Capitolul V.

Formarea methemoglobinei sub aciunea ionilor nitrii

la oxidarea oxihemoglobinei cu nitrii
Procesele de oxidoreducere n organismele vii sunt unele dintre cele mai importante etape n metabolismul att al substanelor endogene, ct i al xenobioticelor n
organismele vii. Un interes deosebit n acest domeniu prezint hemoproteinele. Funcia
principal a hemoglobinei este fixarea i transportarea oxigenului n organismele vii,
care se realizeaz datorit prezenei Fe2+ din molecula hemului. Legtura moleculei de
O2 cu hemoglobina nu este stabil. Structura teriar i cuaternar a hemoglobinei rapid i ncontinuu oscileaz ntre conformaia oxi- i dezoxi-formei. n rezultatul acestor
oscilaii conformaionale este posibil ndeprtarea moleculei de O2 i trecerea HbO2
n Hb [356]. Forma oxigenat a hemoglobonei se afl ntr-un echilibru dinamic cu
dezoxiforma, care n anumite condiii poate fi antrenat n reacia de methemolgobinizare. Fixarea reversibil a oxigenului poate fi realizat numai de atomul de fier bivalent. n acest proces fierul rmne n starea de oxidare Fe2+, astfel hemoglobina este
oxigenat i nu oxidat; n rezultat, se formeaz oxihemoglobina (HbO2). Hemoglobina
sau dezoxihemoglobina (Hb) i (HbO2) au proprieti diferite.
Sub aciunea diferiilor oxidani n rezultatul proceselor de oxidoreducere se formeaz methemoglobina (MetHb), forma oxidat a hemoglobinei n care Fe2+ s-a oxidat
n Fe3+; astfel, MetHb i pierde funcia de transport a O2. De regul, n snge se menine o concentraie constant de MetHb n limitele de la 1-5% [331]. Dar, sub influena
xenobioticelor ce ptrund n snge, concentraia MetHb crete considerabil, ajungnd
n unele cazuri pn la 70% [332,333]. n rezultatul acestor procese n organism se provoac o hipoxie, ceea ce duce la diferite procese patologice.
n literatura de specialitate sunt descrise grupe de compui care duc la formarea
MetHb, dintre care fac parte diferite xenobiotice. Un rol deosebit n formarea MetHb
revine nitrailor i nitriilor, oxizilor de azot, care ptrund pe diferite ci n organismul
uman: cu produsele alimentare, apa, aerul. Ionii nitrai i nitrii sunt indispensabil legai
ntre ei n circuitul natural al azotului, dar, datorit activitii chimice nalte a nitritionului, ei se gsesc n concentraii mici n mediul nconjurtor. Astfel, prima etap la
intoxicarea cu nitrai este reducerea lor la ioni nitrii.
Cunoaterea mecanismelor reaciilor dintre hemoglobin i diferii methemoglobinizani st la baza elaborrii metodelor de inhibiie mpotriva oxidrii hemoglobinei.
V.1. Mecanismele de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitrii i alte xenobiotice
Oxidarea HbO2 cu ioni nitrii este un proces alctuit din dou etape [334]: etapa
lent (perioada-lag) i etapa rapid, autocatalitic. Curbele cinetice sunt reprezentate
prin forma S. Trebuie de menionat c procesul de oxidare a formei oxigenate a HbO 2
i a Hb cu nitrii este diferit. n rezultatul studierii oxidrii Hb cu ioni nitrii n condiii
anaerobe s-a obinut un amestec de MetHb i nitrozohemoglobin (HbNO) [335].
n condiii anaerobe la interaciunea NaNO2 cu Fe(II) n mediu acid are loc generarea
NO [335]. Astfel, formarea HbNO este precedat de oxidarea Hb cu NO2- cu formarea
145

de MetHb i NO, iar ultimul n continuare se asociaz cu Hb i formeaz HbNO.

Curbele cinetice de consum a Hb n prezen de NO2- n condiii anaerobe nu se mai
prezint sub form de S, ca pentru condiiile aerobe. Stadiul-limit la interaciunea
HNO2 cu Hb este formarea MetHb i NO, iar a doua etap (asocierea Hb cu NO) este
rapid [335,336].
Oxidarea Hb n MetHb se realizeaz n rezultatul transferului de pe ultimul strat
al 3-d electronului de la fierul hemului. Pentru ca transferul electronului s se realizeze,
e necesar apropierea particulelor pentru interaciunea orbitalului-donor al reductorului Fe(II) cu orbitalul-acceptor al oxidantului NO2-. n cazul cnd a asea poziie coordinativ a fierului nu este ocupat de ligandul O2, are loc, probabil, o interaciune efectiv a orbitalului-donor al Hb cu orbitalul acceptor al NO2. Transportul 3d-electronului pe orbitalul molecular duce la formarea radicalului NO22-, care n continuare se
poate descompune n anionul NO- i O22- [337].
Formarea H2O2 la protonarea anionului peroxid O22-i interaciunea cu NO- poate
duce la generarea oxidului de azot(II). Oxidul de azot format poate interaciona cu
deoxyHbFeII (k = 2.5107 M-1s-1) [338-339]:
deoxyHbFeII + NO HbFeIINO
(V.1)
V.1.1. Procese de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitrii
n studierea mecanismului de oxidare a HbO2 cu ionul nitrit este destul de important rolul O2. Unul dintre mecanismele de oxidare a HbO2 cu NaNO2 propus n [340]
include eliminarea oxigenului, dar n cantiti nensemnate:
HbO2 + NaNO2 MetHb + NaNO3 +1/2 O2
(V.2)
De rnd cu procesul normal de eliminare a O2 n organismele vii permanent are
loc i o autooxidare a HbO2 n MetHb:
HbO2
MetHb + O2
(V.3)
Din reacia de mai sus observm c are loc generarea radicalului anion-superoxid
(O2) ce posed proprieti paramagnetice. Acest radical a fost detectat n sistemul
HbO2-NaNO2 prin metoda RMN. Concentraia maximal a centrelor paramagnetice se
mrete cu creterea concentraiei de hemoglobin, iar la sfritul reaciei aceste particole de O2 dispar.
Pentru a stabili prezena radicalului O2 n sistemul HbO2-NaNO2, s-a utilizat metoda inhibitorilor ce include introducerea n sistemul dat a enzimei (superoxiddismutaza).
n rezultat, s-a observat efectul inhibitor n oxidarea HbO2, ceea ce demonstreaz c
O2 particip n procesul de formare a MetHb. ns, participarea O2 n mecanismul de
oxidare a HbO2 cu NO2- este prezentat diferit. Unii autori consider c O2 oxideaz
Fe(II) din HbO2 cu formarea H2O2, alii afirm c O2 nu este un oxidant direct al HbO2,
dar este necesar n autocataliz. Aceast deducere este confirmat prin faptul c superoxiddismutaza i manifest aciunea inhibitoare anume n stadiul autocatalitic.
n procesul de oxidare a HbO2 cu NO2- un rol important i revine anume oxigenului din molecula hemoglobinei, care este ca un autocatalizator n acest proces. Autorii
lucrrii [336] nainteaz presupunerea c n rezultatul proceselor de oxidoreducere la
146

interaciunea NO2- cu O2 are loc generarea oxidului de azot. O astfel de direcie a procesului este asigurat de potenialele de oxidoreducere ale NO2- i O2, care alctuiesc
+0,99 i -0,33 V, corespunztor.
Un alt factor important n mecanismul de oxidare a HbO2 este formarea NO2 n
stadiul de iniiere a procesului de oxidare. Formarea acestui radical n sistem a fost
stabilit prin utilizarea aminelor (anilina), care inhib procesul de oxidare a HbO2, datorit formrii N-nitrozoaminelor cu NO2-. Mecanismul ion-radicalic include formarea
NO2-, care n continuare duce la propagarea procesului dat:
HbO2 +NO2- MetHb + O22- + NO2
(V.4)

HbO2 + NO2 MetHb + O2 NOO

(V.5)
O2 NOO- + O22- NO2- + 2O2
(V.6)
2+

O2 + 2H NO2
(V.7)
Un intermediar important n procesul de oxidare a HbO2 cu NO2 este H2O2, care
se formeaz n rezultatul dismutaiei O2 [336]. S-a constatat c influena H2O2 asupra
reaciei de oxidare a HbO2 cu NO2- depinde de [NO2-]0 i [H2O2]0.
n literatur sunt mai multe opinii despre rolul H2O2 n sistemul HbO2-NaNO2,
dintre care dou sunt mai principale: 1) interaciunea direct a H2O2 cu ionul nitrit;
2) interaciunea H2O2 cu intermediarii obinui n procesul de oxidare a HbO2.
Cercetrile efectuate [344] relev c la interaciunea H2O2 cu MetHb se formeaz
un intermediar supraoxidat (HbIV=O). Concentraia lui este mic i de aceea nu poate
fi detectat prin metode optice. Studii efectuate pe diferite modele demonstreaz formarea unui complex intermediar al MetHb i metmioglobinei (MetMb) cu H2O2 i
descompunerea lui ulterioar.
n prima etap a acestui proces are loc oxidarea monoelectronic a MetMb
(Fe(III)Fe(IV)) cu formarea intermediarului. n etap a doua intermediarul format
sufer o reducere monoelectronic cu formarea unui radical, ns starea de oxidare a
fierului nu se schimb. n etapa a treia radicalul format sufer o reacie oxidoreductoare intern, n rezultatul creia Fe(IV) se reduce la Fe(III). Constanta de vitez
a reaciei de oxidare de ordinul doi cu H2O2 pentru o serie de proteune hem este
105 lmol-1 s-1.
Pentru a concretiza rolul H2O2 n procesul de oxidare a HbO2 cu nitrit-ion, s-a
studiat influena catalazei asupra acestui proces. S-a constatat c catalaza inhib procesul de oxidare a HbO2 cu NO2-, ntruct are loc o concuren ntre MetHb i NO2pentru molecula de H2O2, a crei concentraie n sistem depinde de concentraia ionului nitrit.
n baza cercetrilor efectuate de ugalei [341] s-a propus mecanismul ion-radicalic n lan. Principalul produs intermediar, care asigur ramificarea lanului, este H2O2.
Ramificarea i propagarea lanurilor se efectueaz cu participarea radicalului NO2,
care se formeaz la interaciunea H2O2 cu ionul nitrit.

147

n baza rezultatelor cercetrilor mecanismului procesului de oxidare a HbO2 cu

ion nitrit au fost propuse dou scheme [342]:
Schema 1
HbO2 +NO2- + H+ Hb +NO2 + HO2
(V.8)

Hb +NO2 MetHb +NO2

(V.9)
NO2-+ HO2 NO2 +HO2(V.10)
HO2- + H+ H2O2
(V.11)
H2O2 + MetHb
Hb(IV) = O + H2O
(V.12)
+

Hb(IV) = O + NO2 + H MetHb + NO2 + HO

(V.13)
Schema 2
H2O2 + NO2- NO2 + HO +HO(V.14)
HO + NO2- NO2 + HO(V.15)
Mecanismele prezentate n schemele 1 i 2 descriu dou procese extremale de
parcurgere a reaciilor n sistemul HbO2-NO2-. n realitate, n mediul reactant ar putea
avea loc toate reaciile prezentate n ambele scheme.
Aportul reaciilor cu formarea Hb(IV) = O trebuie s creasc odat cu creterea
concentraiei MetHb n sistem. n acelai timp, creterea concentraiei NO2- mrete
aportul reaciilor din schema 2 i mrete viteza de formare a MetHb.
V.1.2. Participarea altor xenobiotice n oxidarea hemoglobinei
Oxidanii hemoglobinei au fost clasificai n dou grupe: 1) ce reacioneaz cu
oxihemoglobina; 2) ce reacioneaz cu dezoxihemoglobina. Din grupa a doua fac parte
compuii nitroaromatici, iar ceilali methemoglobinizani se clasific la grupa nti.
Mecanismul de oxidare a substratului cu diferii methemoglobinizani poate fi diferit:
sub aciunea oxidanilor din grupa nti reaciile parcurg dup mecanisme att n lan
cu ramificare degenerat (NaNO2, N2O4, CH3(CH2)XNO2), ct i dup procesul neramificat (NH2OH, CH3CH2NO2, p-anizidin).
Astfel, procesul de methemoglobinizare n prezena oxidanilor din grupa nti,
prin careva aproximare, se consider o reacie cu participarea fierului bivalent al complexului porfirinic n care unul din liganzi oxigenul molecular posed proprieti
nalt electroacceptoare i, n condiii extremale, poate forma intermediari cu sarcini
separate Hb+O2-.
Reacia de methemoglobinizare este posibil dac n calitate de reageni particip
compui din grupa a doua, care posed o afinitate nalt de electron i sunt n stare
uor s accepte electronul atomului de fier din hem. Astfel de proprieti posed compuii nitroaromatici.
n cazul intoxicaiei cu nitroalcani sintetici i naturali oxidarea HbO2 i a mioglobinei are loc dup un mecanism asemntor cu oxidarea ionilor nitrii. Este stabilit c
n procesul de oxidare particip numai nitroalcanii primari i secundari. Rezultatele
cercetrilor cinetice [343] duc la concluzia c mecanismul de methemoglobinizare sub
aciunea nitroalcanilor este la fel ion-radicalic. O cale mai probabil de formare a

148

MetHb n sistemul dat include iniierea procesului prin oxidarea monoelectronic a

anionului nitroalcanului de ctre HbO2:
R1R2CNO2- + HbO2 R1R2CNO2 + Hb + HO2
(V.16)
n continuare, radicalul format oxideaz o molecul de HbO2 n MetHb i se formeaz HO2-. Anionul HO2- n prezen de H+ formeaz H2O2, care, la fel, interacionnd
cu HbO2, formeaz MetHb. Dar trebuie de menionat c efectul methemoglobinizant al
nitroalcanilor n comparaie cu cel al ionilor nitrii este mai slab. Nivelul concentraiei
de MetHb format in vivo este considerabil mai jos ca n cazul intoxicaiilor cu aceleai
doze de ioni nitrii. Aceast concluzie, bazat pe cercetri experimentale, se explic prin
lipsa ramificrii lanurilor n reacia cu HbO2, participarea particulelor radicalice formate
n biotransformarea nitroalcanilor i prin deteriorarea peroxidic a biostructurilor [343].
Cunoaterea mecanismelor de biotransformare a nitroalcanilor a permis elaborarea
orientat a antidoilor la intoxicarea cu aceti compui. Un efect mai puternic a fost obinut
la utilizarea compuilor care interacioneaz efectiv cu radicalii liberi [343]; astfel, se
ntrerupe procesul patologic de oxidare peroxidic a biostructurilor n starea lor iniial.
n calitate de oxidani ai HbO2 pot participa hidroperoxizii organici, de exemplu
hidroperoxidul de ter-butil (t-BOOH), care se poate forma n organism n procesul de
oxidare lipo-peroxidic. Procesele de oxidare peroxidic a HbO2 cu t-BOOH au loc
prin ruperea homoltic a legturii -O-O- cu formarea radicalilor ter-butoxil (t-BO) i
ter-butil-peroxidic (t-BOO) [344]:
ROOH
HbFe(III)
HbFe(II)
(V.17)
HbFe(III) + ROOH HbFe(III)(-OOR) + H+
(V.18)

+
HbFe(III)( OOR) HbFe(IV) = O + RO Hb Fe(IV) = O + RO
(V.19)
HbFe(IV) = O + ROOH HbFe(III) + ROO + HO(V.20)
Concentraia radicalilor intermediari, generai n celule, a fost nregistrat utiliznd
metoda chemiluminescent [344]. Astfel de radicali ce se formeaz duc la modificaii
oxidative nespecifice n celule i acesta este unul din procesele cele mai periculoase
pentru celul. Efectul toxic al radicalilor liberi n celul a dus la formarea mecanismului de aprare antioxidativ. Produii intermediari supraoxidai ai hemului sunt oxidani
puternici, care pot fi antrenai n oxidarea peroxidic a lipidelor [344]. Radicalii organici
formai la oxidarea HbO2 cu hidroperoxizi organici servesc ca surse de activare a O2,
care n continuare pot participa n reglarea proceselor fiziologice destul de importante.
Rezultatele cercetrilor proceselor de oxidare n celule a HbO2 cu t-BOOH, obinute prin metoda chemiluminescent [344], constat c n continuare formarea produilor duce la:
1) oxidarea peroxidazic rapid a glutationului (GSH)
ROOH + 2GSH ROH + GSSG + H2O
(V.21)
2) oxidarea peroxidic a lipidelor.
La mrimi de pH7,5 n reacia de methemoglobinizare t-BOOH joac rolul de
catalizator la formarea H2O2, ce particip la procesul n lan de oxidare a HbO2. Radicalul HO2, format la etapa de iniiere, la interaciunea cu t-BOOH duce la formarea
H2O2 i a radicalului ter-butil-peroxil.
149

HO2 + t-BOOH H2O2 + t-BOO

(V.22)
Astfel, n sistem crete concentraia peroxidului de hidrogen format i concentraia
de MetHb.
V.2. Metode de inhibiie n procesul de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii
V.2.1. Descompunerea peroxidului de hidrogen
Conform teoriei catalizei metal-peroxidice, oxidarea proteinelor este condiionat
de sisteme specifice electrodonore, care reduc oxigenul molecular pn la H2O2. Peroxidul de hidrogen format n sistemele biologice este privit ca o form stabil a oxigenului activ, care se transport in vivo la distane mari, ceea ce duce la deteriorri grave
ale sistemului departe de locul de generare a radicalilor oxigenului n rezultatul stresului oxidativ.
Peroxidul de hidrogen format n rezultatul disproporionrii O2, ca produs intermediar, n continuare particip la diferite procese peroxidice i astfel are loc ramificarea
lanului n procesul de oxidare a HbO2, provocnd creterea vitezei de methemoglobinizare.
Pentru a inhiba procesul de oxidare a hemoglobinei n sistemul HbO2NaNO2,
este necesar de a nltura H2O2 din acest sistem. Exist diferite ci de diminuare a acestui produs intermediar din sistem. Unul dintre procedee poate fi fixarea H2O2 cu bicarbonatul de sodiu i formarea peroxo-hidrocarbonatului (Na2CO31.5H2O2) [345,371]:
NaHCO3 + H2O2 NaHCO3 H2O2
(V.23)
2NaHCO3 H2O2 Na2CO31,5H2O2 + CO2 + 1,5H2O + 0,25 O2
(V.24)
Factorul de autoaccelerare () se micoreaz odat cu creterea concentraiei
NaHCO3, iar timpul de stabilizare a vitezei maxime de oxidare a hemoglobinei la
creterea concentraiei de NaHCO 3 se atinge la un grad mai nalt de conversie () a
HbO2 n MetHb.
n afar de influena direct a NaHCO3 n procesul de oxidare a HbO2 n MetHb,
menionat mai sus, este posibil i un alt mecanism, legat de formarea bioxidului de
carbon, ce se alipete la gruprile libere NH2 din HbO2. n rezultat, hemoglobina i
micoreaz afinitatea fa de O2:
HbO2
Hb + O2
(V.25)
Deoarece o parte din NaHCO3 la pH 6,65 se transform n H2CO3, n rezultat CO2
format se poate lega cu hemoglobina. Lund n consideraie c predecesorul peroxidului de hidrogen n reacia cu NO2- este numai oxihemoglobina, concentraia de H2O2
format se micoreaz.
Un alt tip de inhibitori care duc la diminuarea H 2O2 n sistem sunt tiolii (cistamina, cisteina, glutationul redus) [346]. n prezena acestor compui are loc reducerea
vitezei procesului de methemoglobinizare n sistemul HbO 2-NaNO2 i diminuarea
factorului de autoaccelerare () de 1,5-2,0 ori.
Deplasarea nensemnat a maximului vitezei (d/d) n direcia creterii gradului
de conversie () odat cu creterea concentraiei tiolilor, la fel ca n sistemul HbO2
NaNO2H2O2 , duce la micorarea concentraiei H2O2 n prezena acestor inhibitori.
150

Constantele efective de vitez (kef) pentru cistamin, cistein i glutation n sistemul

HbO2NO2tiol se micoreaz, n comparaie cu sistemul fr tioli. S-a constatat c
concentraia H2O2 este prezent numai n expresia cinetic a kef i nu intr n expresia
factorului de autoaccelerare (). Din aceste considerente, exist o dependen nensemnat a d/d n f() n perioada iniial i o influen mai mare a tiolilor asupra kef
(dup punctul de curbur a curbei cinetice).
Superoxiddismutaza (SOD) micoreaz viteza de autooxidare a HbO2 n MetHb
datorit dismutaiei radicalului HO2 i micorrii concentraiei H2O2 n comparaie cu
sistemul fr aceast enzim. n prezena SOD din doi moli de O2 se formeaz numai
o molecul de H2O2:
SOD
H2O2 + H2O
2 O2 + 2 H+
(V.26)
Astfel, concentraia H2O2 se micoreaz de 2 ori n prezena SOD fa de autooxidarea natural. La introducerea n sistemul HbO2-NO2-SOD a diferiilor reglatori
peptidici, obinui din plasma sngelui uman, se observ variaia activitii SOD. Prezena activatorilor SOD in vitro (s-a utilizat mas eretrocitar uman i animal) micoreaz, iar a inhibitorilor SOD mrete viteza de methemoglobinizare.
La utilizarea acestor reglatori ai activitii SOD n cercetrile experimentale
in vivo s-a constatat c are loc diminuarea efectului de methemoglobinizare la intoxicarea cu nitrit de sodiu n prezena activatorului SOD i creterea lui n prezena
inhibitorului SOD.
V.2.2. Dezactivarea radicalilor activi ai oxigenului
Dereglrile majoritii funciilor organismului (procesele infamatorii, reaciile
alergice, bolile infecioase, cancerul, SIDA, mbtrnirea) sunt determinate de variaia
coninutului de radicali activi ai oxigenului n esuturi [336]. Cunoaterea mecanismelor reaciilor dintre biomolecule cu forme active ale oxigenului i a constantelor reaciilor cinetice, care n majoritatea lor sunt n lan, permite de a selecta preparate antioxidante pentru corecia diferitelor stri patologice i mbuntirea calitii vieii.
Antioxidanii au proprietatea de a interaciona cu forme active ale oxigenului,
micornd intensitatea proceselor de oxidare radicalic, neutraliznd radicalii liberi
prin reacii de schimb al atomului de hidrogen (n majoritatea cazurilor) cu radicali
liberi de oxigen. Compuii din grupa dat au un atom mobil de oxigen i astfel interacioneaz cu radicalii liberi sau cu metalele cu valen variabil, ce au rolul de catalizator. Mobilitatea atomului de hidrogen este determinat de legtura slab cu atomii de
carbon (C-H) sau sulf (S-H). n rezultatul interaciunii se formeaz radicali mai puin
activi ai antioxidanilor (care nu au proprietatea de a prelungi lanul). Conform cercetrilor, aceti radicali sunt eliminai din organism sub form de compui moleculari,
formai la interaciunea lor cu ali radicali asemntori.
Radicalul anion-superoxid (HO2-hidroperoxid) se formeaz n prezena diferiilor
methemoglobinizani (NO2-, hidroxilamina, 1-halogen-1-nitro-alcani), reageni donori
de electroni i n procesul de autooxidare a HbO2. Ambele procese sunt unificate prin

151

stadia monoelectronic a oxigenului cu eliberarea anionului superoxid, care n continuare duce la iniierea procesului n lan.
Pentru inhibarea procesului de oxidare al HbO2, care este ion-radicalic n lan, este
necesar de a capta particulele active ale oxigenului prin utilizarea diferiilor inhibitori.
La prima etap protecia de radicalii activi ai oxigenului este nfptuit de enzimele antioxidante: superoxiddismutaza, catalaza, peroxidaza. SOD catalizeaz reacia
de dismutaie a O2, adic inactiveaz aceti radicali care apar n reaciile de transfer al
electronului:
SOD
H2O2 + O2
2H+ + 2O2
(V.27)
Peroxidul de hidrogen format n celule la oxidarea aerob este descompus de
catalaz (Ct):
Ct
H2O2 + H2O2
(V.28)
O2 + 2H2O
Viteza reaciilor prezentate cu participarea enzimelor este determinat de procesul
de difuzie i nu necesit energie de activare.
Dintre inhibitorii solubili n ap face parte hidrochinona. Procesul de inhibiie n
prezena hidrochinonei este determinat de consumul ion-radicalului superoxid [366] ce
s-a generat n etapa de iniiere. S-a stabilit [347] c cu creterea concentraiei inhibitorului are loc creterea perioadei de inducie.
n prezena diferiilor derivai ai hidrochinonei la fel are loc procesul de inhibiie,
ns gradul de inhibiie este mai mic [348]. Efectul inhibitor mai nalt al hidrochinonei
este determinat de structura plan i de posibilitatea repartizrii efective a surplusului
de sarcini negative n radicalul semichinonic, adic de posibilitatea maxim de a delocaliza electronul necuplat.
Efectul de inhibiie a acestor inhibitori este detectat att pe sectorul iniial de autooxidare al curbei cinetice, determinat dup variaia factorului de autoaccelerare (),
ct i dup punctul de curbur al curbei cinetice, determinat prin variaia constantei
efective de vitez de ordinul unu (kef).
Un efect inhibitor prin captarea radicalilor HO2 (O2) l au fenolii [338] cu structur spaial complex. Intre aceti inhibitori ionolul (2,6-di-tret-butil-4-metilfenol)
s-a dovedit a fi cel mai efectiv. Complexitatea structurii conduce la slbirea sau la
pierderea proprietilor inhibitoare.
Compuii polifenolici (flavonoizii, polifenolii) conin n structura de baz grupe
hidroxilice, metilenice, metoxilice i a. Ei au proprietatea s cedeze treptat electroni i
posed dou mecanisme de activitate antioxidant: inactiveaz radicalii liberi oxidani
(O2 , HO2 ) i formeaz compleci stabili cu metalele (fierul, cuprul, cobaltul i a.).
Activitate antiradicalic posed numai formele reduse ale compuilor fenolici, pe cnd
formele chinonice sunt antioxidani slabi. Ele pot fi restabilite n prezena acidului
ascorbic, recptnd proprietile de antioxidani.
Un rol important n inhibiia procesului de oxidare a HbO2 cu ion nitrii are captarea radicalilor hidroxili (OH), care se genereaz n acest proces de oxidare. S-a stabilit c acidul uric este o capcan efectiv pentru radicalii HO. Un analog structural al
152

acidului uric este acidul violuric i derivaii lui. Derivaii acidului violuric la fel posed proprieti inhibitoare, dar mai puin pronunate. Aceast aciune este determinat
de mobilitatea atomului de hidrogen n poziia 3 i a hidrogenului din grupa iminoxilic.
Rolul atomului de hidrogen n poziia 3 se confirm prin micorarea brusc a efectului de inhibiie la introducerea substituenilor n aceast poziie. Efectul inhibitor se
manifest la fel la etapa de iniiere i dup punctul de curbur. Astfel, acidul violuric
capteaz n afar de radicalii activi ai oxigenului i ali intermediari. n calitate de
inhibitori n procesul de methemoglobinizare a fost studiat 5-hidroxi-6-metiluracilul.
S-a stabilit c introducerea dozelor de acest inhibitor n sistemul HbO2NaNO2
n concentraii de 3,2-19,2 mol% din concentraia NaNO2 conduce la micorarea vitezei reaciei de oxidare a HbO2. Reacia se descrie prin curba cinetic sub form de S,
n care perioada de inducie nu este reprezentativ. Influena acestui antioxidant, ce se
manifest asupra mrimii i nu influeneaz asupra mrimii kef de ordinul pseudonti dup punctul de curbur al curbei cinetice, se explic prin particularitatea mecanismului de inhibiie. Principalele particule ce interacioneaz cu 5-hidroxi-6-metiluracilul sunt forme active ale oxigenului.
n reacia de oxidoreducere cu radicalii HO2 i HO particip ferocenele, compui
ce conin Fe2+. n rezultatul reaciei n sistemul HbO2NaNO2 radicalii HO sunt eliminai i astfel are loc inhibiia acestui proces, pronunat n prima etap a curbei cinetice.
V.2.3. Captarea radicalilor NO2
Analiza produselor intermediare n reacia de oxidare a HbO2 cu ion nitrit i legitile cinetice de parcurgere au permis de a constata c acest proces este ion-radicalic
n lan [349]. n cadrul realizrii reaciei se formeaz radicalul NO2, peroxidul de
hidrogen i forme supraoxidate de Hb(IV). Radicalul NO2se manifest ca un agent de
baz n oxidarea hemoglobinei i ca particul principal n prelungirea lanului. Conform schemei propuse de ugalei [340], radicalul NO2 se formeaz la diferite etape de
parcurgere a procesului.
Formarea particulelor supraoxidate de Hb(IV)=O se realizeaz cnd n sistem
crete concentraia de MetHb.
Pentru a inhiba procesul de oxidare a hemoglobinei, este necesar de a recombina
radicalul NO2 cu alte particule radicalice stabile. Din literatur este cunoscut proprietatea radicalilor NO2 de a interaciona cu radicalii nitroxili.
Stabilitatea radicalilor nitroxili este determinat de doi factori principali: gradul
de delocalizare a electronului necuplat la legturile cu substitueni (factor termodinamic) i dificultile sterice din apropierea atomului cu densitate nalt de spin (factor
cinetic). Pentru procesul de inhibiie n oxidarea HbO2 cu NO2- s-au utilizat diferii derivai tetrametilpiperidinici n care electronul necuplat, n general, este localizat la grupa
nitroxil, care, fiind steric ecranat, i confer o stabilitate nalt acestui radical [349].
Efectul de inhibiie pentru diferii derivai nitroxilici nu depinde de structura lor,
iar timpul de inducie crete odat cu creterea concentraiilor acestor inhibitori. Acea 153

st proprietate de nalt reactivitate a diferiilor derivai nitroxilici este legat de localizarea electronului necuplat pe fragmentul N-O.
Radicalii NO2 pot fi captai efectiv de aminele aromatice. n irul aminelor aromatice complexitatea structurii i introducerea substituenilor acceptori conduce la
diminuarea efectului de inhibiie.
Aminele aromatice inhib procesul de methemoglobinizare n sistemul HbO2
NaNO2. n acest scop, n cinetica de methemoglobinizare au fost utilizate difenilamina,
N-benzil-2-naftilamina i derivaii p-fenilendiaminei. n curbele cinetice obinute la
oxidare dispare forma S. Dispariia ei este legat de captarea radicalului NO2 de ctre
inhibitor n concurena lui cu hemoglobina.
n calitate de concureni ai hemoglobinei pentru NO2 particip i ferocenele, care
sunt compui reductori i care la fel posed i proprietatea de a descompune H2O2. n
irul ferocenelor cele nesubstituite posed efect maxim de inhibiie. Introducerea grupelor -NH, -SH i a substituenilor acceptori nu influeneaz esenial asupra activitii
inhibitoare, deoarece fragmentul structural de baz, ce particip n procesul de inhibiie, este ionul de fier. Efectul de inhibiie sub aciunea ferocenelor se observ n toat
perioada de reacie.
V.2.4. Reducerea methemoglobinei
Un alt procedeu de protejare a HbO2 de oxidare este reducerea produsului oxidat
al reaciei-MetHb [372]. Principala cale de reducere in vivo este participarea enzimelor
NADH i NADPH (hemoglobin-reductaze).
NADH-citocrom b5-reductaza are un rol important n reducerea MetHb din eritrocite, iar aportul NADPH este mai redus. ns, acest proces se activeaz n prezena
albastrului de metilen [350]. Albastrul de metilen (AM) este un donor de electroni n
reducerea neenzimatic a MetHb [350]:
MetHb(Fe3+) + R = N+(CH3)2 Hb(Fe2+) + R-N(CH3)2
(V.29)
AM (red)
AM(oxid)
Acest transfer neenzimatic al electronului de la AM(red) la MetHb reduce Fe(III)
din hem n Fe(II), iar AM(red) trece n stare oxidat. n absena NADPH methemoglobinreductaz se reduce numai n jur de 6% MetHb din eritrocite, iar n prezena
acestei reductaze are loc reducerea mai intens a AM(oxid) [351]:
AMoxid + NADPH AMred + NADP+
(V.30)
Astfel, aceast enzim este mai activ in vivo n prezena albastrului de metilen.
La concentraii mari de AM nu are loc reducerea MetHb, ci oxidarea HbO2.
Este cunoscut c cofermenii NADH i NADPH reduc activ metalele cu valen
variabil [351]. n lucrare a fost studiat influena cofermenilor NADH i NADPH
asupra oxidrii HbO2, la pH 6,53. S-a observat c la [NADH]- i [NADPH]- mrimea
factorului de autoaccelerare este mai mic fa de sistemul fr cofermeni.
Mrimea kef la fel se micoreaz n prezena acestor coenzime i n acelai mod.
Efectul de inhibiie asupra mrimilor i kef este practic acelai, ceea ce poate fi expli 154

cat prin aciunea de reducere a acestor enzime asupra fierului din MetHb din particulele intermediare de Hb(IV) i incapacitatea acestor enzime reductoare de a participa
la protejarea mpotriva oxidrii antiperoxidazice.
Procesul de reducere a MetHb in vitro se efectueaz la fel cu participarea diferiilor reductori cu greutate molecular mic [352]. Un astfel de reductor este acidul
ascorbic (AAs), care se caracterizeaz prin proprietatea de reducere a MetHb n Hb [352].
Cercetrile au fost efectuate att n condiii aerobe, ct i n condiii anaerobe. n condiii aerobe, n prezena hexafosfatului, procesul de reducere a MetHb cu AAs se intensific. Un rol important n reducerea MetHb l au compuii tiolici, care sunt reductori
naturali: glutationul redus [351,353], cisteina, cistina [352,354,355].
Inhibitorul trebuie s interacioneze cu radicalii ce prelungesc lanul cu mult mai
rapid, dect aceti radicali ar interaciona cu substratul de oxidare [340]. Stabilizarea
proceselor radicalice i reglarea lor st la baza selectrii multor preparate farmaceutice
din ultima generaie.
V.3. Noi metode de inhibiie n procesul de oxidare
a hemoglobinei cu nitrii
Methemoglobinemia este provocat, n majoritatea cazurilor, de prezena nitrailor n ap i n produse alimentare, care sub aciunea microflorei nitratreductoare din
cavitatea bucal i tractul gastrointestinal, se transform n nitrii. Ultimii, intrnd n
reaciile de oxidoreducere, duc la formarea methemoglobinei sau nitrozocomplecilor
hemoglobin-NO [373]. n Moldova, problema nitrailor n ap trezete ngrijorare,
deoarece cca 62% din fntni i 5% din sondele arteziene, folosite de populaie, conin
ap cu concentraii mai mari dect CMA [357,358,378,379]. Cele mai afectate din acest
punct de vedere sunt raioanele Teleneti, Cahul, Drochia, Edine, Rezina, Cantemir
.a., unde n unele surse de ap concentraia de nitrai atinge 100-750 mg/l (depind
de 2-15 ori limita maxim admisibil). Exist un ir de factori ce duc la formarea methemoglobinemiei: factori nnscui, de provenien toxicologic exogen, provocat
de diferii toxicani ce oxideaz hemoglobina n MetHb i de provenien endogen,
determinat de micorarea sau insuficiena dezvoltrii sistemelor methemoglobinreductoare.
Deseori, proveniena toxicologic cauzat de nitrai i activitatea endogen a sistemelor reductoare sunt legate ntre ele. n cazul unui organism cu deficiene n ceea ce
privete secreia gastric, stomacul este populat de bacterii i nitratul se transform n
mare parte n nitrit (se pot forma de la 100-1000 mg NO2-/kg), adic fr intoxicare
grav formarea MetHb depete ritmul de reducere al ei i procesul devine ireversibil
[358,359,376].
n perioada anilor 70-80 ai secolului XX, principiile i concepiile de studiere a
reaciilor n lan au fost cu succes folosite pentru descrierea proceselor ion-radicalice
n lan reacii ce includ etapa de transfer al electronului [340].

155

Diversitatea proceselor n lan se descrie prin trei tipuri de legiti cinetice: 1) procese n lan neramificate; 2) ramificate; 3) procese ramificate degenerate cu ruperea
liniar, ptratic i crucial a lanului.
S-a stabilit c procesul de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitrii este de tipul trei;
adic este un proces n lan i parcurge cu ramificarea degenerat a lanului, iar radicalul care prelungete lanul este NO2.
Una dintre particularitile principale ale reaciei dintre HbO2 i ioni nitrii este
caracterul ei autocatalitic: curba cinetic are forma S.
V.3.1. Metode experimentale de cercetare
Studiile experimentale au fost efectuate cu utilizarea masei eritrocitare de la donori
sntoi, care a fost supus hemolizei timp de 18-20 ore, pentru distrugerea membranei
eritrocitelor sub aciunea cloroformului. Concentraia hemoglobinei n hemolizat a fost determinat prin metoda spectrofotometric din curba de etalonare, unde ca soluii etalon s-au
utilizat soluiile de albumin de bovin de diferite concentraii determinate la = 280 nm.
Studiul legitilor cinetice ale reaciei s-a efectuat prin metoda spectrofotometric, utiliznd n acest scop spectrofotometrul SF-46 i cuve de cuar de 1 cm. Pentru meninerea
constant a temperaturii s-a utilizat ultratermostatul U-10 i celula termostatat de sticl.
Determinarea concentraiei HbO2 s-a efectuat n baza maximului de absorbie la
max= 540 nm i al MetHb la max= 630 nm. A fost calculat gradul de transformare
() dup consumul HbO2 utiliznd relaia = D0 D / D0 D i gradul de formare a
MetHb dup relaia = D / D. n conformitate cu caracterul curbelor cinetice sub
forma S, viteza reaciei a fost calculat ca derivata gradului de conversie la timp (d/d).
Coeficientul unghiurilor dependenei de (se calculeaz ca tangenta unghiului )
determin factorul de autoaccelerare ce caracterizeaz ramificarea lanurilor [360].
Lucrrile experimentale conin studii ale inhibiiei procesului de oxidare a HbO2
cu ioni nitrii. n acest scop au fost studiate sistemele: 1) HbO2 NO2-; 2) HbO2
NO2- H2O2; 3) HbO2 NO2- Inhibitor (Inh); 4) HbO2 NO2- H2O2 Inhibitor.
Pentru evaluarea gradului de inhibiie cu diferii reductori, obinui din produse
secundare vinicole, au fost studiate legitile cinetice de oxidare a HbO2 cu NO2- n
funcie de diferii parametri: 1) concentraia nitritului; 2) concentraia substratului
(HbO2); 3) pH-ul mediului de reacie. n continuare s-a determinat gradul de inhibiie
n sistemele studiate n prezena i absena peroxidului de hidrogen.
V.3.2. Legitile cinetice n sistemele HbO2 NO2- i HbO2 NO2- H2O2
Studiile cinetice de oxidare a HbO2 cu NO2- [362,364,365] au fost efectuate n urmtoarele intervale de concentraii: [HbO2] = 510-5 mol/l; [NO2-] = 310-4 - 110-3 mol/l;
pH-ul mediului 7,2; t = 20C. Legitile cinetice obinute la oxidarea masei eritrocitare
selectate confirm rezultatele primite anterior n literatur [360]. Curbele cinetice de
acumulare a MetHb (Fig. V.1) n funcie de concentraia ionilor nitrii se caracterizeaz prin micorarea perioadei de inducie odat cu creterea concentraiei ionilor nitrii.
Legitile cinetice la variaia concentraiei NO2- se caracterizeaz prin caracterul
constant al curbelor cinetice, care pot fi transformate ntr-o singur curb numai prin
schimbarea scrii pe axa timpului.

156

Coeficienii de transformare () pentru diferite [NO2-]0 sunt determinai de raporturile concentraiilor reagenilor pentru curbele transformate (Tab. V.1).
Din dependena lg i logaritmul raporturilor concentraiilor reagenilor curbei
standard i ai curbei transformate [lgCstand/Ctrans] la variaia concentraiei reagenilor,
s-a stabilit [361]:
n

lg = lg Cs tan d ,
lg Ctrans

unde n este tangenta unghiului (tg) al dreptei corespunztoare. Pentru diferite [NO2-]0
s-a calculat tg, care este egal cu 2.

[NO2 ] 5 10 4 mol / l
[NO2 ] 110 4 mol / l

[NO2 ] 8 10 4 mol / l
[NO2 ] 3 10 4 mol / l

Fig. V.1. Curbele cinetice de acumulare a MetHb la diferite concentraii de nitrii:

pH 7,1, t = 38oC, = 630 nm, [HbO2] = 5x10-5 mol/l.
Tabelul V.1
Transformarea curbelor cinetice de formare a MetHb ( = 630 nm) i determinarea
n funcie de [NO2-]0; pH 7,1, [HbO2]0 = 510-5 mol/l
[NO2-]0 x 104,
mol/l

max, s

10
8
5
3

300
900
1800
3300

1
2

1
3,0
6,0
11,0

Cstand/Ctrans

lg Cstand/Ctrans

lg

1,25
2,0
3,33

0,097
0,30
0,52

0,48
0,78
1,04

n conformitate cu forma S a curbelor cinetice, viteza reaciei, exprimat ca derivata gradului de conversie n funcie de timp, la nceput crete pn la viteza maxim
i apoi scade (Fig.V.2). S-a stabilit experimental c, cu creterea concentraiei NO2-,
viteza maxim a reaciei crete. Astfel, la [NO2-]0 = 110-3 mol/l, viteza maxim este de
0,128 la t = 6 min., iar pentru [NO2-]0 = 310-4 mol/l, d/d = 0,09 la t = 58 min.

157

[NO2 ] 110 4 mol / l

[NO2 ] 5 10 4 mol / l

t. min

[NO2 ] 8 10 4 mol / l
[NO2 ] 3 10 4 mol / l

Fig. V.2. Variaia vitezei reaciei (d/d) n funcie de timp n sistemul HbO2-NO2-, la variaia
concentraiei nitritului, soluie-tampon fosfatic, pH 7,2, t = 23C.

Acumularea MetHb, ca produs al reaciei de oxidare a HbO2, n perioada de accelerare are loc dup legitatea parabolic, despre care fapt indic dependena liniar
de timp (). n literatura de specialitate [362] astfel de legitate a parcurgerii i dezvoltrii reaciei se observ la procesele n lan cu ntreruperea ptratic a lanului. Coeficientul unghiular al dependenei de (factorul de autoaccelerare = tg) crete cu
mrirea concentraiei NO2-.
Procesul de oxidare a HbO2 cu NO2- depinde de pH-ul mediului reactant (Fig. V.3).
Gradul de transformare () a HbO2 pentru diferite pH-uri (6,72; 6,90; 7,10; 7,61)
variaz n funcie de pH. Cu ct pH-ul este mai mic, cu att max se atinge mai rapid
(pentru pH 6,72 max se atinge la 5 min., iar pentru pH 7,69 la 80 min.) [370].

Fig. V.3. Dependena gradului de transformare () n funcie de timp n sistemul HbO2- NO2-,
la variaia pH-ului, soluie-tampon fosfatic, = 540 nm, [HbO2] = 5x10-5 mol/l,
[NO2-] = 5x10-4 mol/l.

Conform schemei procesului de oxidare, reaciile (V.8), (V.11) includ participarea

ionilor de hidrogen.
Cu ct [H+]0 va fi mai nalt, cu att mai mare va fi viteza reaciei (V.4), adic la
acidularea mediului reactant legtura ntre hemoglobin i O2 se slbete i, astfel, la
ndeprtarea moleculei de O2 ionul nitrit mai uor se apropie de fierul hemic. n rezultat,
are loc transferul mai rapid al electronului 3d al orbitalului donor al Fe(II) pe orbitalul
acceptor al NO2-. Iar n cazul creterii pH-ului are loc intensificarea legturii ntre ligand
i O2, ceea ce duce la micorarea vitezei reaciei (V.8) [370].
Principala particul ce oxideaz hemoglobina este radicalul NO2, care n continuare conduce la prelungirea lanului (reaciile V.5, V.6).
158

Procesul de ramificare a lanului este determinat de formarea H2O2 (reacia V.11)

n sistemul reactant, care, la rndul su, oxideaz MetHb la o stare supraoxidat
(Hb(IV) = 0) (reacia V.12) la interaciunea cu NO2-.
n studiile experimentale, la oxidarea HbO2 cu NO2-, au fost utilizate diferite concentraii de peroxid de hidrogen n intervalul 110-6 - 510-5 mol/l i s-au obinut curbele
cinetice de consum al HbO2 i de formare a MetHb pentru diferite concentraii de H2O2.
Variaia vitezei procesului n timp este prezentat n Figura V.4. Concentraiile altor
componeni din sistem au fost constante. Analiznd datele experimentale prezentate n
Figura V.4, observm c variaia vitezei maxime d/d n timp scade cu micorarea
[H2O2]0 [368,374].

d/d

0.15

0.1

0.05

0
0

10

20

30
t, min

40

50

[H2O2]=1*10^-4 mol/l

[H202]=5*10^-5 mol/l

[H2O2]=1*10^-5 mol/l

[H2O2]=5*10^-6 mol/l

60

Fig. V.4. Variaia vitezei reaciei (d/d) n funcie de timp n sistemul HbO2 NO2- H2O2,
la variaia concentraiei nitritului, soluiei-tampon fosfatice, pH 7,1, t = 37C,
= 540 nm, [HbO2] = 5x10-5 mol/l, [NO2-] = 5x10-4 mol/l.

Dac comparm datele experimentale de acumulare a MetHb obinute n sistemul

HbO2 NO2- (Fig. V.1) cu sistemul HbO2 NO2- H2O2 (Fig. V.5), observm c pentru
[NO2-]0 = 510-4 mol/l timpul 1/2 este aproximativ de 30 min., iar pentru aceleai condiii, n prezen de H2O2, 1/2 se micoreaz cu creterea [H2O2]0 de la 25 min. pn la
6 min.

[N2 O2 ] 110 4 mol / l

[N2 O2 ] 110 5 mol / l

159

[N2 O2 ] 5 10 5 mol / l
[N2 O2 ] 5 10 6 mol / l

Fig. V.5. Curbele cinetice de acumulare a MetHb n sistemul HbO2 NO2- H2O2, soluiatampon fosfatic, pH 7,1, t = 37C, = 630 nm, [HbO2] = 5x10-5 mol/l, [NO2-] = 5x10-4 mol/l.

n prezena H2O2 are loc micorarea perioadei de inducie. La creterea [H2O2]0,

factorul de autoaccelerare a procesului de oxidare a HbO2 cu NO2- crete [368,370,374].
V.3.3. Cinetica procesului de oxidare a HbO2 cu NO2- n prezena inhibitorilor
n rezultatul reaciei de oxidare a HbO2 cu NO2- se formeaz ion-radicalul superoxid O2 i NO2. Aceti radicali se formeaz n rezultatul urmtoarelor reacii:
Hb(O2)4 + NO2- [Hb(O2)4] + NO2
(V.31)

[Hb(O2)4] O2 + Hb(O2)3 .a.m.d.

(V.32)
Pentru a micora viteza procesului de oxidare a HbO2 cu NO2 este necesar de a
nltura particulele radicalice NO2 i O2 (HbO2). n acest scop au fost utilizai diferii
inhibitori [364,366,368].
V.3.3.1. Utilizarea acidului ascorbic n inhibiia procesului de oxidare a HbO2
Introducerea acestui inhibitor n reacia de oxidare a HbO2 cu NO2- n cantitate de
2-10% din [HbO2]0 duce la creterea perioadei de inducie (Fig. V.6.) odat cu creterea
concentraiei lui (C1AAs = 0, C2AAs = 210-6 mol/l, C3AAs = 310-6 mol/l, C4AAs = 410-6 mol/l,
C5AAs = 510-6 mol/l). Oxidarea HbO2 s-a efectuat n soluie-tampon fosfatic (pH 7,2),
[NO2-]0 = 510-4 mol/l, [HbO2]0= 510-5 hem/l.

Fig. V.6. Curbele cinetice de acumulare a MetHb n sistemul HbO2 NO2- AAs,
la variaia concentraiei [AAs], soluie-tampon fosfatic t = 24C, = 630 nm,
[HbO2] = 5x10-5 mol/l, [NO2-] = 5x10-4 mol/l.

La compararea concentraiei MetHb formate n sistem la diferite concentraii de

[AAs], s-a constatat c valoarea maxim a [MetHb] pentru C1AAs apare la 30 min., iar
cu creterea [AAs]0 timpul de stabilire maxim a [MetHb] crete aproape de trei ori
pentru C5AAs. Creterea concentraiei AAs n sistem duce la micorarea neesenial a
factorului de autoaccelerare de la 2,510-4 s-1 pentru [AAs]0 = 210-6 mol/l pn la
1,910-4 s-1 pentru [AAs]0 = 410-6 mol/l (Fig. V.7), care s-a calculat din dependena
n f() ca tg la diferite [AAs].
7
6

f*10^4,s^-1

160

4
3
2
1
0
1

1.5

2.5

3.5

4.5

[re d]*10^6, m ol/l

[Aas]
([DFH3Na])

[DFH3Na]
([Aas])

Fig.7 De pe nde na factorului de autoacce le rare de [AAs ] i [DFH3Na] la

oxidare a HbO2 cu NO2-: pH 7,1, [NO2-}= 5*10^-4 m ol/l

5.5

f*10^4,s^-1

Fig. V.7. Dependena factorului de autoaccelerare de [AAs] i [DFH3Na]

la oxidarea HbO2 cu NO2-, pH 7,1, [NO2-] = 5x10-4 mol/l.

n condiiile de realizare a reaciilor (V.31), (V.32) a fost stabilit o dependen

neesenial a poziiei maximului vitezei de oxidare a HbO2 (d/d) n funcie de pentru
diferite concentraii de AAs, ndreptat spre creterea gradului de conversie . O deplasare asemntoare are loc la micorarea concentraiei H2O2 n sistemul HbO2 NO2[346]. Reieind din cele expuse i n baza datelor din literatur [20] putem constata c
n sistemul HbO2 NO2- AAs odat cu creterea concentraiei inhibitorului are loc
diminuarea concentraiei H2O2. Acidul ascorbic influeneaz asupra perioadei de iniiere, i anume: capteaz radicalii O2 (HO2), care se formeaz conform reaciei (V.8).
Reacia (V.10) va parcurge cu o vitez mai mic, astfel concentraia H 2O2 format
dup reacia (V.11) se va micora. Reieind din cele expuse, principalul oxidant al
HbO2 va fi radicalul NO2. n cazul creterii concentraiei AAs, comparabil cu concentraia HbO2, vom putea mri gradul de inhibiie.
Dac n sistemul HbO2 NO2- AAs se introduce H2O2 de concentraia 510-5 mol/l,
n acest caz se observ o intensificare a procesului de oxidare a HbO2 i de stabilire a
concentraiei maxime de MetHb i tmax se micoreaz de la 50 min. la 10 min. n absena
i n prezena H2O2 (510-5 mol/l), corespunztor. Astfel, constatm c AAs poate inhiba
procesul la stadia de iniiere, micornd concentraia radicalilor formai.
n literatura de specialitate se propune utilizarea AAs pentru tratarea methemoglobinemiei. ns, o serie de publicaii tiinifice contrazic aceast constatare [356].
Conform rezultatelor experimentale obinute, s-a constatat c MetHb format n sistem
nu interacioneaz cu AAs. Astfel, AAs poate fi utilizat pentru prentmpinarea formrii
MetHb, dar nu a reducerii ei.
V.3.3.2. Influena dihidroxifumaratului acid de sodiu asupra oxidrii HbO2 cu NO2Un alt inhibitor care a fost utilizat n sistemul HbO2NO2- este hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu (DFH3Na) [363,366,368]. Pentru a stabili gradul de inhibiie s-a
studiat cinetica procesului de consum al HbO2 (max = 540 nm) i de acumulare a MetHb
(max = 630 nm) [376]. Formarea MetHb n sistemul HbO2 NO2- n prezena DFH3Na
la t = 20C, pH 7,2 (soluie-tampon fosfatic), [HbO2]0 = 510-5 mol/l n funcie de diferite concentraii de DFH3Na este prezentat n Figura V.8. Din datele experimentale
prezentate n aceast figur la variaia [DFH3Na]0 ( C1DFH Na 0; C2DFH Na 2 106 mol/l;
3

161

C3DFH3 Na 3 106 mol/l; C4DFH3 Na 4 106 mol/l; C5DFH3 Na 5 106 mol/l ) constatm c

concentraia maxim de MetHb se atinge dup t = 30 min. pentru C1DFH Na i crete

3

pn la t 60 min. pentru C DFH Na .

5

La oxidarea HbO2 cu NO2- n prezena AAs viteza procesului dup punctul de

curbur n funcie de [AAs] 0 variaz cu mult mai puin (Fig. V.6) n comparaie cu
oxidarea HbO2 cu NO2- n funcie de concentraia DFH3Na (Fig. V.8). Pentru AAs este
caracteristic influena asupra perioadei de inducie. n schimb, pentru sistemul cu
DFH3Na durata perioadei de inducie variaz cu mult mai puin n funcie de concentraia lui, dar mai mult se schimb viteza dup punctul de curbur a procesului autocatalitic (Fig. V.8) [366-370].

[DFH 2 Na 2 ] 0 mol / l
[DFH2 Na 2 ] 310 6 mol / l
[DFH2 Na 2 ] 510 6 mol / l

[DFH2 Na 2 ] 210 6 mol / l

[DFH2 Na 2 ] 410 6 mol / l

Fig. V.8. Curbele cinetice de formare MetHb n sistemul HbO2 NO2- DFH2Na2,
la variaia concentraiei DFH2Na2, soluie-tampon fosfatic, pH 7,2, t = 21C,
= 630 nm, [HbO2] = 5x10-5 mol/l, [NO2-] = 5x10-4 mol/l.

[DFH2 Na 2 ] 210 6 mol / l

[DFH2 Na 2 ] 410 6 mol / l

[DFH2 Na 2 ] 310 6 mol / l

[DFH2 Na 2 ] 510 6 mol / l

Fig. V.9. Variaia vitezei reaciei (d/d) n funcie de timp n sistemul HbO2 NO2- DFH2Na2,
162

la variaia concentraiei DFH2Na2, soluie-tampon fosfatic, pH 7,2, t = 21C,

= 540 nm, [HbO2] = 5x10-5 mol/l, [NO2-] = 5x10-4 mol/l.

Variaia vitezei (d/d) n funcie de timp, calculat din datele experimentale obinute la = 540 nm i la = 630 nm, depinde de [DFH3Na]0. Cu creterea [DFH3Na]0,
variaia maxim a vitezei (d/d) de formare a MetHb n f() scade. S-a stabilit c poziia maximului curbei cinetice d/d se schimb nensemnat n funcie de i corespunde intervalului = (0,5-0,7) [370,376].
Deplasarea maximului d/d = f() n direcia mrimilor mai mari ale la concentraii mai mici ale DFH3Na este determinat de prezena n mediul de reacie a
radicalilor NO2 n concentraie mai nalt, ce asigur un aport mai mare n etapa de
ramificare a procesului cu participarea acestui radical i atingerea mai rapid a vitezei
maxime. n acelai context constatm c mrimea d/d depinde de [DFH 3Na]0 i
crete odat cu micorarea [DFH3Na]0. La C5DFH Na obinem d/d maxim aproximativ
3

de dou ori mai mic dect la C DFH Na [365,370,376].

Coeficientul unghiular al dependenei de (factorul de autoaccelerare = tg)
se micoreaz cu creterea concentraiei inhibitorului (Fig. V.7). Deoarece n sistem
are loc micorarea factorului de accelerare cu creterea [DFH3Na]0, putem presupune
c concentraia catalizatorului, adic a H2O2, n procesul autocatalitic se micoreaz cu
creterea concentraiei de DFH3Na. Astfel, constatm c acest inhibitor influeneaz
asupra procesului de ramificare a lanului n oxidarea HbO2, micornd viteza procesului de autoaccelerare n mediul reactant.
Introducerea n sistemul HbO2 NO2- DFH3Na a H2O2 duce la micorarea perioadei de inducie de la 25 min. pn la 7 min. Dac comparm datele experimentale
ale variaiei vitezei n sistemele HbO2 NO2- DFH3Na (Fig. V.9) i HbO2 NO2-
DFH3Na H2O2, constatm c variaia maxim a vitezei n sistemul fr H2O2 apare la
= 25 min., pentru [DFH3Na] = 210-6 mol/l, iar n prezena a [H2O2] = 510-5 mol/l,
pentru aceleai concentraii ale reductorului la = 7 min. Peroxidul de hidrogen
poate interaciona cu NO2- (reacia V.14) i astfel se formeaz radicalul NO2 care conduce n continuare procesul.
Dar, de rnd cu radicalul NO2, se formeaz i radicalul HO care n continuare
particip la propagarea reaciei i la mrirea concentraiei radicalului NO2 (ec. V.15).
n prezena inhibitorului, cu creterea concentraiei lui, viteza de oxidare a HbO 2
se micoreaz. Variaia maxim a vitezei d/d = 0,18 pentru [DFH3Na] = 210-6 mol/l
i se micoreaz pn la 0,06 la [DFH3Na] = 510-6 mol/l (Fig. V.9). Viteza procesului
de formare a MetHb crete n prezena H2O2 datorit mririi concentraiei radicalului
NO2 ce se formeaz adugtor la interaciunea H2O2 cu NO2- i care este un agent de
oxidare a Fe2+ n Fe3+ din hem (ec. V.5).
Mecanismul de aciune a inhibitorului se bazeaz pe interaciunea lui cu radicalul
OH ce se formeaz dup reacia (14) cu formarea de particule mai stabile [370,375].
Efectul de inhibiie va depinde de raportul constantelor de vitez k1/k2, unde k1 este
constanta de vitez la interaciunea OH- radicalilor cu inhibitorul, iar k2 constanta
de vitez a reaciei dintre OH i ionul nitrit (reacia V.15). n cazul n care k1/k2 >1,
2

163

putem obine efectul de inhibiie, adic viteza procesului ce duce la oxidarea Fe2+ n
Fe3+ este mai mic dect viteza de generare a particulelor radicalice oxidative, deoarece aceste particule n continuare interacioneaz nu cu substratul, dar cu inhibitorul.
Reieind din rezultatele prezentate n Figura V.8, constatm c DFH3Na poate interaciona att cu radicalul OH, ct i cu radicalul HO2, care se formeaz n perioada
de iniiere. Cu ct mai mare este concentraia inhibitorului, cu att mai mic este viteza
de autoaccelerare, deoarece concentraia peroxidului de hidrogen, care joac rolul de
catalizator n acest proces, se micoreaz, dat fiind c scade [HO2]. La fel, viteza procesului de oxidare a HbO2 se micoreaz datorit micorrii [NO2] dup reacia (V.15).
n studiile experimentale s-a constatat la fel i efectul inhibitor al rezveratrolului asupra
oxidrii HbO2. Cercetrile aciunii DFH3Na asupra oxidrii HbO2 cu NO2 s-au efectuat
in vivo i la fel s-a constatat efectul de inhibiie n formarea MetHb.
Concluzii
Cercetrile procesului de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii n prezena acidului ascorbic, hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu i rezveratrolului indic la faptul c
aceti inhibitori n domeniul de concentraie (110-6 - 510-6) mol/l nu influeneaz
asupra caracterului curbelor cinetice i legitilor generale de parcurgere a procesului.
La introducerea acestor compui n sistem are loc inhibiia procesului de oxidare
a HbO2 cu ioni nitrii, determinat dup variaia concentraiilor de HbO2 i MetHb.
Timpul de stabilire a gradului maxim de transformare a substratului crete de
trei ori odat cu mrirea concentraiei inhibitorilor n intervalul (110-6-510-6)
mol/l.
n cazul utilizrii acidului ascorbic n calitate de inhibitor n acest sistem are loc o
inhibiie mai pronunat la etapa de iniiere. Astfel, constatm c AAs interacioneaz cu radicalul O2 (HO2), care se formeaz la etapa de iniiere. Creterea concentraiei AAs n sistem duce la micorarea neesenial a factorului de autoaccelerare de la 2,510-4 s-1 pentru [AAs]0 = 210-6 mol/l pn la 1,610-4 pentru
[AAs]0 = 410-6 mol/l. Variaia nensemnat a n funcie de [AAs]0 confirm c
inhibitorul, micornd concentraia HO2 la etapa de iniiere, micoreaz n acelai
timp concentraia catalizatorului ce se formeaz (peroxidul de hidrogen) i, astfel,
nu obinem variaii mari ale vitezei n perioada a doua de propagare a lanului.
Hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu influeneaz asupra vitezei din perioada rapid de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii i, cu creterea [DFH3Na]0, are loc micorarea
vitezei dup punctul de curbur al procesului autocatalitic. Aceste rezultate indic
la participarea DFH3Na n captarea nu doar a radicalilor HO2 n perioada de iniiere, dar i a radicalilor OH care, la interaciunea cu NO2-, formeaz radicalii
NO2; astfel, are loc diminuarea vitezei n perioada rapid.

164