SUBIECTE BIOMOL

1.Caracteristicile procariotelor si a celulelor eucariote

Din categoria procariotelor, fac parte toate bacteriile,

micoplasmele și alegele verzi-albastre. Toate procariotele sunt
organisme monocelulare sau coloniale, aerobe sau anaerobe, cu
dimensiuni cuprinse între 1 și 10 microni.
Celula procariotă este învelită de un perete rigid, lipoproteic.
Acestea conțin sacul mureinic, inexistent la celulele eucariote.
Plasmalema este cel de-al doilea înveliș al celulei, de natură
lipoproteică. Acesta are rol în respirație, însă nu se poate învagina pentru
a forma vezicule prin care să încorporeze soluții nutritive de la exterior.
Membrana celulară formează un singur compartiment citoplasmatic
fară o structură internă bine organizată. Sistemele enzimatice sunt
localizate în citoplasmă, pe plasmalemă sau mezozomi. Se remarcă lipsa
nucleului și a majorității organitelor celulare. Singurele organite celulare
din citoplasma celulelor procariote sunt ribozomii cu coeficientul de
sedimentare 70S, al căror număr este de 10 ori mai mare decât la
eucariote.
ADN-ul procariot este reprezentat de o singură moleculă circulară
și spiralizată numită nucleoid. Pe lângă ADN, procariotele conțin și
ARN. Transcripța AND-ului și translația ARNm au loc concomitent. Un
singur tip de ARN POLIMERAZĂ transcrie cele trei tipuri de ARNm,
ARNr, ARNt. Reproducerea celulelor se realizează prin diviziune
directă sau amitotică.
Eucariotele sunt celule nucleate, cu dimensiuni cuprinse între 10 și
1000 microni care pot forma organisme monocelulare, coloniale sau
pluricelulare.
Protozoarele, ciupercile, plantele și animalele sunt organisme
eucariote. Dintre acestea, unele ciuperci și protozoare sunt organisme
unicelulare, iar pluricelulare sunt în totalitate animalele și plantele.
 Celulele eucariote au nucleul bine individualizat, inconjurat de o
membrană proprie. Eucariotele au în citoplasmă organite celulare
precum mitocondrii, lizozomi, peroxizomi, aparat Golgi și reticul
endoplasmatic, delimitate prin endomembrane de restul citoplasmei care
formeaza matricea citoplasmatică. Eucariotele au în citosol un
citoschelet ce determină forma și mișcările celulei din care fac parte
curentul citoplasmatic și mișcarea ameboidală.
Nucleul îndeplinește două roluri principale: depozitarea informației
genetice în ADN-ul din cromozomi și reglarea sau controlul tuturor
proceselor celulare.

2.Structura nucleului

Nucleul este prezent la toate celulele eucariote, conține aproape

întreaga cantitate de ADN care formează genomul celular. Ocupa 10%
din volumul total al celulei. În structura nucleului s-au evidențiat
cromatina nucleară, nucleolul, matrixul nucleolar și membrana nucleară.
Membrana proprie sau anvelopa nucleară este trilaminată și
strabătută de pori. În structura acestei membrane distingem membrana
nucleară internă care se leagă de lamina nucleară și membrana nucleară
externă care se continuă cu membrana reticulului endoplasmatic ce
prezintă ribozomi. Între cele două membrane există un spațiu, numit
perinuclear, cu diametru de 20-40 nanometri.
Porii nucleari sunt canale de legătură între conținutul
nucleopasmatic și citoplasmă. În centrul unui por nuclear apare un canal
prin care moleculele solubile în apă pot circula din nucleu în citoplasmă
și invers.
Funcțiile porilor se rezumă la transportul macromolecular din
nucleu în citoplasmă și invers.
3.Structura cromatinei

Cromatina se formează prin asocierea ADN-ului nuclear și a

proteinelor. Cromatina se clasifică în două categorii după modul de
reacție cu coloranții bazici: eucromatina care se colorează slab cu
coloranții bazici și heterocromatina care se colorează intens.
Eucromatina conține gene structurale, are mai mult ADN nerepetitiv, în
care predomină perechile de baze G-C și proteinele non-histonice. Este
puțin condensată și reprezintă partea transcripțională a cromatinei. Se
replică precoce la începutul fazei S.
Heterocromatina are mai mult ADN repetitiv, în care predomină
perechile de baze A-T și proteine histonice. Este foarte compactă,
inactivă transcripțional. Se replică tardiv la începutul fazei S.
Heterocromatina este de două feluri: constituitivă și facultativă.
Heterocromatina constituitivă este format din ADN înalt repetitiv și nu
se transformă niciodată în eucromatină.
Heterocromatina facultativă diferă la celule, chiar la organisme. În unele
celule, anumite gene sau părți de din cromozomi pot fi active, putând să
se transforme în eucromatină, iar în alte celule pot fi inactive.
Matricea nucleară este formată dintr-o rețea de filamente
insolubile. Are rol în menținerea formei nucleului și stabilitatea lui în
interfază. Modificările structurale ale cromatinei în vederea replicării sau
transcripției, activarea sau inactivarea genelor sunt influențate de
matricea nucleară.

4.Structura nucleolului

Nucleolul este situat în nucleu la celulele aflate în interfază și la

celulele embrionare care nu au început sinteza de proteine proprii.
Nucleolul este format din: centru fibrilar de ADN transcriptibil de
5 nanometri, o regiune fibrilară densă de ARN în curs de sinteză, o
componentă granulară care conține particule de preribozomi și o
componentă amorfă care ocupă spațiile dintre fibre și granule.
 Nucleolul ocupa 30% din volumul nucleului, iar în celulele
tumorale, nucleoli apar hiperatrofiați, având o formă neregulată.

5.Structura acizilor nucleici, nucleotide si nucleozide

Acizii nucleici, sunt molecule biologice, care conțin informația

genetică. Există două tipuri de acizi nucleici: acid dezoxiribonucleic
(ADN) și acid ribonucleic (ARN).
Aceștia sunt bipolimeri rezultați din polinucleotide, formați prin
policondensarea unor unități denumite nucleotide. O nucleotidă este
alcătuită dintr-un nucleozid și un radical fosfat.
Ordinea nucleotidelor în lungul catenei de ADN reprezintă
informația genetică codificată pe baza căreia se stabilește înlănțuirea
aminoaicizilor în proteine. Sensul de citire este determinat de polaritatea
5’ către 3’ a catenei ADN. Orice secvență de nucleotide se citește în
direcția 5’ către 3’ și se scrie cu capătul 5’ la stânga.
Sediul principal al localizării ADN-ului este nucleul celulelor.
Sediul secundar este în mitocondrii si cloroplaste.
Nucleotidele sunt unitatea monomerică a acizilor nucleic și sunt
compuse dintr- un radical fosfat, o pentoză si o bază azotată, fie ea
purinică sau pirimidinică.

6.Bazele azotate și ozele, denumirea nucleotidelor

Ozele sunt reprezentate de riboză si dezoxiriboză. Glucidul,
pentoza sau oza specifică ARN-ului este riboza, iar a ADN-ului
dezoxiriboza.
Riboza este o pentoză din seria D (dextrogir) în care toți hidroxilii
(grupările OH) sunt orientați spre dreapta.
Dezoxiriboza derivă din riboză printr-o reducere a funcției alcool a
grupării 2-hidroxil. Gruparea 2-hidroxil prezentă în ARN îl face
susceptibil la hidroliză alcalină, în timp ce ADN-ul este rezistent. Atât
ARN cât și ADN sunt hidrolizați in mediu acid.
Bazele azotate sunt împărțite în două grupe: purinice- adenină,
guanină și primidinice- citozină, timină și uracil (pentru ARN). Singura
diferență între ele este că ADN conține timină, iar ARN-ul conține
uracil.
Bazele azotate ale acizilor nucleici aparțin celor două molecule în
funcție de nucleul aromatic de bază care constituie scheletul. Nucleul
aromatic pirimidinic este format din 6 atomi, 4 de carbon și 2 de azot.
Nucleul aromatic purinic este format din doi nuclei heterociclici alipiți,
unul de 6 atomi și altul de 5 atomi, având 2 atomi de carbon în comun.
Bazele azotate prezintă fenomenul de tautomerie, o formă a
izomeriei.
Bazele azotate sunt notate convențional printr-o inițială și o
culoare astfel: adenina cu A și verde, guanina cu G și galben, citozina cu
C și albastru, tiamina cu T, iar uracilul cu U și roșu. Fiecare bază poate
intra în structura a două nucleozide în funcție de oză. Fiecare nucleozidă
poate fi legată de una, două sau trei grupări fosfat.
O altă modalitate de denumire a nucleotidelor este cea dată de
nucleozidă și numărul radicalilor fosfat, de exemplu AMP, ADP, ATP,
ultimele două fiind bogate în energie.

7.Structura primară și secundară a ADN-ului

Structura primară a ADN-ului:

Nucleotidele se unesc între ele prin legături fosfodiesterice, în
urma înlăturării resturilor fosforice beta și gamma. Capătul 3’ al unei
dezoxiriboze este unit cu capătul 5’ al alteia printr-un rest de acid
fosforic. Ordinea nucleotidelor în lanțul polinucleotidic reprezintă
structura primară a ADN-ului. Ordinea nucleotidelor este arbitrară.
Structura secundară a ADN-ului:

Corespunde tipului B de ADN, prezent în regiunile de

eucromatină, cu gene active metabolic. Cele două catene ale moleculei
de ADN se înfăsoară plectonemic, orientate spre dreapta, având forma
unei scări în spirală. Cele două balustrade ale scării sunt reprezentate
printr-un schelet glucido-fosforic, treptele scării fiind perpendiculare pe
schelet. Prin așezarea în interior a bazelor azotate, acestea sunt protejate
de acțiunea diferiților factori de mediu.
Structura ADN este perfect regulată. În configurația ei spațială,
molecula de ADN prezintă două ferestre laterale: una mai mică și una
mai mare. Ele sunt importante în recunoașterea și fixarea pe ADN a
proteinelor histonice, la nivelul ferestrei mici sau a unor molecule
proteice reglatoare la nivelul ferestrei mari.

8.Hibridizarea bazelor azotate și complementaritatea lor

Un acid nucleic prezent în soluție moleculară formează legături de

H asociind nucleotidele două câte două, astfel că o nucleotidă cu A să se
lege cu T sau cu U în ARN și o nucleotidă G cu C. Legătura-hibridizare
A-T este mai puțin stabilă decât G-C, deoarece între adenină și timină se
formează două legături de H, iar între citozină și guanină 3.
Legea complementarității bazelor azotate stă la baza
mecanismelor prin care se realizează funcțiile genetice ale ADN:
transcripția, replicarea, repararea leziunilor, recombinarea.

9.Condensarea și hidroliza nucleotidelor

Creșterea lanțului de acizi nucleici se face întotdeauna prin

extremitatea 3’OH terminal a acidului nucleic. Condensarea se face
pornind de la un substrat activat, o nucleotidă trifosfat.
 Hidroliza ultimilor doi fosfați va furniza energia necesară
condensării. Nucleotida monofosfat ramasă va fi esterificată printr o
funcție acidă a fosfatului cu funcția alcool eliberată din carbonul 3’ al
ribozei. Invers, adăugarea unei molecule de apă pe această legătură ester
va produce o reacție de hidroliză care va detașa ultima nucleotidă și va
elibera C3’ a nucleotidei precedente.

10.Treptele de organizare ale cromatinei

Cromatina se formează prin asocierea ADN-ului la proteinele
histonice. Proteinele histonice sunt proteine polipeptidice care conțin în
special arginină și lizină. Rolul histonelor este de stabilizare a dublului
helix de ADN, inducând o structură terțiară.
Proteinele non-histonice sunt polipeptide acide heterogene, cu
funcții catalitice în metabolismul ADN-ului.
Se cunosc 4 niveluri de organizare ale cromatinei:
Primul nivel de organizare este reprezentat de nucleozom și
ADN linker. ADN-ul asociat cu histonele formează nucleofilamentul de
cromatină cu diametrul de 11 nanometri. Nucleozomul prezintă o
secvență de ADN. Nucleozomii sunt legați între ei printr-un segment de
ADN linker formând ligamentul subțire de cromatină.
Al doilea nivel este solenoidul, caracterizat prin formarea fibrelor
de cromatină de 30 nanometri ce se realizează prin spiralizarea fibrelor
subțiri spre dreapta.
Fibrele de 300 nanometri, constituie al treilea nivel de
condensare a cromatinei.
Al patrulea nivel reprezintă condensarea și plierea buclelor ce
duc la formarea cromatidelor. Se formează la începutul profazei. Fiecare
cromatidă conține o singură moleculă de ADN. La sfârșitul diviziunii, în
telofază, se produce decondensarea cromozomilor.
11.Denaturarea ADN, renaturarea, respirația și absorbția ADN-ului

Denaturarea termică se realizează la limite de temperatură, 63-

100 grade Celsius deoarece stabilitatea legaturilor de H cedeaza, astfel
se desface dublux helix în cele două catene polinucleotidice,
complementare. ADN-ul prin denaturare termică trece de la condiția de
dublu catenar, la monocatenar.
Pentru denaturarea chimică se pot utiliza alcalii. La pH alcalin
crescut, încărcătura multor gene angajate în formarea legăturilor de H se
schimbă. Astfel, bazele pierd capacitatea de a forma legături de
hidrogen. La ph mai mare de 11,3-12, toate legăturile de hidrogen sunt
rupte, iar ADN-ul este complet denaturat.
Denaturarea ADN-ului este însoțită de efectul hipercromatic, adică
de creștere a intensității absorbției razelor UV de către bazele azotate
expuse la exterior. Bazele azotate sunt cromofile și hidrofile.
Renaturarea ADN-ului este însoțită de efectul hipocromatic
doarece prin refacerea structurii dublu catenare, bazele azotate se află
spre interiorul structurii bicatenare. Renaturarea este un proces mai lent
decât denaturarea, în urma careia ia naștere o structură bicatenară
hibridă.
Respirația și absorbția ADN-ului presupune deschiderea
regiunilor bicatenare pentru a forma bucle monocatenare. Acest fenomen
se numește respirație ADN și îi permite acestuia interacțiuni cu diferite
proteine. Absorbția reprezintă capacitatea unei soluții ADN de a absorbi
lumina UV.

12.Replicarea ADN- generalități

În faza S a ciclului celular, are loc sinteza ADN-ului. Este procesul

molecular prin care se realizează copierea exactă a moleculelor de ADN,
se transmite mesajul genetic de la o generație la alta, astfel, toate
celulele conțin aceeași informație ereditară.
 Dintr-o moleculă ADN se formează două molecule identice. Acest
mecanism se desfășoară datorită particularităților structurale ale ADN-
ului: ADN-ul este bicatenar, iar catenele ADN sunt complementare și
anti-paralele.

13.Caracteristicile replicării

a)Semi-conservativă: fiecare moleculă este formată dintr-o catenă

“veche” și una “nou sintetizată”
b)Completă: replicarea ADN-ului antrenează întregul cromozom,
rezultând doi cromozomi identici
c)Bi-direcțională: replicarea începe într-un punct bine determinat
numit origine de replicare și pornind din acest punct, se derulează
simultan în ambele direcții.
d)Semi-discontinuă: aparatul de replicare sare o distanță mică și
apoi copiază înapoi spre furca de replicare. Fragmentele s-au unit cu
timpul în bucăți mari, arătând că erau legate covalent la scurt timp după
sinteză.

14.Elementele esențiale necesare replicării

Pentru replicare este nevoie de ADN parental, fiecare catenă de

ADN servind drept matriță, cele 4 dezoxiribonucleozide trifosfat dNTP
(dATP, dGTP, dTTP, dCTP), cele 4 ribonucleozide trifosfat NTP (ATP,
GTP, UTP, CTP), acestea sugerând necesitatea sintezei de ARN în
cursul sintezei de ADN, proteine specifice, majoritatea enzime și Mg2+.
15.Helicaza, primaza, ADN topoizomerazele I și II

Pentru replicarea ADN-ului avem nevoie de anumite proteine,

precum: helicaza sau proteina ADNB care catalizează denaturarea in
vivo a ADN-ului, cu consum de energie. ADN helicazele desfac dublul
helix de ADN și eliberează monocatenele ce vor funcționa drept matrițe
pentru replicare. Primaza este enzima cu activitate ARN polimerază și
inițiază replicarea prin sinteza unei secvențe de ribonucleotide numită
primer.
ADN topoizomerazele I și II despiralizează helixul ADN și eliberează
tensiunea din molecula de ADN. Topoizomerazele secționează una sau
ambele catene ale ADN-ului. Există astfel două tipuri de enzime: I, care
determină secționarea unei singure catene ADN și II, ce determină
secționarea ambelor catene ADN simultan.

16.Proteinele de replicare A (RPA) sau proteine SSB

Proteinele de replicare A (RPA), numite și proteine SSB mențin

separate cele două catene desfăcute de helicaze, prin fixarea la
monocatene și masacrarea perechilor de baze care au tendința naturală
de a se reuni, prin refacerea punților de hidrogen. Proteina SSB
împiedică reîmperecherea bazelor.

17.Complexul ADN-primază-ADN polimerază α, ADN ligazele

Complexul ADN-primază-ADN polimerază α, este implicat în

sinteza primerilor catenei întârizate a ADN-ului. Sub acțiunea ADN-
primazei se sintetizează secvențe scurte de ARN la care ADN
polimeraza α adaugă circa 30 dezoxiribonucleotide. Apoi, complexul
este îndepărtat, iar AND polimeraza delta continuă sinteza lanțului de
dezoxiribonucleotide început.
 ADN ligazele sunt enzime capabile de reconstituire a legăturilor
fosfodiester 3OH si fosfatul 5 a 2 nucleotide vecine dintr-ul lanț de
ADN. De asemenea, intervin în numeroase procese de reparare a ADN-
ului genomic.

18.Antigenul nuclear de proliferare celulară

PCNA sau antigenul nuclear de proliferare celulară se leagă în

imediata vecinătate a proteinelor RPC și împreună sunt principalele
proteine asociate ADN polimerazei. PCNA se organizează sub forma
unor dimeri ce permit încorporarea neîntreruptă a mii de nucleotide în
catena ADN nou sintetizată. Blocarea PNCA oprește replicarea ADN-
ului.

19.ADN polimerazele la procariote și eucariote – nu găsesc în cărți,

am căutat juma de oră, skip!

20.Mecanismul molecular al replicării ADN-ului la eucariote

Sinteza ADN-ului începe prin despiralizarea catenelor de ADN și

prin formarea buclei și furcilor de replicare. Fiecare catenă reprezintă o
matriță pentru catena nou formată. Sinteza se desfășoară bidirecțional.
Furca de replicare prezintă: catena matriță 3’ către 5’ de ADN ce se
numește catenă lider, catena matriță 5’ către 3’, numită și catenă
întârziată. ADN-ligaza unește între ele fragmentele Okazaki.
Etapele replicării: inițierea, ce include atașarea replizomului la
punctul de origine al replicării și despiralizarea locala a helixului ADN
de către helicaze, elongarea ce se caracterizează prin alungirea catenelor
nou-sintetizate de ADN polimerază, în această etapă având loc creșterea
continuă a catenei lider, terminarea care presupune înlăturarea ARN-
primerilor, înlocuirea golurilor de către ADN polimerază și unirea
capetelor fragmentelor catenelor de ADN.
Pe cele două catene matriță are loc, în prezența ADN polimerazei,
aranjarea secvențială și complementară a dezoxiribonucleotidelor
activate prealabil.

21.Particularitățile replicării ADN la eucariote

Mecanismele de replicare a ADN-ului la eucariote sunt în general

asemănătoare celor de la procariote. Apar anumite particularități
determinate de mărimea enormă a genomului, asocierea ADN-ului cu
proteinele în fibrele de cromatină și replicarea în faza S a ciclului
celular.
Viteza de replicare a ADN-ului la eucariote este redusă. ADN-ul
trebuie însă replicat în circa 8 ore. ADN-ul eucariotelor este asociat cu
proteine histonice, formând nucleozomii. Pe cealaltă moleculă de ADN
se vor constitui nucleosomii noi.

22.Fidelitatea replicării ADN

Acuratețea replicării ADN este critică pentru transmiterea

informației ereditare în succesiunea celulelor și organismelor. În
momentul în care cele două catene ADN sunt separate, nucleotidele
avtivate se aranjează spontan. Gradul crescut de fidelitate al replicării
este rezultatul unor activități speficice ale ADN polimerazelor. ADN
polimeraza ajută la creșterea fidelității replicării prin inserția corectă a
bazelor în catena ADN nou sintetizată. De asemenea, activitatea de
autocorecție a ADN polimerazelor este un mecanism major pentru
acuratețea replicării ADN.
 Integritatea structurală a ADN-ului este extrem de importantă
pentru supraviețuire și toate celulele vii au mecanisme de reparare a
leziunilor ADN.

23.Structura și clasificarea genelor

Gena este formată din secvențe structurale ce codifică succesiunea

de AA și o secvență reglatoare importantă pentru expresia genei.
Secvența structurală este formată din regiunea 5’ netraductibilă
care debutează cu prima nucleotidă modificată, regiunea centrală care
fragmentează exonii de introni și regiunea 3’ netraductibilă.

24.Promotorul, enhancerii și silancerii, exonul, intronul

Fiecare genă conține promotorul, care este recunoscut de ARN-

polimeraza, enzimă implicată în transcripție. Promotorul nu este
transcris și tradus, el intervine în inițierea transcripției și orientarea
direcției în care acesta se va derula.
Amplificatorii sau enhancerii sunt secvențe care stimulează
expresia genei.
Inhibitorii sau silancerii, inhibă expresia genei. Sunt localizați
adesea între promotori și enhanceri, numiți și antienhanceri.
Exonul reprezintă partea secvenței codificatoare a unei gene ce
este transcrisă, se regăsește în ARN precursor, în ARNm și în secvența
de aminoacizi a proteinei. Există exoni cu fragmente scurte sau lungi.
Un exon codifică cel mai adesea un domeniu funcțional al proteinei sau
o parte a acestuia.
Intronii sunt reprezentați de secvențe necodificate ale genei ce se
transcriu, fiind prezente în ARN-precursor, dar nu și în ARNm.
Activitățile multor promotori sunt amplificate de secvențe de ADN,
precum enhanceri.
25.Tipuri de ADN nuclear

ADN-ul nerepetitiv reprezintă circa 60% din lungimea totală a

genomului și este alcătuit din secvențe unice. Restul de ADN
nerepetitiv, circa 90% este necodat, prezent în introni.
ADN moderat repetitiv reprezintă circa 30% din genomul uman
și este alcătuit din secvențe scurte.
Genele pentru ARNr sunt secvențe repetate în tandem localizate
pe brațele scurte ale cromozomilor acrocentrici.
Genele pentru ARNt sunt gene repetate în tandem, localizate mai
ales la nivelul cromozomilor 1 și 6.
Secvențele LINEs sunt dispersate în întregul genom, numărul de
copii fiind de circa 500.000, adică 3-5% din genom.
Secvențele SINEs sunt secvențe scurte dispersate în cromozomi în
circa 100.000 de copii
ADN înalt repetitive reprezintă 10% din genom și este alcătuit din
secvențe foarte scurte, repetate în tandem de milioane de ori.

26.Transcripția

ADN-ul conține informația ereditară necesară formării și

funcționării organismului, realizării proceselor metabolice care
controlează viața. Sinteza proteinelor se realizează pe baza genelor
structurale în citoplasmă, de către ribozomi. Moleculele de ADN sunt
copiate, transcrise sub forma moleculelor de ARNm, mai mici, care trec
prin porii membrane nucleare și transmit informația în citoplasmă.
Astfel, sinteza proteinelor se realizează în două etape: transcripția și
translația sau sinteza proteinelor.
27.Tipuri de ARN polimeraze

ARN polimeraza I este localizată în nucleoli unde se găsesc

genele ribozomale și catalizează sinteza precursorilor majorității
moleculelor de ARNr.
ARN polimeraza II este localizată în nucleoplasmă și catalizează
sinteza precursorilor ARNm. Este inhibată specific de alfa amanitină.
ARN polimeraza III este localizată în nucleoplasmă și catalizează
sinteza precursorilor ARNr și o varietate de mici fragmente de ARN
nuclear și citoplasmatici.

28.Factorii proteici de transcripție

1)Factorii de transcripție generali-sunt proteine care recunosc
secvențele consens ale promotorului. Aceste proteine sunt implicate în
inițierea, direcționarea, elongarea și terminarea procesului la toate
genele de clasă II.
2)Factorii de transcripție specifici- sunt reprezentați de proteine
care recunosc secvențe specifice promotorilor genelor care se exprimă în
anumite țesuturi. Activează anumite gene, realizează decondensarea
cromatinei, eliberarea promotorului și activarea factorilor de transcripție
generali.

29.Mecanismul transcripției

Etapele transcripției sunt inițierea, elongarea și terminarea.

Produsul primar al transcripției este o moleculă de ARNm-precursor.
Inițierea transcripției, este etapa necesară recunoașterii primului
nucleotid care va fi citit. Atât punctul start cât și promotorul sunt
recunoscute de factorii proteici de transcripție. Inițierea transcripției se
realizează prin formarea complexului de inițiere al transcripției ce
presupune atașarea factorilor specifici de transcripție pe promotori, prin
atașarea ARN-polimerazei la complexul proteic și prin atașarea celui de-
al doilea ribonucleotid și formarea legăturii fosfodiesterice în molecula
de ARN.
Elongarea transcripției debutează cu modificarea configurației
complexului proteic de transcripție. Fiecare nucleotidă trifosfat este
aleasă specific pentru a fi complementară cu baza corespunzătoare din
lanțul antisens.
Terminarea transcripției are la baza două ipoteze. Prima
presupune ajungerea ARN-polimerazei la terminator și transcrie
secvența palindromică, iar cea de-a doua, arată că nu există nici o
secvență pe catena antisens a ADN-ului care să codifice încetarea
transcripției.

30.Maturarea ARN-ului mesager

ARNm-precursor format în urma transcripției nu poate fi

transportat imediat în citoplasmă. În structura acestuia se află și introni.
Pentru a preveni degradarea, are loc prelucrarea capetelor și eliminarea
enzimatică a intronilor. Etapele de maturare sunt reprezentate de
prelucrarea capătului 5’, prelucrarea capătului 3’ și înlăturarea intronilor,
respectiv legarea exonilor cap la cap.

31.Rolul secvenței CAP și a cozii poliA

Secvența CAP asigură stabilitatea moleculei de ARN și reprezintă

un situs de recunoaștere pentru ribozomi în vederea inițierii translației.
Pentru adăugarea secvenței CAP a un complex multienzimatic, exercită
trei activități: hidroliza fosfatului transcriptului primar, transferul pe
fosfatul rămas a unui guanilat de la GTP și metilarea acestui guanilat.
 Coada poliA asigură stabilitatea capătului 3’ al moleculei de
ARNm și controlează trecerea moleculei de ARNm din nucleu în
citoplasmă. Coada poliA este digerată lent de o exonuclează din
citoplasmă dacă mesagerul este activ.

32.Splicing alternativ- nici aici nu găsesesc nici o informație, doar

exemple.

33.Tipuri de ARN

Pentru a forma, ARN nucleotidele GMP, AMP, UMP, CMP sunt

condensate prin legături fosfodiesterice.
1)Acid-ribonucleic ribozomal (ARNr)-82%
2)Acid-ribonucleic de transfer (ARNt)-16% transportă AA
activați pentru transducție.
3)Acid-ribonucleic mesager (ARNm)-2%
4)Ribonucleoproteine mici nucleare (<1%) structurează particula
de recunoaștere a proteinei semnal.

34.ARN-ul mesager

Se formează în urma transcripției genelor purtătoare de informație

care va fi tradusă în proteine. Prin intermediul ARNm, ribozomii
primesc informația pentru sinteza proteinelor. ARNm cuprinde mai
multe secvențe: o secvență 5’ care nu va fi tradusă și care corespunde
exonului 1 și unei părți din exonul 2, secvențe de codoni pentru a
încorpora AA și secvența 3’ netradusă.
35.ARN-ul de transfer

ARN-urile de transfer sunt polinucleotide monocatenare relativ

scurte. Există cel puțin un ARNt pentru fiecare AA. Nucleotidele din
structura ARNt sunt modificate, de obicei metilate. Prin hibridizarea
intracatenară maximă, ARNt are aspect cruciform.

36.Diferențele dintre ARN și ADN

ARN este mai scurt, are 70-100.000 de nucleotide.

ARN conține riboză, ADN conține dezoxiriboză.
ARN prezintă uracil în structură, iar ADN-ul conține timină.
ARN-ul este monocatenar, iar ADN-ul este bicatenar.

37.Structura proteinelor

Există patru structuri ale proteinelor: primară, secundară, terțiară și

cuaternară.
Structura primară este citită de la capătul amino pană la capătul
carboxil. În structura proteinelor, intră un număr de 20-21 de AA. Al 21-
lea, neconvențional, selenocisteina, este un component al
selenoproteinelor. Modificări minore în structura primară pot avea efecte
drastice pentru organism.
Structura secundară se realizează prin intermediul legăturilor de
hidrogen care determină apariția diverselor conformații spațiale. Cele
mai frecvente tipuri de structură secundară sunt alfa-helixul și beta-
structurile.
Structura terțiară se realizează prin intermediul cristalografiei cu
raze X. În structura terțiară apare o alternare a alfa-helixurilor și a beta-
structurilor. Legăturile întâlnite sunt de hidrogen, hidrofobe și ionice.
 Structura cuaternară se referă la modul în care se unesc
subunitățile proteice. În această structură intră câteva lanțuri
polipeptidice care pot fi identice sau diferite. Legăturile prezente în
structura cuaternară sunt de hidrogen, hidrofobe și ionice. Ultimele două
structuri, cea terțiară și cea cuaternară asigură formarea centrilor activi ai
proteinelor.

38.Codul genetic

Codul genetic nu este în sine o informație, ci un dicționar pentru

traducerea secvenței. Relația triplet/AA poartă numele de cod genetic.
Dacă o literă nucleică s-ar traduce printr-un AA, ar rezulta 4 AA, dacă s-
ar traduce prin doi AA, ar rezulta 16 AA, iar daca s-ar traduce prin trei
AA, ar rezulta 64 AA.

39.Activarea aminoacizilor- nici aici nu găsesc

40.Ribozomii

Sunt organite ce reprezintă sediul de traducere a ARNm și de

polimerizare a AA. În structura lor intră ARNm și ribonucleoproteine.
Subunitățile ribozomale se atașează la ARNm în vederea translației, în
rest fiind libere. Ribozomii au câteva centre catalitice, printre care,
situsul A, stiusul P și situsul E, responsabil de eliminarea ARNt.
41.Mecanismul sintezei proteinelor sau translația

Sinteza proteinelor la eucariote implică activitatea a 70 de proteine

ribozomale diferite, a peste 20 de enzime necesare activității AA
precursori, a zeci de proteine auxiliare alături de factori de inițiere,
elongare și terminare, a aproximativ 100 de enzime adiționale pentru
procesarea finală a diferitelor proteine și peste 60 de tipuri de ARNt.
Sinteza proteinelor se realizează prin așezarea secvențială a AA în
ordinea existentă pe mesajul genetic preluat de ARNm de pe matrița de
ADN.

42.Inițierea sintezei lanțului polipeptidic

Inițierea include reacțiile care preced formarea legăturii peptidice

între primii 2 AA ai proteinei. Se produce legarea ribozomului la ARNm
și formarea complexului de inițiere. Această etapă este relativ lentă și
decurge în următoarele etape: formarea complexului metionil-ARNtmet,
activarea aceluiași complex prin adăugarea unei molecule de GTP,
formarea complexului (metionil-ARNtmet)-(GTP) și asocierea acestui
complex la ARNm și recunoașterea codonului de inițiere cu consumul
unei molecule de ATP.

43.Elongarea lanțului polipeptidic, transferul, translocarea și

terminarea translației
Elongarea constă în totalitatea reacțiilor care duc la formarea
primei legături peptidice, până la adăugarea ultimului AA. AA se
atașează în aceeași succesiune cu cea a codonilor din molecula de
ARNm. Este cea mai rapidă etapă a translației și succesiunea reacțiilor
este următoarea: formarea complexelor aminoacil-ARNt, activarea
complexelor aminoacil-ARNt prin adăugarea unei molecule de GTP,
transportarea complexului la situsul A, formarea legăturii peptidice între
AA, eliberarea moleculei de ARNt din situsul P și translocarea
ribozomului cu un triplet.
Terminarea cuprinde o serie de evenimente care duc la eliberarea
lanțului polipeptidic sintetizat și disocierea ribozomilor de la ARNm.

44.Peptidele semnal

Peptidele semnal sunt lanțuri formate din câțiva AA situați la

extremitatea NH2 terminală a proteinelor traduse, semnalând locul pe
care să-l ocupe proteina în celulă. Dacă această proteină este destinată
membranei sau organitelor celulare, partea codată a ARNm începe
printr-o secvență de câțiva AA ca adresă pentru încorporarea ei. Fiecare
organit prezintă un mecanism de recunoaștere și încorporare a
proteinelor necesare și specifice lui. Recunoașterea se realizează datorită
unei secvențe de AA pe care o conține proteina respectivă. După ce
proteina a ajuns la destinație, secvența semnal este eliminată prin
digestie proteolitică, iar receptorul este eliberat și reciclat.

45.Poliribozomii și peptidele semnal

Poliribozomii care se formează pe un mesager conținând o

peptidă semnal, au o evoluție ușor diferită. Transducția se oprește puțin
după sinteza peptidei semnal. Aceasta interacționează direct cu
membrana reticulului endoplasmatic. SRP este constituit din diferite
proteine și un ARN 7S. Dacă interacțiunea peptidei semnal cu SRP are
loc în afara structurii ribozomilor, acesta inhibă elongația.
Traducerea se oprește când SRP este recunoscut de un receptor
specific situat în RE. Imediat ce această legătură este stabilită,
ribozomul este legat de ribozomii din membrana RE lângă un complex
proteic. SRP este eliberată în citosol și traducerea este încheiată.
46.Organizarea structurală a proteinelor
Lanțurile polipeptidice ale proteinelor se pliază în diferite moduri
atât în cadrul propriului lanț, cât și între lanțurile vecine. În funcție de
plierea lanțurilor se disting proteine cu structură secundară, terțiară și
cuaternară.
Se numește proteină matură, aceea care are o formă chimică
definitivă în momentul în care își îndeplinește funcția în organism.
Modul de pliere este esențial pentru activitatea biologică a
proteinelor.

47.Denaturarea și renaturarea proteinelor, degradarea proteinelor

O proteină care posedă o proprietate biologică proprie, unică, se

numește proteină nativă. Denaturarea poate fi reversibilă sau
ireversibilă. Denaturarea ireversibilă este cea termică.
Renaturarea este interpretată ca o dovadă în sprijinul ipotezei că o
proteină având o structură primară corectă se va plia în mod spontan
conducând la structura unică responsabilă pentru activitatea sa biologică.
Renaturarea proteinelor poate fi produsă pe două căi. Una implică
proteina disulfid izomeraza, iar cea de-a doua implică structurile tip
moleculă supraveghetoare.
Degradarea intracelulară a proteinelor se realizează prin două
sisteme generale, anume, lizozomal și al ubiquintinei. Ubiquintina este o
polipeptidă acidă de 76 de AA care este prezentă în toate tipurile de
celule. Aceasta este activată prin interacțiunea ATP-ului cu 2 enzime.
48.Mutațiile genice prin substituție, adiție și deleție

Mutațiile genetice reprezintă modificări ale structurii și funcției

genei. Ele constau într-o modificare survenită în secvența normală a
nucleotidelor. Genele apărute prin modificarea genelor normale sunt
numite gene mutante.
În funcție de plasarea lor în autozomi sau heterozomi, genele pot fi
autozomale sau heterozomale.
După funcția lor, genele sunt divizate în gene structurale care
codifică diferite proteine cu rol structural sau enzimatic, gene operatoare
care declanșează sau nu activitatea genelor structurale și gene reglatoare
care controlează și dirijează activitatea celorlalte două.
În funcție de modul cum se produc modificări, mutațiile genetice
se produc prin: substituție-presupune înlocuirea unei perechi de
nucleotide cu o alta, apoi adiție- care presupune adăugarea uneia sau a
mai multor perechi de nucleotide, iar în final, deleția- reprezentată de
pierderi ale unei nucleotide sau a unor perechi de nucleotide. În cazul
substituției, aceasta se produce în două moduri. Prin tranziție, ceea ce
înseamnă că o bază azotată este înlocuită cu o alta din aceeași categorie,
iar prin transversie, o baza purinică este înlocuită cu o bază pirimidinică.

49.Activitatea unui situs criptic de excizie sau episaj

În afara zonelor de episaj normal, există situsuri criptice care pot fi

activate. Pot fi situate în exon producându-se episaj anormal al exonului
sau în intron.
O substituție, poate altera un situs de legare. Astfel, situsul donator
a intronului 3 este transformat din GT în AT. Există în mijlocul exonului
3, o secvență care servi drept situs donator alternativ, dar care este
normal inactiv.
50.Reverstrancripția la virusuri

ARN din HIV, atunci când pătrunde în sânge, este recunoscut de

receptorul CD4 al limfocitului T4. Formarea complexului receptor-virus
antrenează fuziunea anvelopei virusului și a membranei limfocitului și
prin urmare genomul viral pătrunde în citoplasmă.
Virusul conține o enzimă reverstranscriptază și un ARN viral
purtător al informației genetice. Enzima catalizează retrotranscripția
ARN viral în ADNc. Provirusurile produc noi particule virale prin
transcripție și se traduc prin moartea celulei și distrugerea ADN-ului său.

51.Mutațiile cromozomiale prin deleție, inversie și duplicație

Nu afectează în mod obișnuit structura genelor, dar afectează

legăturile dintre ele. Mutațiile sunt restructurări ale cromozomilor, în
urma cărora grupuri întregi sunt mutate de pe un cromozom pe altul.
După mecanismul lor de producere, mutațiile cromozomiale pot fi
prin: deleție, inversie, duplicație și translocație.
Delețiile constau în pierderea unui locus sau a mai multora de pe
un cromozom. Marile deleții acoperă milioane de perechi de baze.
Microdelețiile nu sunt întotdeauna văzute, de cele mai multe ori
rezultatul unui asemenea fenomen este letal pentru organism.
Inversiunile constau în inversarea prin rotație, cu 180 de grade a
unui segment de cromozom. Se poate produce prin ruperea
cromozomului în două locuri. Acest fenomen se produce mai ales în
profaza mitozei sau a meiozei, când cromozomii lungi și subțiri se mișcă
activ în nucleu. Prin inversie, nu se schimbă cantitatea de material
genetic din cromozom.
Duplicațiile sunt restructurări care afectează o pereche de
cromozomi omologi. Între ei se produce un schimb de segmente inegale.
Uneori, asemenea schimbări nu dau efecte fenotipice vizibile, alteori
determină modificări de natură diferită.
52.Translocațiile cromozomiale

Translocațiile constau în schimburi de segmente între doi

cromozomi neomologi. Translocația poate fi reciprocă (schimb reciproc
de segmente între cromozomi) sau simplă (un segment de pe un
cromozom se transferă pe alt cromozom). Ca și în cazul inversiunilor,
meioza este alterată din cauza dificultăților în împerecherea
cromozomilor omologi.

53.Extracția ADN

Scopul extracției ADN-ului este eliberarea acestuia din celule

pentru utilizare în diverse tehnici.
În prima etapă se va produce liza celulelor, inclusiv a nucleilor
acestora, apoi clivarea enzimatică, cu proteinaza K și în final, eliminarea
ADN-ului din extractul de acizi nucleici.
În a doua etapă sunt precipitate proteinele prin utilizarea unui
amestec de solvenți organici. ADN-ul genomic este extras în soluție.
În ultima etapă, ADN-ul este concentrat și desalefiat prin
precipitare cu etanol absolut. ADN-ul extras este scanat în UV cu
ajutorul unui spectrofotometru care permite aprecierea purității unei
soluții de ADN sau ARN.

54.Extracția ARN total

Pregătirea materialului de studiu pentru extracția ARN-ului diferă

în unele aspecte față de extracția ADN-ului. Reticulocitele din sânge și
măduva hematogenă sunt lizate prin osmoză sau separate de celulele
nucleate prin centrifugare.
Etapa de liză celulară presupune utilizarea tiocianatului de
guanidină, care este un puternic agent denaturant al ARNazelor.
După separare, faza superioară apoasă cu un conținut de ARN este
îndepărtată și pusă într-un tub curat, apoi ARN-ul este precipitat prin
adăugarea a două volume de etanol.

55.Metode de analiză ale bazelor azotate și acizilor nucleici

(spectrofotometria)

Bazele purinice și pirimidinice, nucleozidele și nucleotidele pot fi

ușor detectate datorită absorbției în UV. ADN-ul extras din diferite surse
biologice trebuie verificat în vederea evaluării purității și integrității
înainte de a fi utilizat în diferite tehnici. Aprecierea gradului de puritate
al unui extract de ADN se realizează prin evaluarea absorbanței la
lungimile de undă 260nm și 280nm la un spectrofotometru.
Evaluarea purității ADN-ului se realizează spectrofotometric pe
următoarele considerente: moleculele de ADN, fie ele mono sau
bicatenare prezintă absorbanță la lungimi de undă cuprinse între 257-
260nm, proteinele care pot contamina extractul, au absorbanță maximă
la 280nm, glucidele rămase accidental au absorbanță maximă la 230nm,
iar oligonucleotidele prezintă absorbanță maximă la 220nm.

56.Principiul și componentele reacției PCR

Reacția PCR are la bază mecanismul de replicare in vivo al ADN-

ului și este utilizată pentru amplificarea unei secvențe țintă de ADN într-
un număr mare de copii. Diferența între această reacție și replicarea in
vivo este reprezentată de etapa de denaturare și cea de atașare a
primerilor care în PCR nu sunt realizate enzimatic, ci, prin parcurgerea
unor trepte de temperatură.
Componentele reacției sunt:matrița de ADN, primerii
oligonucleotidici și ADN polimeraza termostabilă.
57.Primerii oligonucleotidici, caracteristici

Primerii oligonucleotidici trebuie să prezinte următoarele

caracteristici: dimesiunea lor să fie de 15-30 perechi de baze,
nucleotidele primerilor trebuie să fie complementare cu cele ale
capetelor 5’, respectiv 3’, procentul molar al nucleotidelor G/C să fie
cuprins între 40-60%, temperatura de atașare a primerilor să fie
apropiată, să nu depășească 5 grade Celsius, valoarea temperaturii de
topire a celor doi primeri să fie identică, primerii să nu fie
complementari, iar concentrația optimă să fie cuprinsă între 0.1-
0.6micrometri.

58.Componentele reacției PCR. ADN polimeraza termostabilă

Enzimele ADN polimeraze termostabile au fost izolate din

microorganisme termofile, manipulate genetic în vederea obținerii unor
variante ameliorate. Se cunosc și se folosesc mai multe tipuri de ADN
polimeraze termostabile: ADN polimeraze din clasa Taq, ADN
polimeraze ADN dependente termostabile din clasa VENT, dNTP și
tamponul de reacție cu tris-hidroxi-aminometan+MgCl2.

59.dNTP(dezoxinucleotid trifosfați), tamponul de reacție

dNTP introduși în reacție sunt folosiți de către ADN polimeraza în
reacția de polimerizare. În amestecul de reacție sunt toate cele 4 tipuri de
nucleotide, în caz contrar scade fidelitatea ADN polimerazei.
Tamponul de reacție conține tris-hidroxi-aminometan și MgCl2.
Ionii de Mg formează complexe solubile cu dNTP furnizând substratul
recunoscut de ADN polimerază.
60.Treptele de temperatură ale unei reacții PCR standard

Denaturarea inițială se realizează pentru o reacție eficientă, timp de

2-5 minute la 94-95 grade Celsius.
Treptele de temperatură ale reacției PCR standard sunt:
denaturarea inițială, la 94-95 grade Celsius, timp de 2-5 minute,
denaturarea de la începutul fiecărui ciclu la 94-95 grade Celsius, timp de
20-30 de secunde, atașarea primerilor la 50-65 de grade Celsius, timp de
20-30 de secunde, extensia primerilor la 72 de grade Celsius, timp de
20-45 de secunde, iar apoi extensia finală la 72 de grade Celsius, timp de
5-15 minute.

61.Controalele asociate unei analize prin PCR. Aplicațiile tehnicii

PCR

Pe gelul de electroforeză trebuie să fie reprezentat de o bandă

ADN-ul CP ( control pozitv)
Un control negativ, ADN CN, lipsește din tubul de reacție, dar sunt
adăugate toate celelalte componente. Gelul de electroforeză nu prezintă
marcaj într-o reacție realizată corect.
Un control intern, ADN CI, diferă de țintă, cu primerii specifici lui,
care se amplifică în paralel cu proba de testat.
Tehnica PCR prezintă marele avantaj că permite obținerea unui
număr mare de copii a unei secvențe de ADN în timp scurt, 3-4 ore, fără
clonarea acesteia pe un anumit vector. Este utilizată în genetică,
microbiologie, virusologie, micologie.
62.Tehnica RT-PCR (PCR reverstranscris)

Această tehnică evidențiază prezența moleculelor de ARNm dintr-

un țesut sau organ.
Etapele tehnicii sunt: extracția ARN-ului total dintr-un țesut sau
organ și transformarea ARN în ADNc prin intermediul ADN
polimerazei ARN dependentă. După obținerea ADNc, etapele PCR sunt
cele cunoscute: denaturarea ADNc-ului la 95 de grade Celsius, atașarea
primerilor la 50-65 de grade Celsius și extensia primerilor de către o
ADN polimerază la 72 de grade Celsius.

63.Tehnica PCR multiplex

Tehnica presupune amplificarea mai multor secvențe țintă cu

perechile de primeri specifici, simultan, în același tub de reacție.
Principala problemă este alegerea atentă a perechilor de primeri. După
amplificare, fragmentele obținute pot fi supuse unei electroforeze
capilare cu detecție în fluorescență.
Testele PCR multiplex implică proiectarea unui număr mare de
primeri, prin urmare, este necesar ca primerul proiectat să aibă o
lungime de 18-22 de baze. Se utilizeaza primeri cu temperatură similară,
de 55-60 de grade Celsius.
Este important să se ia în considerare specificitatea primerilor
proiectați la secvențele țintă. Primerii proiectați trebuie să fie verificați
pentru a se evita formarea dimerilor de primer.

64.Nested PCR

O reacție de tip nested PCR presupune utilizarea a două perechi

de primeri de-a lungul aceluiași fragment de ADN. Se realizează
amplificarea cu primeri externi, urmată de amplificarea cu perechea de
primeri interni.
Deoarece fragmentul este mai lung, este utilizat ca matriță în cadrul celei
de-a doua reacții. Sensibilitatea crește datorită reamplificării regiunii de
interes.

65.Principiul PCR prin metoda Hot Start

Hot Start Taq PCR polimeraza este unul din compușii amestecului
reactiv care nu este adăugat în timpul etapei de preparare PCR.
Sunt utilizate mai multe proceduri, precum, tubul reactiv care este
încălzit la temperatura optimă de acțiune a Taq polimerazei, la 80 de
grade Celsius, apoi se adaugă compusul Hot Start Taq ADN polimeraza
și PCR demarează la cald. Apoi, există și varianta cu parafină. O altă
enzimă amplifică Taq Gold polimeraza pentru a fi activată, amestecul se
încălzește 10 minute la 94 de grade Celsius. Utilizarea Taq Start Taq
polimerazei în prezența anticorpilor, aceștia intră în acțiune la
temperaturi de peste 70 de grade Celsius.

66.Instrumente Real-Time PCR, etapele tehnicii Real-Time PCR

Sistemul qPCR complet integrat, realizează amplificarea, detecția,

măsurarea fluorescenței și un sistem de analiză a datelor.
Funcționarea unui aparat RT PCR constă într-un ciclu termin
pentru amplificare, o sursă de lumină, o cameră de înregistrare și un
computer pentru a controla instrumentul și a înregistra datele.
Tehnica dezvoltată numită RT PCR sau qPCR pe bază de
fluorescență permite colectarea datelor pe parcursul reacției și
cuantificarea cantității de ADN. În această fază, qPCR-reactivii sunt în
exces, produșii se dublează la fiecare ciclu, iar cantitatea de probă poate
fi corelată cu cantitatea de matriță de pornire.
 Etapele tehnicii qPCR sunt: denaturarea ADN-ului la 95 de
grade Celsius, hibridizarea primerilor și a sondei, la 50-65 de grade
Celsius și extensia primerilor de către Taq ADN polimeraza.

67.Detectarea nespecifică cu SYBER Green, avantajele și limitele

metodei

SYBER Green I se intercalează în ADN-ul bicatenar, dar nu se

poate lega la ADN-ul monocatenar.
O consecință a acestei intercalări este intensificarea fluorescenței,
de 800-1000 de ori. Excitarea este produsă de lumina albastră, iar
energia acumulată sub formă de lumină verde.
Un avantaj în utilizarea SYBER Green este cel financiar. Un alt
avantaj în utilizarea SYBER Green, este acela că e simplu și usor de
folosit.
Limitele metodei presupun imposibilitatea efectuării reacțiilor
multiplex, iar dezavantajul major este că se intercalează nespecific între
catenele ADN din reacție. De asemenea, această metodă inhibă
activitatea Taq ADN polimerazei, motiv pentru care soluția specifică
metodei trebuie utilizată în concentrații reduse.

68.Sondele hidrolizabile sau TaqMan

Includ trei oligonucleotide specifice secvenței: primerii sens și

revers și o sondă. Sonda este marcată la capătul 5’ cu un fluorocrom
numit reporter, iar la capătul 3’ prezintă un fluorocrom represor. Sonda
are o lungime de 20-30 de baze, iar temperatura de alipire este cu
aproximativ 10 grade Celsius mai mare decât a primerilor (60-75 de
grade Celsius).
În timpul reacției PCR, în prezența unei molecule țintă, sonda se
alipește specific între situsurile complementare primerilor.
69.Multiplex PCR în timp real

RT-PCR Multiplex este o tehnică în care multiplele secvențe țintă

sunt amplificate și detectate într-o singură reacție PCR. Secvențele
amplificate se disting prin folosirea diferiților fluorocromi conjugați la
sonde.
Dezvoltarea testelor RT PCR multiplex poate fi dificilă și
consumatoare de timp deoarece complexitatea reacției crește și necesită
o optimizare semnificativă.

70.qPCR cu sondele de tip baliză moleculară Beacon

Testele qPCR cu balize moleculare utilizează trei secvențe

specifice oligonucleotidelor:primer sens, primer revers și o sondă. Sonda
este o baliză moleculară, o oligonucleotidă marcată cu un fluorocrom
reporter la capătul 5’ și unul represor la capătul 3’ care formează o
structură de tip ac de păr, aducând reporterul si represorul împreună.
Când baliza este liberă în soluție, nu emite fluorescență, din cauza
structurii. În acest caz, reporterul și represorul sunt în imediată
apropiere. În acest caz, represorul blochează emiterea fluorescenței.

71.qPCR cu sondele de hibridizare FRET

În reacția qPCR cu sonde hibridizate duble, sunt utilizate patru

oligonucleotide: doi primeri și două sonde alăturate sau juxtapuse. Prima
sondă este marcată cu un fluorocrom donor la capătul 3’, iar la capătul
5’ este cea de-a doua sondă cu un fluorocrom acceptor. Sondel
hibridizează într-o orientare cap-coadă la o distanță foarte mică una de
alta pe secvența țintă.
72.qPCR cu primer sonde de hibridizare Scorpions

Aceste reacții utilizează două oligonucleotide: un primer și o

sondăs Scorpion bifuncțională care combină primerul cu o structură
asemănătoare unui ac de păr. Sonda este marcată fluorocrom la capătul
5’ cu rol de reporter și un fluorocrom de represie la capătul 3’. Această
configurație aduce fluoroforii în imediata vecinătate, deci diminuează și
evită fluorescența.

73.Familia genelor de referință interne (gene de menaj sau

housekeeping), caracteristici, exemple

Termenul de genă de menaj a fost inițial utilizat pentru toate

genele care sunt esențiale pentru funcția fiecărei celule.
Gena de referință ideală trebuie să îndeplinească mai multe cerințe:
să fie constitutivă, să fie exprimată constant, fară a suferi dereglări în
timpul experimentului și preferabil, ar trebui să fie exprimată similar cu
nivelul genei țintă.
Genele frecvent utilizate ca gene de referință în qPCR sunt: ARN
18S, B2M, TPB, GUSB, ARN polimeraza II și GADPH.
GADPH este cea mai frecvent utilizată dintre genele de referință
pentru analiza PCR-ului cantitativ. Este o enzima glicolitică, intervine
în repararea ADN-uli și exportul de ARN nuclear.

74.Plot sau câmp de amplificare, linia de bază, ΔRn, valoarea prag

Câmpul de amplificare este un grafic care prezintă relația dintre

numărul ciclului și fluorescență. Aceasta are ca rezultat o curbă
sigmoidă.
 Linia de bază este definită ca numarul ciclurilor PCR în care
semnalul fluorescent emis de reporter se acumulează, dar este sub
limitele de detecție a instrumentului.
ΔRn Software calculează un ΔRn folosind ecuația Rn=Rnf-Rnb,
unde Rnf este fluorescența emisă de sondă, iar Rnb este emisia de
fluorescență a liniei de bază.
Valoarea prag este aleasă din calculul bazat pe variabilitatea liniei
de bază. Se calculează derivația standard a semnalului mediu al
fluorescenței semnalului între ciclurile 3 și 15. Pragul este considerat un
semnal real care poate fi folosit pentru a defini pragul.

75.Curba standard sau cuantificare absolută în qPCR (diluții

seriate)

O curbă standard este generată utilizând diluții seriate de zece ori,

cel puțin 5 matrițe. Se execută fiecare reacție în 3 exemplare, în special
în timpul perioadei de optimizare. Curba standard este reprezentată
grafic pe axa X.
Eficiența unui test ar trebui să aibă o valoare apropiată de 1.
Coeficientul de corelație (r2) furnizează o estimare a bunei desfășurări a
reacției, r2 ar trebui să fie aproape de 1.
În această metodă, cantitatea relativă a unei gene de interes este
măsurată și normalizată. Pentru a aplica această metodă se parcurg 2
etape. Prima face referire la generarea curbelor standard utilizând
calibratorul, iar cea de-a doua presupune calcularea concentrației genei
de interes.

76.Cuantificarea relativă în qPCR "(metoda 2-ΔΔCt)

Mai este cunoscută sub denumirea "(metoda 2-ΔΔCt). Aceasta

elimină necesitatea prezenței curbelor standard. Ecuațiile matematice
sunt utilizate pentru a calcula niveluri de exprima re relativă a unei
genețintă față de o genă de referință sau un calibrator.
Un exemplu poate fi ARN netratat dintr-un țesut normal sau dintr-
o probă la momentul 0 într-o perioadă de timp de studiu.
Pentru a obține rezultate fiabile este important ca eficiențele de
amplificare a genei interne și a genei țintă să fie aproximativ egale, peste
90%. Gena de referință este actina.

77.Secvențierea dideoxi (Sanger)

Secvențierea originală a terminației lanțului dideoxi necesită o

matriță monocatenară. Secvențierea Sanger este o modificare a
procesului de replicare a ADN-ului. Produșii PCR după purificare sunt
folosiți ca matrițe pentru secvențiere. Ampliconii migrează pe gel de
agaroză, iar benzile sunt extrase sub raze UV prin decupare.

78.Secvențierea fluorescentă automată

Cele mai multe metode de secvențiere moderne sunt realizate cu

matrițe bicatenare, eliminând prepararea incomodă a versiunilor
monocatenare de ADN secvențiat.
Electroforeza și citirea scalei de secvențiere este de asemenea
automatizată. Pentru citirea automată a scalei secvenței ADN sunt
folosiți primeri marcați fluorescent.
Coloranții fluorescenți sunt folosiți pe lungimi de undă ale emisiei
fluorescente. În secvențierea automată, cele 4 culori diferite pot fi
atașate primerilor.
79.Secvențierea Roche 454

Platforma Roche 454 folosește tehnica de pirosecvențiere care se

bazează pe detectarea pirofosfatului, eliberat după fiecare încorporare de
nucleotidă în noua catenă sintetizată de ADN. Tehnica pirosecvențierii
constă în activarea unei serii de reacții în aval, care produc lumină la
fiecare încorporare a unei nucleotide.

80.Secvențierea Illumina prin sinteză

Sistemele secvențiere Illumin utilizează terminatori reversibili

pentru citire și o tehnologie de sinteză a ADN-ului pe bază de matrice.
În prima etapă, probele de ADN sunt fragmentate aleatoriu și
sunt legați adaptorii la ambele capete ale fiecărei secvențe.
În cea de-a doua etapă, fiecare secvență atașată la placa solidă
este multiplicată prin amplificare tip puncte PCR care creează mai multe
copii identice ale aceleași secvențe.
Ultima etapă constă în determinarea fiecărei nucleotide din
secvența ADN.

81.Elctroforeza pe gel de agaroză

Este o metodă de rutină utilizată pentru separarea proteinelor ADN

sau ARN. Agaroza este un polimer polizaharidic extras din iarba de
mare. Gelurile de agaroză hidratate pot fi procurate ca atare, preformate.
Agaraoza poate fi procurată și stocată în laborator sub formă de pudră.
Fragmente mici de ADN (50-500 perechi de baze/pb) sunt
evidențiate în geluri de agaroză concentrate. Fragmentele mari de ADN
(2000-50.000 pb) sunt determinate mai bine în concentrații de agaroză
mai scăzute.
 Concentrațiile de peste 5% nu sunt practice deoarece împiedică
migrarea, iar cele de sub 0.5% formează un gel slab.

82.Etapele parcurse în electroforeza ADN pe gel de agaroză

1. Se prepară o soluție de agaroză cu soluție tampon la o concentrație

adecvată pentru separarea fragmentelor de dimensiuni variabile din
proba de ADN.
2. Se încălzește amestecul într-o baie de apă fierbinte.
3. Se adaugă balonul într-o baie de apă la temperatura de 55-65 de
grade Celsius, iar cand gelul topit s-a răcit se adaugă bromură de
etidiu.
4. În timp ce soluția de agaroză se răcește, se alege un pieptene
adecvat pentru formarea fantelor în vederea depunerii probelor în
gel.
5. Se toarnă soluția de agaroză caldă în formă.
6. Gelul polimerizează complet la temperatura camerei după 20-45 de
minute, apoi se toarnă o cantitate mică de tampon de electroforeză
deasupra gelului și se montează gelul în rezervorul de
electroforeză.

83.Gelurile de poliacrilamidă

Sunt geluri reticulate chimic formate prin polimerizarea

acrilamidei cu un agent de reticulare. Reacția este o polimerizare
cu radicali liberi, efectuată de obicei cu presulfat de amoniu ca
inițiator.
Fragmentele de ADN foarte mici și ADN-ul monocatenar
sunt decelate (distinse/evidențiate) cel mai bine prin electroforeză
în gel de poliacrilamidă. A fost folosit inițial pentru separarea
proteinelor, dar s-a dovedit utilă și pentru analiza acizilor nucleici.
Acrilamida pură este neurotoxică și trebuie manipulată cu atenție.
De asemenea, separarea eficientă pe bază de gel de poliacrilamidă
sau de agaroză a acizilor nucleici, depinde de menținerea pH-ului
în matrice.

84.Sisteme tampon disociante sau denaturate

Analiza electroforetică a acizilor nucleici monocatenari este

complicată de structurile secundare formate. Separarea pe baza
greutății moleculare necesită includerea unor agenți de denaturare
care evidențiază monocatenele de ADN, respectiv ARN.
Denaturarea ADN-ului care migrează prin aceste geluri este
aproape complet dependentă de secvența de bază.
Tamponul de încărcare a ADN pentru electroforeză în gel de
poliacrilamidă conține glicerol care crește densitatea soluțiilor
ADN. Gelul conține și coloranți care facilitează observarea
eșantionului după electroforeză, cum ar fi bromura de etidiu.

85.Elctroforeza proteinelor pe gel de poliacrilamidă (SDS-

PAGE)

Electroforeza proteinelor pe o matrice de poliacrilamidă,

denumită în mod obișnuit PAGE este una dintre cele mai utilizate
tehnici.
Proteinele au încărcătură electrică deoarece conțin sarcini
electropozitive și electronegative prin prezența grupărilor
ionizabile ale AA constituienți.
Astfel, dacă un amestec de proteine este situat într-un câmp
elctric, proteinele cu sarcină negativă migrează spre anod, iar cele
cu sarcină pozitivă spre catod. Proteinele nu pot migra când se
aplică un curent electric în jurul punctului lor izoelectric.
86.Tehnica 2-DE

Utilizarea 2-DE a fost în mod eficient definită în multe cazuri

pentru a dezvălui atât mecanisme fiziologice cât și proteine
asociate cu patologii clinice care pot ajuta la descoperirea
biomarkerilor.
2-DE constă în două etape de separare. În prima dimesiune,
moleculele de proteine sunt diferențiate în funcție de punctul lor
izoelectric. Separarea proteinelor sub un gradient de pH permite
recuperarea intensă a benzilor utilizând diferite modalități, precum
electroforeza în gradient de imobilizare sau focalizarea
izoelectrică.
În cea de-a doua dimensiune, separarea proteinelor se
efectuează pe baza greutății moleculare folosind soluții tampon.
Datorită faptului că este improbabil ca diferitele molecule de
proteine să aibă aceleași proprietăți fizico-chimice, ele sunt
separate în mod eficient.

87.Electroforeza pe gel de gradient de denaturare (DGGE)

DGGE exploatează diferențele în denaturarea dintre o

moleculă de ADN normală și una mutagenă. Atracția dintre baze
succesive în același ADN poate afecta denaturarea ADN-ului
bicatenar.
În timp ce fragmentele de ADN bicatenar se mișcă prin gel,
cresc condițiile de denaturare, secvențele atingând punctul de
denaturare, iar catenele complementare încep să se denatureze.
DGGE a fost folosit în detectarea mutațiilor genelor
supresoare ale tumorilor, clonare si polimorfismul populațional.
88.Electroforeza pe gel în câmp pulsat (PFGE)

Fragmentele foarte mari de ADN (50.000-250.000 pb) nu pot

fi decelate prin electroforeză simplă pe agaroză. Mobilitatea
limitată este atinsă atunci când moleculele de ADN se pot mișca
doar în lungime printre porii succesivi ai gelului, proces numit
reptație.
Electroforeza în câmp pulsat poate fi în câmp electric
omogen sferic închis, câmp transvers alterat, gel rotativ și cu
reorientare transversă a unghiului. ADN-ul decelat prin aceste
metode trebuie protejat de rupere și forfecare. Prin urmare, probele
de ADN sunt imobilizate în agaroză înaintea lizei celulare. Această
tehnică este utilă în special în studiul epidemiologiei bolilor
infecțioase.

89.Electroforeza capilară

În acest tip de electroforeză, proba de analizat este separată

într-un capilar de sticlă subțire ce are 30-100 cm lungime și un
diametru de 25-100 micrometri. Există și o fereastră neacoperită,
unde lumina cu lungime de undă specifică fluoroflorilor din reacție
este reflectată peste fragmentele în migrare.
Proba este injectată în capilar electrokinetic, hidrostatic sau
pneumatic. Pentru analiza acizilor nucleici este folosită injectarea
electrokinetică.
Capilarul este plin cu poliacrilamidă, iar porii acesteia vor
juca un rol de sită prin care trebuie să treacă fragmentele de ADN.
Tuburile în care se află soluția de ADN sunt plasate pe un suport
de unde vor fi injectate în capilare prin aplicarea unui curent
electric.
90.Enzimele de restricție

Acestea fac posibilă manipularea secvențelor acizilor

nucleici. Au fost identificate, purificate și clonate noi enzime de
restricție. Acestea participă la fenomenul de restricție asigurând un
sistem de apărare al bacteriilor față de bacteriofagi.
Dacă o colonie infectată de un bacteriofag sintetizează
această enzimă și dacă colonia bacteriană o posedă în genom, fagul
va fi incapabil să se multiplice și să lizeze bacteria.

91.Harta de restricție

Pentru a face o hartă de restricție, ADN-ul este tratat cu

enzime de restricție. De exemplu, un fragment liniar de ADN este
tăiat cu enzima PstI. După incubarea cu enzimă, fragmentele
rezultate sunt separate prin electroforeză cu gel. Imaginea gelului
dezvăluie patru fragmente marcate A, B, C și D.
Mărimea fragmentelor determinate comparativ cu standarde
de greutăți moleculare cunoscute, indică distanța dintre aceste
locuri și distanța de la un loc la capătul fragmentului. Prin
electroforeză cu gel de agaroză, fragmentele sunt evidențiate
aflându-se astfel distanța dintre locurile de restricție.

92.RFLP și testarea parentală

La organismele diploide, secvența cromozomială este

moștenită în proporție de 50% de la fiecare părinte, ca urmare a
recombinării gameților. Acesta include polimorfismele ADN
situate de-a lungul genomului. Profitând de avantajul unei
combinații unice, prin RFLP se poate deduce contribuția unui
părinte cu alele (formă diferită de genă) unui fiu sau fiică.
 Testul de paternitate analizează mărimea fragmentelor unei
progenituri comparativ cu al mamei.
Există mai multe versiuni sau alele pentru fiecare locus.
Prima versiune, presupune ca tatăl să fie heterozigot la locusul 1 și
homozigot la locusul 2. A doua versiune presupune testarea a doi
presupuți tați pentru paternitatea unui copil al cărui profil parțial
RFLP este arătat în gel.

93.Sondele de ADN

Sunt create prin diferite metode. Un fragment de genă care

urmează să fie analizat poate fi clonat pe o plasmidă bacteriană și
apoi izolat prin digestie cu enzime de restricție și purificat cu gel.
Dupa marcare și denaturare, fragmentul poate fi folosit în
procedurile de transfer Southern sau Northern ca sondă.

94.Sondele de ARN

Sunt obținute prin transcripția de pe o matriță ADN și sinteza

ARN in vitro. Acestea sunt similare sondelor ADN, cu o afinitate
de legare mai mare sau egală de secvențele omoloage
complementare. Pot oferi o sensibilitate mai mare decât sondele de
ARN în transferul Southern.

95.Transferul Southern

Are următoarele etape: izolarea și secționarea ADN-ului cu

enzimele de restricție, electroforeza ADN-ului pe gel de agatoză,
depurinarea ADN-ului, denaturarea ADN-ului, transferul
monocatenar pe membrane de nitroceluloză sau naylon, contactul
membranei cu sondele de ARN sau ADN complementar și
vizualizarea prin autoradiografie.

96.Metode de transfer

Transferul poate fi făcut prin mai multe metode: capilar,

electrophoretic și în vid.
Transferul capilar este simplu și relativ ieftin. Poate fi mai
puțin eficient pentru gelurile mari. Procedura este lentă, poate dura
până la 12 ore pentru fragmentele mari.
Transferul electroforetic utilizează curent electric pentru a
transfera ADN pe membrană. Acest sistem utilizează electrozi
atașați deasupra membranei și dedesubtul gelului. Curentul
transporta ADN-ul transversal din gel spre membrană.
Transferul în vid folosește sucțiunea (reducerea presiunii
apei) pentru a muta ADN-ul din gel pe membrane într-un tampon
recirculant.

97.Transferurile Northern

Etapele metodei sunt: extracția ARN-ului, electroforeza pe

gel denaturat, înlăturarea denaturantului din gel, transferul pe
membrană, prehibridizarea și hibridizarea membranelor cu sondele
marcate radioactiv și expunerea filmului autoradiografic pe
membrană.
Transferul Northern este o variantă modificată a tehnicii
Southern și a fost conceput pentru a investiga structura și cantitatea
de ARN.
98.Transferurile Western

O variantă a transferului Southern este Western. Are

următoarele etape: extracția proteinelor, denaturarea proteinelor,
electroforeza proteinelor pe gel SDS-poliacrilamidă, transferul
proteinelor pe membrane, contactul cu anticorpul primar și
contactul cu anticorpul secundar ce are atașată o enzimă.
Ținta imobilizată pentru un transfer Western este proteina.

99.Tehnica ADN microarray

Microcipurile microarray tradiționale reprezintă o colecție de

spoturi ADN microscopice atașate de o suprafață solidă.
Etapele tehnicii sunt: extracția ARNm din celule bolnave și
sănătoase, transformarea ARNm în ADNc prin intermediul
reverstranscriptazei, marcarea fluorescentă din spoturi cu ADNc
marcat și evaluarea prin scanare a zonelor de hibridare de la
nivelul spoturilor.
Țintele sunt de obicei ADN, cADN, produși PCR sau
oligomeri, dar pot fi și ARN sau proteine.

100.Hibridizarea fluorescentă in situ

Este o metodă des folosită pentru a detecta proteine, ARN,

dar și structuri ADN din celulă sau in situ. Pentru analiza
citogenetică, celulele fixate sunt expuse unei sonde. Această sondă
poate fi vizualizată cu un microscop fluorescent în nucleul celulei.
Prepararea unei sonde este punctul critic în analize interfazei
FISH, atât pentru a permeabiliza celulele, cât și pentru a menține
morfologia celulară.
Asemănător cu procedurile de transfer Southern și Northern, atât
sondele, cât și țintele trebuie să fie denaturate înainte de
hibridizare. După hibridizare și inlăturarea sondelor nelegate prin
clătire, sonda este observată la microscop.

101.Descrierea unui plasmid

Plasmidele și fagimidele se dezvoltă în bacterii și sunt foarte

frecvent utilizate pentru manipularea fragmentelor de gene,
indiferent de organism, ca urmare a utilizării enzimelor de
restricție, PCR și a clonării moleculare.
Un plasmid este o moleculă ADN dublu catenară circulară,
extracromozomială, capabilă de a se replica într-o celulă
independent de cromozomul bacterian. Sunt molecule mici
utilizate în ingineria genetică. Acestea conțin o regiune de replicare
care permite replicarea plasmidelor independentă, una sau mai
multe gene de rezistență și un situs de policlonare.

102.Clonajul molecular la plasmide

Constă în inserția unui fragment de ADN exogen într-un

plasmid. ADN-ul exogen organismului donator este digerat de
aceeași enzimă de restricție ca și cea utilizată pentru liniarizarea
vectorului. Fragmentele posedă la cele două extremități, în mod
egal, o parte din secvența de ADN recunoscută de enzima de
restricție.
103.Transcripție in vitro

Situsul de policlonare este încadrat de promotorii T3 și T7,

care permit desfășurarea unui proces de transcripție in vitro. Din
multitudinea de promotori disponibili la bacterii și bacteriofagi au
fost aleși 2 promotori din fagii T3 și T7, datorită faptului că ei sunt
recunoscuți de ARN polimeraza. Acești doi promotori se găsesc în
orientare inversă unul față de altul.
Transcrierea in vitro permite obținerea de molecule ARN ce
pot fi apoi folosite ca sonde moleculare în experimente de
hibiridizare moleculară, conducând la obținerea de proteine ce pot
fi utilizate ulterior analizate.

104.Construcția unei biblioteci de ADN genomic

O bibliotecă de ADN genomic este un ansamblu de vectori

recombinați conținând fiecare un segment diferit din genomul
speciei studiate. Principiul constă în izolarea ADN-ului genomic al
speciei de interes, digerarea acestuia cu enzime de restricție care
permit eliberarea fragmentelor de restricție de mărime compatibilă
cu vectorul ales, în scopul clonării acestora în vectori de clonaj.

105.Construcția unei biblioteci de ADN complementar

Construcția unei biblioteci de ADNc necesită mai multe

etape: principalul constă în purificarea ARNm poliadenilat al
organului prin cromatografie cu afinitate pe o coloana poliT,
copierea acestui ARNm în ADN monocatenar complementar, prin
acțiunea reverstranscriptazei, eliminarea specifică a ARNm prin
ARN-aza, sinteaza catenei complementare ADN de către o ADN
polimerază, legarea oligonucleotidelor adaptoare pentru crearea
situsurilor de restricție, legarea într-un vector de clonaj și sinteza
catenelor de ADNc care este amorsată prin fixarea unei secvențe
scurte poliT.

106.Screening-ul unei biblioteci utilizând sonde marcate

radioactiv

Fragmentele de ADN cunoscute ca posedând o omologie cu

ADNc sau al genei de cercetat pot servi ca sonde în vederea
criblajului (screeningului) bibliotecii.
Fragmentul de ADN sondă este marcat prin hexanucleotide
aleatoriu sau prin translația secțiunii. Membranele de hibridare
conțin vectori ai bibliotecii, iar clonele pozitive sunt reperate și
prelevate.

107.Screening-ul unei biblioteci utilizând anticorpi

Uneori nu se cunoaște secvența proteinei și a genei de clonat.

O metodă biochimică poate duce la purificarea unui polipeptid și
obținerea anticorpilor specifici. Acești anticorpi pot fi utilizați
pentru a izola ADNc, pornind de la o bibliotecă de ADNc.
Astfel, bacteriile din bibliotecă conținând vectori recombinați
sunt capabile de sinteza proteinelor corespunzătoare secvenței de
ADNc.
Complexele stabile antigen-anticorp sunt puse în evidență
prin reacții colorimetrice cu ajutorul unor anticorpi primari, cuplați
cu alții secundari spefici primilor. Clonele care răspund de aceste
hibridări sunt reperate pe plăcile Petri și apoi prelevate.