HISTOCHIMIE SI HISTOENZIMOLOGIE

METODA FROTIURILOR
realizeaz intinderea celulelor n monostrat pe o lamel de sticl. Pot fi examinate : 1. celulele sangvine 2. celulele epiteliale descuamate sau exfoliate 3. sedimentele celulare 4. amprente de esuturi sau organe parenchimatoase
se
2

TIMPII
recoltare ntindere:

sticl lama portobiect cea pe care se efectueaz frotiul lama executoare cu care se ntinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45. uscare

se folosesc dou lame de

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

pentru colorarea frotiului sangvin.

May-Grunwald conine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic i glicerin neutr 2. solutia Giemsa contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra
1. solutia
4

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

Frotiul trebuie sa fie : subire cu un singur strat de celule ntins uniform ambele margini pe lama se termin n franjuri pe lam , ocupnd cca. 2/3 din aceasta la margine se scrie numele pacientului sau un nr. de ordine
5

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM REZULTATE nuclei violet citoplasmele agranulocitelor albastru citoplasmele granulocitelor roz granulaii: neutrofile rou- violet bazofile albastru nchis spre negru eozinofile rou portocaliu
6

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

HISTOCHIMIA
interpretarea

biochimic a celulelor sau esuturilor n raport cu oranizarea lor celular.

PRINCIPIU Se bazeaz pe afinitatea pe care o au unii colorani pentru anumite grupri chimice pe care vrem s le localizm.
10

HISTOCHIMIA
Substanele

chimice celulare i tisulare se identific prin reacii chimice care duc la obinerea de compui colorai , insolubili i observabili la M.O. analiz

HISTOFOTOMETRIA =

cantitativ, n funcie de intensitatea culorii

11

Conditiile minime necesare unei reactii histochimice

substana analizat s se conserve in situ , fixarea utilizat trebuie s conserve structura celulei i s mpiedice deteriorarea componentelor celulare metoda folosit trebuie s fie specific pentru substana sau gruprile chimice care vor fi examinate.
12

Conditiile minime necesare unei reactii histochimice

produsul

de reacie - insolubil previne dispersia sau difuzia produsului de reactie colorat permite examinarea

reactivul

histochimic trebuie s fie

13

specific.

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
monozaharide

solubile
oligozaharide polizaharide

- libere sau combinate

cu proteine

14

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
METODA PAS

( per-iodic acid

Schiff) METODA CU CARMIN AMONIACAL BEST BAZOFILIA METACROMAZIA

15

METODA PAS
evidenierea

glicogenului, GAG, glicoproteinelor si glicolipidelor.

PRINCIPIU

grupri glicol oxidare cu acid periodic grupri aldehidice + cu reactivul Schiff precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.
16

METODA PAS- GLICOGEN

specificitatea

metodei depinde de pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei salivare. Se consider c structurile colorate PAS care dispar n urma pretratamentului cu amilaz conin glicogen
17

METODA PAS

18

CARMIN AMONIACAL BEST

evideniaz glicogenul - polimer cu solubilitate redus n ap . Daca fixarea lui nu este prompt, enzimele hidrolitice l descompun n glucoz care este foarte solubil n ap i difuzeaz. REZULTATE : granule roii n citoplasm
19

CARMIN AMONIACAL BEST

20

BAZOFILIA
proprietatea

substanelor glucidice de a se colora cu colorani bazici de tipul albastru alcian i albastru de metil. fi utilizat i pentru evidenierea lipidelor i proteinelor cu caracter acid

poate

21

ALBASTRU DE METIL

22

METACROMAZIA
Capacitatea

unui substrat de a se colora ntr-o alt culoare dect cea a colorantului.

PRINCIPIU:

- existena unor grupri anionice aflate la o distan foarte mic una de alta formnd agregate cu proprieti de absorbie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate.

23

METACROMAZIA

24

HISTOCHIMIA LIPIDELOR
PRINCIPIU: colorantul trebuie s fie mai solubil n lipide dect n propriul solvent

SUDANOFILIA Colorani Sudan : III rou-portocaliu IV rou B negru BB albastru

25

COLORAII SUDAN

26

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
detecteaz

structura primar a

proteinelor
Reacii

nespecifice proteinele celulare i tisulare sunt identificate pe seama aminoacizilor Reacii specifice folosite pentru identificarea heteroproteinelor
27

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reacii nespecifice
Tirozina Reacia MILLON Arginina Reacia SAKAGUSHI pentru studiul distributiei proteinelor bazice in nucleu Triptofan

28

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice

folosite pentru identificarea heteroproteinelor de ex. nucleoproteinele care se evideniaz pe seama acizilor nucleici.

1. Metoda

FEULGEN 2. Bazofilia 3. Metoda BRANCHET

29

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice

METODA FEULGEN

Molecula AND hidroliza acida dezoxiriboza + reactiv Schiff precipitat rou-violaceu

30

METODA FEULGEN

31

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice

METODA BRANCHET( verde metil-pironin)
cercetarea

bazofiliei dat de acidul fosforic din structura acizilor nucleici

de metil are afinitate pentru ADN-ul nuclear pe care l coloreaz n verde pironina ARN-ul nucleolar si citoplasmatic, pe care l coloreaz n rou
verde

32

HISTOCHIMIA ENZIMELOR

evideniaz localizarea i activitatea enzimelor.

PRINCIPIU:

- reacii chimice care au ca rezultat un compus

colorat i insolubil. In cazul n care produsul rezultat este solubil , se insolubilizeaza printr-o reacie de CAPTUR.
33

ETAPELE OBINERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC

recoltarea fixarea prin congelarea rapid la temparaturi foarte joase secionarea incubarea ntr-un mediu care ofer enzimei conditii ct mai apropiate de cele n vivo. montarea se realizeaza n mediu hidrosolubil glicerina sau sirop Apathy

34

REACII CITOENZIMOLOGICE
PEARSE- evideniaz dehidrogenazele METODA GMRY ( captura de ioni metalici)- evidentierea hidrolazelor
METODA

35

METODA PEARSE
peroxidaze Succinatdehidrogenaz

APLICAII PRACTICE - SDH enzima marker a mitocondriilor

36

METODA PEARSE

37

METODA GMRY( captura de ioni metalici)

pentru

evidentierea fosfatazelor

PRINCIPIU
o

reacie de precipitare a acidului fosforic eliberat de enzim de la nivelul substratului

38

METODA GMRY
Compusul rezultat din aciunea enzimei reacioneaz cu: sulfura de amoniu pentru a produce un precipitat negru sulfura de cobalt pentru hidrolaza alcalin sulfura de plumb pentru cea acid

39

METODA GMRY
APLICAII PRACTICE - evidenierea fosfatazei alcaline enzim cu rol de transport

40

METODA GMRY

41

42

43