Imunologie LP 7

Tehnica Western-Blot (WB)

Tehnica Western-Blot (Imunoblot sau imunoamprente) este una din metodele moderne,
care are ca principiu:
- separarea prin electroforeză a proteinelor după greutatea lor moleculară, prin SDS – PAGE,
-apoi transferarea lor pe o membrană de nitroceluloză sau nylon şi
-detectate cu anticorpi marcaţi radioactiv sau enzimatic, prin autoradiografie, respectiv
colorimetric.

În general, identificarea imunoenzimatică este de elecţie, oferind avantajele sensibilităţii,

stabilităţii reactivilor, facilităţii în manipulare şi interpretare şi accesibilităţii economice

Tehnică
Etapele prin care se efectuează metoda sunt următoarele:

1. Separarea proteinelor prin electroforeză într-un gel de poliacrilamidă, în prezenţă de

sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE).
PAGE=POLIACRILAMID GEL ELECTOFOREZA
SDS= SODIUM DODECIL SULFAT
Pentru electroforeză, sunt folosite gelurile de poliacrilamidă, concentraţia gelului
depinzând de dimensiunea proteinelor ce urmează a fi separate (cu cât greutatea moleculară a
acestora este mai mică, cu atât concentraţia de acrilamidă este mai mare şi porozitatea gelului
descreşte). Poliacrilamida este inertă chimic, transparentă şi stabilă la variaţii mari de pH, precum
şi la variaţia temperaturii şi a forţelor ionice.
Cel mai eficient şi mai utilizat agent denaturant este sodiu dodecil sulfat (SDS), un
detergent anionic, ce disociază proteinele în subunităţi şi se combină cu lanţurile polipeptidice.
Excesul de sarcini negative furnizat de SDS anulează sarcinile electrice individuale ale lanţurilor
polipeptidice.
În acest mod se anulează efectul formei şi încărcăturii electrice ale proteinei în migrarea
electroforetică, separarea realizându-se în funcţie de greutatea moleculară individuală a
proteinelor din amestecul de testat.

1
2
 Gelul este pus într-o cuvă cu tampon de migrare, ai cărei electrozi sunt cuplaţi la sursa de
curent continuu. Migrarea se opreşte în momentul în care albastrul de bromfenol din tamponul în
care probele au fost solubilizate a ajuns la limita inferioară a gelului.

2. Transferul proteinelor pe membrană

Proteinele separate sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză prin difuzie,
electroforeză sau afinitate. Proteinele transferate sunt fixate pe folii de nitroceluloză prin absorbţie
pasivă. Cea mai utilizată, este metoda transferului electroforetic pe membrana de nitroceluloză, ce
prezintă avantajul rapidităţii şi al minimalizării difuziunii laterale a proteinelor.

La sfârşitul electroforezei, se deconectează sursa de curent şi se dezasamblează cuva de

electroforeză. Se începe asamblarea casetei de transfer, în care toate componentele se dispun pe
rând (o folie de burete subţire, 2 hârtii de filtru de 3 mm, gelul, membrana de nitroceluloză, alte 2
hârtii de filtru şi o folie de burete). Se închide caseta de transfer şi se plasează într-o cuvă umplută
cu tampon de transfer rece. Cuva este conectată la sursă şi transferul durează între 1 şi 24 de ore
în funcţie de voltajul aplicat şi sistemul folosit.
Odată transferul încheiat se desface caseta şi membrana este dispusă într-o cuvă de plastic,
într-un tampon de saturare, pentu a bloca situsurile de legare nespecifică şi pentru a îndepărta
excesul de SDS.
Blocarea se poate realiza timp de 2 ore la temperatura camerei sau la 40C peste noapte.
Membrana este tăiată apoi în benzi longitudinale de 4-5 mm grosime.
3. Detecţia imunoenzimatică
Fiecare bandă de nitroceluloză este incubată cu serul de testat, pentru o perioadă adecvată
reacţiei antigen-anticorp (1-2 ore) la temperatura camerei. Urmează un ciclu de 4-5 spălări, iar
complexele antigen-anticorp imobilizate pe membrana de nitroceluloză sunt evidenţiate ulterior

3
cu un conjugat reprezentat de un ser anti-gammaglobuline specifice, cuplate cu o enzimă (ser de
iepure anti-gammaglobulină umană cuplat cu fosfatază alcalină).
Incubaţia cu acest conjugat este urmată de un nou ciclu de 4-5 spălări, ce îndepărtează excesul de
conjugat nelegat.
Vizualizarea benzilor corespunzătore complexelor antigen-anticorp, se realizează prin
adăugarea substratului enzimei, ce va fi descompus de aceasta într-un produs colorat insolubil.

4
 În cazul în care anticorpii din conjugat au fost marcaţi cu izotopi radioactivi, detecţia se
realizează prin autoradiogramă (impresionarea unui film radiologic în dreptul complexului imun).

Evaluarea rezultatelor

Detectie colorimetrica (ELISA)

Chemiluminescenta
Imunoflorescenta

5
Dg. HIV

6
7
8
1. Control pozitv
2. Proba pozitva
3. Test negativ

9
A – control strip showing antibody responses to key HIV proteins

B – Indeterminate response showing antibodies to p24

C – Positive western blot showing responses to at least three key proteins

B: este nevoie de confirmare prin PCR (Polymerase chain reaction)

10