Disciplina:

Biotehnologii in ameliorarea plantelor

CURS

MICROPROPAGAREA CONFORMA PRIN CULTURI

DE MERISTEME
Consideratii generale
• În timp ce la animale organogeneza este limitată în timp iar
creşterea încetează înaintea maturităţii, la plantele superioare
organogeneza este permanentă iar creşterea este teoretic
nelimitată. Generarea continuă de ţesuturi şi de organe se
datorează existenţei meristemelor, care reprezintă centri
histogeni şi organogeni la plante.

• Multiplicarea vegetativă se întâlneşte în natură la multe

specii de plante, şi selecţia naturală a ales o mare diversitate
de mecanisme fiziologice şi de structuri anatomice adaptate la
acest mod de propagare.
• Practica tradiţională agronomică şi horticolă a utilizat cu succes
preadaptările unor specii la multiplicarea vegetativă, constând
din stoloni, bulbi, bulbili, rizomi, ca şi capacitatea unor specii
de a se propaga vegetativ prin butăşire şi prin altoire.
Alcătuirea țesutului vegetal
• Țesuturile vegetale sunt formate din celule care au
aceeași formă, origine, structură și care îndeplinesc
aceeași funcție.
• Clasificarea țesuturilor
A.) După gradul de diferențiere a celulelor se disting
2 tipuri:
• Țesuturi embrionare (numite și meristematice sau
formative);
• Țesuturi definitive.
B.) După forma celulelor, țesuturile pot fi:
• parenchimatice: formate din celule izodiametrice (celule
ce au cele 3 dimensiuni egale sau aproape egale);
• prozenchimatice: formate din celule heterodiametrice
(celule ce au diametrul longitudinal de cel puțin 4 ori mai
mare decât celelalte două dimensiuni).
 Țesuturile embrionare (meristeme)
Țesuturi definitive
• Țesuturile embrionare-Sunt țesuturi tinere.
• Sunt alcătuite din celule mici, rotunde, cu perete celular subțire și au
nucleu voluminos. Nu prezintă spații intercelulare.
• Celulele se divid, sintetizând intens substanțe organice.
• Meristemele sunt singurele țesuturi în care se pot observa celule aflate în
diferite faze ale mitozei.
• Embrionul este alcătuit numai din țesuturi embrionare, în timp ce planta
adultă este alcătuită atât din țesuturi definitive, cât și din țesuturi
embrionare numite meristeme.
• Embrionul este alcătuit la început din meristeme primordiale, din care
derivă apoi meristemele primare ce sunt formate din celule cu un început
de diferențiere.
• Meristemele din embrion ajută la creșterea acestuia, iar meristemele
primare din planta adultă asigură creșterea în lungime a organelor plantei.
• Țesuturi definitive
• Sunt țesuturi formate din celule ce nu se mai divid; provin din meristeme
primare sau secundare. Prezintă sau nu spații intercelulare.
• Țesuturile definitive sunt diferențiate și specializate să îndeplinească o
anumită funcție cum are fi: conducătoare, de apărare, mecanică,
secretoare, de depozitare.
Clasificarea meristemelor
A.) După poziția pe care o ocupă în organele plantelor:
• Apicale - în vârful rădăcinii, tulpinii, ramurilor, determinând
creșterea acestora.
• Intercalare - se întâlnesc la plantele graminee deasupra nodurilor
și determină creșterea în lungime a internodurilor.
• Laterale - sunt dispuse în jurul axului plantei, determină creșterea
în grosime.
B.) După origine:
• Primordiale - sunt cele care apar din primele diviziuni ale zigotului
(celula ou) și alcătuiesc embrionul seminței.
• Primare - iau naștere din cele primordiale.
• Secundare - cambiul și felogenul.
• Cambiul libero-lemnos este zona generatoare libero-lemnoasă;
apare între elementele de lemn și de liber primar, generând spre
exterior liber secundar și spre interior elemente de lemn
secundar.
• Cambiul subero-felodermic (felogenul) este zona generatoare
subero-felodermică – generează suber secundar spre exterior și
feloderm spre interior.
Țesuturile embrionare (meristeme)

• Țesuturile embrionare-Sunt țesuturi tinere.

• Sunt alcătuite din celule mici, rotunde, cu perete celular subțire și
au nucleu voluminos. Nu prezintă spații intercelulare.
• Celulele se divid, sintetizând intens substanțe organice.
• Meristemele sunt singurele țesuturi în care se pot observa celule
aflate în diferite faze ale mitozei.
• Embrionul este alcătuit numai din țesuturi embrionare, în timp ce
planta adultă este alcătuită atât din țesuturi definitive, cât și din
țesuturi embrionare numite meristeme.
• Embrionul este alcătuit la început din meristeme primordiale, din
care derivă apoi meristemele primare ce sunt formate din celule
cu un început de diferențiere.
• Meristemele din embrion ajută la creșterea acestuia, iar
meristemele primare din planta adultă asigură creșterea în
lungime a organelor plantei.
Consideratii generale
• În toate cazurile, multiplicarea vegetativă
este tributară meristemelor şi constituie un
potenţial fundamental al plantelor.
• Vârfurile vegetative terminale sau axilare, deci
meristemele, asigură supravieţuirea în caz de
distrugerea parţială, reprezentând un fenomen
adaptativ faţă de riscurile create de condiţiile de
mediu.
• Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ, cu
celule tinere, ce îşi menţin, în tot cursul vieţii
plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv
proprietatea dea se divide, formând mereu noi
celule.
Meristemele
• La rândul lor meristemele pot fi clasificate în patru categorii
importante:
• I.- meristeme primordiale, numite şi promeristeme - intră în
alcătuirea embrionului rezultat după primele diviziuni ale zigotului.
• Aceste meristeme primordiale se distribuie în planta care se
dezvoltă de la embrion la extremităţile axei principale (deci în vârful
tulpinii şi al rădăcinii), şi la extremităţile ramificaţiilor acestora
(ramificaţiile laterale ale tulpjnii şi ale rădăcinilor secundare).
• Prin urmare, o dată cu ramificarea axei principale, meristemele
primordiale se distribuie în mugurii apicali şi axilari ai ramurilor
tulpinii şi în vârfurile rădăcinilor secundare de diferite ordine.
• Celulele meristemului primordial sunt deci prezente la nivelul
vârfurilor vegetative, se află în diviziune mitotică continuă şi prin
intermediul lor se realizează creşterea regulată în lungime a
organelor care le posedă.
• Celulele meristemului primordial sunt lipsite de orice specializare
funcţională în afară de capacitatea de diviziune;
Meristemele
• II- meristeme primare - derivă din meristemele primordiale, prin
organizarea celulelor sub formă de straturi şi cordoane specifice
foiţelor histogene, de la care se dezvoltă ţesuturile specializate.
• La exterior se află tunica, alcătuită din câteva straturi de celule care
se divid predominant anticlinai (planurile de diviziune formează
unghiuri drepte cu suprafaţa), iar în interiorul domului meristematic
se află corpusul, la nivelul căruia celulele se divid atât anticlinai cât
şi periclinal (planurile de diviziune sunt paralele cu suprafaţa), sau în
planuri diferite.
• Prin diviziunea celulelor tunicii se realizează creşterea în suprafaţă,
iar prin diviziunea celulelor corpusului se realizează creşterea în
volum, fapt ce determină şi forma bombată, de dom, a meristemelor
primare caulinare.
• Sub domul meristematic se diferenţiază cordoane de celule care se
divid periclinal, alcătuind procambiul, din care se vor dezvolta
ţesuturile mecanice şi cele conducătoare.
• O categorie aparte în cadrul meristemelor primare o constituie
meristemele adventive, caracterizate prin localizarea în situsuri
nespecifice, ca de exemplu pe frunză, pe internod, pe rădăcină, etc.
 Sectiune Ţesuturile inoculate pe medii aseptice, de
longitudinala regulă, diferenţiatemorfofuncţional, trebuie
prin meristemul să se dediferenţieze, fenomen ce se petrece
apical în etapesuccesive, până la reîntoarcerea lor
la starea de meristem primar, respectiv
neoformarea de meristeme.
Fenomenul de dediferenţiere celulară se
produce şispontan, de exemplu în cazul
iniţierii unor meristeme, sau al genezei de
rădăcinisecundare din celulele periciclului
radicular.
Dediferenţierea celulelor inoculate in
vitro poate consta în formarea de calus,
dediferenţiere primară, din care se poate
ajunge la un stadiu de dediferenţiere
secundară, când o parte din celulele
calusului se transformă în meristeme,
generatoare de rădăcini sau tulpini.
Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro
constituie o condiţie a formării de
promeristeme şi de iniţiere a organogenezei.
În cultura de meristeme, meristemul este
prelevat împreună cu două primordii foliare
subiacente acestuia.
Meristemele
• III- meristeme secundare - numite astfel deoarece ele nu iau naştere
din meristemul primordial sau primar, ci din ţesuturi parenchimatice
definitive, ale căror celule redobândesc capacitatea de a se divide,
redevenind meristematice.
• Meristemele secundare, sunt de două tipuri, cambiul şi felogenul si
asigură creşterea în grosime a tulpinii şi rădăcinii la speciile
lemnoase, capabile de îngroşări secundare.

• IV- meristeme neoformate - sunt meristeme de tip special, formate

prin dediferenţierea unor celue specializate funcţional, sub influenţa
condiţiilor artificiale de creştere “in vitro”.
• În evoluţia in vitro a explantelor meristematice, un rol important îl
are stadiul de dezvoltare al primordiilor. Primordiile florale recoltate
în faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transformă
în floare. Adeseori, funcţie de specie, la nivelul învelişurilor florale se
poate induce neogeneza de formaţiuni meristematice adventive.
 Caracteristicile structurale ale
meristemelor
• Celulele meristematice deţin caracteristici
structurale particulare, ce le conferă capacitatea de
a se menţine într-o continuă stare de proliferare,
cum ar fi:
• -au pereţii celulari subţiri, celulozici, nemodificaţi
secundar;
• -sunt bogate în citoplasmă,
• au mitocondrii numeroase, nucleul este mare,cu
nucleoli bine reliefaţi;-
• vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi.
• În raport cu celulele parenchimatice sau cu cele
prozenchimatice, celulele meristematice sunt
mici, strâns unite între ele, fără spaţii intercelulare.
Clona vegetala
• Clona reprezintă totalitatea descendenţilor unui individ unic,
multiplicaţi în absenţa procesului fecundării, identici atât între ei cât
şi cu individul de origine.
• Izolate din conexiunile morfo-funcţionale stabilite la nivelul
organismului intact şi cultivate "in vitro” pe medii artificiale, în
condiţiile asigurării unui supliment hormonal adecvat şi a unui regim
optim de lumină şi temperatură, meristemele aplicale şi axilare
manifestă un potenţial regenerativ pronunţat, permiţând
multiplicarea clonală rapidă a multor specii de plante.
• Culturile de meristeme constau din detaşarea unei porţiuni
meristematice de la nivelul vârfului de creştere şi inocularea
acesteia pe un mediu nutritiv, în condiţii aseptice, în vederea
regenerării de plante.
• Uneori explantul este de dimensiuni reduse, (0,1 - 0,2 mm),
constând numai din domul apical, ca în cazul culturilor de meristeme
propriu-zise, sau poate cuprinde şi una sau mai multe primordii
foliare din regiunea subapicală sau chiar o porţiune de laăstar, şi în
acest caz culturile se numesc de apexuri meristematice.
Masivul de celule care
alcătuieşte meristemul
apical se apreciază că
măsoară maximum 500 µ
(Margara, 1982) sau altfel
spus, cca 0,1 mm diametru
şi 0,25-0,30 mm lungime
(Kartha, 1981).
În cazul în care se
depăşeşte
aceastădimensiune, vorbim
despre o cultură de apex.
Etapele
succesive ale
explantarii
unui meristem
• Meristemul caulinar terminal este localizat
în vârful ramurilor şi deregulă, este protejat în
mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.
• Mugurele este constituit dintr-un ax, în
apexul căruia se află meristemul. Prin
diviziunea continuă a meristemului rezultă
celule care, pe măsură ce seîndepărtează de
apex se diferenţiază funcţional. Celulele
externe ale masivului tisular (numit con de
creştere sau vârf vegetativ) se pliază, iar
protuberanţele rezultate constituie primordiile.
Cu timpul, primordiile se diferenţiază
în primordii foliare sau florale.
• De regulă, în primordiile florale se produce
ocreştere a intensităţii ratei de multiplicare
celulară, aceşti muguri devin mai bombaţi,
mai voluminoşi. Celulele din zona centrală se
diferenţiază în xilem, floem şi ţesut
parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre
periferia mugurelui, se întâlnesc primordii
transformate fie în frunzuliţe, din ce în ce mai
mari, fie în boboci, respectiv în componente
florale.
• Mugurii şi bobocii au capacitate
regenerativă ridicată, graţie faptului că
deţin ţesuturi tinere, slab diferenţiate şi
celule meristematice.
Apexurile meristematice
• Capacitatea de creştere nelimitată "in vitro” a apexurilor
meristematice nu se limitează numai la elongarea rapidă a
lăstarului preformat, ci, în funcţie de suplimentul hormonal
administrat în mediul de cultură, se poate realiza neogeneza
de lăstari suplimentari pe termen lung, capacitatea
proliferativă a acestor culturi fiind practic nelimitată.
• În prezent culturile de meristeme reprezintă cea mai extinsă
utilizare a tehnicilor “in vitro”, atât în scopul multiplicării
rapide şi conforme a materialului biologic valoros, deci al
obţinerii de mericlone, cât şi al obţinerii de plante libere de
virusuri.
Aspect histologic
prin apex
Culturi de apexuri caulinare
Aplicațiile culturii de meristeme
• Prin intermediul culturii de meristeme – apicale, terminale sau
laterale,se poate realiza o rapidă multiplicare clonală a
plantelor, îndeosebi a celor horticole şi a unor specii silvice.
• Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obţine o regenerare de
plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă
donatoare, fapt deosebit deimportant în horticultură, asigurându-
se astfel o multiplicare clonală.
• Un alt aspect, foarte important, care derivă din înmulţirea
meristematicăa plantelor, este acela al obţinerii de material
săditor sănătos, în ţesuturile căruia este prevenit orice fel de
atac fitopatogen.
• Plantulele generate in vitro din meristeme, însoţite numai de
prima pereche de primordii foliare, sunt libere de viroze, deosebit
de păgubitoare şi imposibil de evitat şi de combătut în
condiţiile înmulţirii vegetative a plantelor.
• Numai propagarea plantelor prin seminţe poate asigura, într-o
oarecare măsură, eradicarea parţială, temporară, a virozelor, ştiut
fiind faptul că, chiar şi prin seminţe se transmit o serie de viroze.
• Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi şi căpşun, înfloricultură şi în
arboricultură, întrucât reduc vigurozitatea plantelor, scad potenţialul productiv al acestora,
producţia realizată este mediocră şi produseleagricole au un grad înaintat de depreciere a
calităţii lor. Butaşii obţinuţi din plante virozate au o capacitate redusă de înrădăcinare şi
realizează un procentscăzut de prindere. Pe de altă parte, din cauza menţinerii în cultură a
unor plantevirozate se creează pericolul transmiterii virusurilor şi la alte plante,
prinvectorii biologici prezenţi în cultură.
• Până în jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zisă de meristeme nu era cunoscută, abia
începând din anul 1949, prin lucrările lui Wetmore şi Morel s-au pus bazele cercetărilor
sistematice privind cunoaşterea reacţiei explantelor meristematice la condiţii de cultură,
precum şi cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de
diferite dimensiuni, cultivate în condiţii variate de mediu.
• Din păcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot îmbolnăvi tot atât de
repede ca şi oricare altă plantă. De regulă, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigură
multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin minibutaşi, sau se induce formarea de colonii
de propagule, sau se constituie o plantaţie mamă, donatoare de meristeme ori chiar de
butaşi, plantaţie executată în condiţii speciale de protecţie, încât plantele să fie ferite de
atac zoopatogen.
• Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante
meristematice, asigură şi eliminarea din materialul săditor a fungilor şi a bacteriilor.
Astfel, la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de infecţii cu Fusarium roseum, iar
la Pelargonium şi Diffenbachia eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).
• Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de înmulţire
meristematică (Martin, 1977). De exemplu, la cartof, virusul X poate fi
înlăturat, prin înmulţire meristematică, numai în procent de 1%. Unele
virusuri pot exista chiar şi în meristemele apicale (Hollings, 1962).
• Termoterapia vine în ajutorul culturilor de meristeme pentru a
completametodele de combatere a infecţiilor virale, la plante.
• Aceasta constă în supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse
între 35-39ºC, timp de 2-4 săptămâni. În cursul aplicării termoterapiei
virusurile nu se multiplică; ele rămân la nivelul celulelor în care au fost
surprinse în momentul declanşării tratamentului termoterapeutic.
• Combinând cultura de meristeme cu termoterapia se realizează, cu
şanse foarte mari de reuşită, eliminarea virusurilor din plantele generate
in vitro. În consecinţă, mersitemele sunt prelevate de la plante supuse,
prealabil explantării,tratamentului termoterapeutic.
• Explicaţiile privind modul în care celulele meristematice rezistăinfecţiilor
înclină spre justificări de ordin molecular. Una din ipoteze susţine că
există o competitivitate între celula gazdă şi parazit, în ceea ce priveşte
utilizarea unor enzime implicate în procese de restituţie; altă ipoteză,
susţine că celula meristematică utilizează ARN viral, sau că substanţele
generate în urma traumatizării celulelor ar suprima virusurile prezente în
celule.
• În 1959, Martin a intuit posibilitatea creării unei bănci cu explante, în
care să fie conservat materialul biologic meristematic sănătos.
• Prin această tehnică, astăzi, materialul vegetal generat in vitro este
uşor conservat, ţesuturile deţinând nealterată, întreaga lor
capacitate regenerativă.
• Valoarea mare a culturii de meristeme constă deci în:
• -asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor, generat in
vitro;
• -eliminarea agenţilor fito sau zoopatogeni;
• -creşterea la maximum a coeficientului de multiplicare, în cel mai
scurt timp, a unui exemplar vegetal;
• -obţinerea unui material săditor juvenilizat, imposibil de realizat prin
metode tradiţionale de înmulţire vegetativă;
• -conservarea prin temperaturi scăzute a inoculilor meristematici,
pentru o lungă perioadă de timp, într-o anumită fază de dezvoltare,
pentru a avea un stoc permanent, ce să asigure, oricând, necesarul
de material săditor solicitat pe piaţă;
• -conservarea germoplasmei în bănci de gene.
• În extinderea rapidă a acestor practici, în regim industrial a
predominat factorul economic rezultat, în primul rând, din aspectele
fitosanitare, respectiv din obţinerea unor culturi viguroase,
sănătoase.