IZOLAREA I CONFIRMAREA SPECIEI ESCHERICHIA COLI DIN PRODUSELE ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMAL

Izolarea i confirmarea Escherichia coli din produsele alimentare se efectueaz - conform SR ISO/TS 16 649 1,2,3/2009 sau conform SR ISO 7251/2009 E. coli reprezint cel mai bun indicator al CONTAMINRII FECALE a produselor alimentare. E. coli reprezint un bun indicator al CONTAMINRII RECENTE a produselor alimentare.

Trebuie sublinat aspectul de adaptabilitate al bacteriilor n general i al speciei E. coli n special, la modificri de temperatur: frig, congelare, modificri de umiditate (uscciune), modificri de pH, rezisten la antibiotice, etc.

Escherichia coli sau colibacilii sunt bacterii aerobe din grupul coliformelor, se prezint sub form de bastona, sunt mobile, nesporogene, fermenteaz lactoza la 440C, cu producere de gaze i formare de indol din triptofan . Ross T., Ratkowsky D.A., Mellefont L.A., McMeekin, (2003), consider c dezvoltarea speciei E. coli este influenat de mai muli factori: temperatur - este favorizat de o temperatur cuprins ntre 7,63 i 47,43C, existena unor soluii, la o activitatea a apei cuprins ntre 0,951 i 0,999, ajutat de soluii de clorur de sodiu i la un pH situat ntre 4,0 i 8,2.

Mecanismele adaptrilor sunt de natur genetic, traduse prin modificri n genom i al transcripiei expresiei acestor modificri la nivelul genelor. COLIBACILII sunt bacterii care au form de bastonae mici, drepte - bacili sau cocobacili (2,0-6,0/1,1-1,5 micrometri, vii i 1,0-3,0/0,4-0,7 micrometri, moarte i colorate), Gram negative, aezate izolat sau n perechi, adesea mobile dar i imobile, unele tulpini capsuleaz, formnd microcapsule, asporogene.

Temperatura optim de dezvoltare este de 37 0C, dar se dezvolt foarte bine i la 44-450 C. Aceast ultim temperatur fiind un criteriu de diferniere, denumit testul Eyjkman-Mackensie. n laboratoare de bacteriologie alimentar, aceast test se utilizeaz pentru diferenierea lui E. coli de speciile nrudite, de tip Enterobacter, Klebsiella sau alte enterobacterii.

E. coli se dezvolt foarte bine n prezena srurilor biliare i a bilei, a srurilor de seleniu, a colorantului verde briliant, a tetrationatului, etc. Se dezvolt bine la pH neutru; nu se dezvolt la pH mai mic de 5,9 i mor la pH acid. Pe medii nutritive simple se dezvolt bine, producnd turbiditate intens, uneori cu inel la suprafa pe bulionul simplu, cu adunarea unui depozit n cazul culturilor vechi, iar pe suprafaa agarului nutritiv cresc colonii netede, de 2-6 mm, uor convexe, opace, nepigmentate, de tip S. Culturile degaj miros fecaloid, amoniacal.

Brzoi D. i colab., (1999), descriu c aproximativ 95% din tulpinile de E. coli sunt indol pozitive, rou-metil pozitive, VogesProskauer negative, citrat negative, betagalactozidaz i beta-glucuronidaz pozitive i sunt cuprinse n E. coli biotipul 1. Celelalte tulpini rspund diferit, fiind indol negative, nu elaboreaz enzime de tipul beta-galactozidaz i beta-glucuronidaz i sunt catalogate ca aparinnd E. coli biotipului 2.

Speciile din genul Escherichia fermenteaz glucoza, lactoza, manita, trehaloza, produc lizin-decarboxilaz. Exist i unele excepii, de exemplu, tulpinile enteroinvazive, care sunt lactoz i lizindecarbixilaz negative. Diferenierea tulpinilor aparinnd biotipului 1 fa de biotipul 2 se efectueaz pe baza testului IMVIC.

Testele biochimice cele mai importante i care sunt utilizate pentru identificarea speciei E. coli au fost urmtoarele: cretere aerob la 44-450C; producere de gaze captate n tubulee Durham n medii specifice BBLV, LST, etc.; producerea indolului; fermentarea glucozei i/sau lactozei; formarea de colonii roii-violacee, cu centrul mai nchis la culoare, cu reflexe metalizate auriuverzui, caracteristice pe suprafaa mediului GEAM sau Levine

utilizarea glucozei cu formarea de produi acizi stabili, ceea ce determin reacia roului de metil pozitiv; metabolizarea glucozei cu producere de acetoin, reacia Voges-Proskauer negativ; neutilizarea citratului ca unic surs de carbon; fermentarea sorbitolul i producerea betagalactozidazei, exceptnd tulpinile de E. coli O157 H7 - enterohemoragic.

METODA ORIZONTAL PENTRU DETECTAREA I ENUMERAREA ESCHERICHIEI COLI PREZUMTIVE. METODA NUMRULUI CEL MAI PROBABIL. SR ISO 7251/2009

Definiii Escherichia coli prezumtiv: bacterii, care la 44C, fermenteaz lactoza cu producere de gaze i produc indol din triptofan, atunci cnd analiza este efectuat conform metodei specificate n SR ISO 7251/2009. Numrarea Escherichia coli prezumtiv reprezint numrul cel mai probabil de E. coli pe mililitru sau gram de prob din produs identificat prin metoda prevzut de acest SR ISO.

 MOD DE LUCRU Se efectueaz diluii seriate; Se fac nsmnri (cte 1 ml) din produsele lichide utilizate ca atare pt. prima inoculare i/sau din diluiile urmtoare n cte trei tuburi, din minim diluii consecutive, pe mediul LST bulion lauril sulfat, turnat cte 10 ml/tub; Se utilizeaz LST dublu concentrat pt. alimentele lichide, utilizate ca atare i din diluia iniial pt. produsele solide; Se utilizeaz LST simplu concentrat pt. diluiile urmtoare.

 INCUBAREA Tuburile cu LST nsmnate se incubeaz de 37 0C, timp de 24 - 48 ore; CITIREA TEST POZITIV - Se constat prezena opacitii (cretere microbian) i producere de gaz. SUBCULTURILE Din tuburile pozitive se fac nsmnri pe mediul bulion EC; CITIREA TEST POZITIV - Se constat i producere de gaz.

 SUBCULTURILE Din tuburile pozitive se fac nsmnri pe mediul bulion EC; Din tuburile pozitive se fac nsmnri pe ap peptonat steril -APS; CITIREA TEST POZITIV - Se constat producere de gaz pe bulion EC i producere de indol pe APS. Se numr tuburile pozitive i se citete n tabelul McGrady cifra corespunztoare E.coli/g sau ml produs; Dac nu exista tuburi cu reacie pozitiv rezultatul este ABSENT/g sau ml produs examinat.

METODA ORIZONTAL PENTRU ENUMERAREA ESCHERICHIEI COLI -glucuronidaz pozitiv. Partea 1. METODA NUMRRII LA 44C UTILIZND MEMBRANE 5-BROMO-4CLORO-3-INDOLYL -D-GLUCORONID. SR ISO 16 649-1/2001

METODA NUMRRII LA 44C UTILIZND MEMBRANE 5-bromo-4- cloro-3-indolyl -dglucoronid , cf. SR ISO 16 649-1/2001 Este o tehnic de lucru care pune n eviden coloniile de E. coli resuscitate prin utilizarea membranelor specifice i incubarea la 44C, pe mediu solid cromogenic care conine ingrediente pentru detectarea enzimei -glucuronidaz. Tulpinile care nu cresc la 44C, sunt considerate -glucuronidaz negative, astfel c suele de E. coli O157nu sunt detectate.

DEFINIII: E. coli -glucuronidaz pozitiv sunt bacterii care produc colonii de culoare albastr pe mediul tripton-bil-glucuronid TBX, n condiiile specificate n SR ISO 16 6491/2001. Determinarea numrului de uniti formatoare de colonii E. coli -glucuronidaz pozitiv stabilit pe gram sau ml de produs/prob i stabilit prin calcul.

MOD DE LUCRU Din cantitile specificate de probe sau din diluiile iniiale se fac inoculri pe membrane celulozice impregnate cu agar, minerale i glutamat modificcat sau mediul MMGA, care se incuibeaz timp de 4 ore la 37C; Pentru izolare, membranele celulozice dup perioada de resuscitare pe MMGA se transfer pe mediul TBX, care se incubeaz la 44C, timp de 18-24 ore . Se citesc plcile care conin ntre 15 i 150colonii albastre tipice sau maxim 300 de colonii atipice.

CITIREA REZULTATELOR REACIA POZITIV numrarea coloniilor din cele dou plci ale fiecrei diluii i a cel puin unei diluii urmtoare, deci minim 2 diluii consecutive i introducerea n urmtoarea formul de calcul: N REACIA NEGATIV medii sterile sau absena coloniilor tipice, albastre.