Tehnici Microbiologice Utilizate În Analiză Și Control PDF

Tehnici microbiologice utilizate
în analiză şi control
Conf. Dr. Biolog Vasilica Barbu
Cuprins
Curs Laborator
Culturi microbiene pure - metode de izolare și conservare Tehnici de izolare a microorganismelor în culturi pure
Metode de evaluare numerică a microorganismelor prin metode Metode indirecte (culturale) de numărare a microorganismelor
clasice directe și indirecte (culturale)
Metode moderne și rapide de numărare a microorganismelor Tehnici directe de numărare a micoorganismelor (metoda Breed
(citometria în flux, bioluminiscență, Petri filme, etc.) și numărarea drojdiilor Saccharomyces sp. cu camera Thoma)
Metode clasice și moderne de analiză a microorganismelor Utilizarea microscopiei confocale în analiza microbiologică
(microscopia confocală)
Metode moderne de identificare a microorganismelor (sisteme Tehnici clasice de măsurare microscopică cu ajutorul
microtest : API, Microlog, Omnilog, teste serologice, , etc.) micrometrului obiectiv
Teste imunologice de determinarea microorganismelor (ELISA, Metode rapide de identificare a unor bacterii cu sisteme
RIA, IMS – MALDI) microtest API (BioMerieux)
Metode genetice de identificarea a microorganismelor (PCR și Tehnologia PCR de identificare moleculară a microorganismelor
derivate)
Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018
Conceptul modern de microorganism
Microorganismele reprezintă un grup foarte heterogen de organisme care au în comun câteva particularităţi generale :
dimensiuni foarte mici, microscopice, care fac ca aceste organisme să nu poată fi vizibile ca indivizi izolaţi decât la
microscop, astfel că de obicei sunt studiate ca populaţii omogene sau culturi pure; în natură, pot fi observate uneori ca
pelicule sau biofilme dezvoltate pe diverse suprafeţe; dimensiunile µm, iar substructurile în nm sau Å;
organizare celulară; teoria celulară (Schleiden şi Schwan, 1838) postulează că toate organismele sunt alcătuite din
celule; deci microorganismele au o organizare celulară, de tip procariot sau eucariot;
sunt sisteme biologice, deci prezintă particularităţile viului: organizare celulară, autonomie (metabolism propriu),
invarianţă (informație genetică ce codifică toate proprietățile acestor celule și transmisă descendenților, ceea ce asigura
menținerea speciilor);
raportul mare între suprafaţă şi volumul celular favorizează strategia de supravieţuire a microorganismelor în natură,
pentru că acest raport influenţează capacitatea de interacţiune cu mediul, respectiv viteza schimburilor de substanţe
dintre organism şi mediu, care stă la baza intensităţii mari a metabolismului, ca şi a vitezei mari de multiplicare.

Conceptul modern de microorganism
Acest sistem de clasificare

Poziţia microorganismelor în sistemele de clasificare a lumii vii.
demonstrează caracterul de grup
Sistemul de clasificare propus de Whittaker (1969), acceptat și în prezent, împarte lumea vie în 5 regnuri: heterogen al microorganismelor,
1.Monera (Prokaryotes) care se regăsesc în primele 3
2.Protista regnuri şi caracterul integrator al
3.Fungi noţiunii de microorganism.
4.Plantae
5.Animalia
Cel mai nou sistem de clasificare este cel pe domenii, bazat pe date de analiza filogenetica la nivel molecular ARNr 16S la PK si 18S la EK, (Carl Woese, 1997):
•Domeniul Bacteria
•Domeniul Archaea,
•Domeniul Eukarya.
Microorganismele se regăsesc în:
PROKARYOTES = MONERA
•Eubacteria – diferenţiate în două mari grupe: bacterii Gram pozitive şi negative
•Cyanobacteria
•Archaea
EUKARYA
•Microfungi: unicelulari - Levuri (Drojdii) şi filamentoşi - Mucegaiuri
•Microalge
•Protozoare
COMPARATIE INTRE CELULA PROCARIOTA SI EUCARIOTA
 Nu au nucleu tipic ci nucleoid (echivalent  Au nucleu tipic – compartiment celular în care materialul genetic
nuclear) – materialul genetic este liber în este bine delimitat de o membrană nucleară dublă, cu pori; în
citoplasmă și atașat la membrana plasmatică în nucleu există unul sau mai mulți nucleoli;
unul sau mai multe puncte (mezozomi);
 Un singur cromozom circular (o singura
 2n cromozomi cu număr, formă și structură caracteristice fiecărei
macromoleculă de ADN);
specii;
 Nu exista proteine histonice
 ADN este complexat cu histone și formează fibra de cromatină
 Se înmulțesc prin diviziune directă
 Se înmulțesc prin diviziune indirectă: mitoza și meioza;
(sciziparitate sau fisiune binară);
COMPARATIE INTRE CELULA PROCARIOTA SI EUCARIOTA
 Nu au organite celulare delimitate de membrană;  Posedă compartimentare celulară – sistem intern de

membrane ce delimitează organite celulare ca: mitocondrii,
lizozomi, plastide, aparat Golgi, reticul endoplasmic;
 Ribozomi mici de 70S;  Ribozomi mari de 80S;
 Poseda întotdeauna perete celular format din acid N-acetil  Poseda uneori perete celular format din chitină (la
muramic; nevertebrate) sau celuloză (celula vegetală);
 Mobilitate realizata prin flageli simpli diferiți de cei de la
 Poseda citoschelet care stă la baza formei, mișcărilor
eucariote;
intracelulare sau locomoției;
 Dimensiuni de 10 ori mai mici față de cele ale celulei
eucariote.  20-30 µ (2-3 µ : limfocite, neuroni granulari din sc.
cerebeloasă sau 250 µ: ovocitul uman, 1m: axonul neuronal, 10
cm diametru: galbenușul de ou)
1 µ = 10-3mm = 10-6m= 10-9nm = 10-10Å
PRINCIPALELE DIFERENŢE INTRE CELULELE PK ŞI EK
PROCARIOTE EUCARIOTE
Tipul de organisme bacterie, alge albastre verzi (cianobacterii) protiste, ciuperci, plante, animale
Dimensiuni ~ 1-10 µm ~ 10-100 µm
Tip de nucleu nucleoid; nu au un nucleu veritabil nucleu adevărat cu dublă membrană
ADN circular molecule liniare (cromozomi) cu proteine histone
sinteza de ARN în nucleu
Sinteza de ARN şi proteine cuplată , cvasisimultană
sinteza de proteine în citoplasmă
Ribosomi (ARNr) 70S (23S+16S+5S) 80S (28S+18S+5,8S+5S)
Structura citoplasmatică structură simplă structură complexă cu membrane intracitoplasmatice şi citoschlet
flagelară şi ciliară făcută de tubulină, dar si prin sistemul actina-miozina

Mişcarea celulelor flagelară făcută de flagelină
(din miofibrile)
Metabolism aerob sau anaerob de obicei aerob
Mitocondrii nu au de la una până la numeroase
Cloroplaste nu au la alge şi la plante
celule izolate, colonii, organisme evoluate cu celule specializate, grupate
Organizare de obicei celule izolate, dar pot forma şi colonii
in tesuturi
Mitoză (pentru celulele somatice)
Diviziunea celulelor diviziune simplă, directa
Meioză (la formarea gameţilor)
Creșterea și multiplicarea microorganismelor
Creșterea și multiplicarea reprezintă rezultatul metabolismului microbian.
Cresterea, în sens biologic, este definită ca procesul de mărire coordonată a tuturor constituienților unui organism ca rezultat
al producerii sau adăugării de substanță nouă. Pornind de la nutrienții din mediu, creșterea se realizează prin sinteza specifică
și echilibrată a unor compuși de bază care sunt asamblați ulterior pentru a forma copii fidele ale constituienților celulari și
ulterior noi celule, prin multiplicare. Creșterea nu se realizează la infinit deoarece este un proces controlat genetic iar
dimensiunile celulelor sunt caracteristice în condiții normale. Atunci când este atins un volum critic, creșterea încetează și
este urmată de diviziunea celulară. Mecanismul molecular declanșator al diviziunii celulare nu este bine cunoscut. În mod
obișnuit există un raport echilibrat, controlat genetic, între suprafața și volumul celulei (S/V) astfel că dezechilibrul S/V
apărut ca rezultat al creșterii, declanșează diviziunea, prin care se restabilește raportul S/V. Mecanismul de multiplicare cel
mai răspândit și caracteristic bacteriilor tipice este diviziunea simplă = binară, izomorfă (mai rar, heteromorfă, cu apariția
de minicelule).
Dinamica procesului de multiplicare În mod obișnuit, creșterea microbiană se referă nu la dimensiunea unei celule, ci la
numărul acestora în populația rezultată, la masa totală (biomasa) care este proporțională cu numărul de celule (creșterea
populației). Pornind de la o singură celulă se ajunge la un număr de celule ce crește în progresie geometrică.

Viteza de sporire a masei populației corespunde vitezei de multiplicare, ce se măsoară prin durata sau timpul de generație
(DG=TG) care reprezintă timpul dintre două diviziuni succesive sau perioada de timp necesară pentru ca o celulă să se
dividă și deci populația să se dubleze.
Durata de generație variază considerabil între specii. De ex., majoritatea bacteriilor au o DG de 1-3h, dar există și excepții.
În condiții favorabile, o celulă de E. coli se divide la fiecare 20/25min. Potențialul de multiplicare nu este atins niciodată,
nici in vitro, și cu atât mai puțin în mediul natural datorită unor factori limitanți, cum ar fi:
Competiția pentru nutrienți,
Relațiile interspecifice de tip antagonist,
Variațiile condițiilor de mediu abiotic (to, pH, pres. osmotică, pres. hidrostatică, umiditate, radiații).
DG este influențată de condițiile de mediu, totuși chiar în prezența unei concentrații mari de nutrienți nu poate să scadă sub
o durată minimă, necesară replicării cromozomului bacterian; diviziunea este declanșată de creșterea concentrației peste o
valoare prag a unei proteine inițiatoare a diviziunii.
În condiții aritificiale de creștere pe medii de cultură, multiplicarea bacteriilor poate fi studiată pe populații omogene de bacterii, folosind
2 tipuri principale de culturi:
1. culturi discontinue sau asincrone – cultivare în sistem închis (ex. flacoane sau eprubete) în care cultivarea are loc într-un volum fix
de mediu nutritiv. Cultivarea discontinuă se caracterizează prin particularități legate de:
volumul fix de mediu, cu modificarea compoziției chimice a mediului pe parcursul cultivării în privința continutului în nutrienți, valorii
pH și a produșilor de metabolism rezultați (acumularea de cataboliți, dintre care unii toxici);
numărul celulelor viabile - variabil: crește progresiv și ulterior începe să scadă prin moartea celulelor și autoliză;
ritmul de diviziune inegal: mai mare la început când populația este tânără și mediul optim, pentru ca apoi să scadă progresiv;
vârsta diferită a celulelor;
 nr. de generații este limitat datorită limitării procesului de multiplicare în anumite condiții de mediu.
2. culturi de tip continuu – obținute în condiții speciale utilizând sisteme de tip chemostat sau turbidostat (bioreactoare) în care mediul
de cultură este permanent reînnoit printr-un mecanism dublu: adăugare de mediu proaspăt cu acelasi ritm cu care se recolteză și
îndepărtează cultura microbiană rezultată. Culturile de tip continuu furnizează celule cu proprietăți uniforme și activități fiziologice
optime, fiind utilizate în procese biotehnologice industriale.
Curba de creștere a unei culturi bacteriene discontinue asincrone (dinamica unei populații bacteriene )
Se analizează curba de creștere a bacteriilor = evoluția unei populații bacteriene care se multiplică prin diviziune simplă în
funcție de timp. Modalitatea de reprezentare grafică este pe o scala semilogaritmică de evoluție a numărului de celule
bacteriene în timp.
Faza de lag (de creștere zero; engl. “to lag’ = a întârzia) – începe din momentul
introducerii inoculului în mediu de cultură. Numărul celulelor bacteriene rămâne
neschimbat sau se modifică foarte puțin. În această fază are loc o adaptare a
celulelor la condiţiile de mediu, biosinteza de ADN/ARN şi o activare a sistemelor
enzimatice şi elaborarea de enzime induse. În cazul drojdiilor, această fază poate
dura 1-2 ore, funcție de compoziţia mediului şi de capacitatea de reglare a
metabolismului propriu. Durata fazei de lag poate fi redusă la limite imperceptibile
în cazurile în care se foloseşte un inoculum mare de cultură în fază logaritmică, iar
transplantarea se face într-un mediu de cultură bogat, identic cu cel în care au fost
cultivate bacteriile din inoculum. La sfârșitul fazei, celulele bacteriene cresc în
dimensiuni și are loc inițierea diviziunii.
Creșterea și multiplicarea bacteriilor

Creșterea și multiplicarea bacteriilor
Faza staționară de creștere (“platou”) - perioada de echilibru în care numărul de celule bacteriene rămâne constant,
astfel că numărul de celule care mor este compensat de numărul celor ce se divid. Celulele sunt mature, dimensiuni și
morfologie normale (ca în atlasele de bacteriologie), apar primele incluziuni și primii spori (la speciile sporogene) și au o
activitate metabolică redusă. La sfârșitul fazei numărul celulelor începe să scadă progresiv.
Faza de declin și moarte celulară – are loc o regresie exponențială care continuă până rămâne o fracțiune mică de
celule rezistente sau până moare toată populația celulară. Durata fazei depinde de durata de viață a speciei. Celulele
prezintă alterări morfologice, se colorează anormal, au substanțe de rezervă, devin acidofile. La speciile sporulate se
întâlnesc numeroși spori maturi.
Cunoașterea evoluției populației microbiene este foarte importantă pentru stabilirea perioadelor optime de recoltare a
metaboliților primari și secundari, în cursul proceselor biotehnologice. Metabolitii primari sunt substante produse de
bacterii pe parcusul căilor metabolice majore și care sunt esențiale pentru viața celulei (enzime, AA, acizi organici). Sunt
sintetizați în faza log. Metaboliții secundari sunt substanțe biochimice neesențiale bacteriilor (vitamine, antibiotice,
alcooli) și care sunt sintetizați în faza staționară.

Cultura pură
Inoculul reprezintă o cultură microbiană aflată în etapa finală a creşterii

exponenţiale pe un substrat nutritiv corespunzător şi în anumite condiţii de
dezvoltare (pH, temperatură, agitare, aerare) specifice. Inoculul constituie
materialul de însămânţare al mediului de cultură (mediu fermentativ steril)
propriu zis. Transferul culturii inocul în mediul de cultură proaspăt (flacon,
tanc, bioreactor, etc) se realizează în condiţii aseptice.
Cultura pură reprezintă o biomasă de celule rezultate prin reproducere
dintr-o singură celulă aflată într-un mediu nutritiv steril, cu volum limitat.
Cultura pură este considerată şi colonia care se formează ca rezultat al
izolării unei celule sau a unei unităţi formatoare de colonii (ufc), atunci
când aceasta este localizată pe un mediu nutritiv solid. Puritatea unei
culturi se poate obţine şi prin repicare, deci prin transfer de celule din
eprubeta ce conţine cultura pură, în alt vas cu mediu de cultură steril.

Importanţa practică a culturilor pure
Izolarea şi obţinerea culturilor pure , cunoaşterea cineticii de creştere prezintă o importanţă practică deosebită în
următoarele domenii:
Identificarea, selecţionarea şi îmbunătăţirea proprietăţilor de biosinteză Culturile pure sunt folosite pentru studiul
proprietăţilor morfologie şi fiziologice, în scopul identificării, caracterizării şi stabilirii domeniului de utilizare a culturii.
Sub formă de culturi pure, microorganismele pot fi supuse unor tratamente fizico-chimice prin care se pot induce
modificări genetice la nivelul acizilor nucleici, cu obţinerea de tulpini mutante, dintre care sunt selectate tulpini
performante.
Obţinerea culturilor starter în procese fermentative industriale (la fabricarea berii, alcoolului, vinului, produse
lactate acide, panificaţie, obținerea de metaboliți, compuși bioactivi etc.) Pornind de la cultura pură, în biotehnologii
alimentare, prin cultivarea în medii adecvate se obţine inocul/maia (cultură starter) a procesului fermentativ. Cantitatea
de inocul trebuie astfel calculată încât, prin introducerea sa în mediul fermentativ steril, concentraţia în celule să asigure
declanşarea rapidă a procesului și permite obţinerea unor produse cu calitate constantă (1-10%). În funcţie de specificul
biotehnologic este obligatorie asigurarea continuităţii în transfer, pentru aprovizionarea cu inocul activ, exact în etapele
potrivite ale producţiei.

Conservarea culturilor pure
Culturile celulare de interes științific sau industrial sunt conservate prin metode diverse bazate pe încetinirea proceselor
metabolice ale celulelor vii.
Viabilitatea, puritatea și stabilitatea (păstrarea acelorași caracteristici morfologice și fiziologice) sunt esențiale pentru o
cultură celulară și, de aceea, se verifică periodic, pe toată durata conservării.
Durata de conservare depinde de:
 Specie,
 Calitatea mediului,
 Metoda de conservare,
 Gradul de deshidratare al mediului.
În funcție de aceasta, se stabileste intervalul de timp la care se va face repicarea culturii pe mediu proaspat, în condiții
de asepsie (sterilitate), pentru a evita contaminarea.
Tehnici de conservare a culturilor pure de microorganisme:
 Repicarea periodică la intervale scurte de timp (subculturi periodice);
 Privarea culturilor de accesul oxigenului;
 Menținerea culturilor la temperaturi scăzute;
 Păstrarea celulelor în medii cu umiditate redusă.

Repicarea periodică (subcultivarea) este o metodă simplă de conservare ce presupune transferul de celule de pe
un mediu epuizat pe un mediu proaspăt, steril cu compoziție similară.
Păstrarea după repicare se va face în condiții care să încetinească procesele metabolice, să prelungească perioada
staționară de creștere și să evite apariția perioadei de declin.
Bacteriile lactice se repică la un interval de 1-3 săptămâni, iar drojdiile, fungii, bacteriile sporogene, actinomicetele
se pot repica și la 2-3 luni.
Avantaje: simplitate, vizualizarea unei eventuale contaminări.
Dezavantaje: - risc de contaminare a culturii;
- modificări genetice prin mutații spontane în perioada dintre pasaje;
- volum mare de muncă;
- consum de medii, reactivi și ustensile.
Refrigerarea și congelarea (crioconservarea) determină prelungirea perioadei de conservare. Se face la 4-5°C

(refrigerare) și la -20…-70°C (congelare la ultrafreezer) și la -195°C (crioconservare în azot lichid).
Impune folosirea unor agenți crioprotectori:
 Asigură diminuarea indicelui de activitate al apei;
 Reduc concentrația de electroliți, reglează presiunea osmotică;
 Influențează permeabilitatea membranei plasmatice;
 Protejează microorganismele de efectul distructiv al cristalelor de ghiață formate în suspensie;
 Pot fi substanțe care pătrund în celulă: glicerol (10-20%), dimetilsulfoxid (7-10%), zaharoza (10-20%)
sau care nu patrund în celula: polivinilpirolidona (1-%)
Conservarea în azot lichid presupune:

 Introducerea celulelor în mediul protector;
 Vidarea;
 Congelarea prin reducerea temperaturii cu 1°C/min până la -30°C, apoi cu 15-30°C/min până la -150°C;
 Imersarea fiolelor în azot lichid la -195…-196°C.
Bacteriile G(+) sunt mai rezistente și mai stabile la crioconservare, comparativ cu cele G(-).
Celulele supuse conservării trebuie să se afle în faza staționară de creștere și la o densitate de 108 – 1012 ufc/ml (celulele
aflate în faza exponențială de creștere sunt mai sensibile, sporii sunt mai rezistenți).
Celulele cultivate pe medii nutritive bogate sunt mai rezistente comparativ cu cele care, anterior congelării, au fost cultivate
pe medii sintetice.
Reactivarea celulelor trebuie făcută rapid (fiolele se țin în baie de apă la 30-45°C) și apoi conținutul se transferă pe mediul
optim.
Refrigerarea si congelarea (crioconservarea)

Avantaje:
 Se păstrează nealterate caracteristicile morfologice și metabolice ale celulelor (stabilitate foarte bună);
 Se reduce incidența modificărilor genetice (siguranță);
 Se reduce numărul de subculturi (repicări).
Liofilizarea
Utilizată frecvent în industrie sau în colecții deoarece prelungeste cel mai mult intervalul de conservare a culturilor (20-
25 ani), fără să producă de regulă, modificări genetice (și deci, nici morfologice sau fiziologice).
Constă în congelarea și apoi uscarea în vid a suspensiilor de celule aflate în medii protectoare;
Exemple de medii protectoare complexe:
 Gelatina 1% + zaharoza 10%;
 Lapte degresat 10%+glucoza 7%;
 Dextrina 2% + clorura de amoniu 0,5% + tiouree 0,5% + acid ascorbic 0,5%;
 Lapte praf 10% + glutamat de sodiu 1%
Păstrarea microorganismelor în stare uscată

 Se pretează mai ales pentru microorganisme sporulate (Bacillus sp.);
 Reducerea umidității mediului duce la trecerea celulelor în stare anabioză;
 Bacillus sp. se menține sub formă de endospori adsorbiți pe nisip steril, după evaporarea apei;
 Mucegaiuri și actinomicete se mențin pe sol steril și uscat, pe medii agarizate uscate sau pe alte materiale:
silicagel, hartie de filtru, amidon, cristale de zaharoza, vată sau mase plastice.
Conservarea culturilor sub ulei mineral
 Celulele sunt cultivate pe mediu selectiv și apoi cultura se acopera cu ulei de parafină sterilizat în prealabil la 170°C
timp de 2 ore.
 Parafina impiedică deshidratarea mediului și pătrunderea oxigenului ceea ce determina trecerea celulelor în stare latență;
 Durata de conservare variază în funcție de specie și de starea culturii (ex. la drojdii vârsta culturii trebuie să fie de 12-14
zile, la mucegaiuri și actinomicete de 7-14 zile).
Colecțiile de culturi celulare
Au ca funcție menținerea, depozitarea și

conservarea acestora timp îndelungat în
interes științific, medical, biotehnologic
sau industrial.
A. E. coli
B. Nostoc commune
C. Fungi
D. Ebola
E. Plasmodium falciparum

COLECTIA DE CULTURI MICROBIENE
 Reprezintă un depozit de material biologic (linii celulare și material genetic) disponibil în egală masură tuturor
cercetătorilor și care asigură menținerea caracteristicilor și/sau a potențialului productiv ale unor organisme utile pentru
învățământ, cercetare, industrie, organisme standard sau obținute prin studii de genetică sau prin tehnologia ADN
recombinant.
 Motivația întemeierii colecției de culturi microbiene:
 Avantajele logistice ale unei instituții centralizate de depozitare;
 Evitarea pierderii unor probe în timpul studiului;
 Informarea corectă asupra riscurilor privind sănătatea și mediul înconjurător, asupra condițiilor de conservare și
manipulare;
 Monitorizarea permanentă a posesorilor unor probe la un anumit moment.
COLECTII DE CULTURI MICROBIENE
Sistemul de brevetare și organizarea laboratoarelor standard

 Constituția SUA din 1789, articolul1, secțiunea 8, clauza 8 conferă Congresului puterea de “a promova
progresul științific și artele aplicate, asigurând pentru un timp limitat autorii și inventatorii cu drepturi limitate
asupra propriilor descoperiri”. Acest timp limitat este precizat in Codul SUA, titlul 35, la o durată de 17-20
ani în care inventatorul are dreptul de a realiza, folosi sau vinde invenția și îl obligă la o descriere completă,
detaliată, susținută experimental, astfel încat cel care o apliă s-o poată reproduce usor, iar beneficiul public al
cunoștintelor brevetate nu trebuie să fie secret. Deci nu se garanteaz monopolul.
 În 1977 se încheie Tratatul de la Budapesta care prevede pentru garantarea recunoașterii complete a unei
invenții privind microorganismele, depozitarea într-un depozit international unic – International Depositary
Authority (IDA)
 Tratatul a fost încheiat sub auspiciile Organizației Mondiale a Proprietății Intelectuale (World Intelectual
Property Organisation – WIPO) și a intrat în vigoare din 1980.
COLECTII DE CULTURI MICROBIENE
Până în prezent există 30 de colecții de culturi care au statut IDA și care sunt obligate să asigure menținerea culturilor în stare
viabilă și pură (lipsite de contaminanți) pe o perioadă de cel puțin 30 ani.
Exemple:
 American Type Culture Collection (ATCC) – Rockville, Maryland, SUA;
 Central Bureau voor Schimmelculture (CBS) in Olanda; Banci de celule/gene:
 German Institute for Microorganisms (GIM sau GmbH). ATCC
CABRI
Statistica WDCM (World Data Culture of Microorganisms)
DSMZ
543 colecții de culturi în 68 țări înregistrate în WDCM. ECACC
144 din ele sunt suportate de guverne. HDB
JCRB Cell Bank
30 din ele sunt semi-guvernamentale. JCRB Gene Bank
130 din ele sunt suportate de universități. RIKEN GENE BANK
Tissue Bank and Data base
6 din ele sunt suportate de industrie.
Home Page
18 din ele sunt particulare UKNCC
ATCC - American Type Culture Collection - infiintata in 1925
BCCM - Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms
BGSC - Bacillus Genetic Stock Center
BCC - BIOTEC Culture Collection, Thailand
CABRI (Common Access to Biological Resources and Information) by EC
CBS - Centraal bureau voor Schimmelcultures
CCAP - The Culture Collection of Algae and Protozoa
CCUG - University of Goteborg, Sweden (>38000 strains)
COLECTII
CGSC - E.coli Genetic Stock Center

Developmental, Cell and Molecular Biology Group Duke University
DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
HAMBI - University of Helsinki, Finland
IEGM - Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms
IMI - CABI Bioscience Genetic Resource Collection
INVAM - The International Culture Collection of Arbuscular and VA Mycorrhizal Fungi
JCM - Japan Collection of Microorganisms – infiintata in 1944 la IFO (Institute for
Fermentation Osaka)
JSCC - Japan Society for Culture Collections on-line database
MGD - Microbial Germplasm Database
MICH - University of Michigan Fungus Collection
MSDN - Microbial Strain Data Network mirrored in Japan
UNSW - University of New South Wales
VKM - All Russian Collection of Microorganisms
TOTAL 1,407,607 COLECTII DE CULTURI MICROBIENE
572,333 bacterii
481,764 fungi
15,801 virusuri
11,251 linii celulare
326,458 alte feluri de microorganisme
18,560 specii sau subspecii de bacterii.

25,106 specii sau subspecii de fungi.
1,774 specii sau subspecii de alge.
1,222 specii sau subspecii vectori.
15 specii sau subspecii de ADN.
427 specii sau subspecii de arhebacterii.
333 specii sau subspecii de linii celulare animale.
66 specii sau subspecii de virusuri animale.
84 specii sau subspecii de virusuri la plante.
934 specii sau subspecii de bacteriofagi.
0 specii sau subspecii de linii celulare de plante.
0 specii sau subspecii de linii celulare hybridoma la animale.
0 specii sau subspecii de linii celulare hybridoma la plante.
0 specii sau subspecii de licheni.
0 specii sau subspecii de protozoare.
AFRICA OCEANIA
COUNTRY CCS CULTURES CULTURE
COUNTRY CCS
S
Egypt 2 1,546
Australia 35 72,569
Morocco 1 664
New Zealand 7 16,947
Nigeria 2 223
Papua New Guinea 1 270
Senegal 1 210 ASIA
TOTAL 43 89,786
South Africa 2 8,360
COUNTRY CCS CULTURES
Uganda 1 550
China 20 71,516
Zimbabwe 2 702
Hong Kong 1 60
TOTAL 11 12,255
India 19 12,090
Indonesia 16 10,505
AMERICA Iran 3 1,319
COUNTRY CCS CULTURES Israel 3 776
Argentina 8 5,104 Japan 24 113,484
Brazil 52 37,110 Korea (Rep. of) 14 64,071
Canada 19 69,363 Malaysia 5 2,508
Chile 1 - Pakistan 5 1,603
Colombia 2 4,092 Philippines 5 3,372
Cuba 5 6,157 Singapore 2 1,389
Mexico 14 5,692 Sri Lanka 4 136
U.S.A. 21 209,276 Taiwan 2 10,398
Venezuela 2 150 Thailand 58 42,541
TOTAL 124 336,944 Viet Nam 1 6,449
TOTAL 182 342,217
COUNTRY CCS CULTURES
Armenia 1 7,575 Europa
Austria 2 6,070
Belarus 1 1,175
Belgium 5 57,855 Kazakhstan 2 199
Bulgaria 3 13,234 Latvia 1 692
Czech 12 7,697 Netherlands 5 76,775
Denmark 2 86,500 Norway 2 2,602
Estonia 3 6,300 Poland 9 8,464
Finland 2 7,513 Portugal 5 7,035
France 35 60,569 Romania 2 760
Germany 12 47,278 Russian Federation 13 40,804
Greece(Hellenic Rep.) 6 5,309 Slovak 3 4,916
Hungary 6 7,907 Slovenia 2 4,160
Ireland 1 380 Spain 4 9,027
Italy 8 12,871 Sweden 3 52,700

Switzerland 1 2,700
Turkey 6 3,710
U.K. 18 81,162
Ukraine 3 113
Uzbekistan 3 1,456
Yugoslavia 2 897
TOTAL 183 626,405
Romania
ICCF WDCM232 Collection of Industrial Microorganisms
RBCAR WDCM928 Romanian Bioresource Centre and Advanced Research

TAXONOMIA MICROORGANISMELOR
• Dimensiunile microorganismelor
• Morfologia celulelor
• Caracterele culturale Dimensiunea celulelor
• Caracterele fiziologice (biochimice)
• Genotipul
Morfologia celulelor :
• Coci, diplococi, streptococi, stafilococi;

• Bacili;
• Vibrioni;
• Spirili și spirochete.
Caracterele fiziologice (biochimice)
Tipul de metabolism energetic:

• Aerob (O2 ca acceptor final de electroni, iar ca produși finali: H2O si CO2);
• Anaerob (compuși anorganici ca acceptori de electroni, se cultivă în anaerostate, în absența O2 și în atmosferă controlată cu
gaze inerte: CO2 sa N2, au metabolism fermentativ);
• Facultativ anaerob (nu necesită O2 pentru creștere, dar cresc mai bine în prezența sa);
• Aerotolerant (nu necesită O2 pentru creștere și cresc la fel de bine în prezența cât și în absența sa);
• Microaerofil (cresc la concentrații reduse de oxigen – 2-10%)
Anaerostate
Temperatura optimă
Caracterele culturale:
Forma: circulară, filamentoasă, neregulată, rizoidă, fuziformă.

Marimea: punctiformă (<1mm), mică (1-2mm), medie (2-3mm), mare (>3mm).
Marginea: întreagă, ondulată, lobată, dințată, filamentoasă, încrețită.
Profilul: plat, ridicat, convex, bombat, umbonat, ombilicat.
Aspect: neted sau rugos, lucios, mat, mucoid, cremos, vascos, pufos.
Transparența: transparente, translucide, opace.
Culoare: nepigmentate sau pigmentate.
Metode de evaluare numerică a microorganismelor prin
metode clasice directe și indirecte (culturale)
Numărarea microorganismelor eukariote cu camere de numărat
Adâncimea
Suprafața unui pătrățel elementar

Numărarea celulelor de drojdii cu citometrul Thoma

Numărarea celulelor de drojdii cu citometrul Thoma

Metoda directă de numărare a bacteriilor în preparate
fixate și colorate (metoda Breed)
Metodele ce au la bază examenul microscopic direct se caracterizează prin simplitate, rapiditate şi se pretează cel mai
bine la studiul celulelor clar individualizate.
Celulele bacteriene aflate într-un volum cunoscut de lichid se repartizează pe o suprafaţă limitată de frotiu, iar după
fixare şi colorare simplă se stabileşte numărul de celule prin examen microscopic direct.
•Pe o lama de sticlă degresată se conturează cu markerul o suprafaţă Sd de 2-6 cm². (de obicei 1cm²)
•Se inversează lama de sticlă, şi central, cu ajutorul unei micropipete sterile, se plasează o picătură din suspensia de
analizat cu un volum cunoscut Vp, egal cu 0,02-0,05 cm³ (20-50µl) şi, cu ajutorul ansei, se etalează, realizându-se o
repartizare a amestecului cat mai uniform, pe întreaga suprafaţă conturată.
•Uscare în curent de aer cald,
•Fixare (de preferat cu soluţie de alcool 96%, timp de 20 min),
•Colorare simplă,
•Spalare şi uscare.
•Preparatul se studiază apoi la microscop, cu obiectiv de imersie (100x), având grijă ca picătura de ulei de cedru să fie
pusă în momentul în care se face numărarea.
Metoda directă de numărare a bacteriilor în preparate
fixate și colorate (metoda Breed)
𝜋 × 𝑑𝑐²
𝑆𝑐 = [cm2 ]
4
𝑆𝑑
𝑁𝑐 =
𝑆𝑐
𝑛 × 𝑁𝑐
k-coeficient de diluţie 𝑁= ×𝑘
𝑉𝑝
Metoda indirectă (culturală) de evaluare
a numărului de bacterii
 inoculare în masa mediului solidificat, când 1 cm³ din fiecare

diluţie se transferă cu câte o pipetă sterilă în plăci Petri sterile.
Peste suspensia din fiecare placă se repartizează mediul de
cultură specific, cu agar (10-15%), fluidificat şi temperat la 40 -
45°C. Mediul se omogenizează cu suspensia din placă prin
mişcări orizontale, circulare ale plăcii. După solidificarea
mediului, prin termostatare în condiţii optime, se vor forma
colonii atât la suprafaţa mediului cât şi în profunzimea acestuia.
 În cazul microorganismelor anaerobe se recomandă cultivarea
în dublu strat, adică după înglobarea celulelor în mediu şi
solidificare, primul strat de mediu se acoperă cu încă un strat de
mediu semisolid steril;

Metoda indirectă (culturală) de evaluare
a numărului de bacterii
 inoculare prin răspândirea celulelor pe suprafaţa mediului solidificat,

când 0,1 cm³ proba diluată se transferă într-o placă Petri sterilă, în care, în
prealabil a fost repartizat mediul de cultură cu agar. Suspensia se răspândeşte
uniform pe întreaga suprafaţă a mediului de cultură cu ajutorul unui
instrument special (de exemplu spatula Drigalski). Această tehnică prezintă
dezavantajul că unele celule pot să rămână ataşate de instrumentul de etalare,
generând erori de interpretare.
Pentru obţinerea unor rezultate mai concludente se recomandă inocularea
a câte două plăci în paralel pentru fiecare diluţie analizată (n reprezintă media
aritmetică a coloniilor numărate în cele două plăci). Se va calcula numărul de
microorganisme pe gram sau cm³ probă de analiză cu formula:
ufc / cm³(g)= n x k,
k este coeficientul de diluţie corespunzător plăcii în care s-a numărat.

Evaluarea numărului de microorganisme prin utilizarea
mediilor de imersie
Tehnici moderne prevăd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu geloză sau benzi de hârtie impregnate cu
medii adecvate. Lamele cu medii de cultură gelozate se menţin în tuburi speciale, sterile. În momentul utilizării se
extrage aseptic lama din tub, se imersează în proba de analizat, după care se reintroduce în tubul steril şi se
termostatează la temperatura optimă microorganismelor analizate. După termostatare, 16-24 h pentru bacterii şi 3-4
zile pentru drojdii şi mucegaiuri, se pot număra coloniile caracteristice care s-au dezvoltat la suprafaţa lamei.
Lame specializate pentru control microbiologic selectiv:
lame Lactocult - pentru controlul microbiologic al laptelui;
lame pentru evidenţierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae (geloză tripticază soia + VRBC geloză);
lame pentru evidenţierea selectivă a bacteriilor din genul Pseudomonas (mediu specific cu geloză);
lame pentru determinarea fungilor filamentoşi (geloză tripticază soia; tripticază soia cu TTC + geloză cu roz bengal
şi cloranfenicol ş.a.);

 lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA
0,01TTC*) destinate pentru determinarea numărului total de Hychech (Difco)
microorganisme;
 lame Biokar – pentru număr total de coliformi; număr total de
drojdii şi mucegaiuri;
 lame Microtest. Benzile de hârtie (Dacto Strip) impregnate cu
medii selective se pretează cel mai bine la
controlul produselor lichide (adsorb un volumul de lichid de
0.1-1ml). Strip-ul se imersează în lichidul de analizat, se
menţinere în contact cu proba un timp definit, apoi se
reintroduce in ambalajul steril şi se termostatează în condiţii
optime.
Biokar

Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza microbiologică
cantitativă și calitativă
Petrifilms - discuri în care mediul de cultură specific este deshidratat şi acoperit cu o folie din plastic. La inocularea a 1 cm³
suspensie de celule, apa conţinută în suspensie rehidratează mediul şi după termostatare este posibilă numărarea coloniilor
(microorganismelor – ufc/ml).
Avantaje:
reducerea timpului de analiză,
reducerea preţului de cost/probă,
creşterea numărului de probe analizate,
creşterea calităţii şi îmbunătăţirea substanţială a productivităţii.

Indicatori:
TTC - clorură de trifenil tetrazoliu (culoarea virează spre roşu datorită reducerii de către microorganisme cu formare de
formazan);
BCIP - brom cloro indoxil fosfat (indicator pentru fosfatază, produsă în general de drojdii şi mucegaiuri; virajul culorii, precipitat
bleu);
BCIG - brom cloro indoxil β glucuronidă este indicator al β glucuronidazei, pe care o posedă Escherichia coli; virajul culorii -
precipitat bleu.

Evaluarea numărului de microorganisme
după flitrare prin membrană
Această metodă se pretează la analiza probelor lichide cu un conţinut redus de

microoganisme, care nu conţin compuşi ce produc colmatarea filtrului.
Pentru analiză, o cantitate controlată de lichid de analizat (1 - 10 cm³) se transferă
aseptic în rezervorul aparatului de filtrare, apoi lichidul trece prin filtru (cu pori
mici, capabili să reţină toate microorganismele), după care membrana se ridică
aseptic cu o pensetă sterilă şi se transferă într-o placă Petri sterilă în care în
prealabil s-a repartizat mediul de cultură agarizat adecvat. Uneori, mediul de
cultură specific este impregnat deja în membrane şi astfel, după filtrare, membrana
se plasează într-o placă Petri sterilă.
Prin termostatare în condiţii optime, la suprafaţa membranei se formează colonii
caracteristice, care se pot număra şi analiza din punct de vedere morfologic.

Tehnici de evaluare a creșterii prin
determinarea globală a biomasei
 pot fi aplicate atât pentru evaluarea populațiilor aparţinând microorganismelor unicelulare, dar mai ales în cazul
microorganismelor filamentoase.
 biomasa microbiană este recuperată, în general prin centrifugare (2000-4000 rot., 10 min., la 4°C), este spălată de
mai multe ori cu soluţie 0,9% NaCl, pentru îndepărtarea impurităţilor din mediul de fermentaţie, reţinute o dată cu
celulele, apoi uscată la temperatura de 105°C, până la greutate constantă.
Dezavantaje:
 nu se poate face distincţie între biomasa vie şi cea autolizată;
 nu se aplică decât în cazul mediilor lichide fermentate în care microorganismele sunt singurele particule în
suspensie;
 conţinutul de biomasă nu reflectă întotdeauna gradul de multiplicare al celulelor. De exemplu, în cazul
mucegaiurilor, celulele cresc acumulând intracelular substanţe de rezervă şi formează pereţi celulari groşi fără să se
producă diviziunea celulară.
Estimarea cantitatii de biomasa prin dozarea unor
constituienti celulari
Determinarea cantitativă a unor componenţi aflaţi în concentraţie aproximativ constantă în celulele microbiene oferă
indicaţii asupra evoluţiei unei culturi fiind posibilă stabilirea, prin echivalenţă, a concentraţiei de biomasă.
Astfel de componenţi sunt: proteine, acizi nucleici (ARN, ADN), ATP, NADH. Celulele separate din mediul de
fermentaţie prin filtrare sau centrifugare sunt spălate, apoi sunt supuse unor tratamente mecanice sau fizice pentru
eliberarea componenţilor celulari şi evaluarea acestora prin tehnici standardizate.
Creşterea şi multiplicarea celulelor este în dependenţă directă cu biosinteza de proteine. Pentru evaluarea conţinutului
total de proteine sunt recomandate metodele biochimice clasice: metoda biuretului, metoda Lowry, metoda Bradford,
metoda Kjeldahl, sau hidroliza proteinelor şi dozarea aminoacizilor.
Biomasa microbiană are un conţinut remarcabil, constant, de ADN. Determinarea sa este destul de sofisticată, necesitând
tehnici de liză a celulelor, extracţie, separare. Pentru dozare se apelează la metode spectrofotometrice (λ= 260 nm) sau
electroforetice. Studiul acizilor nucleici este utilizat mai mult pentru identificarea microorganismelor.

ATP-ul este un constituent normal al celulelor vii, fiind un
intermediar important al metabolismului celular cu rol în
metabolismului energetic. Evaluarea biomasei microbiene prin
determinarea conţinutului de ATP tinde să se generalizeze.
Principiul metodei de determinare a ATP-ului se bazează pe emisia
luminoasă produsă prin oxidarea luciferinei la oxiluciferină, reacţie
catalizată de către enzima luciferază în prezenţă de ATP.

Estimarea electronică a numărului de microorganisme cu
aparatul Coulter
De o parte şi de alta a unui tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi

doi electrozi de platină imersaţi într-un electrolit, ale căror borne sunt
conectate la tensiune continuă. Prin aspiraţie celulele trec pe rând prin
orificiu şi generează un impuls electric a cărui amplitudine este
proporţională cu volumul celulei. Impulsurile fiind de foarte scurtă durată,
aparatul permite numărarea unui număr mare de celule, într-un timp foarte
scurt. Este posibilă şi o clasificare a celulelor în funcţie de volumul lor.
Această tehnică se aplică pentru analiza suspensiilor de drojdii, realizând
simultan cu numărarea şi dimensionarea celulelor. Rezultatele sunt
reproductibile când se utilizează suspensii diluate de celule. Sarcina
electrică a celulelor poate genera erori.

Evaluarea populațiilor microbiene prin măsurarea fluorescenței
Citometria în flux
Este o metodă biofizică bazată pe tehnologia laser, des utilizată în biotehnologie

pentru numărarea, sortarea celulelor, detecția biomarkerilor şi aprecierea stării
fiziologice a celulelor, prin măsurarea fluorescenței emise de celulele
marcate în prealabil cu un colorant (fluorocrom/fluorofor).
Rezultatele sunt traduse pe o histogramă care redă, în timp real, numărul de
evenimente în funcţie de intensitatea fluorescenței, deci un profil al populaţiei.

Evaluarea populațiilor microbiene prin măsurarea fluorescenței
Citometria în flux
Interpretare:
•Când colorantul este un marker de viabilitate, din histogramă se evaluează numărul de celule vii. Metoda se
bazează pe faptul că celulele vii respiră şi de aceea sunt capabile să reducă clorura de 2, 3, 5 trifenil-tetrazoliu
(TTC) solubilă şi incoloră, în trifenil formazan insolubil şi roşu. Ca urmare, celulele vii tratate cu soluţie TTC
1% se colorează, pe când cele moarte nu.
•Dacă histograma înregistrează net două pik-uri este posibilă cuantificarea separată a microorganismelor dintr-
o cultură mixtă (de exemplu, streptococi şi lactobacili).
•Dacă markerul este un anticorp sau o sondă nucleică se pot număra specific anumite microorganisme dintr-o
populaţie heterogenă.

Citometria în flux
Componente principale:
1.un flux de celule aflat în suspensie, dirijat de un ”fluid de manta”care

transportă și aliniază celulele astfel încât să treacă individual prin dreptul
unui fasciculul laser;
2.Sistemul optic cu sursa de lumină - lămpi (mercur, xenon) și lasere de
mare putere: argon (488 nm), roșu-HeNe (633 nm), HeCd (UV), diode
laser (albastru, verde, roșu, violet);
3.Sistemul de sortare: lentile, filtre precum și detectori/fotomultiplicatori =
sistem de conversie de la semnal analogic la semnal digital (ADC) - care
convertește măsurătorile analogice ale luminii împrăștiate în față (forward-
scattered light FSC) precum și ale luminii dispersate lateral (side-scattered
light SSC)
4.Sistemul electronic: un sistem de amplificare - linear sau logaritmic
pentru analiza semnalelor.
Procesul de colectare a datelor din probe utilizând citometrul de flux este
denumit achiziție. Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018
SISTEMUL FLUIDIC
Ac de injecţie
Cameră de scurgere
Lichid de“înveliş” sau

fluid de manta
Flux laminar
După colorare/marcare fluorescentă, celulele
aflate în fluid sunt antrenate printr-un orificiu
îngust şi trec prin faţa unei surse luminoase (mii
pe secundă) . Fluorescența emisă de fiecare celulă
este captată de fotomultiplicatori (detectori).

FSC ŞI SSC
LASER Forward Scatter
Dispersia luminii:
 α=0  Forward Scatter (FS)  dimensiunea
LASER  α=90° Side Scatter (SS)  granularitatea
Emisia luminii fluorescente:
 cantitatea de fluorocromi  informații calitative şi cantitative
Side Scatter
Prezentarea rezultatelor:
Histograme – 1 parametru
Grafice – 2 parametri: 1 punct = 1 particulă (dot-plot)

Izotiocianat de fluoresceină (FITC)
Phycoeritrină (PE)

GRAFIC DOT-PLOT PENTRU FITC ŞI PE
PE+ FITC+ / PE+
PE FL
FITC- / PE-
FITC FL
FITC+
Parametri măsurabili
•Viabilitatea celulei.
•Apoptoza (cuantificarea degradării ADN, potențialul membranei mitocondriale, modificările permeabilității, activitatea caspazei)
•Aderența celulelor (de exemplu, aderența gazdă-patogen)
•Monitorizarea integrității și electropermeabilității membranelor celulare
•Antigenii de suprafață celulară: markeri pentru cluster de diferențiere (CD)
•Antigenii intracelulare (diverse citokine, mediatori secundari, antigenele nucleare etc.)
•Caracterizarea rezistenței multidrog (MDR) în celulele canceroase
•Pigmenți de celule, cum ar fi clorofila sau fitoeritrina
•Exprimarea proteică, localizarea și modificările proteinelor
•Activitatea enzimatică
•pH, calciu ionic intracelular, magneziu,
•Glutationul
•Analiza și sortarea cromozomilor
•Conținutul total de ADN (analiza ciclului celular, proliferarea, ploidia, aneuploidia, endoreduplicarea etc.)
•Conținut total de ARN
•Produse transgenice in vivo, în special marcate cu GFP (proteina fluorescentă verde) sau proteine fluorescente înrudite

Sisteme microtest de identificare a microorganismelor
API 50 CH (BioMerieux)
Analizează metabolismul glucidic al microorganismelor. Constau în 50 microtuburi fiecare conţinând o zonă anaerobă (o
porţiune din tub) pentru studierea fermentării şi o zonă aerobă (o porţiune de godeu) pentru studierea testelor de oxidare şi
asimilaţie.
Primul tub nu conţine substrat şi este utilizat drept control negativ. Celelalte tuburi conţin o cantitate definită de substrat
deshidratat, aparţinând familiei de carbohidraţi şi derivaţilor lor (heterozidaza, polialcooli, acizi uronici).
Aceste subtraturi pot fi metabolizate printr-o varietate de reacţii biochimice:
 Asimilaţie: este indicată pentru creşterea organismelor în godeuri atunci când substratul este singura sursă de carbon
prezentă.
 Oxidare: evidenţiată prin schimbarea de culoare în godeuri, detectată de indicatorul de pH din mediu (se datorează
producerii aerobe a acidifierii).
 Fermentarea: este evidenţiată prin schimbarea de culoare în tuburi datorate producerii anaerobe a acidifierii detectate de
indicatorul de pH-ul în mediu.
Sisteme microtest
API 50 CH Kit conține 10 teste Produse adiţionale necesare (care nu sunt incluse în kit):
Mediu de inoculare cum ar fi:
 10 strip-uri API 50 CH API 50 CHL Medium (pentru bacteriile lactice)
 10 cutii de incubare API 50 CHB/E Medium (pentru Bacillus / Enterobacteriaceae)
 10 buletine Ulei mineral
 1 insert Pipete sterile
Standard McFarland 2
Echipament de laborator necesar: Tampoane
Soft de identificare
Incubator
Frigider (2 – 8oC)
Bec Bunsen
Marker

Sisteme microtest
API 50 CHL Medium 10 ml API 50 CHB/E Medium 10 ml

Polipeptonă 10g Sulfat de amoniu 2g
Extract de drojdie 5g Extract de drojdie 0,5g

Tween 80 1 ml Triptonă 1g
Fosfat dipotasic 2g Roşu fenol 0,18g
Acetat de sodiu 3H2O 5g
Bază minerală (Cohen-Bazire) 10 ml
Citrat diamoniu 2g
Tampon fosfat pH 7,8 1000 ml
Sulfat de magneziu7H2O 0,20g
Sulfat mangneziu 4H2O 0,05g
Bromcresol purpur 0,17g
Apă demineralizată până la 1000 ml

Sisteme microtest
Precauţii:
Destinat numai diagnosticului in vitro.

Personalul de laborator calificat trebuie să utilizeze metode aseptice şi precauţiile
obişnuite contra agenţilor infecţioşi.
Nu se pipetează cu gura prelevatele și reactivii.
Nu se folosesc galeriile şi mediul după data expirării.
După scoaterea din frigider, se lasă mediul la temperatura ambiantă (20-30 oC)
înainte de utilizarea lui.
Deschideţi fiolele uşor, astfel:
 Ţineţi fiola vertical, într-o mână (capacul alb în partea superioară).
 Acoperiţi partea înclinată a capacului cu vârful degetului mare.
 Apăsaţi cu degetul partea înclinată a capacului cu o mişcare spre exterior
spărgând extremitatea fiolei în interiorul capacului.
 Îndepărtaţi uşor capacul.
 Aplicaţi o presiune laterală asupra capacului pentru transferarea în totalitate a
reactivului în flaconul picurător
Sisteme microtest
Preparare inocul
•Cultura bacteriană cultivată over night pe mediu de cultură adecvat, selectiv.
•Se verifică microscopic puritatea tulpinii bacteriene.
•Se prepară inoculul în mediul de suspensie recomandat în fiecare trusă API 50CHL Medium şi API 50 CHB/E Medium.
Pregătire strip-uri
•Un strip conţine 5 strip-uri mai mici, fiecare conţinând 10 tuburi numerotate.
•Se pregăteşte cutia de incubare (conţine o tavă şi un capac).
•Se notează numărul de înregistrare al tulpinii pe partea laterală alungită a tăvii (nu se face notaţia pe capacul cutiei).
•Se distribuie cam 10 ml apă distilată sterilă sau demineralizată în fagurele celulelor tăviţei pentru a realiza atmosferă umedă
pe timpul incubării.
•Se pun în tavă 5 strip-uri mici (0 – 9, 10 – 19, 20 – 29, 30 – 39 şi 40 – 49) .

Sisteme microtest
Inoculare strip
Suspensia bacteriană se distribuie folosind o pipetă sterilă în cele 50 de tuburi după cum urmează:
•Cutia de incubare se înclină pentru a permite introducerea în godeuri a suspensiei bacteriene de identificat.
•Se recomandă evitarea formării bulelor de aer prin distribuirea suspensiei bacteriene în godeuri.
•Când se inoculează numai tubul, se recomandă să nu se depăşească pentru a putea realiza condiţiile de anaerobioză cu ulei
mineral.
•Când trebuie să se umple ambele părţi ale godeului – tubul şi cupula – se recomandă umplerea acestora în aşa fel încât să nu
se formeze menisc concav sau convex.
•Strip-urile se incubează la temperatura optimă de creştere în funcţie de microorganismul de studiat: 30oC, 37oC sau 55oC.

Sisteme microtest
Strip-urile se citesc:
•după finalizarea perioadei de incubare (24 ore sau 48 ore) depinzând de microorganism şi de tipul de reacţie studiat
(fermentare, oxidare sau asimilaţie),
•semicantitativ: - 0 este dată de reacţiile negative şi 5 de reacţiile pozitive în cazul intensităţii maxime; Valorile de 1, 2, 3, sau 4
sunt date de reacţiile intermediare ( 3, 4 şi 5 fiind considerate ca pozitive).
•Rezultatele sunt raportate în tabel (buletin de analiză) și redau profilul biochimic al microorganismelor.
Interpretare:
Profilul biochimic poate fi folosit pentru:

-identificarea microorganismelor cu ajutorul unui soft de identificare
-analiza taxonomică a grupelor de microorganisme
-clasificarea populaţiei bacteriene necunoscute în grupe (biotipuri)

Testul API 20 Strep
Testul API 20 Strep (BioMerieux) constă în 20 de microtuburi ce conțin substrat deshidratat pentru
a evidenția proprietățile biochimice ale tulpinilor analizate.
1. Mediul API GP, 25 fiole cu 2 ml, se păstrează la 2 – 8°C. Mediul are un pH 7,4 – 7,6 și
următoarea compoziție:
oL-cistină 0,5g
oTriptonă (bovină/ porcină) 20g
oClorura de sodiu 5g
oSulfit de sodiu 0,5g
oRoșu fenol 0,17g
oApă distilată până la 1000ml
2. Reactivi:
oNIN, VP1 + VP2, ZYM A + ZYM B
oUlei mineral
oMediul de suspensie API
oStandard McFarland nr.4
Testul API 20 Strep
 Se crează cameră umedă prin picurarea câtorva picături de apă distilată sterilă în excavațiile cutiilor de incubare;
 Se prepară inoculul din cultura stoc conservată executând o subcultivare în mediu selectiv over night, la temperatura de
37°C până la faza logaritmică de creștere.
 Cu această cultură, folosind mediul de suspensie API se realizează un inocul cu o densitate optică (turbiditate)
comparabilă cu standardul McFarland nr.4.
 Se inoculează strip-urile, cu atenție să nu se formeze bule de aer.
 Microtuburile VP – LAP (1 – 9) (Voges Proskauer ‒› Leucin aminopeptitaza) se umplu cu această suspensie, iar în
microtubul ADH (10 - Arginin dehidrolaza) - doar jumătate. Restul de suspensie cu densitatea McFarland 4, se aspiră și
se toarnă peste mediul API GP, se omogenizează și se încarcă pe jumătate microtuburile RIB – GLYG (11: Fermentarea
D-ribozei – 20: Hidroliza glicogenului).
 Microtuburile ADH – GLYG (10 – 20) s-au umplut cu ulei mineral până la formarea unui menisc convex. Cutia de
incubare se acoperă cu capacul propriu și se incubează 24h la temperatura de 37°C.

Testul API 20 Strep
Pentru citirea și interpretarea rezultatelor după 24h de termostatare se ține cont de următoarele recomandări:
În microtubul 1VP (Voges Proskauer) se adaugă o picătură din reactivii VP1 și VP2
În microtubul 2HIP (Hidroliza acidului hipuric) se adaugă 2 picături din reactivul NIN.
În microtuburile 4-9 PYRA ‒› LAP (Pirolidonil arilamidaza ‒› Leucin aminopeptitaza) se adaugă câte o picătură din ZYM
A și ZYM B. Se așteaptă 10 minute și eventual se expun microtuburile 10 secunde la lumină puternică pentru a decolora
orice exces de reactivi după care se face citirea rezultatelor.

Nr. Microtub Reac\ia/enzima Negativ Pozitiv Nr. Microtub Punctaj Reacția Profil
1 VP Prod. de acetoină Incolor Roz-rosu numeric
(Voges Proskauer) 1 VP 1 + 7
2 HIP Hidroliza acidului Incolor/bleu Albastru închis/violet 2 HIP 2 +
hipuric
3 ESC 4 +
3 ESC Hidroliza esculinei Incolor/galben pal/ Negru
verde deschis 4 PYRA 1 - 4
4 PYRA Pirolidonil arilamidaza Incolor/portocaliu Portocaliu intens 5 GAL 2 -

deschis 6 GUR 4 +
5 GAL Galactozidaza Incolor Violet 7 GAL 1 + 3
6 GUR  Glucuronidaza Incolor Albastru
8 PAL 2 +
7 GAL  Galactozidaza Incolor/Violet pal Violet intens
9 LAP 4 -
8 PAL Fosfataza alcalină ------//------ ------//------
10 ADH 1 - 4
9 LAP Leucin aminopeptitaza Incolor Portocaliu
11 RIB 2 -
10 ADH Arginin dehidrolaza Galben Roșu
12 ARA 4 +
11 RIB Fermentarea D-ribozei Portocaliu/roșu Galben
13 MAN 1 + 7
12 ARA Ferm. L arabinozei ------//------ ------//------
14 SOR 2 +
13 MAN Ferm. D manitolului ------//------ ------//------
15 LAC 4 +
14 SOR Ferm. D sorbitolului ------//------ ------//------
16 TRE 1 + 1
15 LAC Ferm. D lactozei ------//------ ------//------
17 INU 2 -
16 TRE Ferm. D trehalozei ------//------ ------//------
17 INU Ferm. Inulinei ------//------ ------//------
18 RAF 4 -
18 RAF Ferm. D rafinozei ------//------ ------//------ 19 AMD 1 - 0
19 AMD Hidroliza amidonului ------//------ ------//------ 20 GLYG 2 -
20 GLYG Hidroliza glicogenului ------//------ ------//------ 21  hemoliza 4 -

TE H N O LO G IA PC R
Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction = reacţie de polimerizare în lanţ) este o metodă de amplificare
enzimatică in vitro a unei anumite secvenţe de ADN.
 a fost descoperită în 1985 de către Kary B. Mullis (1993 - Premiul Nobel) și, după 1988, a cunoscut o dezvoltare
explozivă și o rafinare extraordinară, fiind reacția care a revoluționat Biologia Moleculară a acizilor nucleici.
Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri
oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare).
Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de replicare ADN in vivo, îl reprezintă faptul că în
reacţia PCR etapa de desfacere a dublului helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic,
ci prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacţie este o ADN polimerază ADN-
dependentă (cu funcţie de replicază).
Licența de utilizare a reacției PCR este deținută de compania Hoffman La Roche.
Principalele componente ale reacţiei sunt:
 Matriţa ADN,
 Enzima ADN polimerază termostabilă,
 primerii oligonucleotidici,
 deoxinucleotidetrifosfat libere (dNTP),
 tamponul de reacţie,
 ioni de Mg++.
O reacţie PCR este formată din n cicluri (între 25 şi 40).
În fiecare ciclu sunt parcurse 3 etape principale:
 denaturarea termică a matriţei (deci, desfacerea dublului helix ADN),
 ataşarea primerilor şi
 polimerizarea propriu-zisă.
La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (ciclu de amplificare), cantitatea de ADN rezultată este dublă faţă de matriţă
care a intrat în ciclu. Produsele rezultate într-un ciclu (ampliconi) sunt folosite ca matriţă în ciclul următor, astfel încât
numărul final de copii ADN este de:
2n ∙ y unde:
y = numărul iniţial de copii,
n = numărul de cicluri de replicare.
Un pas important în dezvoltarea tehnologiei PCR a fost procesul de automatizare care a condus la producerea în prezent a
unor aparate ce desfaşoară “singure” întreg procesul de PCR, parcurgând toate treptele de temperatură în n cicluri.
Matriţa ADN este reprezentată de molecule de ADN d.c. linear/circular ce includ secvenţa de
amplificat (gena).
•Puritatea ADN introdus ca matriţă reprezintă un parametru important pentru succesul unei reacţii PCR.
De exemplu, cantităţi mari de ARN dintr-un extract ADN pot chelata ionii de Mg2+, determinând astfel
o activitate scăzută a ADN polimerazei. Pe de altă parte, o serie de contaminanţi din extractul ADN pot
inhiba acţiunea ADN polimerazei.
•Cantitatea de matriţă ADN introdusă într-o reacţie PCR influenţează puternic performanţa reacţiei.
Cantităţile recomandate pentru o reacţie PCR standard sunt:
• maximum 500 ng pentru ADN genomic uman,
• 1-10 ng ADN bacterian,
• 0.1-1 ng ADN plasmidial.
•Numărul de copii de secvenţă matriţă depinde de complexitatea moleculelor de ADN.

•Dacă trebuie amplificată o secvenţă de 1 kbp dintr-un plasmid de 4 kbp, secvenţa matriţă reprezintă
25% din ADN introdus în reacţie.
•o secvenţă tot de 1 kbp, dar dintr-un ADN genomic uman (care are 3.3 x 109 bp), reprezintă doar
0.00003% din ADN introdus în reacţie. Ca urmare, pentru a avea acelaşi număr de secvenţe matriţă,
trebuie introdusă o cantitate de ≈ 106 ori mai mare în cazul ADN genomic uman.
Ca recomandare generală, se porneşte cu un min. de 104 copii de secvenţă matriţă pentru a obţine un semnal într-o
reacţie PCR de 25-30 cicluri, având însă grijă ca, în amestecul de reacţie, concentraţia finală de ADN să fie ≤ 10 ng/μl.
Conversia acizilor nucleici din g în număr de molecule
Cantitate Acid nucleic Nr de molecule

1g 1kpb ARN 1.80 x 1012
1g 1kpb ADNdc 9.18 x 1011
1g Vector pGEM ¾ Z 2.85 x 1011
1g ADN de bacteriofag 1.90 x 1010
1g ADN genomic de E. coli 2.00 x 108
1g ADN genomic uman 3.04 x 105
Primerii oligonucleotidici 15 şi 30 bp
•sunt complementari cu (și se atașează la) capetele 3’ale celor două catene din regiunea ce
urmează a fi amplificată. Unul este forward sau upstream celălalt este revers sau downstream.
•să aibă un procent molar de guanină + citozină (% mol GC) cuprins între 40 – 60%
•să aibă o distribuţie echilibrată a domeniilor bogate în A/T şi G/C.
•să aibă valori Tm identice sau foarte apropiate care să permită temperaturi de ataşare între 55 şi
65oC (pentru specificitate maximă 62-65oC).
•să nu prezinte secvenţe cu complementaritate intracatenară (care, ar determina structuri
secundare interne).
•să nu fie complementari unul cu celalalt (pentru a se evita dimerizarea primerilor).
•concentraţiile optime ale primerilor într-o reacţie PCR sunt între 0.1 şi 0.6 μM.
Într-o reacţie PCR, un parametru important îl repezintă temperatura de ataşare a primerilor la matriţa ADN
(“primer annealing temperature”). Astfel, în cazul primerilor cu valori ridicate de Tm poate fi crescută
temperatura de ataşare a primerilor. Acest lucru conduce la minimizarea ataşărilor nespecifice, la evitarea
dimerizării primerilor, precum şi la creşterea cantităţii de produs PCR corect.
Pentru a estima temperatura de topire pentru orice oligonucleotid se aplică formula:
Tm = 81.5 + 16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%G+C) – 675/n
Unde [Na+] reprezintă concentraţia salină molară ([K+] = [Na+])

şi n = numărul de baze din oligonucleotid
De exemplu, pentru calcularea Tm a unui oligonucleotid 22mer (format din 22 de nucleotide) cu

60% GC, în 50 mM KCl:
Tm = 81.5 + 16.6 ∙ (log100.05) + 0.41 ∙ (60) – 675/22 = 53.84oC
Temperatura optimă de atașare a primerilor se află prin tatonări începând cu 5⁰C sub cea de
topire calculată (Tm).
dNTP (deoxinucleotidetrifosfat libere = dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
•Sunt folosite de către ADN polimerază în reacţia de polimerizare.
•d(NTP) se vor lega prin legături fosfodiesterice 3′-5′ în ordinea dictată de
complementaritatea cu nucleotidele ”citite” pe catena matriță.
•În amestecul de reacţie se introduc cantităţi echimolare din cele 4 tipuri de molecule; în
caz contrar scade fidelitatea ADN polimerazei.
•Concentraţia optimă a dNTP variază între 50 şi 500 μM (pentru fiecare dNTP),
valoarea cea mai des folosită fiind 200 μM. Această concentraţie trebuie corelată cu
concentraţia Mg2+.
•În cazul în care se doreşte obţinerea unor produşi de reacţie PCR marcaţi (radioactiv
sau neradioactiv), se introduc dNTP marcate.
Tamponul de reacţie conține
•Tris-hidroxi-aminometan (ca substanţă amfoter)
•MgCl2 (necesar funcţionării optime a ADN polimerazei termostabile).
Există şi variante în care tamponul de reacţie nu conţine Mg2+, iar acesta este livrat separat,
permiţând optimizarea concentraţiei ionilor de Mg2+ (soluţiile ce conţin Mg2+ trebuie
dezgheţate complet şi vortexate câteva secunde pentru că atunci când sunt îngheţate soluţiile
de MgCl2 tind să formeze gradienţi de concentraţie).
Ionii Mg2+
•formează complexe solubile cu moleculele dNTP pentru a forma substratul propriu-zis
recunoscut de ADN polimerază, deci, reprezintă un factor crucial ce afectează performanţa
oricărei ADN polimeraze.
•o serie de componente ale reacţiei de PCR (agenţi chelatori prezenţi în proba de ADN –
EDTA sau citraţii sau diverse tipuri de proteine) pot scădea cantitatea ionilor liberi de Mg2+,
ceea ce conduce la o activitate slabă sau chiar inactivitate a polimerazei.
•excesul ionilor de Mg2+ reduce însă fidelitatea enzimei şi poate conduce la creşterea
amplificărilor nespecifice prin ataşările nespecifice ale primerilor.
Concentraţia optimă de MgCl2 variază între 1 şi 5 mM, valoarea cea mai
frecvent folosită fiind 1.5 mM (cu dNTP la concentraţia de 200 μM fiecare).
ADN polimeraza termostabilă
În majoritatea experimentelor, cantitatea optimă de ADN polimerază termostabilă este

cuprinsă între 0.5 şi 0.25 U / 50 μl volum de reacţie.
Iniţial, reacţia PCR folosea ca replicază fragmentul mare (Klenow) al ADN polimerazei I de la
Escherichia coli (după pierderea activității exonucleazice 5′-3′). Această enzimă era însă
inactivată de temperaturile ridicate necesare etapei de denaturare a matriţei. Ca urmare, la
fiecare ciclu de replicare trebuia adaugată enzimă “proaspătă”.
Ulterior, a fost descoperită şi introdusă în reacţia PCR o ADN polimerază termostabilă - Taq-pol - izolată
dintr-o tulpină de Thermus aquaticus (bacterie termofilă izolată din izvoarele termale Yellow Spring din
SUA) care posedă echipamente enzimatice cu temperaturi optime ridicate (mai mari de 70oC) şi care sunt
capabile să desfăşoare activităţile specifice şi după treceri peste temperaturi extreme (în jur de 100oC).
Thermus aquaticus
Morning Glory Pool, Yellowstone National Park,

Wyoming, USA Taq-pol
Taq pol
• greutate moleculară de 94 KDa
• o activitate specifică la 20.000 unităţi/mg
• temperatura optimă de 75-78oC,
• la T > 90oC activitatea sa scade semnificativ.
• la T optimă, o moleculă polimerizează ≈150
nucleotide/sec.
• în afară de activitatea de polimerizare (5’-3’), această
specie moleculară de ADN polimerază, mai are şi
activitate exonucleazică (5’-3’).
• nu are însă activitate exonucleazică în direcţie inversă
polimerizarii (3’-5’) - ce asigură funcţia de citire şi
încorporare corectă a d(NTP) - proofreading). Astfel,
fidelitatea încorporării depinde strict de concentraţia
dNTP în amestecul de reacţie.
• Rata erorilor de încorporare 1-2 / 104 baze
• Taq pol permite realizarea de reacţii PCR în 3 trepte
de temperatură, în care denaturarea moleculelor de
ADN d.c. se realizează la 90-95oC, ataşarea primerilor
la 55-60oC, iar polimerizarea la 72-75oC.
În marea majoritate a cazurilor, pornind de la asemenea variante naturale, ADN polimeraze termostabile au
fost manipulate genetic (cu obţinerea unor variante ameliorate) şi clonate în tulpini de E.coli
(microorganism ce este mult mai uşor de crescut şi manipulat decât bacteriile termofile).
ADN polimeraza Ampli-Taq
•este o ADN polimerază recombinantă obţinută prin exprimarea unei forme modificate a genei pentru Taq
pol în E.coli.
•activitatea optimă se desfășoară la temperatura la care are loc şi ataşarea stringentă a primerilor (55-75oC,
cu maximumul la 60oC). Ca urmare, folosirea acestei enzime simplifică reacţia PCR de la 3 trepte de
temperatură la 2 trepte: 95oC – temperatura la care se realizează denaturarea ADN d.c., 60oC – ataşarea
primerilor şi polimerizarea.
•are o stabilitate mult mai mare la temperaturi de peste 90oC, faţă de Taq pol, a cărui activitate enzimatică
scade semnificativ cu fiecare trecere peste 90oC.
•are şi activitate exonucleazică în direcţie 3’-5’, ceea ce determină ca această enzimă să prezinte o mult
mai mare specificitate de citire şi de încorporare.
ADN polimeraza Stoffel-Ampli-Taq este reprezentat de Ampli-Taq din care a fost scos un fragment de 290
aminoacizi de la capul N-terminal responsabil de activitatea exonucleazică în directie 5’-3’ şi deci, nu
prezintă acest tip de activitate, ceea ce, pe de o parte, creşte mult viteza de polimerizare, iar pe de altă parte
permite o amplificare mai eficientă a matriţelor circulare (de ex. ADN plasmidial). Este de 2 ori mai
termostabilă decat Ampli-Taq şi îşi păstrează activitatea optimă într-un interval mult mai larg de
concentraţii de Mg++.
ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa VENT
1. ADN polimeraza VENT pol este o ADN polimerază ADN dependentă termostabilă
izolată din Thermococcus litoralis. Această bacterie trăieşte în izvoare marine calde,
cunoscute în literatura de specialitate sub denumirea de “vent-uri”. VENT pol
desfăşoară ambele tipuri de activităţi exonucleazice(3’-5’ şi, respectiv, 5’-3’).
2. ADN polimeraza VENT pol (exo-) este similară cu VENT pol, dar nu are act. exonucleazică 5’-3’.
ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa DEEP VENT

1. ADN polimeraza DEEP VENT pol este izolată dintr-o tulpină de
Pyrococcus furiosus (microorganism ce trăieşte în izvoare marine calde de mare
adâncime). Această enzimă desfăşoară ambele tipuri de activităţi exonucleazice,
dar este mai rezistentă decât VENT pol şi decât Ampli-Taq pol la T>100oC - necesare denaturării matriţelor (în
mod special la matriţele circulare, lungi sau cu % mol GC ridicat).
2. DEEP VENT pol (exo-) este similară cu DEEP VENT pol, dar nu are activitate
exonucleazică 5’-3’.
ADN polimeraze ambivalente termostabile

1) ADN polimeraza rTth pol este o ADN polimerază recombinată obţinută prin exprimarea unei forme
modificate a genei din Thermus thermophilus, în E.coli. Caracterul ambivalent al acestei enzime constă în
faptul că poate fi folosită ca ADN polimerază ARN dependentă (revers-transcriptază), în prezenţa MnCl2, după
care, prin chelatarea ionilor de Mn şi adăugare de MgCl2, poate acţiona ca ADN polimerază ADN dependentă,
desfăşurând o reacţie PCR clasică.
În ceea ce priveşte concentraţia de enzima polimerizatoare, aceasta depinde de tipul de
enzimă folosită. Pentru ADN polimeraza Taq pol sunt suficiente 1.25 U într-un volum de
reacţie de 50 μl.
Cantităţi crescute de enzimă sau timpi prelungiţi de polimerizare nu vor creşte semnificativ
produsul de reacţie, ci vor genera artefacte datorate activităţii exonucleazice 5’ - 3’ a enzimei
Taq pol (în gelul de verificare vor apărea ca nişte benzi “mânjite”).
Un alt parametru important al reacţiei PCR este temperatura la care are loc reacţia de
polimerizare (“extension temperature”). Această temperatură este în funcție de tipul de ADN
polimerază folosită, în general se recomandă menţinerea timpului de 1 minut pentru fiecare
kbp de amplificat.
Ca număr de cicluri, pentru marea majoritate a reacţiilor PCR sunt suficiente 25-40 de cicluri.
Un alt aspect important în manipulările genetice ulterioare ale unui produs de reacţie PCR îl
reprezintă tipul de capete pe care îl generează ADN polimeraza respectivă. Astfel, ADN
polimeraza Taq pol generează capete coezive cu prelungiri 3’-A, în timp ce majoritatea
enzimelor ce prezintă activitate exonucleazică 3’ - 5’ generează capete netede.
Treptele de temperatură ale unei racţii PCR standard
Denaturarea iniţială
Pentru ca o reacţie PCR să se desfăşoare eficient, este foarte important ca moleculele ADN
matriţă să fie denaturate iniţial complet. Acest lucru poate fi realizat prin încălzirea iniţială a
amestecului de reacţie 2 min la 94-95oC.
Treapta de denaturare din cadrul fiecărui ciclu
De obicei, este suficientă o denaturare de 20-30 sec la 94-95oC, dar aceasta trebuie adaptată
funcţie de termocycler şi de tuburile folosite (de ex., dacă se lucrează în tuburi de 500 μl sunt
necesari timpi mai lungi decât dacă se lucrează în tuburi de 200 μl). Totodată, pentru matriţe
bogate în GC se recomandă folosirea unor timpi de denaturare mai lungi.
Ataşarea primerilor
În marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataşare a primerilor trebuie determinată
şi optimizată empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezintă unul din factorii cei mai critici
pentru asigurarea unei înalte specificităţi a reacţiei PCR. Dacă temperatura de ataşare este mult
prea înaltă, nu are loc ataşarea primerilor, iar dacă temperatura este prea scăzută, atunci creşte
probabilitatea ataşărilor nespecifice.
Polimerizarea propriu-zisă
Taq ADN pol polimerizează aproximativ 60 nucleotide/secundă la 72oC. În fiecare ciclu, o
perioadă de polimerizare de 45s este suficientă pentru amplificarea unor fragmente de până
la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul se calculează în
multipli de 45s, urmat de ajustări pentru diverse matriţe.
Pentru a obţine o cantitate cât mai mare de amplicon, se poate varia timpul de polimerizare,
astfel: pentru primele 10 cicluri se foloseşte un timp constant de polimerizare (de ex. 45s
pentru 1 kbp), iar pentru următoarele 20 de cicluri se creşte timpul de polimerizare cu 2-5s
per ciclu (de ex. 50s pentru ciclul 11, 55s pentru ciclul 12 etc). Mărirea progresivă a timpului
de polimerizare oferă enzimei mai mult timp pentru polimerizare, pentru că pe măsură ce
reacţia PCR avansează, în amestecul de reacţie se găseşte din ce în ce mai multă matriţă şi
din ce în ce mai puţină enzimă activă (randamentul enzimei scade datorită expunerii
prelungite la temperaturi înalte).
Polimerizarea (extensia) finală
În multe reacţii, după ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacţie se ţin 5-15 min la 72oC pentru a realiza
polimerizarea completă a produşilor parţiali, precum şi renaturarea moleculelor monocatenare. La finalul
reacției, amestecul se răcește la 4oC și se poate păstra un timp nedefinit.
Platoul amplificării
O reacţie PCR de amplificare ADN in vitro nu este infinită: după un anumit număr de cicluri, secvenţa
amplificată nu se mai acumulează exponenţial, iar reacţia intră într-o fază lineară (staţionară) denumită
platoul amplificării.
AVANTAJE
Marele avantaj al tehnicilor PCR îl reprezintă faptul că permite obţinerea unei cantităţi mari
dintr-o anumită secvenţă ADN, fără a necesita clonarea acesteia în prealabil într-o moleculă de
tip vector și în situații când sunt disponibile cantităţi foarte mici de ADN. Asemenea situaţii se
întâlnesc în :
• diagnosticul unor boli monogenice, detectarea de noi mutaţii în gene importante în anumite
boli;
• diagnosticul unor infecţii umane: permite detectarea particulelor infecţioase bacteriene şi
virale
• chiar aflate într-o proporţie mică,
• chiar pentru specii ce se cultivă dificil in vitro,
• chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenică mare şi
• chiar pentru patogeni ce au perioadă mare de latenţă; astfel, pot fi identificaţi indivizii
umani pozitivi înainte de manifestarea clinică a bolii;
AVANTAJE
• studii privind mecanismele genetice ce acompaniază procesele maligne (detectarea

secvenţei şi ţesutului în care se exprimă anumite oncogene în diverse procese
maligne);
• studii de taxonomie, sistematică şi filogenie moleculară: obţinerea rapidă a unei

cantităţi mari din secvenţe ADN cu valoare taxonomică şi/sau filogenetică;
• biologia populaţiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite secvenţierea

rapidă a unor molecule de ADN de la foarte mulţi indivizi, fără a necesita în prealabil
clonarea acestora;
• studii de antropologie: tehnica PCR permite în prezent recuperarea şi analiza unor

secvenţe ADN din fosile;
• medicină legală: cu ajutorul reacţiilor PCR pot fi în prezent analizate la nivel

molecular o serie întreagă de probe biologice.
TIPURI DE PCR
Obţinerea de sonde ADN/ARN marcate

Astfel, într-o variantă, se folosesc primeri
marcaţi (radioactiv sau neradioactiv) şi dNTP
nemarcate.
Ampliconii obţinuţi într-o asemenea reacţie
sunt molecule dublu-catenare marcate la
capete (primerii unei reacţii PCR intră în
structura produşilor de reacţie).
Într-o altă variantă, în reacţia PCR se introduc atât primeri marcaţi, cât şi dNTP marcate.
Ampliconii obţinuţi vor fi reprezentaţi de molecule marcate pe toată lungimea.
În ambele cazuri, ampliconii rezultaţi sunt denaturaţi

termic, obţinându-se în final sondele monocatenare
utilizabile în reacţiile de hibridizare moleculară
http://www.gene-quantification.de/poster-main.html
Reverstranscription PCR (RT-PCR)
•denaturarea structurilor secundare ale

moleculelor ARN,
•ataşare un primer complementar capului 3’ al
moleculei ARN
•sinteza primei catene de ADNc. In această
reacţie se foloseşte o ADN polimerază ARN-
dependentă (revers-transcriptază),
•Hibridul ARN:ADN obţinut este supus unei
reacţii de distrugere a catenei ARN cu RNaza
H,
•la catena ADNc rămasă este ataşat un primer
complementar cu capul 3’ al acesteia. După
sinteza celei de-a doua catene, rezultă un
ADNdc, moleculele sunt introduse într-o
reacţie PCR obişnuită.
MS PCR (Mutation Specific PCR): experimente de mutageneză situs-specifică, modificările dorite pot fi
introduse în ampliconi pe calea primerilor (inserţii sau de deleţii).
În toate aceste cazuri se utilizează o tehnologie PCR în care

reacţia de amplificare este împărţită în 2 reacţii PCR separate
în care sunt amplificate cele 2 secvenţe ADN aflate de o
parte şi de alta a situsului de modificat. În aceste 2 etape se
folosesc perechi de primeri:
• primer extern (pentru capătul secvenţei iniţiale)
• primer intern (primerii interni sunt complementari
situsului de modificat şi conţin în secvenţă mutaţia
dorită).
Prin folosirea unor asemenea primeri, ampliconii rezultaţi
conţin deja modificarea dorită, precum şi o zonă de
complementaritate inter-ampliconi. Urmează:
• amestecarea celor 2 produse PCR,
• denaturarea termică a moleculelor urmată de renaturarea
acestora.
• adăugarea de primeri exteriori şi realizarea unei noi
reacţii PCR, al cărei rezultat va fi reprezentat de molecule
ADN identice cu matriţa initială, conţinând însă şi
modificarea dorită.
PCR in situ
Una din limitările tehnicii PCR o reprezintă necesitatea de a extrage şi purifica matriţa (ADN sau ARN)
înainte de amplificare. Varianta tehnică PCR in situ combină o reacţie PCR cu o hibridizare moleculară in
situ. Astfel, reacţia PCR se realizează în celule intacte şi este apoi detectată prin hibridizare in situ (întreaga
reacţie, atât PCR, cât şi hibridizarea, se realizează pe ţesut împarafinat şi plasat pe lama de microscop).
Printr-o asemenea tehnică se poate identifica foarte exact care celule posedă o anumită secvenţă ADN sau
care exprimă o anumită genă. Pe de altă parte, se reduce foarte mult riscul contaminării produselor PCR cu
alte secvenţe ADN.
saline-sodium citrate (SSC) buffer
Human papilloma virus (HPV) in situ polymerase chain reaction (PCR) of breast cancer cell lines.
(A–C) cell line MBA-MB-175V11 ( human breast cancer cell lines)
(D–F) cell lines BR-SK3( human breast cancer cell lines)
(G–I) cell lines HeLa (HPV-18 containing cervical cancer cell line: positive control).
(A, D and G) In situ PCR with HPV E6 primers.
(B, E and H) In situ PCR with HPV L1 primers.
(C, F and I) No primer (negative) in situ PCR control.
Real Time PCR (PCR cantitativ = qPCR)
Metodele PCR tradiţionale (convenţionale) au la bază o detecţie a produşilor PCR în faza de platou a procesului
(detectie end-point).
În ultimii ani, tehnologia PCR a fost revoluţionată prin dezvoltarea metodelor de detecţie în faza exponenţială
(detecţie în timp real: real-time PCR).
• Real Time PCR este o metodă diferită faţă de RT-PCR (reverse transcriptase PCR).
• Real Time PCR este o metodă care include atât amplificarea fragmentului ADN în timp real cât şi analiza
(cuantificarea) acestuia.
• Limita inferioară de detecţie mult îmbunătăţită (cantităţi mult mai mici de probă şi mai puţine diluţii ale
probelor).
• Un număr mult mai mare de probe de concentraţii diferite pot fi analizate în acelaşi timp.
Applied Biosystems
7700
Applied Biosystems
iCycler
BioRad
6000 Rotor Gene

FluorTracker
LightCycler Corbett Research
Stratagene
Roche
Sonde TaqMan (sondă = probe) sunt dublu marcate:
•la un capăt cu o substanță fluoroforă (“reporter dye” R) și
•la celălalt capăt cu o moleculă blocantă (“quencher dye” Q).
FRET = fenomenul Fluorescence Resonance Energy Transfer are loc numai când fluoroforul (reporter) și quencerul
sunt apropiați. Quencer-ul inhibă emisia fluorescentă a reporter-ului, până la etapa de extensie (elongare) când cele două
molecule se separă și apare fluorescența.
În cazul în care amplificarea este eficientă, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan.
În cursul etapei de elongație, Taq polimeraza, prin activitatea sa enzimatica de 5’ endonuclează, va degrada sonda TaqMan
și va elibera astfel fluoroforul (reporter dye). Deci, amplificarea fragmentului ADN se poate vizualiza cu ajutorul
moleculei reporter pe tot parcursul reacției, nu numai la sfârșit. Intensitatea fluorescenței crește direct proporțional cu
multiplicarea ampliconului, după fiecare ciclu.
Quantification Cycle (Cq) or Threshold Cycle (Ct)
The cycle at which fluorescence from amplification exceeds the
background fluorescence has been referred to as threshold cycle
(Ct), crossing point (Cp).
Ct (ciclu prag)= primul ciclu la care sistemul optic poate
detecta fluorescența, ca urmare a amplificării secvenței.
Cu cât este mai mare cantitatea de ADN inițial în probă, cu
atât Ct va fi mai mic.
Dacă se folosește curba standard, soft-ul va compara Ct al
standardelor cu Ct al probelor și va determina concentrația
de ADN inițială a fiecărei probe.
The number template control (NTC)
relative fluorescence units
Aplicații Real-Time PCR
• Genotipare
 Trisomii și detectarea numărului de gene unice din genom
 Diagnosticul prenatal al celulelor fetale din sângele matern
 Diagnosticul cancerelor
• Cuantificarea expresiei genelor
• Studiul ADN mitocondrial
• Detecția metilării
• Detecția inactivării cromozomului X
• Verificarea existenței ADN în probele biologice
• Controlul calității alimentelor
• Testarea stabilității genetice
• Monitorizarea eficienței medicamentelor pe microorganisme
• Detectare și cuantificare a ADN viral
• Detecția și cuantificarea patogenilor

Tehnici Microbiologice Utilizate În Analiză Și Control PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Tehnici Microbiologice Utilizate În Analiză Și Control PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Tehnici microbiologice utilizate

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Acest sistem de clasificare

 Nu au organite celulare delimitate de membrană;  Posedă compartimentare celulară – sistem intern de

Structura citoplasmatică structură simplă structură complexă cu membrane intracitoplasmatice şi citoschlet

flagelară şi ciliară făcută de tubulină, dar si prin sistemul actina-miozina

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Inoculul reprezintă o cultură microbiană aflată în etapa finală a creşterii

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Tehnici de conservare a culturilor pure de microorganisme:

 Repicarea periodică la intervale scurte de timp (subculturi periodice);

 Privarea culturilor de accesul oxigenului;

 Menținerea culturilor la temperaturi scăzute;

 Păstrarea celulelor în medii cu umiditate redusă.

Refrigerarea și congelarea (crioconservarea) determină prelungirea perioadei de conservare. Se face la 4-5°C

Conservarea în azot lichid presupune:

Refrigerarea si congelarea (crioconservarea)

Păstrarea microorganismelor în stare uscată

Au ca funcție menținerea, depozitarea și

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Sistemul de brevetare și organizarea laboratoarelor standard

CGSC - E.coli Genetic Stock Center

18,560 specii sau subspecii de bacterii.

Bulgaria 3 13,234 Latvia 1 692

Czech 12 7,697 Netherlands 5 76,775

Denmark 2 86,500 Norway 2 2,602

Estonia 3 6,300 Poland 9 8,464

Finland 2 7,513 Portugal 5 7,035

France 35 60,569 Romania 2 760

Germany 12 47,278 Russian Federation 13 40,804

Greece(Hellenic Rep.) 6 5,309 Slovak 3 4,916

Hungary 6 7,907 Slovenia 2 4,160

Ireland 1 380 Spain 4 9,027

Italy 8 12,871 Sweden 3 52,700

ICCF WDCM232 Collection of Industrial Microorganisms

RBCAR WDCM928 Romanian Bioresource Centre and Advanced Research

• Coci, diplococi, streptococi, stafilococi;

Tipul de metabolism energetic:

Forma: circulară, filamentoasă, neregulată, rizoidă, fuziformă.

Numărarea microorganismelor eukariote cu camere de numărat

Suprafața unui pătrățel elementar

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

 inoculare în masa mediului solidificat, când 1 cm³ din fiecare

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

 inoculare prin răspândirea celulelor pe suprafaţa mediului solidificat,

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Această metodă se pretează la analiza probelor lichide cu un conţinut redus de

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

De o parte şi de alta a unui tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018

Este o metodă biofizică bazată pe tehnologia laser, des utilizată în biotehnologie

Universitatea Dunărea de Jos din Galati 2017-2018