Cultura de rădăcini

Cultura de rădăcini constă în creşterea pe medii aseptice a rădăcinilor detaşate. Tehnicile de

cultivare in vitro a rădăcinilor au fost realizate încă în etapa de pionierat a cercetărilor efectuate în
această direcţie. Astfel, White a dovedit că rădăcini detaşate de la plantule de tomate pot fi cultivate in
vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate.

În general, se utilizează rădăcina primară, embrionară, prelevată de la plantulele formate prin

germinarea seminţelor în condiţii aseptice. Principala problemă care se ridică, în acest caz, este aceea a
realizării unei perfecte sterilizări a seminţelor. Sămânţa sănătoasă, cu tegumentele întregi, nelezate, are
ţesuturi embrionare neinfectate. Seminţele pot fi dezinfectate folosind agenţi puternici de sterilizare
întrucât prezenţa tegumentului protejează formaţiunile embrionare de toxicitatea soluţiei de sterilizare.
Astfel, un exemplu de realizare a sterilizării, izolării şi cultivării in vitro poate fi cel al unei rădăcini
primare prelevate de la o plantulă de mazăre. Aproximativ 20 seminţe de mazăre, cu tegumentul întreg,
se introduc într-un vas Erlenmayer, în aproximativ 250 ml alcool etilic 70o; se agită seminţele, iar după
cca 10 secunde se decantează etanolul iar peste seminţe se adaugă soluţie de hipoclorit de calciu 10%,
timp de 20 minute, toate operaţiunile efectuându-se în camera sterilă. După cele 20 minute se
decantează soluţia de hipoclorit de calciu iar seminţele se clătesc în trei reprize de apă distilată sterilă.
După clătire se îndepărtează seminţele devenite translucide, ca urmare a infiltrării apei sub tegument,
iar seminţele întregi se inoculează, tot în condiţii sterile, în vase Petri, în care a fost repartizat un mediu
de cultură MS (Murashige-Skoog) simplu constituit din soluţia stoc de macroelemente şi agar 6,5%.
Seminţele se incubează la întuneric, în condiţii controlate, timp de 48 ore, după care, când rădăciniţa
plantulei atinge lungimea de aproximativ 20 mm, în condiţii aseptice, se detaşează vârful rădăciniţei (cca
5-10 mm) şi se inoculează tot în vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un mediu de cultură constituit din
macroelemente şi zaharoză, pH-ul fiind 5,8 (Reinert şi Yeoman, 1982).

Se poate constata că mediul de cultură recomandat este unul simplu lipsit de microelemente,
vitamine sau hormoni. Se pot utiliza şi medii mai complexe, clasice, iar ca sursă de carbon organic poate
fi folosită glucoza în loc de zaharoză. Creşterea rădăcinilor in vitro are loc pe medii de cultură lichide
neagitate. Zilnic se poate urmări dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia Petri a unei
hârtii milimetrice.

De obicei, după 21 zile de cultură se constată o plafonare a creşterii, moment în care se

recomandă subcultivarea rădăcinilor, prin excizarea apexului şi transferarea lui pe mediu proaspăt.
Subcultura se poate face şi la interval de 7 zile. După aproximativ două subculturi, este oportună
introducerea în mediul de cultură a tiaminei şi a acidului nicotinic, în dozele normale, utilizate pentru
alte tipuri de explante.

Prin cultura de rădăcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare. Street
precizează că auxina stimulează atât creşterea în lungime a fragmentelor de rădăcini de tomate cât şi
diviziunea celulelor meristemului apical. Utilizând culturi de rădăcini, pe diferite tipuri de medii, ca şi
compoziţie şi consistenţă, s-a putut stabili efectul diferiţilor fitohormoni de creştere, al elementelor
chimice sau al unor substanţe organice, în formarea rădăcinilor, în creşterea lor, precum şi urmările
carenţării celulelor lor în anumite elemente. Prin extrapolarea acestor rezultate, s-a reuşit îmbogăţirea,
an de an, a cunoştinţelor privind funcţionarea rădăcinilor şi rolul lor în metabolismul general.

De asemenea, din cultura de rădăcini se poate obţine uşor calus, mai ales din cele principale sau
din cele îngroşate secundar. Procesele de organogeneză, la nivelul rădăcinilor netransformate în calus,
se rezumă la ramificarea acestora în radicele secundare. Geneza de muguraşi şi tulpiniţe are loc la
nivelul ţesutului calusal, provenit din rădăcini, sau pe explante radiculare.

6.1.7.2 Cultura de meristeme

Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-şi menţin, în tot cursul vieţii
plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formând mereu noi celule.
Meristemele sunt localizate în vârful ramificaţiilor organelor (tulpini sau rădăcini), fiind meristeme
apicale, de tip primar, cu rol în creşterea în lungimea organelor; meristeme primare găsim şi în straturile
profunde ale rădăcinilor şi tulpinilor. La organele ce suferă procese de modificare secundară morfo-
anatomică, îngroşări, întâlnim meristeme secundare, respectiv cambiul şi felogenul. De regulă, prin
termenul de cultură de meristeme se înţelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare.

Masivul de celule care alcătuieşte meristemul apical se apreciază că măsoară maximum 500 µ
(Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru şi 0,25-0,30 mm lungime (Kartha, 1981). În cazul în
care se depăşeşte această dimensiune, vorbim despre o cultură de apex.

Celulele meristematice deţin caracteristici structurale particulare, ce le conferă capacitatea de a

se menţine într-o continuă stare de proliferare, cum ar fi:

-au pereţii celulari subţiri, celulozici, nemodificaţi secundar;

-sunt bogate în citoplasmă, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli bine
reliefaţi;

-vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi.

În raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt

mici, strâns unite între ele, fără spaţii intercelulare. Meristemele primare au celule de forma poligonală
iar meristemele secundare au formă tabulară. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor
secundare au o dispoziţie radială, respectiv toate celulele generate dintr-o celulă meristematică mamă
sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat naştere.

Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar arbitrar,
la angiosperme, straturile de celule componente sunt subîmpărţite în tunica şi corpusul.
 La meristemul radicular păturile celulare prezintă o structură diferită de aceea descrisă la
tulpină.

Forma, mărimea şi conformaţia meristemului apical, caulinar variază mult la diferitele specii dar,
în mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor vasculare, meristemul
la gimnosperme şi meristemul de angiosperme.

Meristemul caulinar terminal este localizat în vârful ramurilor şi de regulă, este protejat în
mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.

Mugurele este constituit dintr-un ax, în apexul căruia se află meristemul. Prin diviziunea
continuă a meristemului rezultă celule care, pe măsură ce se îndepărtează de apex se diferenţiază
funcţional. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de creştere sau vârf vegetativ) se pliază, iar
protuberanţele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se diferenţiază în primordii foliare
sau florale. De regulă, în primordiile florale se produce o creştere a intensităţii ratei de multiplicare
celulară, aceşti muguri devin mai bombaţi, mai voluminoşi. Celulele din zona centrală se diferenţiază în
xilem, floem şi ţesut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui, se întâlnesc
primordii transformate fie în frunzuliţe, din ce în ce mai mari, fie în boboci, respectiv în componente
florale. Mugurii şi bobocii au capacitate regenerativă ridicată, graţie faptului că deţin ţesuturi tinere, slab
diferenţiate şi celule meristematice. Meristemele apicale posedă o relativă autonomie, fapt încă
insuficient argumentat şi dovedit experimental. În evoluţia in vitro a explantelor meristematice, un rol
important îl are stadiul de dezvoltare al primordiilor. Primordiile florale recoltate în faze prea avansate
de dezvoltare, cultivate in vitro, se transformă în floare. Adeseori, funcţie de specie, la nivelul
învelişurilor florale se poate induce neogeneza de formaţiuni meristematice adventive.

Cambiul şi felogenul sunt meristeme prezente în organele îngroşate secundar sau în cele
metamorfozate (rădăcini tuberizate). De regulă, cambiul constituie o principală zonă regenerativă.

Ţesuturile inoculate pe medii aseptice, de regulă, diferenţiate morfofuncţional, trebuie să se

dediferenţieze, fenomen ce se petrece în etape succesive, până la reîntoarcerea lor la starea de
meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. Fenomenul de dediferenţiere celulară se
produce şi spontan, de exemplu în cazul iniţierii unor meristeme, sau al genezei de rădăcini secundare
din celulele periciclului radicular.

Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro poate consta în formarea de calus, dediferenţiere

primară, din care se poate ajunge la un stadiu de dediferenţiere secundară, când o parte din celulele
calusului se transformă în meristeme, generatoare de rădăcini sau tulpini.

Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiţie a formării de promeristeme şi

de iniţiere a organogenezei.

În cultura de meristeme, meristemul este prelevat împreună cu două primordii foliare

subiacente acestuia.
 Ball (1946) a fost primul care a obţinut plantule din meristeme de Lupinus albus şi Tropaeolum
majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste experimente au relevat potenţialitatea organogenetică a
diferitelor părţi ale apexului.

În prezent, o atenţie deosebită se acordă studiilor privind cunoaşterea reacţiei meristemului

cultivat in vitro, în raport cu condiţia funcţională a meristemului in situ, precum şi a rolului primordiilor.
Este evident faptul că un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, îşi poate manifesta
totipotenţialitatea sa reală; în condiţiile inoculării lui împreună cu primordiile, ori in situ, această
capacitate este mascată de corelaţiile existente ca urmare a prezenţei alături de meristem şi a celorlalte
ţesuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui însoţit de primordii, este dependentă de
fitohormonii de creştere prezenţi în mediul de cultură. Se pare că primordiile, chiar în faza în care
frunzele sunt abia schiţate, se pot transforma fie în frunze, fie în muguri floriferi. Experienţele de
microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight şi Koehnert (1969), precum şi ale altor
autori, au permis stabilirea faptului că tinerele mucroane foliare se află într-o stare nedeterminată încă
morfofuncţional. Problema transformărilor morfologice şi structurale, în cadrul proceselor de tranziţie
care au loc în trecerea stării vegetative a meristemului în stare florală, precum şi a celor legate de
reversia meristemelor iniţial florale, în meristeme vegetative constituie punctul de plecare în
multiplicarea vegetativă in vitro, pornind de la explante constând din boboci sau din învelişuri florale. La
conopidă, în faza de preinflorescenţă, Margara (1982) se pot distinge trei categorii de meristeme:
vegetativ, de generare a inflorescenţei şi de formare a florilor.

Definitivarea direcţiei de evoluţie a meristemului apical, din vegetativ în floral, depinde de o

serie de factori exogeni – fotoperioadă, temperatură – sau endogeni – specie, hormoni.

În condiţiile cultivării unor explante in vitro, celulele ţesuturilor inoculate pe medii aseptice
suferă un proces de dediferenţiere şi generează meristeme. Din aceste meristeme, prin rediferenţiere,
vor lua naştere organe. Organogeneza constituie momentul de bază în asigurarea multiplicării
vegetative.

De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaţiuni meristematice, aflate într-un stadiu
tânăr, nediferenţiat funcţional în meristem generator de rădăcini, sau în meristem generator de tulpini,
fiind numite promeristeme. Tot legat de activitatea meristematică incipientă, există şi un alt termen,
întâlnit în literatura de specialitate – meristemoid (Torrey, 1966). Această noţiune se referă la formaţiuni
meristematice, abia schiţate, cu direcţie de dezvoltare nedeterminată, aparent identice din punct de
vedere morfologic.

Se ştie că meristemul radicular al angiospermelor se deosebeşte funcţional de cel al tulpinilor

nefiind interconvertibil, cu toate că axa caulinară şi cea radiculară, în evoluţia filogenetică, au o origine
comună. Diferenţierea funcţională a meristemului se face, probabil, în stadiul de promeristem; în cazul
meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evoluează în: meristem proliferativ,
meristem generator de rădăcini şi meristem de tip caulogen. Dar nu se cunoaşte dacă aceşti
meristemoizi sunt identici sau prezintă deja amprenta determinismului lor funcţional, radicular şi
caulinar.
 Meristemele radiculare, funcţie de originea lor se împart în mai multe categorii:

-meristem apical – situat în vârful rădăcinilor;

-meristem lateral – format pe rădăcina principală;

-meristem adventiv – provocat în a se forma la nivelul tulpinilor, frunzelor sau al altor organe,
care în mod natural nu sunt purtătoare de rădăcini. Inducerea formării acestor meristeme radiculare
adventive constituie baza multiplicării vegetative prin butaşi, marcote sau organe de rezervă;

-meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv.

Meristemele caulinare pot fi împărţite astfel:

-meristeme apicale (terminale) – derivate din muguraşul embrionului;

-meristeme axilare – aflate la axila frunzelor;

-meristeme adventive – formate pe diverse organe;

-meristeme neoformate – generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.

Formarea meristemelor şi organogeneza sunt procese care se petrec treptat, sub control genetic
şi hormonal. Factorii de mediu pot şi ei stimula inducerea şi viteza de desfăşurare a proceselor de
organogeneză. Hormonii sau regulatorii de creştere de sinteză constituie factori cu rol hotărâtor în
direcţionarea proceselor de diferenţiere a meristemelor, în meristeme radiculare sau caulinare. Auxinele
intervin în reglarea formării meristemelor radiculare iar citochininele în neogeneza de muguraşi.

Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite în tehnicile de multiplicare şi de

micropropagare a o serie de specii de interes economic.

Astfel, se poate concluziona faptul că, la plantele superioare există o diversitate de meristeme
clasificate, după localizarea lor în plantă. Meristemele mai pot fi clasificate şi în alte două categorii:

-meristeme histogene – care produc obişnuit numai ţesuturi;

-meristeme organogene – care dau naştere la ţesuturi ce formează organe;

Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca structură şi funcţiune,
meristemele caulinare sunt deosebit de complexe structural şi funcţional. Ele variază ca aspect şi
potenţialitate, de la o specie la alta. Meristemele caulinare, terminale, constituie, în fapt, un microbutaş,
întrucât vârful vegetativ al plantei, inoculat in vitro îşi formează un propriu sistem radicular, în partea sa
bazală. În consecinţă, acest tip de meristem este frecvent folosit în tehnicile de multiplicare şi de
propagare accelerată a plantelor, pe medii aseptice.

Potenţialitatea regenerativă a acestor meristeme este, de regulă, extrem de mare. Ele se

adaptează bine la condiţiile in vitro, suportă uşor traumatismul provocat de explantare, reluându-şi
activitatea în urma trecerii lor pe medii aseptice, generând plante. Acest fapt presupune atât creşterea
axei mugurelui şi a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzuliţelor, cât şi neogeneza de rădăcini. În final,
meristemul terminal, apical sau axial generează una sau mai multe plante, în funcţie de balanţa
hormonală prezentă în mediul de cultură. Meristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase
ridică probleme speciale, întrucât ele aparţin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce
îngreunează o alimentare optimă a lor cu apă, cu nutrienţi şi hormoni. Acest lucru constituie
impedimente fiziologice care, pe plan funcţional, se traduc printr-o regresie a capacităţii regenerative a
celulelor lor, soldată cu o scădere a totipotenţialităţii acestor meristeme.

Meristemul apical se formează în momentul organizării embrionului şi rămâne activ în tot cursul
vieţii plantei. Excepţie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical în decursul
sezonului de iarnă se află în stare de latenţă.

Prin intermediul culturii de meristeme – apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o rapidă
multiplicare clonală a plantelor, îndeosebi a celor horticole şi a unor specii silvice.

Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obţine o regenerare de plante identice din punct de
vedere genetic cu planta mamă donatoare, fapt deosebit de important în horticultură, asigurându-se
astfel o multiplicare clonală.

Un alt aspect, foarte important, care derivă din înmulţirea meristematică a plantelor, este acela
al obţinerii de material săditor sănătos, în ţesuturile căruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen.
Plantulele generate in vitro din meristeme, însoţite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt
libere de viroze, deosebit de păgubitoare şi imposibil de evitat şi de combătut în condiţiile înmulţirii
vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin seminţe poate asigura, într-o oarecare măsură,
eradicarea parţială, temporară, a virozelor, ştiut fiind faptul că, chiar şi prin seminţe se transmit o serie
de viroze. Dar nenumărate plante horticole nu se pot înmulţii prin seminţe sau, la unele soiuri,
multiplicarea prin seminţe este dificilă (orhidee), ori seminţele nu sunt fertile, ceea ce a făcut ca
înmulţirea acestora pe cale vegetativă să constituie unica metodă de multiplicare a lor. Pe de altă parte,
multiplicarea plantelor pe cale asexuată, prin metode de înmulţire vegetativă clasică, a condus la
degenerarea descendenţilor ca o consecinţă a perpetuării, an de an, a infecţiilor virale. Astfel, o cultură
sănătoasă de garoafe (Rudelle, 1977), înmulţite timp de cinci ani prin butăşire clasică, a prezentat o
răspândire în masă a virozelor, multe din ele, cauzând degenerări. Totodată, multiplicarea vegetativă,
prin metode tradiţionale, are drept consecinţă şi o perpetuare a unor mutaţii somatice.

Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi şi căpşun, în floricultură şi în

arboricultură, întrucât reduc vigurozitatea plantelor, scad potenţialul productiv al acestora, producţia
realizată este mediocră şi produsele agricole au un grad înaintat de depreciere a calităţii lor. Butaşii
obţinuţi din plante virozate au o capacitate redusă de înrădăcinare şi realizează un procent scăzut de
prindere. Pe de altă parte, din cauza menţinerii în cultură a unor plante virozate se creează pericolul
transmiterii virusurilor şi la alte plante, prin vectorii biologici prezenţi în cultură.

Primele încercări de cultivare a extremităţilor de tulpini şi de rădăcini sunt citate ca fiind

realizate încă din 1922, de către Kotte şi de către Robbins, la mazăre şi porumb, dar fără mare succes.
Ulterior, în 1946, Ball a reuşit să obţină plante din apexuri meristematice la Lupinus albus şi la
Trapaeolum majus. Până în jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zisă de meristeme nu era cunoscută,
abia începând din anul 1949, prin lucrările lui Wetmore şi Morel s-au pus bazele cercetărilor sistematice
privind cunoaşterea reacţiei explantelor meristematice la condiţii de cultură, precum şi cu privire la
comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate în condiţii
variate de mediu.

Dacă meritul de a fi reuşit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball, în schimb
prioritatea în ceea ce priveşte obţinerea de plante sănătoase, devirozate, prin cultura in vitro a
meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de
rezultatele obţinute între anii 1949-1950 de către Limasset şi Cornuet, Morel a avut intuiţia de a cultiva
in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 µm lăţime şi 150-200 µm înălţime, cu 1-2 primordii
foliare.

Experienţele efectuate de Limasset şi Cornuet au constat în urmărirea, prin analize serologice, a

gradului de răspândire şi a evaluării intensităţii virozării organelor vegetative aeriene a plantelor la
diferite distanţe de apex. Ei au constatat o distribuţie inegală a virusurilor în corpul plantelor şi au
observat un gradient mai scăzut de infecţie virală, pe măsura apropierii de vârful vegetativ, respectiv de
meristemul apical. Cea mai redusă infecţie virală a fost semnalată în sucul extras din frunzele aflate încă
în mugur. Pornind de la aceste fapte, Limasset şi Cornuet au extirpat, aseptic o calotă de ţesut apical sau
meristem şi câteva primordii foliare şi au depus-o pe o frunză tânără de tutun, lezată printr-o scarificare
superficială. După trecerea unei perioade de incubaţie s-a putut constata că frunzele de tutun, pe care s-
a amplasat exclusiv calota meristematică, au fost virozate în proporţie de 60%, în timp ce frunzele pe
care s-au aplicat ţesuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai îndepărtate de meristem) s-a
infectat în procent de 100%. Aceste experienţe ia condus pe Limasset şi Cornuet la concluzia că în apexul
caulinar migrarea şi înmulţirea virusurilor este oprită.

Încă din 1952, Morel şi Martin au intuit faptul că, pornind de la plante virozate, prin explantarea
şi cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obţine o plantă sănătoasă, conservând, în
acelaşi timp, caracterele genetice ale plantei mamă. Această ipoteză a fost atestată de către Morel şi
Martin prin experienţe efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima de eradicarea
virozelor, prin procedeul imaginat şi pus în practică de către Morel şi Martin. Tulpinile generate in vitro,
neposedând rădăcini, au fost transformate în minibutaşi. Aceştia au dat naştere la plante libere de
viroze. Au urmat apoi cartofii şi orhideele. În 1957, Quak a remarcat că metoda lui Morel şi Martin este
posibil de aplicat, cu aceleaşi rezultate, la garoafe. Din acel moment s-au demarat cercetările în scopul
stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare şi producere a unui material săditor sănătos,
cu randament economic asigurat, având ca obiectiv obţinerea de flori de calitate superioară.

În acest mod a fost elaborată ipoteza imunităţii potenţiale a celulelor meristematice la atacul
viral. Dacă prelevarea se face de la o plantă neinfectată, sau care prezintă o infecţie virală slabă, atunci
cresc şi mai mult şansele de a preleva explante meristematice, lipsite de infecţii virale.
 Din păcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot îmbolnăvi tot atât de repede
ca şi oricare altă plantă. De regulă, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigură multiplicarea lor, tot
pe medii aseptice, prin minibutaşi, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se constituie o
plantaţie mamă, donatoare de meristeme ori chiar de butaşi, plantaţie executată în condiţii speciale de
protecţie, încât plantele să fie ferite de atac zoopatogen.

Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante

meristematice, asigură şi eliminarea din materialul săditor a fungilor şi a bacteriilor. Astfel, la garoafe s-a
realizat eliberarea plantelor de infecţii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium şi Diffenbachia eradicarea
bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).

Cercetările recente au dovedit însă, că nu toate meristemele sunt libere de infecţii virale. Invazia
meristemelor cu virusuri este dependentă de tipul meristemului, al virusului şi de specia plantei
parazitate. Cu cât explantele meristematice sunt mai mici, cu atât şansa prelevării de celule lipsite de
virusuri este mai mare, dar cu cât inoculul meristematic este mai mare, cu atât este mai ridicată
capacitatea lor regenerativă.

Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de înmulţire meristematică (Martin, 1977). De
exemplu, la cartof, virusul X poate fi înlăturat, prin înmulţire meristematică, numai în procent de 1%.
Unele virusuri pot exista chiar şi în meristemele apicale (Hollings, 1962).

Termoterapia vine în ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de

combatere a infecţiilor virale, la plante. Termoterapia a fost elaborată de către Kunkel, în 1936. Aceasta
constă în supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse între 35-39oC, timp de 2-4 săptămâni. În
cursul aplicării termoterapiei virusurile nu se multiplică; ele rămân la nivelul celulelor în care au fost
surprinse în momentul declanşării tratamentului termoterapeutic.

Combinând cultura de meristeme cu termoterapia se realizează, cu şanse foarte mari de reuşită,

eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. În consecinţă, mersitemele sunt prelevate de la
plante supuse, prealabil explantării, tratamentului termoterapeutic. Dar, în această situaţie, descreşte
vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scăderea capacităţii de supravieţuire şi de regenerare a
celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se alungeşte iar virusurile, nemultiplicându-se,
rămân în celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce înlesneşte prelevarea unor explante apicale mai
mari de până la 1 mm, micşorând pericolul recoltării unor ţesuturi subiacente meristemului, infectate cu
germeni fitopatogeni. În consecinţă, explantele meristematice prelevate de la plante supuse
termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativă şi de creştere va fi mai ridicată, ceea ce
compensează epuizarea fiziologică, cauzată de termoterapie.

Kassanis (1950) a dovedit că unul din virusurile cartofului, localizat în frunze, poate fi inactivat la
nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar tot Kassanis a precizat că la tomate există virusuri a
căror activitate este suprimată abia la 80oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe
cercetători să prelungească durata termoterapiei, de la câteva zile la câteva luni şi să ridice temperatura
de la 35 la 40oC (Quak, 1977).
 Hakkaart şi Quak (1964), experimentând cu meristeme excizate de la crizanteme, de până la 1
mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat că prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20
zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea
tratamentului termoterapeutic peste această durată de timp (până la 50-60 zile)nu a condus la
depăşirea procentului de plante devirozate.

În unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vârful meristematic şi în decursul
cultivării ţesuturilor in vitro. Astfel, Hollings şi Stone (1964), au reuşit această performanţă la garoafe, iar
Walkey şi colab. (1969) la cireş. Această eradicare endogenă a virozei, în interiorul celulelor cultivate pe
medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecinţă a traumatizării
celulelor excizate. Cu cât a fost mai mic fragmentul de ţesut excizat, cu atât traumatismul a fost mai
puternic şi efectul endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai mare (Walkey, 1980). De
regulă însă, este imposibil să regenerăm anumite specii de plante din fragmente atât de mici de ţesuturi;
ori în alte condiţii, nu poate fi realizată o traumă de o aşa amploare încât să se producă o disturbare a
metabolismului virusurilor din celulele explantate, soldată cu suprimarea atacului viral.

Explicaţiile privind modul în care celulele meristematice rezistă infecţiilor înclină spre justificări
de ordin molecular. Una din ipoteze susţine că există o competitivitate între celula gazdă şi parazit, în
ceea ce priveşte utilizarea unor enzime implicate în procese de restituţie; altă ipoteză, susţine că celula
meristematică utilizează ARN viral, sau că substanţele generate în urma traumatizării celulelor ar
suprima virusurile prezente în celule.

În anul 1978, Walkey, a reuşit obţinerea de plante sănătoase şi prin cultivarea in vitro a ţesutului
gametofitic femel, respectiv ovare sau ţesut nucelar, sau a meristemului floral.

Trebuie subliniat şi marele merit pe care Morel l-a avut în intuirea importanţei deosebite a
descoperiri posibilităţii de a obţine plante sănătoase din plante bolnave, precum şi a direcţiilor aplicative
pe care le-a deschis această tehnică, efectuată în condiţii aseptice. Cele mai mari realizări le-a avut
Morel în multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, în anul 1963, Morel comunica primele rezultate cu
privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. Acestea se refereau la faptul că
meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, generează un glomerul de 1-2 mm, de culoare
verde, numit protocorm. Prin ruperea şi cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o masă globuloasă,
un glomerul de cca 3-4 mm slab diferenţiat histologic, constituită dintr-un parechim, cu celule mari,
sărace în citoplasmă şi cu vacuole întinse. În partea centrală a glomerulului se disting câteva fascicule
vasculare. Fragmentând periodic această masă şi cultivând-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare
capacitate de multiplicare vegetativă a celulelor detaşate. În anul 1978, Murashige afirma că, dintr-un
meristem de orhidee, în decursul unui an, prin fragmentări şi subcultivări repetate ale protocormilor, se
pot obţine cca 4 milioane de noi plante de orhidee. Protocormul produs in vitro este asemănător cu
protocormul de germinaţie, rezultat din embrionii seminţelor.

În 1959, Martin a intuit posibilitatea creării unei bănci cu explante, în care să fie conservat
materialul biologic meristematic sănătos. Prin această tehnică, astăzi, materialul vegetal generat in vitro
este uşor conservat, ţesuturile deţinând nealterată, întreaga lor capacitate regenerativă.
 Valoarea mare a culturii de meristeme constă deci în:

-asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor, generat in vitro;

-eliminarea agenţilor fito sau zoopatogeni;

-creşterea la maximum a coeficientului de multiplicare, în cel mai scurt timp, a unui exemplar
vegetal;

-obţinerea unui material săditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metode tradiţionale de
înmulţire vegetativă;

-conservarea prin temperaturi scăzute a inoculilor meristematici, pentru o lungă perioadă de

timp, într-o anumită fază de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce să asigure, oricând,
necesarul de material săditor solicitat pe piaţă;

-conservarea germoplasmei în bănci de gene.

În extinderea rapidă a acestor practici, în regim industrial a predominat factorul economic

rezultat, în primul rând, din aspectele fitosanitare, respectiv din obţinerea unor culturi viguroase,
sănătoase. Astfel, cartoful, plată extrem de importantă atât în hrana omului şi pentru industrializare dar
şi în hrana animalelor, a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a vigurozităţii culturilor
prin eradicarea virozelor, cultivând in vitro meristemele caulinare. Cartoful este atacat de nenumărate
virusuri care, de cele mai multe ori, pot fi prezente concomitent în ţesuturi, ceea ce epuizează planta şi
scade, considerabil recolta. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu toate tipurile de virusuri
pot fi în egală măsură combătute. Astfel, la cartof, dintre toate virusurile prezente foarte des în cultură
(A, Y, M, S, X) virusul A este mai uşor de îndepărtat, comparativ cu virusul X. Multiplicarea in vitro prin
meristeme a luat o mare amploare şi la garoafe. Astfel, în Franţa, cifra de afaceri realizată, în categoria
florilor tăiate, prin vânzarea garoafelor, ocupă locul doi iar exportul horticol francez este reprezentat în
proporţie de 80% de garoafe, 90% dintre acestea provenind din mutaţii de culoare, practicate la tipul
american de garoafă creat de William Sim, în 1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a făcut în miliarde de
exemplare. Conservarea calităţilor sale genetice se datorează metodei de multiplicare prin cultura in
vitro a meristemelor caulinare, apicale. Infecţiile virale afectează nu numai calitatea florilor, ci reduce
foarte mult şi capacitatea de înrădăcinare a butaşilor. În laboratoarele unei singure unităţi se produc
anual, in vitro, cca 10 000 de garoafe. Înmulţirea meristematică a permis vindecarea garoafelor şi de boli
vasculare, respectiv eradicarea atacului de Phialophora cinerescens, Fusarium oxysporum, şi a
bacteriozelor Pseudomonas caryophylli şi Pectobacterium parthenii. De o mare importanţă este cultura
orhideelor, obţinerea de material săditor devirozat la garoafe, căpşun, crizanteme, la pomi fructiferi, la
arbori şi arbuşti.

Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu înseamnă urmărirea, ca scop în sine, numai eradicarea
bolilor ci pur şi simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase. Această metodă este cu
atât mai importantă cu cât se pleacă de la un material iniţial devirozat.
 Se practică diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip caulinar
şi anume:

-unele procedee vizează cultivarea exclusivă a celulelor conului meristematic, fără primordii
foliare, pentru studierea proceselor regenerative, în dependenţă de dimensiunea redusă a explantelor şi
de consecinţele traumatismelor provocate;

-altele privesc obţinerea de material săditor devirozat, explantele constând din meristeme
recoltate împreună cu prima pereche de primordii foliare, lungimea explantelor fiind de până la 500 μm,
respectiv 0,25-0,7 mm;

-altele au în vedere obţinerea unui număr foarte mare de plantule, în timp scurt utilizând
explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionând diferenţierea de meristeme axilare şi de muguri
adventivi pe apexul iniţial.

În oricare din cazuri trebuie să avem în vedere selectarea, cu mare atenţie şi pricepere, a
plantelor mamă, donatoare de explante. Este de dorit ca ele să fie sănătoase şi să se afle într-o perioadă
de creştere activă. Latenţa organelor uneori ridică probleme speciale şi implică aplicarea unor
tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergenţa meristemelor. Alegerea explantelor,
sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultură folosit, regimul din camerele de creştere influenţează
supravieţuirea explantelor. Restabilirea proceselor biologice, de diviziune şi de regenerare precum şi
sensul desfăşurării histo şi organogenezei, diferenţierea de plante, dezvoltarea lor şi apoi capacitatea
adaptativă a acestora la mediul normal sunt influenţate atât de factori endogeni, cât mai ales de cei
exogeni, în special de balanţa hormonală şi de regimul de lumină, respectiv de temperatură.

De regulă meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapidă creştere. Cu toate
acestea şi meristemele laterale, prelevate din mugurii axilari, pot fi folosite în culturile de meristeme. La
crizanteme din 5000 de vârfuri meristematice, 32% din mugurii apicali, terminali, au crescut, generând
plante mature, în timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante.

Mărimea explantelor se stabileşte în funcţie de specie şi de scopul urmărit. Când se are în

vedere obţinerea de plante libere de viroze la garoafe, explantul nu trebuie să depăşească 0,5 mm dar
nici să fie mai mic de 0,2 mm, deoarece, în acest caz, este dificilă înrădăcinarea plantulelor generate din
meristeme. În cazul în care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai mare, de până la 1 mm.
În camerele de creştere intensitatea luminii se recomandă să fie de 2400-2600 lucşi, în regim de
fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. În alte cazuri, lumina trebuie intensificată la 3500-4000
lucşi, iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 lucşi. Temperatura trebuie să
fie stabilizată între 22-25oC. Uneori există indicaţii stricte cu privire la regimul termic şi de iluminare,
cerute de un anumit tip de cultură, potrivit unei anumite specii sau corespunzător unei anumite etape
de dezvoltare a inoculilor.

În literatura de specialitate sunt recomandări şi cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru
prelevarea şi inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel, se specifică că meristemele de garoafe
supravieţuiesc, în proporţie mai mare, dacă sunt recoltate primăvara sau toamna devreme; meristemele
recoltate iarna înrădăcinează mai uşor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule
libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof, meristemele recoltate primăvara sau vara, de timpuriu,
înrădăcinează mult mai repede în raport cu cele care sunt prelevate şi inoculate la finele anului.

În ceea ce priveşte substratul de cultură, de cele mai multe ori, se utilizează medii de cultură
solide. La cartof, garoafe şi la alte specii se pot folosi şi mediile lichide. PH-ul mediului de cultură poate
constitui un factor limitativ al creşterii şi dezvoltării meristemului cultivat in vitro. Astfel, de regulă, pH-ul
de 5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; după autoclavare, pH-ul scade, iar în decurs de o săptămână de la
cultivarea ţesuturilor, pH-ul descreşte până aproape de 5,4. Un pH iniţial scăzut inhibă formarea
rădăcinilor.

În compoziţia mediilor de cultură sunt incluse macro şi microelemente, FeEDTA, vitamine,

aminoacizi şi o sursă de carbon organic, reprezentată, de regulă de zaharoză în concentraţie de 2-3%.
Natura hormonilor şi concentraţia acestora variază de la o specie la alta, în funcţie de scopul urmărit.
Astfel, pentru înrădăcinare se folosesc cu precădere ANA şi AIA, care însă folosite timp îndelungat pot
duce la inhibarea creşterii rădăcinilor. În acest caz, se recomandă subcultivarea explantelor pe medii
lipsite de auxine. Citochininele stimulează creşterea meristemelor, mai ales în cazul în care ele se fală în
latenţă, precum şi formarea de nenumăraţi muguraşi. Concentraţia fitohormonilor de creştere variază în
diferitele faze de evoluţie ale meristemelor.

Plantele complet formate prezentând rădăciniţă şi tulpiniţă vor fi scoase din condiţiile in vitro,
fiind trecute în condiţiile mediului septic. Ele vor fi transferate în ghivece mici, în amestec de perlit cu
pământ. Se poate realiza transferul lăstăraşilor în mediul septic,chiar neînrădăcinaţi, această operaţiune
putând determina înrădăcinarea lor. Buys (1969) recomandă transferarea timpurie în sol a plantelor de
garoafe neoformate in vitro, întrucât rădăciniţele generate in vitro sunt în mică măsură folositoare în sol,
iar prelungirea duratei de menţinere a plăntuţelor în flacoanele de cultură, ridică nejustificat costul
materialului plantat rezultat. Atunci când plantele sunt suficient de mari, se va testa serologic,
eventuala prezenţă a virusurilor şi gradul de infecţie.

Metodele de testare a virozelor şi natura acestora variază de la o specie la alta. În 1977, Clark şi
Adams au pus la punct un procedeu ELISA de identificare a prezenţei virusurilor, iar în 1973, Derrick, a
preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate în determinările de
virusologie vegetală. Pentru a uşura exactitatea investigaţiilor este de dorit să se facă o analiză a
infecţiilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum şi în cultura, sau culturile apropiate.
După stabilirea unei culturi lipsite de germeni este absolut indispensabil ca plantele să fie menţinute în
condiţii speciale fie că ele sunt prezervate în condiţii de temperaturi scăzute, în recipientele lor de
cultură, pe medii aseptice, fie că sunt cultivate în teren, într-un perimetru ferit de infecţii, metodele fiind
menite să realizeze evitarea unei reinfectări a plantelor.

Metodele criobiologice de prezervare a materialului obţinut in vitro sunt economice şi

indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum şi a unei cantităţi limitate
de material iniţial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizată la temperaturi extrem de scăzute. În
aceste condiţii se asigură reducerea tuturor funcţiilor metabolice. Primele încercări de crioconservare au
fost făcute de către Seiberg în anul 1976, la garoafe. Ulterior s-a reuşit şi conservarea altor tipuri de
inoculi: calus, celule sau protoplaşti. Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substanţe
crioprotectoare, cu rol în prevenirea daunelor cauzate de îngheţarea bruscă a celulelor, respectiv
formarea cristalelor de gheaţă. Cele mai folosite substanţe crioprotectoare sunt dimetilsulfoxidul
(DMSO) şi glicerolul (Kartha, 1981, citată de Cachiţă, 1984). Meristemul este ţesutul cel mai potrivit
pentru a fi conservat la temepraturi scăzute, graţie alcătuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el îşi poate
păstra întreaga capacitate regenerativă, întrucât în momentul repunerii lui în condiţii optime de mediu,
celulele îşi reiau activitatea metabolică şi fiziologică normală. Meristemul se pretează cel mai bine
conservării prin crioconservare, celulele lui fiind sărace în vacuole şi având o citoplasmă densă.

Pentru executarea operaţiunilor de congelare, îndeosebi pentru coborârea gradată a

temperaturii, există dispozitive speciale. O metodă accesibilă preconizează introducerea flacoanelor cu
inoculi într-o baie de alcool, mediu în care se produce descreşterea gradată a temperaturii.

În anul 1980, Dale şi colab. Au pus la punct o metodă de stocare la temperaturi scăzute a unor
graminee sau a unor plante legumicole, constând în conservarea îndelungată a plantelor, generate in
vitro, prin menţinerea lor la temperaturi de 2-4oC, în regim de 8 ore lumină pe zi si o intensitate de 300
lucşi. Cultura poate fi menţinută astfel 10-11 luni, după care se recomandă ca aceasta să fie transferată
pe mediu proaspăt.

O altă problemă deosebită de biologie se ridică în cazul plantelor generate in vitro. Plantele
provenite atât din meristeme cât şi din explante de altă natură, prezintă un grad de juvenilitate similar
plantelor dezvoltate din embrionii seminţelor. Astfel, materialul de plantat, generat in vitro, este
superior celui obţinut prin metodele tradiţionale: butăşire, marcotaj, altoire.

Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatată morfologic, de exemplu la plantulele

de căpşun, diferenţiate din meristeme. La căpşun, frunzele tinere sunt întregi, în timp ce frunzele
plantelor bătrâne sunt trifoliate. Generarea de frunzuliţe întregi sistează la inoculi în momentul în care
se depăşeşte faza de morfogeneză, constând în proliferarea a noi muguri axilari, prin repicări repetate şi
cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinină.

Un caz particular este acela al reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie prelevate
meristeme apicale. Un exemplu îl constituie plantele lemnoase, multianuale. Explantele sau butaşii
prelevaţi de la astfel de plante îşi pierd capacitatea de înrădăcinare. La aceste plante se practică diferite
metode de reîntinerire a materialului biologic prin butăşiri sau microbutăşiri in vitro, altoiri de apexuri
de plante adulte pe tinere plantule.

Sfecla constituie un alt exemplu de plantă a cărei ţesuturi adulte prezintă o foarte scăzută
capacitate organogenetică. De aceea se recomandă inducerea formării de meristem prin repicări
succesive.

O problemă deosebită o constituie aceea a menţinerii meristemului vegetativ, inoculat pe medii

aseptice, într-o stare primară, întrucât în cazul în care se inoculează un meristem vegetativ, prelevat de
pe o tulpină floriferă, există pericolul ca anumiţi factori de mediu să inducă formarea florilor sau invers,
să grăbim, prin reglarea fotoperioadei şi a altor factori de mediu, transformarea unui mugur vegetativ, în
mugure florifer. Reglarea fotoperioadei şi sporirea cantităţii de zaharoză din mediu la 40-50 g/l sunt
factori care par să determine transformarea apexului vegetativ în florifer.

La numeroase plante, detaşarea meristemelor florale şi cultivarea lor in vitro imprimă ţesuturilor
capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, generând muguraşi. Adeseori, se formează muguri
axilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui să se formeze boboci. Inocularea in vitro, pe
medii, cu sau fără fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescenţe tinere conduce la formarea
a numeroşi muguri. La conopidă, prelevarea unui mic explant din apexul preinflorescenţei şi cultivarea
lui pe mediu lichid, cu o auxină (AIA), provoacă reveria ţesuturilor din florifere în vegetative. Astfel,
poate fi înmulţită planta pe cale vegetativă (Crisp şi colab., 1974, citat de Cachiţă,1984).

Originea comună a meristemului vegetativ şi a celui florifer face ca transformarea, în direcţia

diferenţierii morfologice şi funcţionale să fie posibilă, într-o anumită fază de dezvoltare a plantelor sau a
organelor. Reuşita este dependentă de vârsta ţesutului, de specie şi de condiţiile de mediu.

Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante.