Cultivarea virusurilor

Structur

foarte simpl
Ageni acelulari:
Segmente

de acizi nucleici
nveli proteic protector
sunt

adaptate la un parazitism
obligatoriu intracelular (nu exist medii
acelulare pe care putem cultiva virusuri)
se pot dezvolta doar n celule vii

Schema de diagnostic n bolile

virale
I.
II.

Diagnostic virusologic
Diagnostic serologic

Diagnostic virusologic
1. Recoltarea produselor
patologice

preparate
microscopice (ME)
se pot detecta Ag
virale IF, metode
imunoenzimatice, alte
procedee

2. Izolarea virusului

inocularea pe unul din

sistemele celulare vii
urmrim dezvoltarea
virusului
identificarea virusului

Diagnostic serologic
se

recolteaz dou probe de ser

prima prob odat cu produsul patologic
A doua prob la 7 -14 zile interval
Se urmrete creterea n dinamica titrului
anticorpilor specifici

Sisteme celulare care asigur

dezvoltarea i cultivarea virusurilor:

animale de experien

oul de gin embrionat

culturi de celule

Animale de experien
apariia

semnelor de boal
leziunile care apar n esuturile afectate:
preparate colorate
incluzii virale = formaiuni rotunde-ovalare
situate n nucleul celulelor parazitate de virus
sau al citoplasmei
uneori au importan diagnostic
incluziile Babe-Negri n citoplasma
neuronilor infectai cu virusul rabic
detectarea anticorpilor specifici

Inocularea pe animale a permis

izolarea:
virusului

poliomielitei maimu
virusurilor gripale inoculare intranazal la
oarece nou-nscut
virusul Coxsackie A oarece nou-nscut
virusul rabic, arbovirusuri intracranian la
oarece nou-nscut

Virusul Coxsackie A,B virus cu ARN (fam.

Picornaviridae)

inoculare subcutanat n regiunea cefei la oarece

nou-nscut a unei mici cantiti mici de produs
patologic (LCR)
v.coxsackie A oarecele moare ntr-o
sptmn paralizie flasc leziuni n
musculatura striat (degenerarea musculaturii,
fenomene de miozit)

Pe seciuni din musculatur, colorate HE alterarea

structurii normale a musculaturii striate

v.coxsackie B leziuni n principal la nivelul SN;

oarecii mor cu paralizie spastic leziuni i n
pancreas, ficat

Oul embrionat
= sistem celular nchis, steril; sunt celule tinere
n dezvoltare, nu gpsim dezvoltate
mecanismele de aprare umoral i celular
inoculare din anii 1930
v. gripale (metod de elecie)
v. urlian

Dezvoltarea virusurilor pe oul embrionat

- urmrim viabilitatea embrionului
- v. variolei se urmrea apariia pe
membrana corioalantoidian a unor mici
leziuni de culoare alburie
- v. gripale:

nu omoar embrionul
incubare 48 ore la frigider 18 ore
se taie un cpcel n dreptul camerei de aer
se absorb lichidul alantoidian i lichidul amniotic
n acele lichidese cut prezena virusului gripal
prin reacia de hemaglutinare (HA)

Reacia de hemaglutinare
diluii

din lichidele embrionare (1/4, 1/8,

1/16, 1/32, ... )
suspensii de hematii de coco
1 or la temperatura camerei (TC)
dac exist v. gripal aglutinarea
hematiilor

 identificarea

virusului hemaglutinant prin

reacia de hemaglutinoinhibare (HI)

Se

folosesc anticorpi antigripali cunoscui

dac

agentul hemaglutinant este virusul

gripal, anticorpii s-au fixat pe suprafaa
virusului, deci virusul nu mai aglutineaz
hematiile (se depun ca un buton)

Culturi de celule
= sisteme celulare vii care permit izolarea

virusurilor n laborator
introduse n practica de laborator n 1949
Tipuri de celule:
culturi

primare
culturi de celule diploide
linii celulare

culturi de celule dezvoltarea virusurilor

1. ECP (efect citopatic)

citocid (cu moartea celuleor infectate de virus)

picornavirusuri

sinciial (celulele fuzioneaz apar mase gigante

multinucleate) paramyxovirusuri, virus
respirator sinciial

agregare (celulele formeaz palcarde)

adenovirusuri

transformarea tumoral a celulelor virusurile

oncogene, retrovirusuri

minim detecatrea virusului prin IF, HA, HAI

fr modificri v. rubeolei

2.Incluzii
nucleu v. herpetice, adenovirusurile
citoplasm v. turbrii, poxvirusurile
nucleu i citoplasm v. rujeolei, v.
citomegalic
3. Hemaglutinare

4. Hemadsorbie: adsorbia hematiilor pe

suprafaa celulelor n care se multiplic
virusul
5. Imunofluorescena
6. Interferena prin acest fenomen se pune
n eviden virusul rubeolei
se adaug un virus despre care tim exact
ECP dac al 2-lea virus nu mai produce
efect citocid nseamn c n celulele
respective s-a multiplicat v. rubeolei

Identificarea virusurilor
1. Reacia de hemaglutinare (HA),
hemaglutinoinhibare (HI)
HI confirm i identific varianta de virus
izolat

 Reacia

HI i n diagnosticul serologic
(pentru depistarea Ac specifici)
dg. serologic, totdeauna lucrm probe
perechi de seruri: o prob ct mai aproape de
debutul bolii, serul se congeleaz pn la
recoltarea celei de-a 2-a probe la 7 zile de la
prima prob
ambele probe se lucreaz n aceeai zi, cu
acelei materiale

2. RFC

pentru identificarea virusului

mai ales pentru dg. serologic
tehnica Bradstreet-Taylor (pe plci cu godeuri)
tehnic la rece:
Dup ce se pun n contact diluii de ser de bolnav +
Ag + C' (prin titrarea C' n tabl se ah se titreaz
concomitent C' i hemolizina) 18 ore / 4 C
+ sistem hemolitic (hematii de oaie + hemolizin) =
sistem Ag-Ac cu rol de indicator

3. Seroneutralizarea (SN)
reacie

laborioas (rar n laborator)

pentru unele picornavirusuri (v. poliomielitei)
= neutralizarea infectivitii virale de ctre Ac
specifici antivirali astfel nct aceste
complexe Ag-Ac nu mai permit:
producerea infeciei la animale
infectarea oului embrionat
infectarea culturilor de celule

4. IF pentru detectarea Ag din culturi de celule

sau produs patologic i pentru detectarea Ac
din ser
5. Metode imunoenzimatice pentru
depistarea infeciei HIV confirmarea
infeiei HIV prin alte procedee (Western blot)
6. Imunodifuzia n gel (CIEF) HBV