Biotehnologii de obinere a enzimelor furajere utilizate n hrana animalelor

Generaliti: Termenul de enzim a fost folosit pentru prima dat de ctre Kuhne (1887) pentru a numi o subtan catalitic obinut din drojdii. Mai t rziu s!a stabilit faptul c enzimele sunt de fapt proteine cu acti"itate catalitic. #le sunt sintetizate de toate or$anismele "ii (microor$anisme% plante &i animale) &i produc ansamblul reaciilor biochimice care determin metabolismul. #nzimele sunt biocatalizatori foarte eficieni% ele acioneaz 'n cantiti mici &i au o acti"itate e(trem de intens% put nd mri "iteza de desf&urare a reaciilor chimice de p n la 1)* ori. #nzimele acioneaz asupra substratului pentru care manifest specificitate catalitic numai 'n anumite condiii de temperatur &i p+% &i la fel ca orice catalizator nu se consum &i nu se transform 'n timpul reaciilor chimice. perioad 'ndelun$at de timp din trecutul omenirii enzimele au stat la baza obinerii p inii% br nzeturilor% "inului &i a berii fr a fi 'ns identificate. ,in multitudinea de enzime care particip la reaciile metabolice% au fost identificate &i caracterizate p n 'n prezent peste -))) de enzime% din care . -)) sunt disponibile pentru utilizare 'n procesele industriale.

Clasificarea enzimelor: /lasificarea enzimelor se face 'n primul r nd dup natura reaciei pe care o catalizeaz &i apoi dup substratul &i produ&ii specifici. #nzimele au fost clasificate 'n urmtoarele clase0 Oxidoreductaze 1 catalizeaz reacii de o(ido! reducere% denumite 2donor3 acceptor o(idoreductaze4. Transferaze 1 catalizeaz transferul unor $rupri chimice de la o molecul la alta% fiind denumite 2$ruptransferaze4. Hidrolaze ! catalizeaz scindarea pe cale hidrolitic a le$turilor dintre un atom de carbon &i ali atomi. Liaze 1 catalizeaz scindarea moleculelor de substrat la ni"elul le$turilor /!/% /!5% /!6% /!7% fr a inter"eni 'n reacie molecule de ap ca 'n cazul hidrolazelor. Izomerazele ! catalizeaz rearanjri interne 'n molecula substratului. Ligazele (sintetazele) 1 catalizeaz sinteza a - ractani prin formarea le$turilor de tip0 /!/8 /!58 /!68 /!7.

#nzimele folosite 'n alimentaia animalelor sunt 'n e(clusi"itate hidrolazele% acestea a" nd capacitatea de a de$rada anumite substane 'n prezena apei% absolut necesar acti"itii enzimatice. 9a finele fiecrui ciclu de reacie enzima se re$se&te neconsumat alturi de produ&ii rezultai din de$radarea substatului iniial.

Specificitatea i mecanismul de aciune al enzimelor 7pecificitatea reprezint proprietatea de baz a enzimelor care este determinat de structura &i conformaia situsului catalitic. #nzimele au o specificitate dubl0 Specificitatea de substrat- unele enzime au o specificitate absolut acion nd strict asupra unui substrat% iar altele au o specificitate relati"a de $rup acion nd asupra mai multor substraturi cu structuri chimice asemntoare. Specificitatea de aciune- const 'n faptul c fiecare enzim catalizeaz numai un anumit tip de reacie. :cela&i substrat poate fi catalizat de mai multe enzime 'ns tipurile de reacie &i produ&ii de reacie finali sunt diferii.

ecanismul de aciune al enzimelor ;nteraciunea enzim! substrat este una de complementaritate ri$uroas asemntoare modelului lac!tcheie. Molecula de substrat se fi(eaz la situsul catalitic% form nd un comple( de tranziie din care se obine rapid unul sau mai multe produse. ;nteraciunea temporar a moleculei de substrat cu enzima se realizeaz prin trei tipuri de catene laterale de aminoacizi care intr 'n structura situsului catalitic0 prima caten asi$ur le$area% a doua caten induce orientarea steric &i a treia induce acti"area substratului. <entru a a"ea loc transformarea substratului 'ntr!un produs% este necesar ca moleculele substratului s fie acti"ate. #ner$ia de acti"are a unui substrat reprezint cantitatea de ener$ie necesar pentru ca toate moleculele dintr!un mol de substan s atin$ o stare acti"at. #nzimele au capacitatea de a mic&ora foarte mult ener$ia necesar pentru acti"area moleculelor de substrat &i accelereaz transformarea substratului 'n produ&i de reacie.

"actorii care influeneaz! #iteza de reacie a enzimelor Viteza de reacie reprezint cantitatea de substrat care se transform 'n unitatea de timp.

<rincipalii factori care influeneaz "iteza de reacie sunt0 concentraia enzimei, concentraia substratului, temperatura, pH-ul &i efectorii enzimatici. Concentraia enzimei. =iteza de reacie este direct proporional cu cre&terea concentraiei enzimei ('ntre anumite limite)% apoi aceasta de"ine constant. Concentraia substratului$ /re&terea concentratiei substratului la o concentraie enzimatic constant determin 'n prima faz o cre&tere rapid a "itezei de reacie dup care aceasta de"ine constant. 9a concentraii mici ale substratului numai o parte dintre situsurile catalitice ale enzimelor sunt saturate cu molecule de substrat. ,up structurarea complet a situsurilor enzimatice% asi$urarea unui e(ces de substrat nu mai determin o nou cre&tere a "itezei de reacie.

Temperatura. =iteza de reacie a enzimelor cre&te o dat cu cre&terea temperaturii p n la anumite limite peste care efectul catalitic scade% iar 'n fimal dispare. :cti"itatea enzimatic are loc numai 'n anumite limite ale temperaturii% enzimele folosite 'n alimentaia animalelor a" nd o acti"itate intens 'n inter"alul >?! @))/% temperatura specific or$anismului animal. Temperaturile de peste 8)! A))/ produc denaturarea ire"ersibil a proteinelor a" nd loc pierderea acti"itii enzimatice. Meninerea stabilitii enzimelor furajere la temperaturi ridicate este de dorit 'n cazul $ranulrii nutreurilor combinate% proces care necesit temperaturi de 7)! 8))/. pH ul. #nzimele au acti"itate catalitic intens la "alori foarte diferite ale p+!ului mediului. p+!ul optim este considerat cel la care "iteza de reacie este ma(im. <epsina are p+!ul optim de -%)! -%?% tripsina 7%8 iar fosfataza alcalin A%).

!fectorii enzimatici acioneaz asupra enzimelor influen nd poziti" sau ne$ati" "iteza reaciilor enzimatice. #fectori enzimatici acti"atori sunt0 Mn-B % /a-B % /l! % M$-B #fectori enzimatici inhibitori sunt0 ire"ersibili0 <b-B % +$-B % /5% :s re"ersibili! se asociaz temporar de enzim bloc ndu!i acti"itatea catalitic.

,eterminarea vitezei de reacie se poate realiza pe baza msurrii $radului de transformare a substratului 'ntr!un anumit inter"al de timp sau prin msurarea concentraiei de produs rezultat ca urmare a reaciei enzimatice% 'ntr!o unitate de timp.

Biotehnologia obinerii produselor enzimatice furajere #nzimele pot fi produse din culturi de microor$anisme% culturi de celule &i e(tracte de esuturi animale sau "e$etale. Cn momentul de fa cea mai mare parte a enzimelor sunt obinute cu ajutorul microor$anismelor% 'n special ciuperci &i bacterii.

%#antajele utilizrii microorganismelor pentru obinerea enzimelor :"antajele utilizrii microor$anismelor pentru obinerea produselor enzimatice sunt0 microor$anismele pot sintetiza o $am lar$ de enzime dintre care o parte nu pot fi produse de or$anismul animal8 deoarece microor$anismele sunt capabile s se adapteze unor condiii foarte "ariate de mediu (temperatur% p+% etc) enzimele microbiene sunt deseori mai stabile 'n medii mai puin fa"orabile fa de enzimele pro"enite din plante sau animale8 datorit multiplicrii mai rapide a microor$anismelor se pot obine cantiti mai mari de enzime8 separarea enzimelor bacteriene se face relati" u&or% mai ales c nd au o localizare e(tracelular8 mediul de cultur este mai u&or de sterilizat &i pot fi e"itate u&or contaminrile8

preul de cost este mai mic comparati" enzimelor obinute din culturi celulare sau e(tracte tisulare. ,oar anumite ciuperci &i bacterii au capacitatea de a se multiplica rapid &i de a produce o cantitate mare de enzime. :ceste microor$anisme sunt selecionate din populaiile slbatice sau sunt obinute prin tehnici de in$inerie $enetic 'n cazul crora informaia $enetic a unei enzime este transferat la alt microor$anism. <entru a $si microor$anismele adec"ate sintezei enzimatice au fost testate sute de $enuri &i specii microbiene. /ompoziia mediului are de asemenea un rol foarte important 'n procesele de biosintez enzimatic. :cesta trebuie s conin zaharuri% proteine &i sruri minerale asi$urate prin0 hidrolizate de amidon% zaharoz% melas% fin de cereale% &rot de soia etc. Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc mediul de cultur

Mediul de cultur trebuie s 'ndeplineasc c te"a condiii importante0 s fie accesibil 'n cantiti mari8 s nu conin substane to(ice8 s aib o compoziie constant8 s se obin la un pre de cost sczut8

&rocedee folosite pentru producerea enzimelor <rincipalele metode folosite pentru producerea enzimelor la scar industrial sunt0 <rocedeul D la suprafa E. /onst 'n utilizarea unui mediu solid sau semisolid care conine cantiti mici de ap &i este foarte bine aerat. ,up terminarea fermentaiei% mediul este omo$enizat% uscat p n la 1)! 1-F ap &i apoi mcinat sub form de pudr. Metoda este laborioas &i foarte costisitoare. Totu&i prin acest procedeu se obin unele enzime cum sunt proteazele &i pectinazele din $enul :sper$illus. <rocedeul D submers E <rin acest procedeu se obin majoritatea enzimelor microbiene. Mediile nutriti"e sunt lichide% iar culti"area microor$anismelor este submers. Metoda permite asi$urarea unui control ri$uros asupra compoziiei chimice a mediului% p+!ului% temperaturii &i aerrii. Gioreactoarele folosite pentru producerea enzimelor sunt 'nchise (se reduce riscul contaminrii cu microor$anisme strine)% a" nd capaciti cuprinse 'ntre 1)! ?) m>. Hermentaia dureaz 'ntre >)! 1?) ore. <rodusele de fermentaie obinute prin aceast metod sunt purificate% standardizate &i supuse unui control de calitate.

#nzimele eliminate de microor$anisme 'n spaiul e(tracelular ('n stare liber) pot fi izolate u&or prin 'ndeprtarea masei celulare% centrifu$are &i filtrarea lichidului. #nzimele intracelulare sunt izolate prin dezinte$rarea mecanic a membranelor celulare &i mitocondriale cu ajutorul morilor cu bile% omo$enizatoarelor sub presiune etc. <rodusele enzimatice sunt comercializate sub form solid sau lichid% 'n stare brut sau cu mare puritate. #nzimele furajere se introduc 'n nutreurile combinate 'n cantiti de 1!- I$3t a" nd costuri cuprinse 'ntre >!-? J3 I$.

<entru meninerea stabilitii enzimelor o period mai lun$ de timp% fr a fi influenat ne$ati" acti"itatea lor catalitic se folose&te metoda imobilizrii enzimelor. ;mobilizarea se poate face folosind metode fizice &i chimice. Metodele fizice mai des utilizate sunt0 adsorbia enzimelor 'n interiorul unei matrici insolubile% acoperirea enzimelor cu $el sau 'ncapsularea enzimelor 'ntr!o membran semi! permeabil. ,in punct de "edere chimic enzimele pot fi le$ate co"alent la un suport insolubil de natur anor$anic sau or$anic (ceramic% sticl% celuloz% nKlon% polistiren).

Ln produs enzimatic nou aprut poate fi comercializat numai dup "erificarea securitii &i a si$uranei aplicrii lui 'n producie. Testele se efectueaz pe animale de laborator &i sunt foarte costisitoare put nd dura de la c te"a sptm ni la c i"a ani. icroorganismele folosite n producerea enzimelor Microor$anismele implicate 'n producia de enzime aparin fun$ilor (:sper$illus% <enicillium% +umicola &i Trichoderma)% bacteriilor ($enurile Gacillus licheniformis &i Gacillus subtilis) &i chiar unor drojdii. 'tilizarea enzimelor n structurile de nutreuri combinate Ltilizarea enzimelor 'n hran a fost menionat pentru prima dat de ctre /harlton &i col. (1AA*)% acesta su$er nd urmtoarele ci pentru folosirea comple(elor enzimatice0 simpla introducere n diet. #nzimele introduse 'n plus la dieta standard (fr reformulare) 'mbuntesc di$estibilitatea nutreurilor &i totodat 'mbuntesc performanele de cre&tere ale animalelor. ,e aceea utilizarea lor a fost su$erat 'n reetele prestarter &i starter ale acestora. utilizarea altor materii prime n diet. <rin folosirea enzimelor se obser" o 'mbuntire a ni"elului de ener$ie% protein brut &i a di$estibilitii aminoacizilor% enzimele put nd fi adu$ate la reete reformulate cu un cost mai redus de producie.

'tilizarea produselor enzimatice n hrana animalelor Ltilizarea enzimelor 'n alimentaia animalelor a fost necesar 'n urma unor constatri efectuate asupra proceselor de di$estie ale animalelor cum ar fi0 enzimele di$esti"e ale animalelor mono$astrice pot di$era numai o parte din substanele nutriti"e coninute de materiile prime furajere. <orcii &i psrile nu sintetizeaz unele enzime cum sunt0 M $lucanazele% celulazele% fitazele &i prin urmare nu pot "alorifica eficient o serie de substane prezente 'n cantiti mari 'n nutreurile de ori$ine "e$etal etc. Totodat animalele tinere au un echipament enzimatic incomplet dez"oltat% de aceea utilizarea substanelor nutriti"e din hran este mai redus dec t la adulte.

<rodusele enzimatice furajere au fost realizate in nd cont de particularitile tubului di$esti" &i ale di$estiei diferitelor specii de animale. #le trebuie s reziste p+!ului foarte acid din stomac% la atacul enzimelor proteolitice din stomac &i intestinul subire% &i s aib o acti"itate catalitic optim la temperatura &i p+!ul caracteristic animalelor crora le sunt administrate. <rodusele enzimatice pot fi at t de fermentaie unic c t &i amestecuri enzimatice. Cn cazul produselor de fermentaie unic"% 'n funcie de microor$anismul utilizat &i de compoziia chimic a substratului se obine o anumit enzim cu acti"itate catalitic specific. #rodusele multienzimatice sunt amestecuri comple(e de enzime bacteriene &i fun$ice obinute prin combinarea 'n diferite proporii a produselor enzimatice de fermentaie unic &i au o capacitate catalitic multipl.

(biecti#ele urmrite folosind enzimele furajere Cn funcie de tipul enzimelor &i modul de aciune al acestora produsele enzimatice administrate ca aditi"i furajeri urmresc urmtoarele obiecti"e0 Suplimentarea enzimelor endogene. 7e folosesc cu precdere amilazele &i proteazele 'n cazul animalelor tinere cum sunt puii% purceii &i "ieii care au echipamentul enzimatic insuficient dez"oltat 'n primele sptm ni de "ia. #nzimele e(o$ene particip alturi de cele endo$ene la di$erarea mai bun a hranei 'n cazul speciilor &i cate$oriilor amintite de animale. <rin adu$area 'n hran a lipazelor microbiene sunt "alorificate eficient $rsimile adu$ate 'n nutreul combinat pentru cre&terea ni"elului ener$etic al hranei care atra$e dup sine sporuri mai mari de cre&tere &i mic&orarea consumurilor specifice. %sigurarea unor enzime care nu sunt produse de organismul animal$ Cn acest scop se folosesc0 celulaza, hemicelulaza, pentanaza, glucanaza, Xilanaza, - galactozidaza, fitaza. :ceste enzime hidrolizeaz anumite substraturi pentru care or$anismul nu are capacitatea de a sintetiza enzime specifice.

Holosindu!se preparate multienzimatice compuse din enzimele amintite 'n hrana mono$astricelor% cre&te capacitatea acestora de a de$rada componenii pereilor celulelor "e$etale% sunt 'nlturate efectele ne$ati"e ale polizaharidelor neamidonoase% fiind 'mbuntit totodat utilizarea ener$iei &i a aminoacizilor din hran. ,e asemenea prin utilizarea fitazelor microbiene% fosforul este eliberat din forma sa fitic cum se $se&te 'n mare parte 'n cereale% tr e% boabe de le$uminoase &i &roturi% iar apoi poate fi di$erat &i absorbit de ctre or$anismul animal la ni"elul intestinului subire. Totodat se reduce efectul poluant al fosfailor eliberai 'n mediu prin dejeciile animalelor. odul de prezentare a preparatelor enzimatice: <rodusele enzimatice sunt adu$ate 'n nutreul combinat sub form uscat sau lichid. #rodusele enzimatice sub form" uscat" sunt diluate pe un suport de cereale% tr e sau &roturi% realiz ndu!se un premi( de enzim. ,ozele recomandate sunt de .1 I$ enzim3 t nutre combinat (1 I$ enzim B A I$ suportNO 1)F enzim din care se d 1) I$ premi( cu 1)F enzim 3 tona de nutre combinat). <rodusele enzimatice sub form uscat sunt mult mai rezistente la temperaturi ridicate comparati" cu formele lichide% lucru deosebit de important 'n cazul $ranulrii nutreurilor combinate. <entru a 'nltura pericolul inacti"rii enzimatice% 'n timpul fabricrii nutreurilor combinate s!a urmrit pe de o parte obinerea unor enzime stabilizate% rezistente la temperaturi c t mai mari% iar pe de alt parte dez"oltarea unor tehnolo$ii de producere a enzimelor lichide. #rodusele enzimatice sub form" lichid" se adau$ 'n nutreurile combinate prin pul"erizarea $ranulelor. <rodusele enzimatice lichide au o stabilitate de peste * luni. #le pot fi imobilizate pe un suport solid &i elimin nd e(cesul de ap% timpul de $aranie este mult mai mare.

&rodusele enzimatice ce pot fi folosite n hrana animalelor <rodusele enzimatice pe baz de fitaze0 %llz)me &h)tase (:lltech)% *atuphos (Gasf)8 "itase+ Heeds ;nternational)% *o#o ph)tase (6o"o 6ordish). (Hinm

<rodusul multienzimatic %llz)me SS" (:lltech) se poate obine pe subproduse furajere0 mal% $r u sau tr e de $r u% prin fermentarea acestora cu ciuperca !spergillus niger. <rodusul comercial are un coninut de -1F <G% -%*F PG &i 18F /elG &i conine 7 tipuri de enzime0 proteaze, amilaze, "ilanaze, beta- glucanaze, pectinaze, celulaze &i fitaze. 7e poate introduce 'n hrana tuturor speciilor de animale% dar 'n special la porcine &i pasri 'n doze de )%)-F din structura nutreului combinat. ,ietele 'n care se folose&te acest produs multienzimatic% pot fi reformulate prin reducerea "alorii ener$etice a nutreului combinat cu circa 7? Kcal &i reducerea coninutului 'n /a &i < cu )%1F comparati" cu lotul martor% reduc ndu!se in acela& timp preul de cost al furajelor% cu meninerea concomitent a performanelor producti"e la un ni"el ridicat.

<rodusul multienzimatic ,enz)me-" (Kemin #uropa din Gel$ia) conine celulaze% M $luconaz% Q amilaz% lipaz &i proteaz% destinat reetelor cu materii prime care au mult celulaz8 %#)zime! pui de carne8 &orz)me! purcei &i porci la 'n$r&at.

Subtilaza .! porcinele supuse 'n$r&rii (di$er amidonul &i proteinele din cereale)8 %spergilaza (la purcei)8 &roteaza bacterian! (tineret porcin 'nrcat! obinut la ;nstitutul de /ercetri /himico! Harmaceutice Gucure&ti)8 Celulaza C/ (pui de carne &i porci la 'n$r&at)8 %llz)me 0egpro (folosit pentru &rotul de soia)8 %llz)me "1 (pentru hidroliza enzimatic a finii de pene)8 Bioz)m / 2333 (Giomin :ustria)! conine "ilanaza folosit 'n nutreul combinat pentru psri &i porci care conine mult $r u8

Bioz)m G 4333 (Giomin :ustria) 1 nutre combinat pentru porci &i psri care conine mult orz8 Bioz)m 533 (Giomin :ustria)! produs multienzimatic destinat psrilor &i porcilor care primesc 'n hran nutre combina cu porumb% &rot de floarea! soarelui &i &rot de soia. /ompania american :lltech a obinut primul preparat enzimatic protejat pentru rume$toare0 "ibroz)me. <reparatul administrat 'n doz de 1? $3 zi determin cre&terea produciei de lapte datorit unei in$este mai mari de hran &i a unei fermentaii rumenale mai eficiente a substraturilor $reu di$estibile. :dministrarea enzimei la tineretul taurin a determinat cre&terea sporului mediu zilnic. :du$area enzimelor furajere 'n hrana porcilor% psrilor &i mai recent a rume$toarelor% contribuie la cre&terea di$estibilitii substanelor nutriti"e din nutreuri% 'mbuntirea performanelor producti"e a animalelor% utilizarea 'n proporii mai mari a materiilor prime cu di$estibilitate mai sczut &i cu un pre de cost mai mic% reducerea costurilor pe unitate de produs &i reducerea polurii mediului.