea mai mare poate fi
considerată valoare potenŃială, valoare maximală, care nu poate fi atinsă decât dacă
nutreŃul respectiv este asociat cu alte nutreŃuri.
Pentru alcatuirea raŃiilor de hrana la orice specie de animale este necesar mai
întâi cunoaşterea potenŃialului productiv al nutreŃurilor, mai precis conŃinutul în elemente
nutritive, în energie, vitamine şi elemente minerale ce de altfel presupune estimarea
valorii nutritive a acestora.
În cazul nostru, constituirea raŃiilor pentru vacile de lapte care vor reprezenta
loturile experimentale în cadrul protocolului din acest proiect se va face pe baza
următoarelor nutreŃuri :
- fân de lucernă
- siloz de porumb
- masă verde (lucernă + golomăŃ)
- nutreŃ combinat V1
- nutreŃ combinat V2

Structura amestecului de nutreŃ combinat V1 (în procente):


- porumb - 32,5
- grâu - 25,5
- şrot fl soarelui - 30
- şrot soia -8
- carbonat Ca -2
- sare -1
- premix -1
Structura amestecului de nutreŃ combinat V2
- porumb - 39
- srot f. soarelui - 20
- şrot soia -8
- tărâŃe grâu - 30
- cretă f. - 1,4
- fosfat dialc. - 0,6
- premix -1

Tabel 1. CompoziŃia chimică a nutreŃurilor


Specificare SU PB GB Cel B Cen SEN SO EB

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
113
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Fân lucernă 1000 194 29 306 104 372 896 18,22


865 168 21 265 90 321 775 15,76
Siloz porumb 1000 78 19 234 71 598 929 18,52
326 25 6 76 23 196 303 6,03
NC vaci 1 1000 193 34 96 69 608 931 18,55
880 170 30 84 61 535 819 16,32
NC vaci 2 1000 189 36 98 55 622 945 18,77
884 167 32 87 48 550 836 16,59
NV (golom + 1000 165 38 294 106 397 894 18,28
lucernă) 210 35 8 62 22 83 188 16,59
Pentru stabilirea valorii nutritive a nutreŃurilor s-a utilizat modelul matematic de
simulare a metabolismului energetic şi proteic la rumegătoare parcurgându-se
următoarele etape:

3.4. Etapele de determinare a valorii nutritive energetice a silozului de


porumb.

Pe baza compziŃiei chimice Weende s-a pus în evidenŃă un conŃinut de 269 g


SU/kg furaj şi o concentraŃie în cenuşă de 71 g, în PB de 78 g şi în Cel.B de 234 g.
Se calculează mai întâi cantitatea de PB şi de CB la 1 kg substanŃă organică (SO)
după ce se determină cantitatea de SO la un kg SU:

1. g SO/kg SU = 1000 g SU – g cenuşă

adică, 1000 g SU – 71 g cenuşă = 929 g SO, apoi se raportează cantităŃile de PB şi CB la


cantitatea de substanŃa organică folosind regula de trei simple, astfel:

g PB/kg SU x g SU 78 x 1000
2. g PB/kg SO = --------------------------- = ---------------- = 83,96 g
g SO 929

g CB/kg SU x g SU 234 x 1000


3. g CB/kg SO = --------------------------- = ---------------- = 251,88 g
g SO 929

4. Energia brută s-a determinat prin intermediul calorimetrului adiabatic (bomba


calorimetrică) metodologie descrisă de Burlacu şi col., 1991.

EB /1000 g SU = 18,52

5. SODv = 664 +1,007 PB – 0,00085 CB


= 664 + 1,007 x 83,96 – 0,00085 x 251,88
= 664 + 84,55 – 0,214098 = 748,34
SOD = 0,920 SODv + 60 – h
= 0,920 x 748,34 + 60 – 20
= 688,47+ 60 – 20 = 728,47

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
114
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

6. Calculul digestibilităŃii energiei brute (EB) a nutreŃurilor (dEB):


- pentru silozuri: 0,10263 x SOD – 5,723
0,10263 x 728,47 – 5,723
74,76 – 5,723 = 69,04
7. Calculul energiei digestibile (ED) a unui kg SU nutreŃ:

ED = EB x dEB = 18,52 x 0,690 = 12,78 MJ/kg SU

8. Calculul energiei metabolizabile (EM):


EM
------ = 0,8417 – 0,000099 CB – 0,000196 PB + 0,0211 NPA
ED
= 0,8417 – 0,000099 x 251,88 – 0,000196 x 83,96 + 0,0211 x 1,5
= 0,8417 – 0,02493612 – 0,01645616 + 0,03165 = 0,83

9. Calculul energiei metabolizabile (EM) a unui kg SU nutreŃ:

EM
EM = ED x ------ = 12,78 x 0,83 = 10,61 MJ/kg SU
ED

EM 10,61
10. q = ------- = ---------- = 0,57
EB 18,52

Kl = 0,24 x q + 0,463
= 0,24 x 0,57 + 0,463 = 0,600

ENL = EM x Kl = 10,61 x 0,600 = 6,37 MJ/kg SU

ENL nutreŃ 6,37


Valoarea UNL = ---------------- = --------- = 1,05
ENL ovăz 6,07

0,3358 x q2 + 0,6508 x q + 0,005 0,3358 x (0,57)2 +0,6508 x 0,57+0,005


Kmp= ------------------------------------------ = -------------------------------------------------
0,9235 x q + 0,283 0,9235 x 0,57 + 0,283

0,10910142 + 0,370956 + 0,005 0,48505742


= ------------------------------------------- = ---------------- = 0,600
0,526395 + 0,283 0,809395

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
115
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

ENC = EM x Kmp = 10,61 x 0,600 = 6,37 Mj/kg SU

ENC nutreŃ 6,37


Valoarea UNC = ---------------- = --------- = 1,03
ENC ovăz 6,16

Modalitatea de calcul pentru determinarea valorii nutritive proteice a silozului


de porumb.

Pentru calculul valorii proteice s-a considerat:


Dg reprezintă degradabilitatea substanŃelor azotate în rumen şi pentru porumbul
siloz = 0,82;
dr reprezintă digestibilitatea reală a proteinelor care pentru porumbul siloz =
0,70;
PF reprezintă produşii de fermentaŃie, care pentru porumbul siloz cu 33,02% SU
= 80.

SOF (g/kg SU) = SOD - [PB x (1 –Dg) + GB + PF]

= 728,47 - [78 x (1 – 0,82) + 19 + 80]


= 728,47 – 78 x 0,18 – 19 - 80
= 728,47 – 14,04 – 19 – 80 = 615,43 g/kg SU

PDIA (g/kg SU) = PB (g/kg SU) x (1 – Dg) x dr


= 78 x (1 – 0,82) x 0,70
= 14,04 x 0,70 = 9,83 g/kg SU

PDIMN (g/kg SU) = PB (g/kg SU) x [1 – (1 - Dg)] x 0,9 x 0,8 x 0,8


= 78x [1 – (1- 0,82)] x 0,9 x 0,8 x 0,8
= 78x 0,82 x 0,9 x 0,8 x 0,8 = 36,84 g/kg SU

PDIME (g/kg SU) = SOF x 0,145 x 0,8 x 0,8 =


= 615,43 x 0,145 x 0,8 x 0,8 = 57,11 g/kg SU

PDIN (g/kg SU) = PDIA + PDIMN


= 9,83+ 36,84 = 46,67 g/kg SU

PDIE (g/kg SU) = PDIA + PDIME


= 9,83+ 57,11 = 66,94 g/kg SU

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
116
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Tabel 2. Valoarea nutritivă (g/kg nutreŃ /kg SU)


Specificare SU UNL PDIN PDIE Ca P
Fân lucernă 1000 0,79 103 83 15 2
865 0,68 89 72 13 1,7
Siloz porumb 1000 1,05 47 67 2,5 3,3
326 0,34 16 21 0,8 1,0
NC vaci 1 1000 1,1 147 127 7,0 8,8
880 0,97 129 112 6,0 7,7
NC vaci 2 1000 1,09 139 122 7,4 8,2
884 0,96 123 108 6,5 7,2
NV 1000 0,88 91 92 9,5 2,8
(golom.+lucernă) 210 0,19 19 19 2,1 0,6

Cunoscându-se valoarea nutritivă a nutreŃurilor s-au putut alcătui raŃii pentru vaci
de lapte în plină lactaŃie, pe perioada de iarnă şi pentru perioada de vară.

Tabel 3. Exemplu de raŃie de hrană pentru vaci de lapte cu o greutate corporală de


550 kg , cu o producŃie medie zilnică de lapte cuprinsa intre 25 si 30 l, cu un procent
de grăsime de 4%, pe perioadă de iarnă (R1)
NutreŃul St. Nat SU UNL PDIN PDIE Ca P
(kg) (kg) (g) (g) (g) (g)
Norma - 17,2-21,5 19,41 1700 1700 102 65
Fân lucernă 3,46 3 2,37 309 249 45 6
Siloz porumb 29,14 9,5 9,97 447 636 24 31
RB - 12,5 12,34 756 885 69 37
Deficit - - 7,07 944 815 33 28
NC 7,32 6,45 7,09 948 819 45 57
TOTAL asigurat - 18,95 19,43 1704 1704 114 94
În cazul exemplului de raŃie de mai sus s-au folosit ca nutreŃuri de bază fânul de
lucernă şi silozul de porumb, repezentând principalele categorii de nureŃuri de volum din
Ńara noastră cu precădere din Câmpia Română. Pentru acoperirea deficitului apreciat după
raŃia de bază s-a adăugat o cantitate de nutreŃ combinat până la atigerea normei de
energie, dictată de cumulul de unităŃi nutritive lapte (UNL), a celei de proteină prin
(PDIN )şi (PDIE) respectiv pentru săruri. S-au asigurat astfel unităŃile nutritive şi cele
două secvenŃe de proteină tocmai aşa cum se cere pentru a nu se face nici un fel de risipă
din aceste componente. De regulă este foarte greu de echilibrat cele două componente
proteice după cum vom vedea în celelalte exemple.

Tabel 4. Exemplu de raŃie de hrană pentru vaci de lapte cu o greutate corporală de


600-650 kg, cu o producŃie medie zilnică de lapte de 35 l, cu un procent de grăsime
de 4%, pe perioadă de vara (R2)
NutreŃul St. Nat SU UNL PDIN PDIE Ca P
(kg) (kg) (g) (g) (g) (g)
Norma - 20-22 21 2175 2175 135 90
Fân lucernă 4,62 4,0 3,16 412 332 60 8
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
117
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Masa verde (luc.-golomat) 43 9,03 7,95 822 859 86 25


RB - 13,03 11,1 1234 1191 146 33
Deficit - - 9,9 941 984 - 57
Porumb 4,06 3,5 5,07 301 406 1,05 10,15
Srot soia 3,57 3,21 4,46 1053 578 11,9 24,32
Asigurat - 19,74 20,63 2588 2175 135+ 67,47
Fosfat dicalc. 0,130 0,130 - - - - 22,53

În cazul acestei raŃii ( R2) deşi se asigură aproape perfect necesarul energetic
(UNL) în corelaŃie strânsă cu proteina dictată de efectul substanŃelor fermentescibile din
întreaga raŃie (PDIE), proteina digestibilă intestinală permisă de conŃinutul în azot
(PDIN) depăşeşte valoarea dictată de normă, lucru care nu poate fi uşor evitat, cele câteva
sute de grame de proteină consumându-se cu o eficienŃă scăzută. Deşi, asistăm la
acumularea unui surplus al unei componente proteice, aceptăm această situaŃie tocmai
pentru a nu înregistra minusuri la altele. Deci, se consideră suficiente elementele
constitutive ale unei raŃii atunci când fiecare dintre ele atinge cantitatea impusă de normă.
Pentru această raŃie care propune şi o cantitate de lapte de cel puŃin 35 l zilnic pe lângă
raŃia de bază care a solicitat şi un fân de leguminoase se cere adăugat şrot de soia (liznă ş i
metionină) într-o proporŃie aproape egală cu porumbul, care până la urmă să asigure
proteina digestibilă intestinală tot printr-un surplus de PDIN.

Tabel 5.
Specificare SU UNL PDIN PDIE Ca P
Porumb 1000 1,45 86 116 0,3 2,9
860
Srot soia 1000 1,37 328 180 3,7 7,6
900

Se observă astfel necesitatea asigurării unor nutreŃuri cu o concentraŃie sporită atât


în energie cât şi în proteină mai ales când se au în vedere vaci cu productivităŃ i
deosebite.

Tabel 6. Exemplu de raŃie de hrană pentru vaci de lapte cu o greutate corporală de


550 kg, cu o producŃie medie zilnică de lapte de 15 l, cu un procent de grăsime de
4%, pe perioadă de iarnă (R3)
NutreŃul St. Nat SU UNL PDIN PDIE Ca P
(kg) (kg) (g) (g) (g) (g)
Norma - 13 12,3 1029 1029 70 50
Fân lucernă 3,42 3,0 2,37 309 249 45 6
Siloz porumb 21,93 6,58 6,9 309 440 16 22
RB - 9,58 9,27 618 689 61 28
Deficit - - 3,03 411 340 9 22
N.C. V1 3,17 2,79 3,07 411 354 19 24
Asigurat - 12,37 12,34 1029 1043 80 52

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
118
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

În cazul vacilor cu producŃii modeste de lapte, partea energetică, proteina cât ş i


mineralele se pot asigura din mai puŃine ingrediente fără să fie necesare cantităŃ i
importante de nutreŃuri concentrate. Din studii pe vaci hrănite cu raŃii cu diferite rapoarte
între nutreŃurile de volum şi cele concentrate s-a observat că dacă animalele primesc în
hrană nutreŃuri de volum cum ar fi lucernă sau pormb plantă sub diferite forme de
conservare, însă de foarte bună calitate, pentru o vacă cu o producŃie zilnică de numai 15
l lapte nu este necesară adăugarea de nutreŃuri concentrate.

4. Concluzii
Pentru satisfacerea cerinŃelor nutriŃionale ale vacilor de lapte se impun
următoarele:
- cunoaşterea normelor de hrană: - norma de substanŃă uscată (kg);
- norma de energie netă lapte (UNL);
- norma de proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g);
- normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g);
- normele de microelemente şi vitamine (mg; UI);
- capacitatea de ingerare a hranei (USV);
- raportul dintre PDIE/UNL.
- cunoaşterea valorii nutritive a nutreŃurilor:
- conŃinutul în substanŃă uscată (g/kg SN);
- conŃinutul în energie netă lapte (UNL/kg SU);
- conŃinutul în proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g/kg SU);
- conŃinutul în macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g/kg SU);
- conŃinutul în microelemente şi vitamine (mg/kg SU sau UI/kg SU);
- ingestibilitatea nutreŃului (USV/kg SU).
- date despre animal: - greutatea potenŃială a vacii, G (kg);
- producŃia potenŃială maximă zilnică de lapte PlM (kg/zi);
- conŃinutul în grăsime al laptelui GrL (%);
- săptămâna de lactaŃie “n”;
- luna de gestaŃie ( se iau în consideraŃie numai lunile 8 şi 9).
Bibliografie
1. Alderman G. (1993) – Energy and protein requirements of ruminants, CAB International
Wallingsford, UK.
2. Burlacu Gheorghe (1991) – Metode şi tehnici pentru masurarea valorii nutritive a nutreŃurilor.
Editura CERES, Bucureşti.
3. Burlacu Gh., Cavache A. şi Burlacu R. (2002) – PotenŃialul productiv al nutreŃurilor şi
utilizarea lor. Editura Ceres, Bucureşti.
4. Crista Nicolae (1985) – Digestia, metabolismul şi producŃiile la rumegătoare. Editura
CERES, Bucureşti
5. R. Jarrige (1993) – AlimentaŃia bovinelor, ovinelor şi caprinelor. Ed. INRA, Paris.
6. Nicolae Mircea, Petroman Ioan (1999) – Nutritia vacilor de lapte , Editura Mirton,
Timisoara.
7. Stoica Ioan şi Liliana Stoica (2001) – Bazele nutriŃiei şi alimentaŃiei animalelor, Editura
Coral Sanivet, Bucureşti.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
119
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CONCLUZII

A:
1. Majoritatea procedurilor de preparare a probelor pentru determinarea compuşilor din
plante sunt dezvoltate în aşa fel încât extractul final introdus în coloanle GC şi HPLC sau
capilarele CE să conŃină numai analitul cu toate interferenŃele eliminate.

2. O comparaŃie a tehnicilor de extracŃie descrise anterior pentru izolarea componenŃilor


din materialul plantelor este prezentata în tabelul 8.

Tabelul 8 – ComparaŃie între diferite tehnici de extracŃie lichid – lichid utilizate în


analiza metaboliŃilor plantelor.
ExtracŃie Soxhlet USE ASE MAE SFE
Cost scăzut scăzut ridicat mediu ridicat
Timp de 6 – 48 h < 30 min < 30 min < 30 min < 60 min
extracŃie
Solvent 200 – 600 < 50 < 100 < 40 <10
utilizat (mL)
USE – ultrasonic extraction; ASE – accelerated solvent extraction; MAE – microwave-
assisted extraction; SFE – supercritical fluid extraction

În lucrarea realizată de G. Romanik şi colab. sunt prezentate tehnicile de pregătire


a materialului plantelor în vederea separării şi analizei cromatografice, printre acestea:
extracŃia Soxhlet, extracŃia cu ultrasunete (sonicare), extracŃia accelerată cu solvent,
distilare cu abur, procese de membrană, extracŃia cu fluide supercritice, microextracŃia în
fază solidă.

3. În figura 4 sunt reprezentate schematic etapele pentru determinarea compuşilor din


plante.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
120
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

PLANTE

Pregătirea probei

• congelare - uscare
• omogenizare

Extractie

• SE • MSPD
• Soxhlet • SPME

ANALIZA INSTRUMENTALĂ

GC LC Altele

Altele GC - MS Altele LC-UV-MS/MS CE TLC


• FID • Q-MS • UV • IT-MS • UV • UV
• ECD • IT-MS • NMR • TOF-MS • ED • chemical
• MS

Figura 4 – Rerezentarea schematică a etapelor deurmat în determinarea compuşilor din


plante

SE: solvent extraction; MSPD: matrix solid-phase extraction; SPME: solid-phase micro-
extraction; MS/MS: tandem mass spectrometry; TLC: thin layer chromatography; FID:
flame ionization detection; ECD: electron capture detection; Q: quadrupole; IT: ion-trap,
NMR, nuclear magnetic resonance; TOF, time-of-flight.

B:
1. ProducŃia cea mai ridicată s-a înregistrat în varianta D şi anume 4372 l/ha urmată
de celelalte două variante AC şi B.
2. FaŃă de animalele care au păscut în turmă vacile din variantele îmbunătătite au dat
cu 230-268% mai mult lapte, cea ce confirmă eficienŃa măsurilor de îmbunătăŃire.
3. În ce priveşte conversia furajelor de pajişti în productie de lapte se constată un
consum ridicat de SU şi anume 1,20 kg SU la varianta AC, 1,00 kg SU la var B şi
1,45 kg US la var D , fiind destul de mari faŃă de alte condiŃii cu climat mai
blând.
4. Aceste experimentări urmează a fi aprofundate pe viitor cu analize mai
amănunŃite asupra calităŃii laptelui în funcŃie de calitatea furajului.
5. În prezent se fac analize chimice la probele de plantă şi sinteza altor date care se
vor prezenta în etapa următoare a proiectului.
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
121
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

C:
1. InvestigaŃiile de laborator astfel efectuate au permis ca pe baza screeningului
hematologic să poată fi diagnosticate o serie de tulburări metabolice (subclinice) între
care amintim îndeosebi anemia. Valorile semnificativ scăzute ale hematocritului
(tabel 1, 5 şi 9) pot fi atribuite deficienŃei de aport al unor microelemente în materiile
prime furajere folosite, de regulă carenŃate în fier, cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a
fost demonstrat şi prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evidenŃiat
nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru.
2. Creşterea valorilor ureei serice indică aport proteic ridicat în raŃie, în special pe seama
furajelor concentrate. Aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii renale fără exprimare
clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop energetic sau
plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a ureogenezei.

Tabelul 12. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 14 de


probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de păşunat – valori
individuale
Nr. crt Calciu Fosfor Magneziu Fier Cupru Seleniu
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (ppm)
1. 7.2 5.9 2.17 211.46 80.60 0.010
2. 8.9 5.1 1.68 176.56 79.10 0.008
3. 8.1 5.5 1.84 137.50 71.14 0.010
4. 7.8 6.7 1.57 133.11 68.66 0.012
5. 7.9 8.3 1.60 200.17 66.17 0.008
6. 7.9 5.0 2.0 116.21 63.18 0.013
7. 8.5 4.8 1.95 126.96 76.62 0.009
8. 8.2 6.0 1.87 129.31 81.09 0.016
9. 6.5 6.8 1.87 165.52 61.43 0.013
10. 9.2 5.0 2.07 117.55 61.90 0.022
11. 8.1 6.0 2.34 106.74 57.62 0.020
12. 9.5 7.3 2.41 107.91 61.76 0.015
13. 8.8 5.4 2.29 211.46 80.60 0.021
14. 7.5 3.7 1.88 176.56 79.10 0.024
X 8.26 5.74 2.10 145.01 69.07 0.02
ds 1.03 1.19 0.24 40.15 10.59 0.00
CV, % 12.52 20.75 11.39 27.69 15.33 21.75
Valori de referinŃă 8-11 5-7,2 2,1-2,8 100-164 75-97 0.04-0.10

3. Valorile scăzute ale glicemiei indică deficit energetic, în special la vacile aflate în
perioada de stabulaŃie. În timpul lactaŃiei, vacile au nevoie cu 40-60% mai multă
energie decât în perioada de repaus mamar. Dacă lactaŃia se realizează în timpul
sezonului rece, capacitatea vacii de a-şi menŃine condiŃia corporală şi de continua
să producă lapte va fi serios compromisă dacă nivelul de energie din raŃie nu este
suficient. Ca regulă generală, pentru fiecare scădere a temperaturii cu 10°C sub
pragul de -20°C, vacile vor avea nevoie, în plus, de 4-6 Mcal energie digestibilă
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
122
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

pe zi. Vara, consumul nutreŃului verde prin păşunat are o influenŃă favorabilă
asupra rezistenŃei organice, asupra sănătăŃii şi productivităŃii, datorită acŃiunii
favorabile a mişcării, razelor solare şi a aerului curat. Creşterea colesterolemiei
indică stări de suprasolicitare.
4. Modificările activităŃii unor enzime serice TGO, Pal, GGT indică evoluŃia la vaci
a unor organopatii, cum ar fi hepatopatii (creşterea activităŃii TGO),
osteoartropatii evolutive (creşterea activităŃii Pal) (tabel 3, 7 şi 11).
5. Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar şi
hipomagneziemie destul de serioasă (tabel 4, 8 şi 12). Valorile macroelementelor
serice analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii.
6. Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe
toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană.
Erorile de alimentaŃie determină afecŃiuni metabolice şi funcŃionale. Acestea se
înregistrează cu precădere in perioada de repaus mamar, cit şi in perioada de
început de lactaŃie. Pe ansamblu, erorile alimentare provoacă nu numai stare de
boala, determinând şi scăderea producŃiei de lapte.
7. CarenŃele alimentare prelungite duc la modificări metabolice importante ale
proteinelor, lipidelor şi în dinamica hormonală, ducând în cele din urmă la
sindrom de infecunditate şi sterilitate, boli ale oaselor. Toate aceste tulburări
nutriŃionale pot fi prevenite prin adoptarea unei strategii raŃionale în hrănirea
bovinelor, respectiv respectarea cerinŃelor nutriŃionale în funcŃie de starea
fiziologică a animalului, de anotimp (furajele de sezon), vârsta animalului şi zona
geografică.

D:
1) Această etapă de raportare a avut ca obiectiv realizarea unei analize critice,
documentară, a referintelor bibliografice, cu privire la metodica utilizată pentru
selectarea şi determinarea markerilor de tip carotenoizi şi importanŃa acestora
pentru organism.
2) Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea
referinŃelor bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea
markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate,
de la furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vacă.
3) Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmenŃi vegetali
naturali, galbeni, portocalii sau roşii, răspândiŃi, în principal, în regnul vegetal (în
morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya,
mango) şi în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon).
4) Privarea organismului animal de hrana care conŃine aceşti pigmenŃi poate duce la
dispariŃia culorii caracteristice. FuncŃia fiziologică a carotenoizilor în plante nu
este încă bine cunoscută dar în organismul animal aceşti pigmenŃi au rol esenŃial
prin relaŃiile lor cu vitamina A şi cu substanŃele de pe retină, importante în
procesul vederii.
5) Deoarece pot fixa oxigenul, formând compuşi oxigenaŃi puŃin stabili, pigmenŃii
carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere.

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
123
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

6) Carotenoizii sunt implicaŃi în caracterizarea nutriŃională şi senzorială a produselor


lactate şi pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri pentru managementului
trasabilităŃii creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă.
7) Din studiul efectuat s-a constatat că s-au identificat aproape 10 carotenoizi (ex.
xantofile, carotenoizi) în furaje, concentraŃia lor variind foarte mult în funcŃie de
stadiul de dezvoltare şi durata conservării acestora.
8) Diferitele studii realizate au relevat faptul că animalul şi factorii care Ńin de
hrănirea/alimentaŃia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă), atât din punct de
vedere cantitativ cât şi din punct de vedere calitativ, prin variaŃia concentraŃiei în
carotenoizi.
9) Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de
carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare
de măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor
de lapte permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii
produselor lactate.
10) Carotenoizii din plante sunt transferaŃi în produsele animale, uneori în
concentraŃie mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai
scăzută, cum ar fi în produsele rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a
produselor lactate şi a stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea
produsului, deşi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune. O
culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńări
europene, are conotaŃii de hrană „naturală”. Astfel, carotenoizii pot fi percepuŃi
ca indicatori ai păşunatului verde.
11) CompoziŃia carotenoizilor în fructe şi legume este mult mai complexă şi variabilă,
cu variaŃii chiar şi la carotenoizii principali si pot fi identificate opt modele
principale.
12) Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este
necesară pentru a minimiza pierderile. Modificarea, reducerea conŃinutului sau
pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării alimentelor poate avea
loc şi prin transportul fizic, izomerizarea geometrică sau prin oxidarea enzimatică
sau ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptată spre procesarea
industrială, prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de
carotenoizi. La prepararea alimentelor în casă, pierderea carotenoizilor are loc în
felul următor: microunde<abur<fierbere<prăjire.
13) O serie de studii au relevat că în timpul maturării sau păstrării brânzei pe
parcursul anului nu apar modificări sau apar doar modificări minore în ceea ce
priveşte concentraŃia de retinol şi carotenoizi.
14) În ciuda faptului că există o mare varietate de carotenoizi în plante, în furaje nu se
găsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importanŃi, din punct de vedere
cantitativ, sunt β-carotenii şi luteina.
15) Până acum, metodele adecvate pentru determinarea carotenoizilor din furaje au
inclus metode care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin
Layer Chromatography- Cromatografie în strat subŃire]). In ultima perioadă au
fost puse la punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure Liquid
Chromatography). Este important să se pună accentul pe faptul că cele mai multe
metode de depozitare a probelor (ex. liofilizarea, îngheŃarea-dezgheŃarea,

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
124
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

refrigerarea), precum şi depozitarea pe termen lung, înaintea analizării, au efect de


degradare a acestor substante.
16) DiferenŃele concentraŃiilor de carotenoizi din speciile de furaje verzi sunt mai
puŃin semnificative faŃă de diferenŃele acestora din speciile de furaje uscate.
17) Uscarea furajelor la soare scade puternic concentraŃia de carotenoizi, în special
când plouă în timpul întoarcerii şi strângerii/adunării fânului cosit. Studiile
realizate de Chauveau-Duriot şi co. au arătat că din momentul cosirii fânului şi
până în momentul însilozării fânului uscat se înregistrează o pierdere medie a
carotenoizilor de până la 83%.
18) Independent de veştejire, procesul de însilozare determină scăderea concentraŃiei
de carotenoizi. Pierderile de carotenoizi depind de pH şi sunt favorizate de
condiŃiile aerobe. Aceste pierderi sunt mai mari în cazul legumelor decât în cazul
ierbii, când pH-ul este mare (~ 5) şi când sigilarea silozului este întârziată,
crescând proporŃional cu timpul de depozitare. Pierderile maxime pot ajunge până
la 80% din concentraŃia iniŃială, dar în silozurile bine construite pierderile sunt, în
general, mai mici de 20%.
19) Majoritatea nutreŃurilor concentrate folosite în hrana vacilor au un conŃinut foarte
scăzut de carotenoizi. Procesarea nutreŃurilor pentru obŃinerea de concentrate
implică, adesea, încălzirea care, probabil, distruge cea mai mare parte din
conŃinutul de carotenoizi.
20) ConcentraŃia de carotenoizi din laptele de vacă este determinată de natura şi de
cantitatea de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj,
precum şi prin transferul acestora din matricea vegetalelor către glandele mamare.
Recuperarea scăzută a carotenoizilor din lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a
acestui transfer şi se estimează că etapele diferite de transfer ale carotenoizilor,
din hrană în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în glandele mamare.
ConcentraŃiile de carotenoizi şi retinol în laptele de vacă, raportate în literatură,
variază foarte mult între diferite studii, de la 1  17 pentru carotenoizi şi,
respectiv, de la 1  12 µg/g grăsime, pentru retinol.
21) ConcentraŃia de carotenoizi din lapte diferă în funcŃie de: specie, rasă, faza de
lactaŃie, starea de sănătate, producŃia de lapte şi grăsimea din lapte,
variabilitatea individuală.
22) Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în
componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul
care determină variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui. MulŃi
cercetători au demonstrat că, în afară de aspectele legate de conŃinutul de
substanŃă uscată din brânză, variabilitatea compoziŃională a acesteia în acizi
graşi, β-caroten, xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compoziŃia
„laptelui original”. CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii
graşi, vitaminele şi carotenoizi, este puternic influenŃată de natura dietei
animalului (compoziŃia biologică, stadiul de maturitate, modul de conservare
etc.), de specia animalului, de rasă, de modul de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles,
de stagiul de lactaŃie în care se află animalul.
23) Carotenoizii din lapte influenŃează proprietăŃile senzoriale ale produselor din
lapte fie indirect, prin intermediul proprietăŃilor antioxidante, fie direct, prin
proprietăŃile lor de îngălbenire

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
125
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

24) Alegerea celei mai adecvate metode pentru analiza carotenoizilor este, de
obicei, determinată de tipul de informaŃii necesare a fi obtinuŃe. În general,
pigmentul carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o
matrice foarte complexă.
25) Principiul metodelor de determinare se bazeaza pe separarea cromatografica
si pot fi: separarea cu coloană cromatografică în curent de apă – metoda clasica de
separare a carotenoizilor, pentru analiza cantitativă; cromatografia în strat subŃire
(TLC), deşi este eficientă în monitorizarea testelor chimice în vederea identificării
rezultatelor, nu este adecvată pentru analizele cantitative, din cauza pericolului de
degradare şi izomerizare la expunerea îndelungată pe masa de lucru;
cromatografia cu gaze este, de asemenea, neadecvată, datorită instabilităŃii
termice şi a volatilităŃii reduse pe care o prezintă marea majoritate a
carotenoizilor; determinarea prin HPLC pe coloane C18 poate fi modul preferat
pentru separarea carotenoizilor pentru analizele cantitative.
26) Din cauza variaŃiilor cantitative şi calitative a carotenoizilor din compoziŃia
alimentelor, este discutabil dacă poate fi stabilit un singur sistem cromatografic
care să poată fi aplicat mai multor tipuri de alimente.
27) Schiedt şi co. au definit criteriile minime necesare pentru identificarea
carotenoizilor:
o spectrul de absorbŃie în regiunea UV, obŃinut în cel puŃin 2 solvenŃ i
diferiŃi, trebuie să fie compatibil cu cromoforul sugerat;
o proprietăŃile cromatografice obŃinute trebuie să fie identice, atât prin
metoda TLC cât şi prin HPLC; co-eluŃiile trebuie făcute cu probe
autentice;
o trebuie obŃinut un spectru de masă care să permit ă cel puŃin confirmarea
masei moleculare.
În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brută a pigmenŃilor prezenŃ i
într-un extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exactă a
pigmenŃilor dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea ş i
cuantificarea definitivă a pigmenŃilor necesită, de obicei, realizarea unor standarde, care
sunt decisive în analiza pigmenŃilor din produsele alimentare.

E.

Pentru satisfacerea cerinŃelor nutriŃionale ale vacilor de lapte se impun următoarele:

- cunoaşterea normelor de hrană:


- norma de substanŃă uscată (kg);
- norma de energie netă lapte (UNL);
- norma de proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g);
- normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g);
- normele de microelemente şi vitamine (mg; UI);
- capacitatea de ingerare a hranei (USV);
- raportul dintre PDIE/UNL.
- cunoaşterea valorii nutritive a nutreŃurilor:
- conŃinutul în substanŃă uscată (g/kg SN);
- conŃinutul în energie netă lapte (UNL/kg SU);
Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
126
Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

- conŃinutul în proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g/kg SU);


- conŃinutul în macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g/kg SU);
- conŃinutul în microelemente şi vitamine (mg/kg SU sau UI/kg SU);
- ingestibilitatea nutreŃului (USV/kg SU).

- date despre animal:


- greutatea potenŃială a vacii, G (kg);
- producŃia potenŃială maximă zilnică de lapte PlM (kg/zi);
- conŃinutul în grăsime al laptelui GrL (%);
- săptămâna de lactaŃie “n”;
- luna de gestaŃie ( se iau în consideraŃie numai lunile 8 şi 9).

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii
trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total
127