Capitolul I.

Formarea N-nitrozoaminelor n ap
I.1. Procese de nitrozare a aminelor
I.1.1. Nitrozarea aminelor secundare
N-nitrozocompuii sunt substane puternic cancerigene i mutagenice formate la
interaciunea dintre diferii nucleofili (amine, amide) i acidul azotos. Rspndirea
larg a acestei grupe de compui n mediul ambiant, proprietatea evideniat de a provoca tumori n diferite organe, efectele cancerigen, mutagen, transplacentar i alte particulariti de acest gen indic la pericolul N-nitrozocompuilor (NNC) pentru animale
i om. Principala primejdie a NNC, comparativ cu ali cancerigeni (hidrocarburile aromatice policiclice, aflatoxinele, bifenilii policlorurai), este proprietatea de a se forma
uor din predecesori n organisme vii i n mediul ambiant.
N-nitrozocompuii cancerigeni deriv de la diferii compui, ce includ majoritatea
aminelor secundare (R2NH) i teriare (R3N), amidelor secundare (RCO.NHR1O) i teriare
(RCO.NR1R2), N-substituenii ureei (R1HNCO.NH2), guanidinele (R1HNC(=NH)NH2)
i uretanii (RR1N.COR). Cei mai rspndii NNC deriv de la aminele secundare
(RR1NH) sau de la derivaii lor N-alchilai [1].
Principalele procese de nitrificare i denitrificare sunt foarte bine adaptate n ecosistem, dar aciunea antropogen asupra mediului nu doar c introduce schimbri, dar
n unele cazuri manifest un impact negativ asupra naturii. Introducerea excesiv a
ngrmintelor minerale de azot (sruri de amoniu, nitrai, uree), poluarea mediului
cu oxizi de azot formai n industrie i transport influeneaz asupra ciclurilor naturale
ale azotului; astfel, n biosfer se creeaz exces de predecesori ai NNC din care se
formeaz aceti cancerigeni.
Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro
(Challis, Rid, Mirvish i Williams). Soluiile apoase acide de sruri ale nitriilor la
pH< 5 sunt cele mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate.
Studiile efectuate demonstreaz c acidul azotos i ionii nitrii nu reacioneaz
direct cu aminosubstratul. Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formeaz n rezultatul interaciunii catalizatorului nucleofil (Y-, care este, de exemplu: NO2-, Cl-, SCN-)
cu acidul azotos, protonat ntr-o faz rapid cu instaurarea urmtoarelor echilibre
(I.1.1, I.1.2 i I.1.3) [1].
NO2- + H3O+
HNO2 + H2O
(I.1.1)
HNO2 + H3O+ H2O + NO+
(I.1.2)
+
H2O + NO + Y Y-NO + H2O
(I.1.3)
R2NH2+ + H2O R2NH + H3O+
(I.1.4)
R2NH + Y-NO R2NNO + HY
(I.1.5)
S-a constatat c doar aminosubstratul neprotonat, care este n echilibru cu acidul
lui conjugat (ec. I.1.4), reacioneaz cu Y-NO dup ecuaia (I.1.5) [5]. Astfel, n irul
echilibrelor prezentate, direcia procesului va depinde de pH, bazicitatea aminosubstratului i prezena catalizatorilor anionici (Y-). n absena altor nucleofili, ionul nitrit
3

acioneaz n calitate de catalizator, Y- , i n acest caz speciile reactive sunt oxidul de

azot N2O3, format n reacia chimic:
2HNO2
N2O3 + H2O
(I.1.6)
Nitrozarea aminelor secundare este studiat destul de larg, iar mecanismul general de nitrozare este sumarizat prin ecuaia I.1.7 [2]:
(I.1.7)
Este cunoscut c aminele au un caracter bazic datorit electronilor neparticipani
de la azot; astfel, n soluii apoase se instaureaz un echilibru (ec. I.1.8), iar constanta
de echilibru reprezint constanta de bazicitate (kb):
R- NH2 + H2O
R- NH3+ + HO(I.1.8)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercit influen decisiv asupra
vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi. Cu ct mai sczut este bazicitatea aminei,
cu att se reduce posibilitatea ei de a fi ionizat i astfel crete viteza de nitrozare.
Bazicitatea aminelor este influenat de structura lor i de densitatea electronic la
atomul de azot.
Aminele alifatice sunt baze mai tari dect amoniacul datorit grupelor alchil, cu
efect respingtor de electroni (+Is), efect ce mrete bazicitatea. Aminele secundare
sunt baze mai tari dect aminele primare, deoarece conin dou grupri alchil cu efect
(+Is), dar aminele teriare sunt baze mai slabe datorit unui efect de influen steric,
produs de cele trei grupe alchil. Aminele aromatice sunt baze mai slabe dect
amoniacul. Bazicitatea mai sczut a aminelor aromatice se datoreaz implicrii
electronilor neparticipani de la atomul de azot ntr-o conjugare cu electronii ai
nucleului benzenic. Pentru aminele studiate n prezenta lucrare scderea bazicitii i
creterea vitezei reaciei de nitrozare are loc conform irului din Figura I.1.1.
Din investigaiile tiinifice se constat c
pentru aminele secundare care au pKa > 5
vitezele reaciilor de formare a Nnitrozoaminelor, calculate dup consumul total
de amine i ioni nitrii, au o dependen
caracteristic de pH, atingnd maximum pentru
amine la pH ~ 3,4, iar pentru aminoacizi ~ 2,5
[3].
Aceast dependen reflect influena
Fig. I.1.1. Dependena vitezei
aciditii mediului reactant asupra concende nitrozare de bazicitatea aminelor.
traiilor de oxid de azot (III) i amine
neprotonate. Totui, mrimea vitezelor de nitrozare n funcie de pH depinde de
bazicitatea aminei (pKa), care determin partea de amin neprotonat ce particip n
reacie.

n intervalul de pH2-5, n absena catalizatorilor (de ex., ioni de tiocianat, Cl-, I-),
reacia de nitrozare aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul
oxidului de azot (III) i nu depinde de natura soluiei-tampon.
Aminocompuii slab bazici (de ex., amidele, derivaii ureei) nu se nitrozeaz att
de activ prin intermediul N2O3. Viteza de nitrozare pentru aceti compui crete cu
micorarea pH-ului, datorit formrii altui agent de nitrozare NO+ sau H2O+ NO; astfel,
nitrozarea acestor substraturi are loc prin interaciunea lor cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat dup urmtoarea ecuaie:
W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O+]
(I.1.9)
Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporional cu
ptratul concentraiei ionilor nitrii i manifest, dup cum s-a menionat mai sus, o
valoare maxim la pH 3-3,4.
W = k10 [R(R1)NH][HNO2]2
(I.1.10)
Viteza de nitrozare a N-alchilureelor, N-alchilcarbamailor, amidelor este proporional cu concentraia ionilor nitrii i a ionilor de hidrogen (ec. I.1.9); astfel, viteza
de nitrozare nu manifest un maxim n funcie de pH, dar crete cu scderea pH-ului.
Se poate constata c, n general, aminele secundare slab bazice, N-alchilureele,
N-alchilamidele simple i guanidinele sunt nitrozate mai rapid. Aminele primare,
teriare i cuaternare de obicei se nitrozeaz cu mult mai ncet, cu excepia compusului
aminoteriar aminopiridina, care este nitrozat extrem de rapid. Viteza de nitrozare
depinde de pH-ul mediului i de concentraia ionilor nitrii.
I.1.2. Formarea agenilor de nitrozare
Formarea agenilor de nitrozare are loc n rezultatul interaciunii ionilor nitrii cu
protonii (H+ sau H3O+) cu formarea acidului azotos (HONO). n soluii apoase se stabilete un echilibru ntre acidul azotos i oxidul de azot (III), conform ecuaiei (I.1.6) [5].
Valoarea constantei de echilibru a fost determinat conductometric la 25C, iar
mai trziu, prin metoda poteniometric, spectrofotometric i cinetic, de ctre Markovits i col., a crei valoare este de 3,010-3 lmol-1.
Reacia (I.1.6) este o cale important de formare a agenilor de nitrozare att
in vivo, ct i in vitro, n particular n mediul ambiant, produse alimentare i n stomac.
Protonarea ionilor nitrii este doar una n irul mare de reacii ce au loc, deoarece n
afar de N2O3 se formeaz i ali ageni de nitrozare, ca ionul acidului azotos (H2O+
NO), tetraoxidul de azot (N2O4) i al. Proporiile relative ale fiecrei specii depind de
aciditatea mediului, ns la o aciditate moderat (pH2-5) ei sunt toi prezeni i pot fi
detectai spectrofotometric (Fig. I.1.2) [7].

Fig. I.1.2. Formarea agenilor de nitrozare la interaciunea nitriilor cu protonii.

La pH2 este important cationul H2O+NO, care este predominant n reacia de

nitrozare. Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil n mediul bazic (ec. I.1.11):
NO+ + OH HNO2 NO2 + H+
(I.1.11)
n mediul acid echilibrul (I.1.12) este deplasat n dreapta i N2O3 se transform n
ionul de nitrozoniu:
N2O3 + 2H+ 2NO+ + H2O
(I.1.12)
Acest echilibru a fost determinat n baza studierii absorbiei n UV a ionului nitrit
la diferite pH-uri. La valori ale pH<7 n soluia de ioni nitrii n regiunea UV = 225 nm
absorb doar moleculele de HNO2 i cu micorarea valorii pH-ului pn la pH 2
absorbia HNO2 scade, deoarece are loc formarea N2O3, care nu absoarbe n regiunea
dat. Iar la micorarea ulterioar a pH-ului (pH<2) absorbia crete, fapt cauzat de
apariia n sistem a NO+, care absoarbe n regiunea dat a spectrului. n acelai timp,
apariia NO+ a fost depistat n sistem deja de la pH 3,0. Pentru reaciile ce decurg la
pH moderat (pH 3), N2O3 apare ca reagent principal n procesul de nitrozare. Oxidul de
azot (III) este instabil i se descompune, la nclzire, la un amestec de oxid de azot (II)
i oxid de azot (IV) (Fig. 1.I.2, etapa VI) [8].
Acidul azotos poate fi oxidat pn la ion nitrat (ec. I.1.13) n rezultatul diferitelor
procese chimice, sau redus la oxid de azot (II) (I.1.14) [1]:
HNO2 + H2O NO3 + 3H+ + 2 e
(E = -0,94 V)
(I.1.13)
HNO2 + H+ + e NO + H2O
(E = -1,0 V)
(I.1.14)
Oxidarea acidului azotos necesit reageni relativ puternici ca dioxidul de mangan
sau clorul, iar oxidanii mai slabi sunt efectivi n mediul alcalin:
NO2 - + 2OH NO3 + H2O + 2 e
(E =0,01 V)
(I.1.15)
Acidul azotos poate fi uor redus pn la oxid de azot (II) cu ajutorul reductorilor anorganici, aa cum sunt ionii de cupru (Cu+), fier (Fe2+), (I) i bisulfit (HSO3),
i al compuilor organici, ca acidul ascorbic, polifenolii, tiolii i al. Comportarea
acidului azotos n prezena agenilor reductori depinde de natura reductorilor, pH-ul
mediului i temperatur. Astfel, n reacia dintre ionul nitrit i hidrogenul sulfurat se
produce NO i sulfur, n soluii acide amoniac i sulfur, n soluie-tampon de
bicarbonat i amoniac sulfur i tiosulfat [8].

Mai mult ca att, acidul azotos poate fi redus pn la azot liber n prezena amoniacului, aminelor primare (RNH2), amidelor (RCONH2), hidrazinei (H2NNH2), ureei
(H2NCONH2), acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec. I.1.16):
XNH2 + HNO2 N2 + H2O + XOH
(I.1.16)
Soluiile apoase ale nitriilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin procesul de fotoliz sau radioliz; n rezultat, obinem amestec de NO i NO2 , care n
continuare este n echilibru cu N2O3 [8]:
h sau
(I.1.17)
N 2 O3
NO2
NO NO2
Oxidul de azot (III), generat din acidul azotos, atac substratul (S) conform reaciei (I.1.18), iar viteza reaciei este determinat cu ajutorul formulei (I.1.19), unde K
este constanta de echilibru:
k
S+ - NO + NO2
N2O3 + S
(I.1.18)
2
W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2] [S]
(I.1.19)
Pentru concentraii mari ale substratului (S), viteza reaciei I.1.18 este cu mult
mai mare dect viteza de hidroliz a N2O3.
Astfel, etapa limit devine formarea N2O3 n reacia (I.1.10), unde expresia vitezei
va include concentraia acidului azotos de ordinul doi. Pentru concentraia substratului
de ordinul zero [5,10]:
W = k [HNO2]2
(I.1.20)
Constanta k a fost calculat pentru diferite substraturi: N-metilanilin, 1,2-dimetilindol, acid ascorbic, hidroxilamin. Valoarea k este aproximativ constant i egal
cu 91 lmol-1s-1 la 25C i cu 0,81 lmol-1s-1 la 0C [11].
Mecanismul de formare a N2O3 reprezint o succesiune a etapelor de protonare a
acidului azotos, care, la rndul su, reacioneaz rapid cu anionul B- formnd BNO, iar
ultimul, la interaciunea cu ionul nitrit, duce la formarea N2O3 [11].

repede
(I.1.21)
HNO2 H3O

H2 NO2 H2 O

repede
(I.1.22)

BNO H 2 O

lent
(I.1.23)
BNO NO2
N 2 O 3 B

O schem similar poate fi prezentat i n cazul cnd este implicat ionul de nitrizoniu.

H2 NO2 B

I.1.3. Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici i induc tumori la diferite specii
de animale, obolani, oareci, epuri, psri, peti n diferite organe, precum vezica
urinar, rinichi, ficat, esofag sau stomac [9,12,13]. N-alchilnitrozoaminele pot induce
tumori tot att de uor i n organismul uman. n primul rnd, expunerea la N-alchilnitrozoamine este bine asociat cu creterea riscului de cancer al sistemului gastric,
colon, vizicei urinare [14-16]. n al doilea rnd, biotransformarea i activitatea biologic a acestor NNC la animale este similar celei din organismul uman [17]. Agenia
Internaional de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din
7

grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA i NDEA, i aa

cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om).
Cercetrile epidemiologice i riscul pentru cancer al NNC se studiaz permanent [19].
n acest context, legitile proceselor de formare a NNC i factorii fizico-chimici ce
influeneaz asupra acestor procese sunt de o importan deosebit. Studiul procesului
de nitrozare a DMA a fost iniiat n 1972 de ctre Taylor i Price, dar a fost studiat
mai nti descompunerea NDMA, ns dependena vitezei procesului de nitrozare de
pH nu a fost studiat. Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost
studiat de Mirvish [10] la pH 3,4, t = 25C n prezena soluiei-tampon, dup formarea
NDMA. Viteza reaciei de nitrozare a DMA este proporional cu concentraia N2O3,
sau cu ptratul concentraiei HNO2 liber i concentraia speciilor neionizate de substrat:
W = k [DMA] [HNO2]2 ,
(I.1.24)
unde constanta de vitez (k) este independent de pH, ns concentraia DMA i HNO2
trebuie calculat pentru fiecare valoare a pH-ului. Concentraia de NaNO2 utilizat n
sistem a fost variat n intervalul 0,02 0,125M, iar concentraia DMA 0,02M.
Pentru a simplifica calculele, viteza procesului a fost determinat dup concentraia total a aminei i ionului nitrit la pH constant, cnd raportul ntre amin i HNO2
ionizat i neionizat nu variaz:
W = k [Total DMA] [Total nitrit]2
(I.1.25)
n acest caz, valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) n ecuaia (I.1.25) variaz odat cu variaia pH-ului [10]. Valoarea k a fost calculat utiliznd ecuaia (I.1.26):
[Total DMA] [Total nitrit]
kk

[MeNH]
[HNO2 ]

(I.1.26)

Produsul mediu de NDMA format n condiii standard la pH 3,4 este de 15,8%,

iar valoarea k este 9,9 10-2 mol-2min-1l2 [10].
Populaia poate fi expus la N-alchilnitrozamine pe dou ci: calea exogen i
calea endogen [20-22]. Expunerea exogen poate avea loc n rezultatul consumului
alimentelor, inhalrii fumului de tutun (0-140 ng/igar), utilizrii articolelor din cauciuc, a produselor cosmetice, aciunii mediului ambiant (aer, ap) [23-26]. Expunerea
endogen rezult din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor n organismul uman
cu formarea lor n condiii acide, care prevaleaz n special n stomac [16,27].
Modelarea matematic [28] i studiul in vivo al formrii N-nitrozoprolinei (NPRO)
indic la faptul c expunerea endogen este mult mai important dect expunerea
exogen [29].
N-nitrozodimetilamina este prezent n alimente (n special bere) [30], pete i n
produse din pete, n produse din carne [31], pesticide (190-640 mg/l), n apa potabil
clorurat (0,02-0,82 g/l) [32] i se formeaz la poluarea industrial. Concentraia
NDMA n produse alimentare variaz n intervalul 0-85 g/kg. La fel, NDMA a fost
detectat n medicamente, ce sunt formate cu aminopirin, de la 10 pn la 371 g/kg.

Aminele secundare sunt constitueni normali n urin, care deriv din degradarea
proteinelor, aminoacizilor, fosfolipidelor i a altor substane bazice, sub influena enzimelor proteolitice i a bacteriilor intestinale.
Dimetilamina, care este principala amin secundar detectat n urin, este prezent n condiii normale n jur de 0,5 mM. Ionul nitrit este depistat n urin, de asemenea, n concentraii variabile, dependente de diet i concentraia lui n apa potabil.
Astfel, prezena NDMA n urin este determinat de dezvoltarea diferitelor bacterii
coliforme (Proteus, Escherichia coli), care transform ionul nitrat n nitrit, formnd n
rezultat diferii ageni de nitrozare ce nitrozeaz DMA.
Au fost supuse cercetrii procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale i a
apelor naturale i s-a constatat c n procesul de potabilizare se pot produce poteniali
cancerigeni NDMA (ec. I.1.27) i NDEA n concentraii de aproximativ 100 i 10 ng/l,
respectiv [32].

(I.1.27)

La acest pH, fracia de HNO2 produs din concentraia total de ioni nitrii este de
0,48, iar concentraia de HN(CH3)2 neionizat este de 4,79 x 10-8 (calculat din valoarea
pka 3,37 i 10,72, respectiv). Utiliznd aceste date, a fost calculat valoarea constantei
de vitez (k), egal cu 8,94 x 106 mol-2min-1l2, care nu se deosebete cu mult de valoarea k calculat de Ridd, egal cu 2,4 x 107 mol-2min-1l2 [11].
Lijinsky i Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100C. n aceste
condiii, la incubare prelungit i pH sczut, ionul nitrit este instabil, iar viteza maxim
de nitrozare nu este la pH 3,4, ci la pH 4,5. Procesul de nitrozare al diferiilor compui
depinde de structura substratului de nitrozare i de pH-ul mediului. Procesul de nitrozare in vivo i in vitro duce la formarea N-nitrozocompuilor, care se caracterizeaz
prin proprieti mutagene i cancerigene. n acest context, studiul legitilor cinetice
ale procesului de formare i de inhibiie a NNC prezint un mare interes.
I.1.4. Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
Reactivi chimici. La efectuarea cercetrilor au fost folosite urmtoarele N-nitrozoamine: N-nitrozodimetilamin compania SIGMA, No 7756, puritatea 99,8%;
N-nitrozodietilamin compania SIGMA, No 0756, puritatea 99,6%.
Inhibitori: acid dihidroxifumaric Sigma-Aldrich, Germania; rezveratrol Fluka;
(+)-catehina Fluka; cvercetina Sigma-Aldrich, Germania; ester dimetilic al acidului
dihidroxifumaric (EDMD), acid ascorbic importator S.R.L. Ecochimie, Moldova,
9

extracte din semine de struguri oxidate obinute la Institutul de Chimie al AM [49],

dihidroxifumarat de sodiu sintetizat n Centrul Chimie Aplicat i Ecologic. Pentru
analiza ionilor nitrii s-a utilizat -naftilamin, acid sulfanilic, acid acetic glacial
importator S.R.L. Ecochimie, Moldova; reagent Griess Fluka, Germania.
S-a utilizat analizatorul de energie termic Model 610 (Thermedics Detection
Inc., SUA), spectrofotometrul SF-46, spectofotometrul UV/VIS, pH-metrul Cecher,
lonomerul 120-2 (Gomel, Bielorusia),Termostatul U-190 (Germania).
Metodica experimentului. Procesul de nitrozare a fost efectuat ntr-o celula cu
termostatare. Coninutul celulei a fost agitat cu amestectorul magnetic. Soluiile substanelor iniiale au fost pregtite separat i amestecate dup termostatare la temperatura necesar cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectiv prin utilizarea soluieitampon citrat-fosfat. Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacie peste anumite perioade de timp. La determinarea NNA
procesul de nitrozare n partea-alicot folosit a fost stopat prin adugarea (1:10) a
amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu n l00 mM soluie-tampon borat (pH 9).
Partea-alicot utilizat pentru analiza ionilor nitrii a fost analizat imediat.
Determinarea N-nitrozocompuilor s-a efectuat prin metoda lui Walter, care
include tratarea NNC cu HBr [6]. n rezultatul procesului de denitrozare a NNC se
formeaz NO, care reacioneaz cu ozonul, formnd NO2* n stare excitat, i apoi se
descompune prin emanarea unui foton. Emisia chemiluminescent este detectat de un
fotomultiplicator instalat n analizatorul de energie termic (AET):
HBr

R1R2NH + NOBr
R1R2NNO
(I.1.28)
NOBr Br2 + NO
(I.1.29)
NO + O3 NO2* + O2
(I.1.30)
NO2* NO2 + h
(I.1.31)
Limita de detecie este de 100 pmol. Sistemul analitic pentru determinarea coninutului de NNC este alctuit dintr-un sistem de detecie unit cu analizatorul de energie
termic (model 610 sau model 402 Thermedics, Waltham, MA) i un integrator
(Hewlett-Packard, Avondale, PA). Vasul de reacie este un balon cu fundul rotund de
500 ml cu trei gturi 24/40, un gt No7 (Ace-thred), pentru introducerea probei, fiind
plasat ntr-o manta de nclzire (Fig. I.1.3) [6]. Unul din gturile 24/40 a fost conectat
la un tub de sticl de admisie a gazului de la o butelie cu argon, n al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracie i n al
treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux, rcit cu o pomp imersabil n
circulaie. Gtul Nr.7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat dup fiecare experiment). Partea superioar a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet
de admisie a aerului i la un tub de nlturare a gazului (NO). Gazul NO trece prin
apte vase de splare, dintre care n primele 1-4 se conin cte 60 ml de 1,5 N NaOH,
5 N NaOH, 99% NaOH (solid) i 99% NaOH granulat anhidru. Vasele de splare 5
(cu 20 ml EtOAc), 6 (cu 20 ml de aceton) i 7 (gol) sunt plasate ntr-un congelator la
-30C (Cryfridge, Baxter, McGraw Park, IL).

10

Metoda analizei NNC cu HBr. n vasul de reacie se adaug 160 ml de etilacetat.

Se stabilete fluxul de oxigen pentru ATE (25 ml/min) i fluxul de argon (40 ml/min).
Atunci cnd vidul n ATE atinge 0,5 mm, se introduce mantaua de nclzire pentru a
da o vitez de reflux de 1 pic/sec i o temperatur de 28C pentru vasul de reacie.
Se injecteaz cu seringa HCl concentrat/acid acetic glacial (5:95, 15 mL), iar mai
trziu 7,5 ml de HBr n acid acetic glacial (33%) i se las pe 15-30 min. dup fiecare
adaos, pentru ca rspunsul ATE s se ntoarc la linia de baz. Mostrele de analizat
(de obicei, 100 L) sunt injectate cu seringa n gtul Nr.7; atunci cnd rspunsul integratorului cade aproape de linia de baz (fiecare 7-10 min.), obinem picuri ascuite.
Standardele de N-nitrozoprolin se prepar zilnic (0,1 nmol, 100 L de 1,0 M NPRO)
i sunt injectate la nceputul, mijlocul i la sfritul fiecrei serii a experimentului.
Pentru nlturarea ionilor nitrii din proba selectat (dup incubarea aminelor
secundare cu NO2-) se introduce acid sulfamic (AS) proaspt pregtit (soluie saturat)
i HCl de 2N [35].

Fig. I.1.3. Schema metodei grup-selective pentru determinarea

coninutului total de NNC [6].

Pentru analiza coninutului total de NNC se iau 400 L prob, se adaug 50 L

AS saturat i 50 L HCl de 1N, se agit i dup 15 min. se analizeaz, introducnd, de
regul, 100 L de prob din acest amestec n vasul pentru extracia NNC n EtOAc i
descompunerea lor cu HBr (I.1.28-I.1.29). Aceast metod de analiz a NNC este de o
selectivitate nalt (coeficientul de variaie a trei msurri este de 5-10%), sensibil
(detecia limit este de 0,01 mol/L i poate fi utilizat fr extracie prealabil).
Legtura N NO n N-nitrozoaminele volatile este foarte slab i energia ei poate fi
determinat reieind din cldura standard de ardere a substanelor iniiale, precum i
din cldura standard de formare a produilor de reacie. Pentru N-nirozodimetilamin:
11

D[(CH3)2N NO] = Hf0[NO] + Hf0[(CH3)2N] Hf0[(CH3)2N NO]

(I.1.32)
(CH3)2N NO (CH3)2N + NO
(I.1.33)
D[(CH3)2N NO] = 52.1 kcalmol-1
(I.1.34)
Fragmentul organic obinut nu duce la formarea radicalului nitrozil i, prin urmare,
nu poate servi ca surs de interferen.
Nitrozarea DMA i DEA
Din studiile bibliografice s-a constatat c n cercetri procesul de nitrozare a DMA
i DEA s-a urmrit dup viteza de formare a NNC. n lucrarea dat cinetica nitrozrii
alchilaminelor secundare s-a studiat dup viteza de consum a predecesorilor NNC, adic
dup variaia nitritului, aminelor i dup formarea NNC. Nitrozarea aminelor s-a studiat n diferite sisteme-model i sisteme reale, n condiiile cnd concentraia NO2- este
cu mult mai mic (110-5 - 510-4M) dect cea studiat n literatur (0,02-0,2M), concentraia substratului fiind de ordinul mM [26,35], iar raportul [NO2-]:[Amin]1. Aceste
studii s-au efectuat reieind din intervalul de concentraii ce se gsesc n sisteme reale.
Nitrozarea DMA
Petele conine o cantitate mare de DMA, care n continuare poate fi nitrozat.
Aceast amin este cea mai rspndit n produsele alimentare. Astfel, studiul procesului de nitrozare a DMA are o importan deosebit. n sistemele reale (produse
alimentare, ap, sistem gastrointestinal) concentraiile agenilor de nitrozare sunt cu
mult mai mici; de exemplu, n ap sunt de ordinul 10-5-10-3M. Reieind din aceste considerente, procesul de nitrozare a DMA cu nitrii a fost studiat n soluii apoase ce conineau DMA (110-3M), NaNO2 (0,0510-3 -110-3M), i n soluie-tampon citrat-fosfat;
procesul a fost studiat la 37C. Viteza reaciei s-a determinat dup variaia concentraiei
ionilor nitrii, NDMA i DMA n sistem n funcie de diferii parametri [54,55].
Cinetica procesului de nitrozare a DMA, studiat dup variaia concentraiei ionului nitrit n sistem n funcie de [NO2-]0, este prezentat n Tabelul I.1.1.
Tabelul I.1.1
NO2-

Dependena vitezei iniiale de consum a

la nitrozarea DMA n funcie de [NO2-]0;
pH 2,6, t = 37C, [DMA]0 = 1 10-3M
[NaNO2]0 .
105M
0,5
1,0
5,0
10,0

Wini.107
M/s
0,5
1,2
7,5
8,9

[NO2-]105M
la 30 min.
0,09
0,39
1,32
4,60

% de NO2reacionat
82
61
73
55

Din rezultatele experimentale obinute n Tabelul I.1.1 constatm c viteza procesului de nitrozare a DMA crete odat cu creterea concentraiei ionilor nitrii.

12

Raportul [NO2-]0 / [DMA]o n sistemul-model este mai mic de 1. Au fost utilizate

concentraii mici de ioni nitrii comparativ cu substratul de nitrozare.
n cazul concentraiilor mici de ioni nitrii ordinul de reacie dup [NO2-]0 este
doi, la fel cum se prezint n literatur [35,36], pentru intervalul concentraiilor mari.
Excesul de amin fa de concentraia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori
(pentru intervalul studiat de NO2-). Astfel, ecuaia vitezei va fi prezentat la pH constant n felul urmtor:

d[NO 2 ]
k1[(CH 3 ) 2 NH] [HNO 2 ]2
dt

(I.1.35)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului, dar [DMA] i [HNO2] trebuie calculat pentru fiecare valoare de pH. n toate cazurile, viteza reaciei depinde de concentraia aminei neionizate. Oxidul de azot (III) se formeaz reversibil din dou molecule
de HNO2. n cazul dat, conform ordinului doi, dup [NO2-]0 la nitrozare particip N2O3
n calitate de agent de nitrozare.
Dac utilizm n ecuaia vitezei concentraiile totale ale reactanilor, atunci constanta de vitez k2 din ecuaia vitezei va depinde de pH:

d[NO 2 ]
k 2 [DMA] [nitrit]2
dt

(I.1.36)

Din curbele cinetice de consum ale nitriilor n f(pH) n sistemul-model

(CH3)2NH-NaNO2 s-a constatat c viteza trece prin maximum la pH 3,4 (Fig. I.1.4) ce
corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 3,37). La pH <3,4 ionul nitrit se
transform aproape totalmente n HNO2 (ec. I.1.1). Astfel, am constatat c pentru
intervalul de concentraii mici ale reactanilor n procesul de nitrozare maximul vitezei
n funcie de pH este situat la pH 3,4, la fel ca pentru intervale de concentraii de ~100
de ori mai mari [38].

Fig. I.1.4. Dependena vitezei de consum a nitriilor i a [NO2-] remanente

de valoarea pH; [NO2-]0 = 110-4M, [DMA]0 = 110-3M, t = 37C.

13

n procesul de nitrozare, concentraia aminosubstratului neprotonat, care este n

echilibru cu acidul lui conjugat (ec. I.1.37), este dependent de pH-ul mediului (pentru
DMA pKa = 10,72) [35].
k4

(CH3)2NH + H3O+
(CH3)2NH2+ + H2O
(I.1.37)

Astfel, viteza reaciei de nitrozare este dependent de pH-ul mediului i bazicitatea substratului, care determin proporia de amin neprotonat. Cu ct mai mic este
pH-ul, cu att mai mare este concentraia aminei protonate, iar cu ct mai mare este
pH-ul cu att mai mic este concentraia agentului de nitrozare.
Pentru viteza de formare a NDMA, studiat dup concentraia produsului format
i calculat din concentraiile totale ale aminei i nitritului de sodiu (ec. I.1.36), s-a
obinut o dependen caracteristic de pH, atingnd maximul la pH aproximativ 3,4.

Tabelul I.1.2
Influena pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA;
[NO2-]0 = 110-4M, [DMA]0 = 1 10-3M, t = 37C
Nitrozarea DMA n funcie de pH
Dup variaia
pH

1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0

Wini.
107
M/s
2,5
4,5
5,3
7,8
8,7
6,3

[NO2-]
-

Dup variaia [NDMA]

5

[NO2 ]10 M
% [NO2 ]
la 30 min.
react. 30 min.
6,0
4,0
3,0
2,0
1,0
1,5

40
60
70
80
90
85

pH

1,68
3,56
4,01
6,86

Wini.
108
MS-1
5,0
18,3
13,3
8,3

[NDMA]104M
la 90 min.
1,4
1,8
1,6
1,5

[NDMA]
la 90 min.,
%
14
18
16
15

Nitrozarea DEA
N-nitrozodietilamina se formeaz n diferite produse alimentare: n produse vegetale marinate 0,69 g/kg i n moare 4,9 g/kg [39], n bere n medie 0,22 g/l,
maximum 2,2 g/l [40], n carne [41].
La fel, NDEA a fost depistat n produse de cauciuc (92 g/kg), produse cosmetice (1,5-5 g/kg) [42], aer poluat cu fum de igri (0,01-0,1 ng/m3) [43], ap deionizat (0,03-0,34 g/l) [44] i n ape reziduale (pn la 5 g/l) [45].
Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiat n funcie de diferii parametri (pH, [NO2-]0, [DEA]0) dup creterea concentraiei de NDEA, determinat prin
metoda extracional-spectrofotometric [46], dup variaia concentraiei de nitrii i
variaia [DEA] [53-55]. Rezultatele experimentale sunt prezentate n Tabelul I.1.3.
14

Tabelul I.1.3
Viteza iniial de nitrozare a DEA n dependen de pH, [NO2-]0 i [DEA]0;
[NO2-]0 = 110-4M, DEA]0 = 110-3, pH 3,5, t = 37C
n f (pH)
pH
Wini. 108 M s-1
dup variaia:
[NO2-] [NDEA]
1,68
40
1,3
2,6
45
2,9
3,56
50
6,4
4,01
45
5,5
6,86
11
4,7

Nitrozarea DEA
n f [NO2-]0
[NO2-]0
Wini. 108 M s-1
4
10 M
dup variaia:
[NO2-] [NDEA]
0,1
35
2,1
0,5
40
2,8
1,0
50
6,2
5,0
61
7,1
10,0
72
8,0

[DEA]0
104M
0,1
0,3
1,0
5,0
10,0

n f [DEA]0
Wini. 108 M s-1
dup variaia:
[NO2-] [NDEA]
5,0
0,01
2,0
2,0
12,0
3,6
22,0
5,0
52,0
6,3

S-a stabilit c cu creterea concentraiei reactanilor viteza reaciei de nitrozare a

DMA crete. Astfel, variaia concentraiei ionului nitrit n intervalul 110-5 - 1103
mol/l duce la creterea vitezei de formare a NDEA de la 2,110-8 M s-1 pn la 8,0108
M s-1 , iar viteza de consum a ionului nitrit n acest interval variaz de la 3,510-7
mol/ls pn la 7,210-7 mol/ls.
Cota-parte calculat de NDEA format n funcie de [NO2-] variaz n limitele
2,2-8,9 % (Fig. I.1.5a). Calculele cinetice efectuate dup consumul [NO2-] pentru diferite concentraii de DEA (0,1-10,0) 10-4 mol/l indic (Tab. I.1.3) creterea vitezei de
nitrozare n intervalul (5-52) 10-8 mol/ls. Dac raportul dintre amin i ioni nitrii
crete, pentru intervalul dat de concentraii, cota-parte de NDEA format (la concentraia constant a ionului nitrit) scade (Fig. I.1.5a). Astfel, n sistemul NO2- DEA
cota-parte de NDEA format din DEA variaz n intervalul 7,8-40,0% pentru intervalul
0,110-4 - 110-3 mol/l de DEA.

Fig. I.1.5. Cota-parte de NDEA format n funcie de (-lg [NO2-]0) i (-lg [DEA]0) (a)
i n funcie de pH (b). [NO2-]0 = 1x10-4M, [DEA]0 = 1x10-3M, t = 37C
15

Pentru raportul [DEA]0/[NO2]0 = 1 n sistemul de reacie concentraia NDEA alctuiete aproximativ jumtate din concentraia substratului de nitrozare, deoarece raportul stoechiometric ntre NO2- i DEA este de 2:1. Astfel, constatm c ordinul dup
concentraia NO2- este doi.
Viteza procesului de nitrozare a DEA n f(pH), att dup variaia [NO2-]0, ct i
dup formarea NDEA0, trece prin maximum la pH 3,4 (Fig. I.1.5b) [33,34]. n toate
cazurile viteza de consum a nitritului este cu mult mai mare dect viteza de formare a
NDEA (Tab. I.1.3), deoarece ionii nitrii nu particip direct la sinteza NNC, dar sufer
o serie de transformri (ec. I.1.1, I.1.2, I.1.3) ce duc la formarea agenilor de nitrozare,
care, la rndul lor, particip n procesul de nitrozare.
Dac comparm vitezele procesului de nitrozare a DMA i DEA, constatm c
formarea NDMA are loc cu o vitez cu mult mai mare [53,55].
Delocalizarea electronilor necuplai de la azot depinde de structura aminei; astfel,
pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA. n rezultat,
DEA are proprieti bazice mai puternice dect DMA i forma protonat este mai stabil. ns, aminele protonate nu se supun nitrozrii; astfel, viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mic dect a DMA.

16