I.2.

Nitrozarea aminelor ciclice

I.2.1. Nitrozarea morfolinei
I.2.1.1. Formarea agenilor de nitrozare i efectele toxice asupra organismului
Expunerea profesional i a mediului ambiant la NNC este considerat a fi un
potenial pericol pentru sntatea populaiei [59-61]. Precursorii NNC, ionii nitrii i
aminele secundare se conin n multe alimente i pot interaciona n condiii acide n
stomac. Morfolina, ca amin secundar, este utilizat pe larg n producerea cauciucului
i poate fi convertit la N-nitrozomorfolin (NMOR) (Fig. I.2.1) n prezena nitritului
deopotriv in vivo i in vitro [60]. N-nitrozomorfolina a fost
depistat ca o impuritate n morfolin (0,8 mg/kg), n gazele de
evacuare din industria cauciucului. n solul din mprejurimile
fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat n conFig. I.2.1.
centraie de 4,4 mg/kg. Este posibil ca NMOR s se formeze i
Structura NMOR.
n rezultatul transnitrozrii din N-nitrozodifenilamin, care se
formeaz la producerea anvelopelor mpreun cu morfolina. N-nitrozomorfolina este
prezent n aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mg/m3) [20].
La fel, populaia poate fi expus la morfolin i NMOR prin alimentaie, produse
cosmetice i fumul de igri [62,63]. Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea direct, de exemplu, a fructelor acoperite cu cear (care conine morfolin) n scopuri de conservare, la utilizarea ambalajului (0,098-8,4 mg/kg), la tratarea cu aburi n
timpul procesrii.
N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic, iar n prezena N-nitrozodietilaminei produce carcinom celular hepatic cu rspndirea metastazelor n plmni
(100%) [64]. Mecanismele efectelor citotoxice i genotoxice ale diferitelor NNC sunt
diverse. Alchilnitrozoamidele sunt ageni de alchilare direct a ADN prin mecanismul
SN1 i nu necesit activare metabolic (metileaz toi atomii de oxigen i aproape toi
atomii de azot). Leziunea mutagenic principal format de alchil-nitrozoamide este la
O6-metilguanina [65,66]. Alchilarea n poziia O6 este responsabil de mutagenitatea i
cancerigenitatea agenilor de alchilare. NMOR este un cancerigen cu aciune indirect,
care acioneaz asupra ADN, ducnd la ruperi mono- i dicatenare [67]. Acest tip de
NNA sunt activate prin reducerea nitrogruprilor la N-hidroxilaminele din ADN [68,69].
n acord cu Appel i Graf [70], aciunea indirect are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) n rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450,
rezultnd amina secundar i NO care, la rndul su, ar putea ataca ADN.
Efectul genotoxic i clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele
hepatocite primare ale oarecilor [71] i Hep62 [72], dar i pentru celulele V79 i VH10
[72,73] cu un nivel sczut de metabolizare enzimatic.
N-nitrozoaminele se formeaz n rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu
diferii ageni de nitrozare, care se pot forma in vivo. Este cunoscut faptul c monoxidul
de azot (NO) poate fi generat n organism de o larg varietate de celule din arginin,
n prezena unor enzime. n organism, NO este un important mediator fiziologic n
3

relaxarea muchilor, neurotransmisie i reglarea presiunii sangvine [74]. Dei n majoritatea sistemelor biologice coninutul de NO este de ordinul nanomolilor, el poate
reaciona eficient cu radicalii superoxizi (O 2-) ntr-un proces controlat de difuzie
[k (NO+ O2-) = (3,9-19)x109 M-1s-1 (75-77)], formnd specii citotoxice de peroxinitrit
(ONOO-/ONOOH) [78,79], ns ntr-o concentraie mic. n condiii patologice, concentraia NO crete i poate atinge 30 M [80,81], formnd n continuare diferii
ageni de nitrozare [82]:
2 NO + O2 2 NO2

k1 = 2,9 106 M-2s-1

(I.2.1)

NO + NO2 N2O3

k2 = 1,1109 M-1s-1
k -2 = 5,03 104 s-1

(I.2.2)

2 NO2 N2O4

2k3 = 9 108 M-1s-1

k -3 = 1,38 104 s-1

(I.2.3)

Dup cum am menionat mai sus, macrofagii activai produc NO, care poate reaciona cu O2 sau O2. i forma ageni de nitrozare (N2O3) [82]. De rnd cu N2O3, NO poate
reaciona extracelular cu O2 formnd NO2- i NMOR n prezena morfolinei [85-87].
2NO + O2 2 NO2
(I.2.4)
NO + NO2 N2O3
(I.2.5)
N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+
(I.2.6)
+
N2O3 + MOR NMOR + NO2 + 2H
(I.2.7)
N2O3 + X- + H2O HX + 2 NO2- + 2H+
(I.2.8)
La pH fiziologic, cnd echilibrul n reacia (I.2.6) este deplasat spre dreapta, produsul este NO2-. Reacia (I.2.8) este, n esen, o hidroliz n prezena diferiilor anioni
(X- = Cl-, I-, Br-, CN- .a.). S-a stabilit c ionii de Cl- particip n astfel de reacii la pH
fiziologic i constantele de vitez au fost deja determinate [85].
Formarea NO3- la oxidarea NO cu O2 nu are loc. Determinarea concentraiilor de
NO format n sistem a permis de a constata c numai 476% din cantitatea de NO2revine NO eliminat. Deci, autorii [86] constat c schema redat mai sus este responsabil numai pentru jumtate din cantitatea de NO2- format i c este posibil prezena
unor alte ci de formare a NO2-.
Ionii nitrii se pot forma la fel n rezultatul interaciunii NO cu O2-, care se formeaz concomitent n mediile de cultur [87,69]. Produsul reaciei dintre NO i O 2este ONOO-, care n continuare reacioneaz cu NO i, n rezultat, are loc formarea
NO2- i NO2 [86,74]:
k9
ONOONO + O2-
(I.2.9)
NO + ONOO NO2 + NO2
(I.2.10)
n schema general ce include reaciile (I.2.4)-(I.2.10) stoechiometria general de
formare a NO2- n prezena superoxiddismutazei (SOD) este:
SOD
3 NO2- + 2H+
3NO + O2- + H2O
(I.2.11)

Astfel, numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2-.
Interaciunea peroxinitritului cu NO este demonstrat prin capacitatea lui NO de a
inhiba parial hidroxilarea benzoatului mediat de peroxinitrit. Constanta de vitez
pentru formarea ONO2- este k9 = 6,7x109 M-1s-1 [86]. n prezena O2- au loc la fel reacii
adugtoare, ce descriu formarea NO3-:
ONOO- NO3(I.2.12)
SOD
O2 + H2O2 +OH
O2 + H2O
(I.2.13)
Constantele de vitez sunt: pentru k11 = 1s-1 i pentru k12 = 2,5x109 M-1s-1. Astfel,
viteza de formare a NO3- este proporional cu [ONO2-] (reacia I.2.12), care este
aproximativ proporional cu raportul [NO]/[O2-] (reacia I.2.9). Valorile raportului
[NO3-]/[NO2-] pentru culturi de macrofagi variaz ntre 0,67 i 1,0 [86].
Apariia NO n fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2- i NO3-, care au
fost formai cu viteze aproximativ egale. Adugarea superoxiddismutazei n mediul de
reacie reduce vizibil raportul dintre [NO3-] i [NO2-] datorit micorrii [O2-] (reacia
I.2.13) [86].
Adugarea morfolinei n acest sistem a rezultat cu formarea NMOR, concurent
cu ceilali produi. Astfel, formarea NMOR poate avea loc i la pH fiziologic (7,4), iar
concentraia ei coreleaz cu concentraia NO, care apare n fluidul extracelular ntr-o
cultur n suspensie de macrofagi.
Lund n consideraie c NMOR este un cancerigen, care produce carcinom
hepatic, cu inducerea metastazelor n diferite organe, studiul procesului de nitrozare
i inhibiie a formrii N-nitrozomorfolinei are o nsemntate deosebit. Elaborarea
unor noi metode de inhibiie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraia
NMOR ce se poate forma in vivo i in vitro.
n acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraii ale reactanilor, similare celor ce se gsesc n sistemele reale i, n condiiile date,
s-a determinat influena unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR.
I.2.1.2. Legiti cinetice n procesul de nitrozare a morfolinei cu nitrii
Nitrozarea morfolinei cu ioni nitrii s-a studiat n sisteme-model dup variaia
concentraiei ionilor nitrii i dup formarea NMOR [106,107]. Iniial s-a studiat
procesul de nitrozare dup variaia concentraiei ionilor nitrii n sistem la pH 2,6
(soluie-tampon citrat-fosfat) la t = 37C. Cinetica procesului de nitrozare a morfolinei s-a studiat n funcie de concentraia NO 2-, a morfolinei i de mrimea pH-ului.
Rezultatele cercetrilor experimentale n funcie de [NO 2-]0 i [MOR]0 sunt prezentate n Tabelul I.2.1.

Tabelul I.2.1
Consumul nitriilor la nitrozarea MOR t = 37C, pH 2,6, = 520 nm,
[MOR]0 = 1x10-3M, [NO2-]0 = 1x10-4M
NO2consumat
(30 min.),
%
56,14

Wx
106 Ms1

510-5

110

-4

65,19

0,35

210-4

69,25

1,29

-4

310

70,09

Constanta
de vitez,
M-1s-1

[MOR]o,
mol/l
510-6 M

0,17
K = 0,65

Nr.
crt.

[NO2-]o,
mol/l

-5

Wx
107Ms-1
1,13

110 M

46,38

1,85

110-4 M

65,2

3,5

74,27

4,95

-3

1,8

NO2consumat
(30 min.),
%
38,16

110 M

Odat cu variaia [NO2-]0 n sistem n intervalul 5x10-5 3x10-4M cota-parte de

ioni nitrii consumai crete n intervalul 56,14-70,09%, iar viteza iniial variaz de
la 0,17x10-6 Ms-1 pn la 1,8 x10-6 Ms-1. Din rezultatele prezentate n Figura I.2.2
constatm c viteza crete liniar n funcie de [nitrit total]02. Aceast dependen liniar
a W de [NO2]2 indic faptul c specia, care reacioneaz cu MOR, este N2O3, deoarece
se formeaz din doi moli de HNO2 (ec. I.2.2, I.2.5). Raportul dintre concentraia ionului nitrit i a substratului crete (cu creterea [NO2-]0) de la 0,05 pn la 0,3, dar rmne
mai mic dect 1.

Fig. I.2.2. Dependena vitezei de consum a NO2- n funcie de [NO2-]0 i [NO2-]02

la nitrozarea MOR; t = 37C, pH 2,6, [MOR]0 = 110-3M.

n cazul n care [NO2-]0 nu este egal cu [MOR]0 i [MOR]0>>[NO2-]0, pentru a

determina constanta de vitez utilizm ecuaia redat n [108]:
6

[NO 2 ]0 ([MOR]0 X NO )
1
2

1n

[MOR]0 [NO 2 ]0
[NO 2 ]0 ([NO 2 ]0 X NO )

sau

(I.2.14)

1g

[MOR]0 X NO
2

[NO2 ]0 X NO
2

1g

[MOR]0
0.434 ([MOR]0 [NO2 ]0 ) kt
[NO2 ]0

(I.2.15)

Constanta de vitez calculat pentru reacia de nitrozare a morfolinei, determinat

dup consumul de NO2-, este k1 = 0,65 M-1s-1, iar expresia vitezei de nitrozare se exprim
n modul urmtor:
W = k1 [MOR][NO2-]2
(I.2.16)
n expresia vitezei, [MOR] reprezint concentraia total de substrat, care indic
concentraia molar a MOR ionizate plus MOR liber, iar [NO2-] concentraia total
de ioni nitrii, care alctuiete suma concentraiilor molare de NO2- i HNO2. Viteza
procesului de consum a ionului nitrit n funcie de [MOR]0 variaz n intervalul
1,13x10-7 4,95x10-7 Ms-1 (Tab. I.2.1).

Fig. I.2.3. Determinarea constantei de vitez la nitrozarea MOR ([MOR] 0 = 110-3M,

[NO2-]0 = 110-4M, pH 2,6, t = 37C, unde a [MOR]0, b [NO2-]0).

n acest interval de concentraii efectul concentraiei NO2- este predominant,

deoarece n expresia pentru vitez ionul nitrt este la puterea a doua. Din Tabelul I.2.1
observm c creterea concentraiei NO2- de ase ori duce la creterea vitezei de nitrozare de apte ori. ns, creterea [MOR]o de 200 de ori mrete viteza iniial numai de
4,3 ori [107].
Viteza de formare a NMOR, calculat din concentraiile totale de substrat i ion
nitrit, depinde de pH-ul mediului. Datele experimentale obinute sunt prezentate n
Tabelul I.2.2 i n Figura I.2.4.
7

Tabelul I.2.2
Cinetica nitrozrii MOR cu nitrit-ion, dup consumul de NO2 , n funcie de pH
(t = 37C, [MOR]0 = 110-3M, [NO2-]0 = 110-4M, = 520 nm)
-

Nr.
crt.
1
2
3
4
5

pH
1,0
2,0
3,0
3,4
4,0

Nitritul consumat timp

de 30 min., %
49,75
54,42
84,21
89,89
71,05

W x 107
Ms-1
1,41
1,78
2,7
4,0
2,33

k1,
M-1s-1
0,37
0,52
1,14
1,23
0,71

Viteza iniial n funcie de pH trece prin maximum la pH 3,4 (egal cu valoarea

pKa pentru HNO2), iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai nalt (89,89%). Aceast dependen reflect influena aciditii mediului asupra concentraiei agenilor de
nitrozare i a morfolinei neprotonate.
Agenii de nitrozare formai se consider cancerigeni i mutageni datorit capacitii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR. n procesul de reacie ionii nitrii se
consum, iar viteza de consum depinde, cum a fost constatat, de diferii factori fizicochimici.
Numai morfolina neprotonat particip n procesul de
nitrozare i formeaz N-nitrozomorfolina. Notnd concentraia morfolinei totale ca [MOR]
i forma neionizat [MORo],
atunci concentraia formei neprotonate a morfolinei poate fi
determinat din relaia [86]:
[MOR 0 ]

[MOR]
,
1 10pk pH

(I.2.17)

unde pk la 37C este 8,23.

Pentru a studia procesul de
[MOR]0 = 110-3M, [NO2-]0 = 110-4M, t = 37C.
nitrozare a MOR dup variaia
concentraiei de NMOR format s-a utilizat metoda de analiz termoenergetic (ATE)
[101]. Nitrozarea MOR cu ioni nitrii s-a efectuat n soluie-tampon citrat-fosfat (~pH 2,5)
n funcie de concentraia NO2- n intervalul (1,37-5,5)x10-3M. S-a constatat (Tab. I.2.3) c
concentraia NMOR crete de la 129 M la 259 M, iar cota-parte de NMOR format
la nitrozare variaz n limitele (3,08-6,20)% pentru intervalul dat al [NO2-]0 (Fig. I.2.5).
Astfel, cu creterea [NO2-]0 n sistem observm creterea [NMOR]. Cantitatea
iniial de MOR este de 25 mol, iar n procesul de nitrozare se transform de la
0,77 mol pn la 1,55 mol n proba analizat (Tab. I.2.3). Randamentul sczut al
reaciei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 2,5, care nu se
supun nitrozrii.
Fig. I.2.4. Dependena WNO de valoarea pH,
2

Tabelul I.2.3
Determinarea NMOR prin ATE n f[NO2 ]0 i influena unor inhibitori
asupra procesului de nitrozare; pH 2,5, t = 37C,
soluie-tampon citrat-fosfat, [MOR]0 = 5 mM
-

[NO2-]0,
mM

Standard
Aria Conc.
10 M uM
5,5 NO2- MF
2,79
1,0
4,16 NO2- MF 2,79
1,0
2,75 NO2- MF 2,79
1,0
1,37 NO2- MF 2,79
1,0
DMA+DFH4
2,79
1,0
DEA+DFH4
2,79
1,0
MF etanol 65% 2,79
1,0
MF 2.34 spir.
2,79
1,0
MF2.34 rezv.
2,79
1,0
spir. SA
2,79
1,0

Vol.
uL
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

Aria
10 M
7,23
5,23
4,44
3,59
0,13
0
0,94
0,83
2,28
0

Proba
Vol.
uL
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

Conc.
uM
2,59
2,10
1,59
1,29
0,05
0
0,34
0,3
0,82
0

Diluia
100
100
100
100
10
1
100
100
100
1

NO-Amina
Conc. Total
uM
umol
259
1,55
210
1,26
159
0,95
129
0,77
1
0,00
0
0,00
34
0,2
30
0,18
82
0,49
0
0

Dac comparm datele obinute la nitrozarea morfolinei (Tab. I.2.4) la un pH mai

ridicat (pH 2,8) la aceeai concentraie de NO2- egal cu 5 mM (dar mai introducem n
sistem NaCl de 0,05 M) cu datele din Tabelul I.2.3 la aceeai [NO2-]0, atunci constatm c concentraia NMOR formate n sistem crete de la 269 M pn la 416 M. n
prezena ionilor de Cl- viteza procesului de nitrozare crete (Tab. I.2.4), deoarece se
formeaz clorura de nitrozil, NOCl, care este un catalizator al procesului de nitrozare.

Randament, %

Randament, %

7
6
5
4
3
2
1
0
1.37

2.75

4.16

5.5

[NO2-]o,
mM
[NO2-]0, mM

Fig. I.2.5. Dependena randamentului reaciei de formare a NMOR n funcie de [NO 2-]0
i cromatograma obinut; [MOR]0 = 5 mM, pH 2,5, t = 37C.

Din rezultatele experimentale prezentate n [110] s-a constatat c procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR. Prin metoda ATE s-a determinat formarea
NMOR la nitrozarea cu ioni nitrii. Dup viteza de consum a ionilor nitrii n sistem
am constatat c acest proces depinde de [NO2-]0, pH i [MOR]0.
9

I.2.1.3. Metodele de inhibiie n procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice, genotoxice i clastogenice ale NNC este obiectivul principal n cercetrile tiinifice n acest domeniu. Proprietile mutagenice i cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe ci [69]: (1) inhibiia formrii NNC;
(2) inhibiia reaciei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN i (3) inhibiia
mutagenicitii NNC prin activarea reparrii leziunilor induse de NNC n ADN.
Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectai diferii antioxidani,
ca vitaminele C i E [72]. Au fost optimizate concentraiile acestor inhibitori [89], utiliznd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor i celulele carcinomei colonului uman
Caco-2. Citotoxicitatea a fost evaluat utiliznd tehnica excluziei cu tripan albastru
(care indic prezena celulelor moarte) n celulele Caco-2 i testul eficienei de nsmnare n celulele hamsterilor V79 (care determin mrirea sau pierderea capacitii
de reproducere).
Dup cum s-a evideniat n [89], vitamina C a micorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR: de la 60 la 40% n celulele Caco-2 i de la 56 la 20% n celulele V79.
S-a micorat i efectul citotoxic n prezena vitaminei C n ambele sisteme. Vitamina E a redus citotoxicitatea indus de NMOR numai n celulele Caco-2, care se gsesc n colon. Astfel, s-a constatat c vitamina C este un reductor mai puternic, care
inhib formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [59,90]. Aciunea antimutagenic
a vitaminei C poate fi corelat cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalent a
unor NNC de ADN celular [91]. Prin compararea aciunii efectului inhibitor al acestor
dou vitamine la reducerea efectelor toxice n prezena NMOR i N-metil-N-nitro-Nnitrozoguanidinei (MNNG), s-a constatat c ambele vitamine nu prezint nici un efect
protector mpotriva citotoxicitii induse de MNNG [93]. Astfel, s-a presupus c nici
una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indus de MNNG sau repararea
acestor modificri ale ADN, confirmnd faptul c, dei att NMOR, ct i MNNG,
aparin aceluiai grup de NNC, mecanismul efectelor lor citoxice este diferit.
Un alt inhibitor testat n procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este
dioxidul de carbon. S-a presupus acelai mecanism de inhibiie n formarea NMOR ca
i n cazul vitaminei C, adic, n primul rnd, diminuarea concentraiei agentului de
nitrozare, care se poate forma printr-un amestec de NO i O2 [85]. Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compui donori de NO (PAPA NONOate i MAMA NONOate)
n funcie de pH, Kirsch i col. [94] au ajuns ns la o alt concluzie.
n rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat c HCO3- nu poate s protejeze morfolina n procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 7,4), ns CO2 inhib
nitrozarea pn la pH 8,9. Acest efect protector
al lui CO2 se explic prin formarea carbamatului de morfolin (Fig. I.2.6), dar nu prin diminuarea concentraiei agenilor de nitrozare [95].
Fig. I.2.6. Formarea aminocarbamailor. Se presupune c formarea aminocarbamailor
in vivo este o ulterioar posibilitate de a inhiba
N-nitrozarea aminelor att de ctre NO/O2, ct i de ctre NO/O2-. ntruct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv n reaciile de nitrozare provocate de N 2O3, factorii
10

care micoreaz densitatea electronilor la atomul de azot trebuie s diminueze reactivitatea aminelor fa de N2O3. n [94] s-au efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuiei sarcinii la morfolin, anionul carbamatului de morfolin i al acidului corespunztor i s-a obinut micorarea sarcinii de la -0,71 la -0,59 i -0,51, corespunztor. Astfel,
atomul de azot al carbamatului de morfolin sau al acidului corespunztor este un nucleofil mai slab dect atomul de azot al morfolinei i, astfel, carbamaii formai sunt
mai puin susceptibili atacului oxidativ al N2O3.
Gradul de inhibiie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde
de tipul sistemului de nitrozare (NO/O2 sau NO/O2-), dar depinde strict de proprietile chimice ale aminelor de a produce carbamai.
Valorile pKa ale aminelor frecvente n organismele vii se afl n limitele 9-12. n
general, ele vor fi protejate de atacul agenilor de nitrozare, deoarece la pH 7,4 ele sunt
aproape complet prezente n form protonat. n condiii acide nitritul este capabil s nitrozeze substratele genernd dou specii de ageni de nitrozare, i anume: N2O3 i ionul
H2NO2+, care este n echilibru cu NO+ i care trebuie s nitrozeze direct aminele protonate [96]. Totui, exist substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul terminal al peptidelor, proteinelor i aminogruprile hemoglobinei (pKa = 6,1 7,1) [96].
La fel s-a studiat inhibiia N-nitrozrii morfolinei prin inducerea n diet a
vitaminelor C i E [97,98], a catehinelor, a ceaiului verde i a sucului din fructe [99].
Se constat c efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din diet [98,109].
Este necesar a constata c efectul genotoxic al NMOR sintetizate n condiii de laborator, n prezena antioxidanilor, este similar pre-tratrii celulelor cu vitaminele A, C
i E ce se conin n diet [100]. Produsele dezaminrii, cum ar fi uracilii, hipoxantinele
i xantinele, sunt mutageni puternici i ele.
Pentru a micora viteza acestui proces am studiat influena diferiilor inhibitori:
acid DFH4, DFH3Na, pigment carotenoidic extras din spirulin, EDMT, EDMT, (+)-Ct.
Datele prezentate n Tabelul I.2.4 (obinute att dup formarea NMOR, ct i
dup consumul de NO2-), indic la faptul c odat cu creterea [DFH4]0 concentraia de
NMOR se micoreaz de la 416 M pn la 70 M pentru concentraiile: C1DFH4 0;

C2DFH4 0,5 mM; C3DFH4 1,5 mM; C4DFH4 2,0 mM; C5DFH4 3,0 mM (Tab. I.2.4).
n intervalul dat al concentraiei inhibitorului randamentul reaciei de nitrozare scade
de la 10% pentru [DFH4]0 = 0 pn la 1,7% la [DFH4]0 = 3,0 mM (Fig. I.2.7).
Tabelul I.2.4
Determinarea NMOR prin ATE n f [DFH4]0; [NO2-]0 = 5 mM; pH 2,8; t = 37C,
soluie-tampon citrat-fosfat, [NaCl]0 = 0,05 M
Standard
Proba
NO-Morfolina
[DFH4]0,
mM
Aria Conc.
Vol.
Aria Vol. Conc. Diluia
Conc.
Total
10 M
uM
uL
10 M uL
uM
uM
umol
0,00 DHF 4,07
1,0
100
8,47 50
4,16
100
416
2,50
0,5 DHF
4,07
1,0
100
6,26 50
3,08
100
308
1,85
1,5 DHF
4,07
1,0
100
5,48 50
2,69
100
269
1,62
2,00 DHF 4,07
1,0
100
3,55 50
1,74
100
174
1,05
3,00 DHF 4,07
1,0
100
1,43 50
0,70
100
70
0,42
11

Fig. I.2.7. Dependena randamentului reaciei de

formare a NMOR i a activitii inhibitoare (% fa de control) de [DFH4]0 i cromatogramele
obinute; pH 2,8; [NO2-]0 = 5 mM,
[MOR]0 = 5 mM, [NaCl]0 = 0,05 M; timp de reacie 60 min.

Raportul [DFH4]/[NO2-]0 este <1 pentru toate concentraiile de DFH4 utilizate n

sistem, ns reacia dat este inhibat aproape complet. Cu creterea acestui raport
[DFH4]: [NO2-]>1 obinem o inhibiie total chiar i n cazul MOR, care are o vitez
de nitrozare destul de nalt (k1 = 0,65 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 0,0017 M-1s-1),
sau, cu att mai mult, DEA (Tab. I.2.3), care n condiiile date nu formeaz NDEA [110].
S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR n prezena extractului carotenoidic
din Spirulin. Este cunoscut [102] c Spirulina conine un ir de compui importani
pentru meninerea proceselor vitale ale organismului uman, printre care sunt peste 50
de principii bioactive, care exercit o aciune terapeutic benefic i care intervin n
reglarea tuturor funciilor organismului [102]. De rnd cu toate vitaminele (excepie
face vitamina D), Spirulina conine carotenoizi, dintre care o mare pondere o are betacarotenul, precursor al vitaminei A.
n cercetrile experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obinut din Spirulin [102]. Din extractul de Spirulin n concentraie de 6 mg/ml s-au pregtit diferite
concentraii de pigment carotenoidic (PC): C1PC = 0,1 mg/ml; C2PC = 0,5 mg/ml;
C3PC = 0,75 mg/ml; C4PC = 1,5 mg/ml i C5PC = 2,5 mg/ml. Randamentul reaciei de
nitrozare este maximal n absena spirulinei ( = 16,1%) i scade pn la 1,5% pentru
[Spir]0 = 2,5 mg/ml (Fig. I.2.8).

Fig. I.2.8. Dependena randamentului reaciei de formare a NMOR i a gradului de inhibiie

de [PC]0, i cromatograma obinut (t = 60 min).
12

Din datele prezentate n Tabelul I.2.5 i n Figura I.2.8 se observ c cantitatea de

NMOR format scade brusc de la 4,44 mol pn la 0,71 mol n intervalul (0-0,5) mg/ml
de PC, iar creterea [PC]0 n continuare influeneaz mai puin asupra efectului inhibitor.
Tabelul I.2.5
[PC]0; [NO2-]0 =

Determinarea NMOR prin ATE n f

5 mM; pH 2,6; t = 37C,
soluie-tampon citrat-fosfat
[PC]o,
mg/ml

0,00
0,10
0,50
0,75
0,75
1,50
2,50

Standard,
concentraia 1,0 uM,
vol. 100 uL
Aria
10 M
4,59
4,59
4,59
4,59
4,59
4,59
4,59

Proba,
vol. 100 uL,
diluia 1000
Aria
Conc.
10 M
uM
3,40
0,74
2,78
0,61
0,55
0,12
6,82
1,49
0,67
0,15
0,38
0,08
0,33
0,07

NO-Morfolina

Conc.
uM
672
606
120
149
146
83
57

Total
umol
4,03
3,63
0,72
0,89
0,88
0,50
0,34

%
NMOR
form.

Grad
de inh., %

16,12
14,52
2,88
3,56
3,52
2,00
1,36

0,0
10,0
82,24
77,92
78,20
87,60
91,60

Din datele experimentale obinute am constatat c viteza procesului de nitrozare a

MOR cu nitrii sub aciunea DFH4 i a pigmentului carotenoidic se micoreaz. Concentraia NMOR, determinat prin metoda ATE, scade n prezena DFH4 n intervalul
de concentraie (0,0-3,0) mM cu 85,2% fa de cantitatea de NMOR format fa de
control.
n cazul procesului de inhibiie cu PC n intervalul (0,0-2,5) mg/ml are loc o diminuare a coninutului de NMOR cu 91,6%.
Consumul de NO2- la inhibiia procesului de nitrozare a MOR
La fel, s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiilor antioxidani n procesul de
nitrozare a morfolinei dup viteza de consum a ionilor nitrii. Unii antioxidani, cum
sunt acidul ascorbic, vitamina E i acidul 5-aminosalicilic, inhib reaciile de N-nitrozare n procesul de cataliz acid [104].
n Tabelul I.2.6 sunt prezentate rezultatele experimentale obinute n inhibiia
procesului de nitrozare a MOR n prezena diferiilor reductori: DFH3Na, DFH4, (+)catehin la pH 2,6 i EDET, EDMD, DFH4 la pH 3,4. La pH 2,6 DFH4 s-a dovedit a fi
foarte eficient n inhibiia reaciei de nitrozare a MOR, comparativ cu DFH3Na i (+)catehin.
Concentraia de DFH4 necesar pentru a diminua aproape total concentraia de
NO2- n sistem este de 1x10-3 M. Conform datelor prezentate n Tabelul I.2.6, consta 13

tm c DFH3Na este un inhibitor mai puin eficient n procesul de nitrozare a MOR

dect (+)-Ct i DFH4.
Concentraia de nitrit (n %), calculat din diferena Cx-C0 (unde Cx,C0 concentraia NO2- redus n prezena i n absena inhibitorilor corespunztori), crete odat cu
creterea [Inh]0 (Fig. I.2.10a). Derivaii sintetizai (Fig. I.2.9) din acidul tartric (EDET)
i DFH4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH4 n procesul de
reducere a ionilor nitrii (Fig. I.2.10b).
Tabelul I.2.6
Inhibiia nitrozrii morfolinei n funcie de concentraia iniial a reductorului
([MOR]0 = 110-3M, [NO2-]0 = 110-4M, pH 2,6, t = 37C)
pH 2,6
DFH3Na
DFH4
NO2- (%)
NO2- (%)
7
[Red]o,
Win, x10 Kinh,
Win, x107
rezid. la
-1
-1 -1 rezid. la
M
Ms
M s
Ms-1
30 min.
30 min.
0
33,34
2,37
33,34
2,37
110-4
27,5
3,15
18
5,5
0,74
510-4
20,9
4,28
10,3
7,35
110-3
8,97
5,2
1,5
9,73
pH 3,4
NO2- (%) Win,
NO2- (%) Win,
[Red]o,
7 Kinh, [Red]o,
rezid. la x10
rezid. la x107
-1 -1
M
M
-1 M s
t=30 min. Ms
t=30 min. Ms-1
EDET
EDMD
110-4
65,4
3,07
510-5
63,3
2,91
510-4 64,87 3,37
110-4
52,26
3,1
0,25
110-3
63,7
3,4
310-4
42,7
3,75
510-4
31,16
5,17

(+)-Ct
NO2- (%)
Kinh,
Win, x107 Kinh,
-1 -1 rezid. la
M s
Ms-1
M-1s-1
30 min.
33,34
2,37
23,33
4,6
1,74
1,01
18,46
5,27
6,79
6,8
NO2- (%)
Kinh,
Win, x107 Kinh,
-1 -1 rezid. la
M s
Ms-1
M-1s-1
t=30 min.
DFH4
46,65
3,96
25,78
8,0
1,4
1,84
0,33
9,8
0,28
12,1

Fig. I.2.9. Structura chimic a esterului dimetilic al DFH4 (a), a esterului dietilic
al acidului tartric (b) i a cetotautomerului EDMD (c).

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA
i DMA. La concentraia NO2- de 110-4M i MOR de 110-3M se consum 60% de
ioni nitrii. n prezena inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2- crete i alctuiete ~ 100 % (Tab. I.2.6). n cazul EDET, pentru aceleai condiii de reacie, consumul de ioni nitrii alctuiete 34,6% (Tab. I.2.6), ceea ce este mai puin cu 32,1%
dect n absena inhibitorului (Fig. I.2.10). Pentru EDMD la concentraia de 110-4M
14

consumul NO2- este mai mare (47,7%) comparativ cu EDET, dar la fel este mai mic cu
19% dect n absena inhibitorului, iar odat cu creterea [EDMD]o pn la 510-4M
crete i consumul NO2- (pn la 68,8%).

DFH4

DFH3Na

DFH4

(a)

(b)

Fig. I.2.10. Concentraia de ioni nitrii redus de inhibitor n funcie de [inh]o (Cx-Co), n %,
unde Cx-Co % de nitrit redus n prezena (Cx) i n absena (Co) diferiilor inhibitori.

Rezultatele obinute indic la faptul c n cazul EDMD i EDET reacia predominant este interaciunea acestor inhibitori cu amina i nu cu agenii de nitrozare. Esterul dimetilic al DFH4 interacioneaz rapid cu anilina sau cu substituenii anilinei n
cataliza acid cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103]. Am putea
presupune c i morfolina la fel poate interaciona n procesul de cataliz acid (pH 3,4)
cu inhibitorul, dar nu cu ionul nitrit, ceea ce duce la micorarea consumului de NO2- .
Teoretic pot avea loc dou mecanisme de cataliz acid la sinteza produsului ntre
amin i inhibitor [103]: (a) protonarea cetotautomerului EDMD, urmat de reacia cu
aminele, eliminarea apei, formarea celui de-al doilea cetotautomer i repetarea etapei
de mai sus; (b) adiia acid-catalizat a aminei la legtura dubl a EDMD, urmat de
eliminarea apei i repetarea acestor etape. Mecanismul (a) este mai favorabil [103],
deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacioneaz cu amina n condiiile catalizei
acide, iar EDMD reacioneaz uor.

(I.2.18)

n rezultatul reaciei (I.2.18) n sistem are loc diminuarea concentraiei aminei

(MOR), care la fel este un predecesor n procesul de formare a NNC.
Determinarea constantelor de vitez pentru reacia dintre nitrit i inhibitori a
fost bazat pe viteza de reacie cunoscut a substanei de referin. Rezultatele descrise mai sus au indicat c inhibitorii utilizai au inhibat N-nitrozarea n mod liniar
15

W*10^7, Ms^-1

W*10^7, Ms^-1

(Fig. I.2.11), iar din Figura I.2.3 am constatat c agentul de nitrozare este N2O3. n
acest caz, constanta de vitez (kR) pentru reacia dintre inhibitor i N2O3 poate fi calculat
utiliznd
constanta de
vitez
determinat
12
pentru reacia
MOR
cu
1
1
N2O3 (0,65 M-1s).
10
8

3
6

5
2
4

4
2

0
0

DFH4 (1)
EDET (4)

DFH4 (1)

0.5

DFH3Na (2)
EDMD (5)

[Inh], m M

(+)-Ct (3)

DFH3Na ( 2 )

Fig. I.2.11. Dependena Wi de consum a NO2 n f [Inh]o,

pentru [MOR]0 = 110-3M, [NO2-]0 = 110-4M.

n sistemul dat, agentul de nitrozare, N2O3, generat n mediul acid poate reaciona
n trei moduri [104]:
(1) interaciunea cu inhibitorii:
V = d[Inh]/dt = kInh[Inh][N2O3]
(I.2.19)
(2) interaciunea cu morfolina:
d[N2O3]/dt = kM[MOR][N2O3]
(I.2.20)
(3) hidroliza N2O3 cu formarea nitritului:
d[N2O3]/dt = kh[N2O3]
(I.2.21)
Hidroliza N2O3 este neglijabil, deoarece aceast reacie este prea lent pentru a fi
relevant (kh = 1000s-1) [105]. Astfel, viteza de consum a N2O3 este urmtoarea:
W = -d[ N2O3]/dt = kInh[Inh][N2O3] + kM[MOR][N2O3]
(I.2.22)
n absena inhibitorilor, viteza de consum a agentului de nitrozare este proporional vitezei iniiale de interaciune a N2O3 cu MOR. Prin mprirea ecuaiei (I.2.22)
la (I.2.19) obinem urmtoarea ecuaie:
W/V = 1+ kM[MOR]/ kInh[Inh]
(I.2.23)
Din concurena inhibitorilor i MOR pentru N2O3 se calculeaz constanta de
vitez a reaciei dintre inhibitor i N2O3 (kInh). Valorile constantelor de vitez a N2O3
cu toi inhibitorii studiai sunt calculate i prezentate n Tabelul I.2.6. Mrimea con 16

stantei vitezei de interaciune a inhibitorilor cu EDMD (k = 0,75 M-1s-1) i cu EDMT

(k = 0,34 M-1s-1) este cu mult mai mic dect constanta de vitez pentru nitrozare a
MOR cu NO2- (fr inhibitor la pH 3,4). Astfel, constatm c aceti esteri se consum
n reacia nu cu ionii nitrii, dar cu aminele. n acest caz, consumul NO2- fa de control
(sistemul NO2- MOR) va fi negativ. Efectul inhibitor al compuilor studiai coreleaz
cu constantele de vitez pentru reacia dintre N2O3 i inhibitor. Gradul de inhibiie (n %)
a reductorilor este prezentat n Figura I.2.12 pentru concentraia reductorilor de
110-4M. Din rezultatele prezentate
observm c concurena pentru
agentul de nitrozare n sistemul dat
o ctig mai uor DFH4, apoi
urmeaz (+)-catehina i DFH3Na.
La fel, a fost testat pigmentul
caratenoidic
n procesul
de
nitrozare a MOR dup viteza de
consum a ionilor nitrii. S-a studiat
variaia concentraiei NO2- n sistemul NO2- PC n funcie de concentraia pigmentului carotenoidic:
C1PC = 0,008 mg/ml; C2PC = 0,012
Fig. I.2.12. Gradul de inhibiie a reductorilor
mg/ml; C3PC = 0,016 mg/ml; C4PC =
fa de control, pentru [MOR]0 = 110-3M,
5
0,024 mg/ml i C PC = 0,032 mg/ml.
[NO2-]0 = 110-4M.
Acest interval de concentraii
s-a ales mai ngust, reieind din datele experimentale obinute n sistemul MOR NO2 PC, studiat dup formarea NMOR prin metoda ATE (intervalul a fost (0,1-2,5)
mg/ml) (Fig. I.2.8), adic s-a studiat intervalul concentraiilor PC, n care efectul
inhibitor variaz semnificativ n funcie de [PC]0. S-a determinat variaia concentraiei
de ioni nitrii n sistemul NO2- PC i MOR NO2- PC n funcie de pH-ul mediului,
[PC]0 i [NO2-]0. Rezultatele cinetice, obinute n sistemul NO2- PC n funcie de
[PC]0 indic la faptul c viteza de consum a NO2- crete odat cu creterea [PC]0, iar
timp de 40 minute concentraia NO2- se micoreaz cu 90% la C5PC (Tab. I.2.7). Astfel,
constatm c n sistem PC interacioneaz cuDFH
NO
micoreaz
agenilor
Na2 iDFH
(+)-Ct concentraia
EDET
EDMD
Control
pH 2,6
pH 2,6
pH 2,6
pH 3,4
pH 3,4
pH 3,4
de nitrozare.
3

Consumul de NO2 total

Consumul de NO2 comparat cu controlul

Tabelul I.2.7
Dependena parametrilor cinetici n funcie de [PC]0 la nitrozarea MOR;
[NO2-] = 110-4M; pH 2,6, t = 37C
Sistemul NO2- PC (I)
[PC]0
x102,
mg/ml

Wini.
x107,
Ms-1

[NO2-]105M
la 40 min.

Sistemul MOR NO2- PC (II)

% de NO2redus la
40 min.

Wini.
x107,
Ms-1

17

[NO2-]105M
la 40 min.

% de NO2redus la
40 min.

0
0,8

0
1,2

10,0
3,3

0
67

0
3,5

10,0
1,6

0
84

1,2
1,6

1,6
2,0

2,4
1,8

76
82

4,8
5,3

1,3
1,1

87
89

2,4

3,0

1,3

87

7,5

0,6

94

3,2

3,6

1,0

90

8,3

0,55

95

Analiznd datele din Tabelul I.2.7, observm c viteza iniial de consum a

NO2- la C5PC este de 2,3 ori mai mare n prezena MOR dect n sistemul NO2- PC
(Fig. I.2.13), fapt datorat consumului NO2- n procesul nitrozrii MOR. Concentraia
de NO2- n sistemul I timp de 40 min. este aproximativ de dou ori mai mare dect n
sistemul II (Tab. I.2.7).
La determinarea NMOR n procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE n funcie de [PC] s-a constatat c [NMOR] scade brusc pn la 0,5 mg/ml de PC (Fig. I.2.8).
Aceste rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraiilor de NO2- dup
40 min. de reacie. Concentraia de NO2- se micoreaz brusc de la 1010-5M pn la
110-5M n intervalul de concentraii ale PC de 0,008-0,032 mg/ml datorit interaciunii
agenilor de nitrozare formai cu inhibitorii.
S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice hidroclorotiazida (HCTZ) i inhibiia proceselor de formare a NNA n sisteme-model. S-a determinat viteza procesului de nitrozare a HCTZ dup variaia concentraiei nitritului
n timp, n prezena diferiilor inhibitori: acidul ascorbic(AAs); rezveratrolul (Rez);
(+)-catehina ((+)-Ct); acidul dihidroxifumaric (DFH 4); tanin standardizat (tanin st.);
enoxil; enotanin.

18

Hidroclorotiazida are o nalt activitate diuretic i hipotensiv i reprezint un

preparat din grupul derivailor benzotiodiazidici, care conine n poziia C(7) gruparea
funcional sulfonamid, avnd urmtoarea structur:
Formula de structur

Aranjarea spaial a moleculei

H
N

Cl

CH2
NH

S
O O

H2NSO2

Mecanismul de formare a Nnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmrit n schema

ce urmeaz (I.2.23):
O
NH

O
S

O
N
H

NH 2
+

Cl

hidroclorotiazida

N O

NH
O N

NH 2

O
N

O
+

- H NH

Cl

O N

NH 2

O
N

Cl

Nnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiia procesului de formare a NHCTA a fost

calculat concentraia remanent de ioni nitrii, n funcie de concentraia utilizat de
reductor. Reieind din valorile obinute, a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA n funcie de natura i concentraia reductorilor.
Din rezultatele obinute constatm c reductorii obinui din produse secundare
vinicole demonstreaz capacitai de inhibiie n formarea NHCTZ.

Concluzii
Cercetrile proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitrii, efectuate
pe sisteme-model, att dup variaia [NO2], ct i dup [NMOR], confirm formarea NMOR. Viteza procesului de formare a NMOR crete odat cu mrirea
concentraiei componenilor din sistem, iar viteza iniial de nitrozare n funcie
de pH trece prin maximum la pH 3,4.
Constanta vitezei de consum a ionilor nitrii n procesul de nitrozare a MOR a fost determinat pentru pH 2,6 dup viteza de consum a nitriilor n sistem (k = 0,65 M-1s-1).
n intervalul de pH1-4, mrimea constantei vitezei de consum a NO 2- n sistemul NO2- MOR variaz n limitele (0,37-1,23) M-1s-1, fiind maxim la pH 3,4
(k = 1,23 M-1s-1).
Constanta vitezei de nitrozare a MOR, determinat dup viteza de formare a NMOR,
este de 0,41 M-1s-1. Aceast diferen este determinat de transformarea ionilor
nitrii n produi intermediari ageni de nitrozare, care, la rndul lor, nitrozeaz
amina, iar stadia limit n proces este interaciunea acestor ageni cu amina.

19

Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitrii (dup formarea NMOR, determinat

prin metoda ATE) a fost studiat n prezena diferiilor inhibitori: DFH4, DFH3Na,
EDMT, EDMD, pigment caratenoidic din spirulin. S-a constatat c aceti compui inhib procesul de nitrozare a MOR, iar gradul de inhibiie este determinat
de natura i concentraia inhibitorului.
Randamentul reaciei de formare a NMOR fr inhibitor (n condiiile date)
este de 10% i scade pn la 1,6% n prezena DFH4 de 1 mM, iar n cazul PC se
micoreaz pn la 1,36% pentru [PC] = 2,5 mg/ml. Activitatea inhibitorului
crete de la 0 (fr inhibitor) pn la 83%, iar n cazul PC pentru concentraia
maxim (2,5 mg/ml) este de 91%.
S-a studiat influena unui ir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR
dup viteza de consum a ionilor nitrii. S-au elucidat particularitile EDT i ale
EDMD n acest proces. Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare dup
consumul ionului nitrit n prezena EDET indic o activitate mai mic cu 32,1%,
iar pentru EDED cu 19% comparativ cu sistemul fr inhibitor. Din rezultatele
obinute se constat c n prezena acestor inhibitori reacia predominant este
interaciunea lor cu MOR, dar nu cu agenii de nitrozare. Astfel, inhibiia procesului se realizeaz prin diminuarea concentraiei substratului de nitrozare n rezultatul protonrii cetotautomerului EDMD, urmat de interaciunea lui cu aminele.
n baza constantei de vitez a procesului de nitrozare a MOR cu NO2-, calculat experimental, i datelor cinetice obinute la inhibiie s-au calculat constantele
de inhibiie pentru diferii inhibitori: k DFH inh = 1,74 M-1s-1, k DFH Na inh = 0,74 M-1s-1,
kctinh = 1,01 M-1s-1 (la pH 2,6), kEDMTinh = 0,25 M-1s-1 i kEDMDinh = 0,34 M-1s-1,
k DFH inh = 1,84 M-1s-1 (la pH 3,4).
4

I.3. Nitrozarea amidelor

I.3.1. Precursori ai N-nitrozometilureei
N-nitrozometilureea (NMU) aparine unei clase de compui cancerigeni, cum sunt
N-nitrozoamidele, care sunt instabili n soluii apoase la pH > 5. De aceea, este foarte
puin probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide s fie depistate n alimente n concentraii apreciabile. Totui, este posibil ca N-nitrozoureele s se formeze in vivo n
stomac prin ingestarea precursorilor (amide i ioni nitrii), deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacie. n prezent, formarea intragastric a N-nitrozocompuilor n organismul uman este bine stabilit i are un rol important n apariia cancerului gastric [114,118,121]. De rnd cu aceasta, cancerigenitatea NMU se manifest asupra sistemului nervos central i periferic, cailor respiratorii,
pielii, rinichilor etc. [120].
Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitrai, nitrii i
substrate de nitrozare). Ca precursori ai formrii N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree i alchilguanidine [138] (de ex., citrulina, arginina, N,N-metilenbisacrilamida

20

i metilguanidina). La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formeaz 35% NMU

(Fig. I.3.1) [141].
NH
CH3

NH

NH2

Fig. I.3.1. Structura chimic a NMU i MGD.

Produsele din pete uscat conin 20-180 mg metilguanidin/kg, a crei nitrozare

produce NMU, ns cu o vitez mai lent dect nitrozarea metilureei [141]. Transformrile au loc dup urmtoarea schem:
Metilguanidin1-metil-1-nitrozoguanidinN-metilnitrozocianamid
N-nitrozometiluree
Principalul precursor al metilguanidinei ce ptrunde n organismul uman este
creatinina i creatina, care sunt constitueni caracteristici ai extractului de carne [117,
120]. Creatina este prezent n carnea i petele proaspt, iar creatinina este produsul
ei deshidratat (ec. I.3.1) i se formeaz la prepararea petelui i a crnii n timpul proceselor de uscare, prjire, afumare.
H3C
CH3
\
\
N CH2
N CH2
/
\
/
\
HN = C
\
NH2

H O

2
HN = C C = O
COOH
\
/
NH

Creatin

(I.3.1)

Creatinin

n studiile sale anterioare S.Mirvish [125] a indicat c creatinina, ce este prezent

n concentraii destul de nalte (30-1400 ppm) n carne, pete i produse de mare, poate
fi nitrozat cu formarea NMU. Pn la 4g/kg de creatinin apar n carnea prjit i
petele srat, uscat, care este produs prin deshidratare [118,120].
n rezultatul tratrii creatininei cu ioni nitrii se formeaz metilureea care, n continuare, se nitrozeaz formnd NMU. Formarea metilureei are loc conform urmtoarei
scheme [118]:
Creatinin5-oxo-creatinin 5-oxim1-metil-hidantoin-5-oxim
N-nitrozometiluree
Prima etap din acest lan este limit. Unele studii epidemiologice din SUA au
presupus c ar fi o legtur ntre consumarea crnii tratate cu ioni nitrai, nitrii i apariia leucemiei la copii i a tumorilor la creier [126].
Ca substrate de nitrozare, cum s-a menionat mai sus, pot servi i alchilureele. Ele
pot fi uor transformate n alchilnitrozourei [125,126]. n China, n sosurile de pete
s-a constatat prezena N-nitrozometilureei, care se acumuleaz la pstrarea n timp a
produselor [119] .
21

n trecut se considera c pot fi nitrozate doar aminele secundare. Studiile efectuate

n continuare au indicat c N-nitrozoaminele se pot forma i la nitrozarea aminelor
teriare, a compuilor cuaternari de amoniu, care se gsesc n mediul nconjurtor, alimente i droguri.
Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimic sau microbiologic. Nitrozarea pe cale chimic depinde de mai muli factori: bazicitatea aminei, pH-ul mediului
de reacie, concentraia substratului i prezena catalizatorilor i inhibitorilor. Unul
dintre catalizatorii importani n procesul de nitrozare a substrailor sunt tiocianaii,
care sunt prezeni n saliv n cantiti de la 12 la 33 mg/100 ml [119,140]. n cantiti
mai mari aceti ioni se gsesc n saliva fumtorilor.
Aminocompuii slab bazici (de exemplu, amidele, derivaii ureei i unele amine
aromatice) nu interacioneaz cu oxidul de azot N2O3. Aceti compui interacioneaz
la pH mai sczut i se nitrozeaz pe alt cale, care include interaciunea substratului
neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat:
Y-NO + RNHCOR RN(NO)CO R + H3O+
(I.3.2)
N-nitrozamida

De obicei, aceste reacii sunt foarte lente la pH>3, dar ele decurg cu o vitez mai
mare cu creterea aciditii.
I.3.2. Cinetica i mecanismul nitrozrii metilureei
S-a studiat experimental nitrozarea metilureei, care se poate forma ca metabolit la
transformarea creatininei din produsele din carne i pete. Ca precursor al agenilor de
nitrozare s-a utilizat nitritul de sodiu [127-129].
Procesul de nitrozare s-a studiat dup variaia concentraiei de NMU format, utiliznd metoda spectrofotometric-extracional. n calitate de extragent a fost utilizat
eterul dietilic. La fel, s-a studiat viteza acestei reacii dup variaia [NO 2-]0 n sistem.
Intervalele de concentraii n sistemele-model au fost urmtoarele: [NO2-]0 = 0,05-1,0 mM,
[MU]0 = 0,03-1,0 mM; pH 1-4.
Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat n celule termostatate. Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea i nitritul de sodiu. La fel, a fost studiat
nitrozarea N,N-bisacrilamidei [138]. Volumul total de soluie a alctuit 20 ml. ndat
dup introducerea nitritului, se stabilete timpul reaciei. La intervale de 10, 20, 30,
60, 90 min. se iau probe a cte 3 ml, care se trec n eter dietilic i se nchid ermetic.
Extracia se efectueaz de dou ori: prima dat cu 3 ml de solvent, a doua oara cu
2 ml. n extractul obinut a fost determinat concentraia NMU la = 235 nm i 325 nm.
Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37C, iar cinetica reaciei de nitrozare s-a studiat dup variaia densitii optice (DO) la = 235 nm, care s-a determinat
cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 n cuve de cuar de 10 mm. Concentraia NMU
a fost calculat utiliznd coeficientul de extincie pentru NMU, a crei mrime la
= 235 nm n solvent organic este egal cu 8x103 l/molcm.
Cinetica nitrozrii metilureei
Deoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importani, s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU n funcie de pH-ul mediului.
22

S-au modelat urmtoarele intervale de pH: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0. Concentraia [MU]o =
= 0,1 mM i [NO2-]0 = 0,1 mM. S-a observat c concentraia NMU formate crete cu
micorarea pH-ului. Dac pentru pH 1 la t = 10 min. [NMU] = 1,8810-5M, atunci
pentru pH 4 [NMU] = 0,3410-5M la acelai interval de timp. La nitrozarea amidelor,
viteza procesului nu trece prin maximum, dar scade cu creterea pH-ului (Fig. I.3.2).
Din datele prezentate se observ c viteza procesului este destul de lent la pH > 2.
Cu micorarea pH-ului de la 2 la 1, viteza crete mai mult de dou ori (de la 13,83
10-9 M-1s-1 31,3310-9 M-1s-1) [130,131]. Procesul de nitrozare s-a studiat timp de
90 min., pn cnd n sistem s-a instaurat un echilibru. Dac calculm concentraia
NMU la echilibru, constatm c, n funcie de pH, concentraia NMU crete cu micorarea pH-ului de la 0,04510-4M (pH 4) pn la 0,3510-4M (pH 1). S-a calculat
coninutul format de NMU (n %) fa de concentraia total a amidei. S-a constatat c
cota-parte a NMU crete de la 4,5% pentru pH 4 pn la 35% (pH 1) (Tab. I.3.1).
Tabelul I.3.1
Dependena concentraiei NMU formate i constanta de vitez (k1) n funcie de pH
pH
1,0
2,0
3,0
4,0

[NO2-]x104, M
1,0
1,0
1,0
1,0

[MU] x104, M
1,0
1,0
1,0
1,0

[NMU]Ex104 , M
0,35
0,17
0,09
0,045

NMU, %
35,0
17,0
9,0
4,5

k1, M-2min-1
416,6
1923
7,5103
7,05104

Fig. I.3.2. Viteza de formare a NMU n funcie de pH; [NO2-]0 = 110-4M , [MU]0 = 110-4M.

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat n funcie de concentraia [NO2-]0 i

[MU]0. Rezultatele experimentale indic la faptul c viteza de nitrozare a MU crete n
intervalul (2,78-7,47)10-8Ms-1 odat cu mrirea [NO2-]0 de la 510-5 M pn la 110-4 M
[102]. Nitrozarea s-a efectuat la pH 1. Rezultatele obinute sunt prezentate n Tabelul
I.3.2.
Tabelul I.3.2
-

Dependena vitezei de nitrozare a MU n funcie de [MU]0 i [NO2 ]0

23

V = f [MU], [NO2-]0 = 1x10-4M, pH 1,0;

V = f [NO2-], [MU]0 = 1x10-4M, pH 1,0
4
8
-1
5
[MU]0x10 M Vx10 Ms
[NMU]10 M [NO2-]0 x104M Vx108Ms-1 [NMU]105M
1,00
3,13
1,93
0,50
2,78
1,67
0,65
2,60
1,56
5,00
5,03
3,02
0,30
2,08
1,25
10,00
7,47
4,48

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel dup variaia [NO2-] n sistem n

funcie de pH-ul mediului, n urmtoarele condiii: [NO2-] = 110-4M, [MU] = 110-4M,
pH 1,0-4,0, t = 37C. Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaia concentraiei NO2- n
procesul de nitrozare. n rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat c viteza
procesului de nitrozare, calculat dup variaia [NO2-], la fel scade cu creterea pH-ului
(Tab. I.3.3).
Tabelul I.3.3
Dependena
pH
1,0
2,0
3,0
4,0

[NO2-]

-4

la echilibru, n funcie de pH; [NO2 ] = 1x10 M,

[MU] = 1x10-4M, pH 1,0-4,0, t = 37C
[NO2-]x105M
[NO2-]x105M
(la echilibru)
(consumat)
0,5
9,5
2,5
7,5
6,5
3,5
7,0
3,0

Datele experimentale obinute, cuprinse n Tabelul I.3.3, coreleaz cu cele prezentate n Tabelul I.3.1, n care viteza a fost calculat dup variaia [NMU]: cu ct este
mai mare [H+]0 n sistem, cu att este mai mic [NO2-] neconsumat, adic viteza de
nitrozare crete cu creterea [H+].
Viteza de nitrozare a MU (dup variaia [NO2-]) n funcie de [MU]0 n intervalul
(1,07,5)10-5M i [NO2-]0 n intervalul (1,07,5)10-5M este o linie dreapt ce trece
prin centrul de coordonate. Astfel, constatm nc o dat c reacia de nitrozare este de
ordinul unu dup [NO2-]0 i [MU]0.
Mecanismul de nitrozare a MU. Din datele experimentale de mai sus s-a obinut
expresia pentru viteza experimental de nitrozare a MU:
Vex. = [NO2-] [CH3-NH-CO-NH2] [H+]
(I.3.3)
Dup cum am menionat (ec. I.1.1-I.1.3), n sistem se pot forma diferii ageni de
nitrozare (N2O3 i NO+), al cror coninut, conform ecuaiilor (I.1.1), (I.1.2), (I.1.6),
depinde de pH-ul mediului:
[N2O3] = K4 [HNO2]2/ [H2O]
(I.3.4)
+
+
[NO ] = K5 [HNO2] [H ] / [H2O]
(I.3.5)
Nitrozarea MU poate avea loc dup urmtoarele reacii:
k6
CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2
CH3-NH-CO-NH2 + N2O3
(I.3.6)
K7
CH3-N(NO)-CO-NH2 + H+
CH3-NH-CO-NH2 + NO+

24

(I.3.7)

Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pH<2, determinm expresia

vitezei reaciei de nitrozare. Viteza experimental pentru reacia de nitrozare a MU
poate fi redat prin expresia:
V'NMU = 1 [MU] [NO2-] [H+]
(I.3.8)
[MU] concentraia total a MU
V"NMU = 2 [CH3NHCONH2] [NO2-] [H+]
(I.3.9)
[CH3NHCONH2] concentraia formei neprotonate a MU
La nitrozarea MU n funcie de pH poate participa NO+ sau N2O3. Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiiile date, scriem ecuaia vitezei de
nitrozare a MU cu N2O3 i cu NO+:
V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2]
(I.3.10)
V7 = k7 [NO+] [CH3NHCONH2]
(I.3.11)
Viteza sumar a procesului de nitrozare a MU poate fi determinat ca suma V6 + V7:
WNMU = V6 H O + V7NO+ = k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO+] [MU]
2

(I.3.12)

nlocuind din (I.3.4) i (I.3.5) expresia pentru concentraia N2O3 i NO obinem

expresia vitezei din care calculm constantele de vitez pentru nitrozarea cu N2O3 (k6)
i NO+ (k7).
K K

KK
(I.3.13)
WNMU [MU] 4 6 [HNO2 ]2 5 7 [HNO2 ][H ]
[H2O]
[H2O]

unde: K4 = 3 10-3, dm3 M-1 K6 = 8,37 106, M-1 s-1

K5 = 3 10-7, dm3 M-1 K7 = 4,36 108, M-1 s-1
Astfel, constatm [133,134] c la procesul de nitrozare a MU cu NO2- n intervalul de pH:1-2 n calitate de agent de nitrozare particip cationul de nitrozoniu (NO+),
deoarece K7 >>K6, iar cu micorarea pH-ului are loc creterea [NO+]:
+

CH3 NH

C
O

NH2 + NO+

CH3

ON

NH2 + H+

(I.3.14)

Reacia de nitrozare a MU decurge dup mecanismul caracteristic compuilor

slab bazici. Conform proprietilor acestor compui, ei nu sunt att de activi ca s se
combine cu oxidul de azot N2O3. La pH<2, MU se nitrozeaz prin interaciunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO+) sau cu cationul hidratat H2ONO+,
adic procesul de nitrozare a MU are loc n rezultatul catalizei acide [135,136].
I.3.3. Inhibiia procesului de nitrozare a metilureei
n lucrrile experimentale s-a studiat influena compuilor de natur reductoare
asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei n sistemul NO2- i MU. n procesul de nitrozare a MU n prezena hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraii de inhibitor n intervalul (510-5 - 110-4) M i controlul (fr
inhibitor). Curbele cinetice de formare a NMU s-au obinut la pH 1, [NO2-] = 1x10-4M,
[MU] = 1x10-4M (Fig. I.3.3).
Din datele obinute constatm [134,137] c DFH3Na are un efect inhibitor n
sistemul dat i cu creterea concentraiei lui scade coninutul de NMU format, adic
25

se micoreaz viteza procesului de nitrozare (Tab. I.3.4). Dac calculm cota-parte de

MU nitrozat, reieind din concentraia total iniial (adic forma protonat i neprotonat), constatm c coninutul de NMU format scade de la 33% la 16% la creterea
[DFH3Na]0 pn la 110-4M (Tab. I.3.4).
Tabelul I.3.4

[DFH3Na]
x104M
1,0
0,5
0,1
0,0

Dependena vitezei de nitrozare a MU i [NMU] la echilibru

n funcie de [DFH3Na]0, pH 1,0, t = 37C
[MU]
[NMU]
[NMU],
Vx108M s-1
x104M
x104M
%
1,0
0,16
16
1,875
1,0
0,21
21
2,40
1,0
0,29
29
3,125
1,0
0,33
33
3,54

k,
M-2s-1
147
125
70
55

4
3,5

[NMU], *10^-5 M

3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

timp, min
[DFHNA]o= 0 M
[DFHNA]o= 5*10^-5 M

[DFHNA]o= 1*10^-5 M
[DFHNA]o= 1*10^-4 M

Fig. I.3.3. Curbele cinetice de formare a NMU n funcie de [DFH4]0;

[NO2-]0 = 110-4M , [MU]0 = 110-4M , pH 1,0.

n acelai mod a fost studiat cinetica procesului de inhibiie, sub aciunea (+)-Ct,
utiliznd metoda extracional spectrofotometric (la = 235 nm); concentraiile
substratului i agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10-4M. Rezultatele experimentale obinute au demonstrat c cantitatea format de NMU la echilibru i viteza
iniial scade odat cu creterea concentraiei de inhibitor (Fig. I.3.4, Tab. I.3.5).
Tabelul I.3.5

[Ct]x105M
26

[NMU], % Vx108M s-1

Dependena vitezei de nitrozare

a MU de [Ct]0, pH 1,0, t = 37C,
[NO2-] = 104M, [MU] = 104M

0
1,0
5,0
10,0

100
92
80
50

3,50
2,47
1,90
1,61

Fig. I.3.4. Randamentul reaciei de nitrozare a MU

n funcie de [Ct]0;
[NO2-]0 = 110-4M, [MU]0 = 110-4M, pH 1,0, t = 37C.

Mecanismul de inhibiie ce are loc n prezena (+)catehinei sau DFH3Na n procesul de nitrozare a MU include interaciunea agenilor de nitrozare cu inhibitorii. n
rezultat, are loc transformarea agentului de nitrozare (NO+) n oxid de azot II, care nu
posed astfel de proprieti (ec. I.3.15):

(I.3.15)

Dac comparm vitezele pentru aceiai parametri n prezena DFH3Na i (+)-Ct

(Tab. I.3.4, I.3.5), constatm c viteza de nitrozare a MU n prezena (+)-Ct este mai
mic. Cota-parte de NMU format n sistem scade odat cu creterea pH-ului n intervalul 1-4, datorit creterii vitezei de nitrozare a MU odat cu creterea [H+]0, iar NMU
la echilibru scade odat cu creterea [Inh]0 (Fig. I.3.4).
Inhibiia procesului de formare a NMU a fost studiat la fel dup consumul nitriilor n sistem n funcie de natura reductorilor. S-a constatat c concentraia remanent de ioni nitrii este minim n cazul DFH4, iar viteza de consum NO2- este minim
n cazul cnd [Inh]0 = 0.
18
16.7

50

Wx107, Ms-1

50

14

40

12
30

10

30

6
20
4.5
10

16

15
8

3.5

4
2

27
remanent
[NO2-]

WNO2-

[NO2-] rem, %

60

Fig. I.3.5. Viteza de consum a NO2- i [NO2-] reman., n funcie de natura Inh;
[MU]0 = 1x10-4M, [NO2-]0 = 1x10-4M, pH 2,6, t = 37C.

Viteza de consum a ionilor nitrii este mai mare ca viteza de formare a NMU. n
sistemul NO2- MU activitatea inhibitoare crete n irul: DFH3Na < (+) Ct < DFH4

28

I.3.4. Denitrozarea N-nitrozometilureei

Proprietile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste
douzeci de ani. Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice n
mediul apos. Exist un ir de mecanisme de hidroliz, care determin viteza proceselor
i compoziia produselor. Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul,
compoziia ionic i organic a mediului, structura chimic a compusului, prezena
grupelor hidroxile. Hidroliza este catalizat de prezena att a acizilor, ct i a bazelor.
Pentru mono- i bisubstitueni ai ureei, ca prim etap a descompunerii hidrolitice, se consider ruperea protonului amidic de la atomul de azot de ctre baz (B-), iar
anionul format se rupe formnd diazotat i izocianat [140,141]:

(I.3.16)

Diazotaii formai la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importan, deoarece n

rezultatul unor transformri au loc procese ce duc la transferul compuilor alchil formai asupra centrelor nucleofile. n calitate de intermediari electrofili alchilici formai
sunt posibili diazocianii, acizii alchilcarbonici .a. [140], care n continuare pot interaciona cu ADN.
Izocianaii formai la fel sunt reageni electrofili, dar ei sunt mai stabili i nu interacioneaz cu ADN. Ei mai des interacioneaz cu proteinele dect cu acizii nucleici.
n medii acide, principala cale de descompunere hidrolitic este denitrozarea, catalizat de prezena acizilor i care are loc conform unui mecanism ionic [141]. Etapa
limitativ, care determin viteza procesului, este protonarea substratului.
Descompunerea N-nitrozometilureei catalizat de acizi are loc cu formarea NO+
i metilureei, dup urmtorul mecanism [142]:
H3O+ + CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N+H(NO)CONH2
(I.3.17)
+
+
CH3N H(NO)CONH2 + X XNO + CH3NHCONH2
(I.3.18)

NO+ + CH3NHCONH2
n cercetrile cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimic
a NMU a fost utilizat lampa cu mercur DRSH-50.
Fotoliza NMU a fost studiat la lungimi de und monocromatice diferite ( = 235 nm,
= 360 nm) i la iradiere total. Investigaiile cinetice ale descompunerii NMU n
funcie de diferii parametri fizico-chimici au fost efectuate n urmtoarele intervale de
concentraie: [NMU]o = 110-5-210-4 mol/l, T = 10-60C, pH 1,0-10,0.
Denitrozarea NMU
Din rezultatele cinetice prezentate n Figura I.3.7 constatm c procesul de denitrozare a NMU se intensific odat cu creterea temperaturii. Viteza procesului de denitrozare depinde de intensitatea razelor UV i de concentraia ionilor de hidrogen.
29

Conform [142,143], momentul de dipol al unui ir de NNA alifatice este de 3,9

4,4 D. Fapt ce atest polaritatea acestor molecule, determinat de delocalizarea perechii
de electroni de la azot, ceea ce atrage dup sine capacitatea de dislocare a perechilor
de electroni comuni:
R
R
N+ N = 0
NN=0
(I.3.19)
R'
R'
Structura i mobilitatea relativ nalt a -electronilor n moleculele de NNC determin reactivitatea lor nalt. n condiii acide viteza de descompunere a NMU se mrete
datorit deplasrii echilibrului (ec. I.3.20) n dreapta:
O N NCO NH2 H

[H O N NCO NH2 ]

HN CO NH2 NO

(I.3.20)
CH3

CH3

CH3

n rezultatul formrii cationului de nitrozoniu, care este un agent de nitrozare,

poate avea loc procesul invers de nitrozare i, n consecin, odat cu creterea [H+]
viteza de reacie sufer o variaie nensemnat (Fig. I.3.6).
n condiii bazice, reacia devine ireversibil i viteza de descompunere a NMU
se mrete brusc. Cationul NO+ (n forma H2NO2+) este legat de particulele ncrcate
negativ B-, conform reaciei:
H2NO2+ + B- NO+B- + H2O
(I.3.21)
Aceste circumstane pot fi evideniate la examinarea relaiei dintre pH i viteza de
descompunere a NMU (Fig. I.3.6). Dup cum se observ, viteza minim de descompunere corespunde pH 3,4. Dac la pH < 4 viteza de descompunere a NMU sufer o variaie nensemnat la micorarea pH, atunci la pH > 5 viteza crete exponenial [115,
127,130].

Fig. I.3.6. Viteza de descompunere a NMU

n funcie de pH; [NMU] = 1x10-4 mol/l,
t = 25C.

Fig. I.3.7. Viteza de descompunere a NMU n

funcie de temperatur; [NMU] = 1x10-4 mol/l,
pH 5,7.

Ecuaia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinat de relaia:
W = -d[NMU]/dt = {(kn + kH [H]+ + kOH [OH]} [NMU]o,
(I.3.22)
30

unde: kn- este constanta de vitez pentru descompunerea NMU la pH 5,7, egal cu
0,2x10-5 s-1; kH- constanta de vitez pentru descompunerea NMU n mediu acid, egal
cu 2,7210-9 l/mols; kOH constanta de vitez pentru descompunerea NMU n mediu
bazic, egal cu 5,3510-2 l/mols [115,130]. Influena temperaturii asupra vitezei de
descompunere a NMU este ilustrat n Figura I.3.7, iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate n
Tabelul I.3.6.
Tabelul I.3.6
Constantele vitezei de descompunere a NMU n f(to)
t, C
ko x105, s-1

1
0,1

15
0,68

25
1,59

40
2,56

50
4,18

60
6,36

Rezultatele prezentate n Figura I.3.7 i n Tabelul I.3.6 demonstreaz creterea

vitezei i a constantei de vitez pentru procesul de descompunere a NMU, odat cu
mrirea temperaturii. Energia de activare calculat, Ea, este de 59,80 kJ/mol. Descompunerea NMU sub aciunea radiaiei UV are loc cu mult mai rapid dect sub aciunea
luminii solare obinuite. Aceasta este cauzat de ruperea legturii >N-N< sub aciunea
razelor UV. Folosind ecuaia lui Arenius, la construirea dependenei kn n funcie de
t (oC) n coordonatele ln kn n f(1/t) a fost calculat energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV, care este de 47,61 kJ/mol [130].
Este cunoscut c N-nitrozoureele se supun uor descompunerii fotochimice. n
medii aprotonate prima etap n procesul de denitrozare fotochimic este ruperea homolitic a legturii ntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) i a radicalului ureei [140]. n lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontan.
Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU i ali derivai denot c n
forma redus anion-radicalic legtura ntre atomii de azot este mai slab dect n
starea de baz. innd cont de acest fapt, s-a presupus c reducerea monoelectronic
trebuie s duc la ruperea gruprii nitrozo- , ceea ce a fost constatat prin metodele
RES i RMN [143]:
(I.3.23)

Viteza de descumpunere a NMU n funcie de concentraia acesteia n cazul iradierii cu raze UV (spectru complet), cu raze = 360 nm i cu raze = 235 nm este
prezentat n Figura I.3.8.
N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitic a legturii N-NO i la
ruperea heterolitic produc NO+. Realizarea acestor produi formai la descompunere
din NNA n soluii poate fi stabilit cu utilizarea metodei Griess [143]. n spectrul
vizibil ( = 535 nm) are loc formarea diazocompuilor la interaciunea reagentului
Griess cu NO2-, ultimul formndu-se la oxidarea speciilor NO i NO+.
31

Fig. I.3.8. Viteza de transformare fotochimic a NMU sub influena razelor UV,
n funcie de [NMU]0; pH 5,7, t = 20C.

Astfel, denitrozarea NMU a fost studiat dup acumularea ionilor nitrii, care se
pot forma n rezultatul oxidrii NO cu oxigen. Valorile vitezelor de descompunere
a NMU, stabilite pentru diferite tipuri de iradieri n aceleai condiii experimentale
(concentraii de NMU, pH i temperaturi), pot fi aranjate conform irului [130]:
W1 > W2 > W3 > Wo ,
(I.3.24)
unde: W1 viteza de descompunere sub aciunea spectrului UV complet; W2 viteza
de descompunere sub aciunea razelor UV cu = 235 nm; W3 viteza de descompunere sub aciunea razelor UV cu = 360 nm; Wo viteza de descompunere n lipsa
iradierii. n Tabelul I.3.7 sunt prezentate constantele de vitez pentru procesul de descompunere a NMU sub aciunea razelor UV [130]:
Tabelul I.3.7
Constantele de vitez n procesul de descompunere a NMU
Constantele transformrii NMU

Condiiile experimentale

Valoarea constantei

ko, 1/s
k1, 1/s
k2, 1/s
k3, 1/s

Lipsa iradierii
Spectrul UV complet
= 235 nm
= 360 nm

1,5910-5
2,3010-5
9,110-5
2,410-5

Din rezultatele prezentate n acest Tabel constatm c NMU se descompune mai

rapid sub aciunea razelor UV cu = 235 nm.
Prin analogie cu procesul de nitrozare, s-a studiat influena diferitelor adaosuri
asupra denitrozrii NMU, i anume: a ionilor metalelor Fe(II), Cu(II), Mn(II), a reductorilor (acidul ascorbic, dehidroxifumaratul de sodiu, reductonul trioz), a oxidanilor (peroxidul de hidrogen, reagentul Fenton). Concentraiile ionilor metalelor au fost
variate n limitele 1,010-75,010-5 mol/l. Efectul reductorilor i al oxidanilor a fost
investigat n limitele 1,010-65,010-4 mol/l [116].
32

n limitele concentraiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de

descompunere a NMU. S-a constatat c n absena catalizatorilor (acizi, baze) NMU
nu se reduce cu astfel de reductori cum este ascorbatul, ditionitul. n organismele vii,
rolul principal n denitrozarea alchilureelor l are NADP-H citocrom-P450-reductaza,
enzim (transfer monoelectronic) ce posed activitate de reductaz, iar n calitate de
donor de electroni este NADP-H.

Concluzii
Principala contribuie n procesul de nitrozare a metilureei o are reacia ce implic
ionul de nitrozoniu NO+. Agentul de nitrozare N2O3 reacioneaz mai lent. Constantele experimentale de vitez ale interaciunii NO+ i N2O3 cu metilureea sunt
egale cu 4,36108 M-1s-1 i 8,35106 M-1s-1, respectiv.
Viteza de formare a NMU se mrete (spre deosebire de aminele secundare)
odat cu mrirea concentraiei H+. n diapazonul de pH de la 1,0 la 4,0 viteza are
valoarea maxim la pH 1,0.
Utilizarea acidului dihidroxifumaric i a (+)catehinei n procesul de nitrozare a
MU cu NO2- duce la micorarea cantitii de NMU format. Activitatea inhibitoare
a acidului dihidroxifumaric este mai nalt dect cea a (+)catehinei.
La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparin
atomului de azot cu rupere ulterioar a legturii >N-N< sub influena temperaturii
i iradierii cu raze UV.
Au fost calculate constantele de descompunere a NMU n funcie de pH, temperatur i pentru diferite domenii de iradiere. S-a constat c constanta vitezei de
descompunere a NMU n procesul fotochimic este mai nalt dect n procesul ce
are loc n lipsa iradierii. Acest fapt demonstreaz influena benefic exercitat de
razele UV asupra procesului de distrucie a N-nitrozoamidelor puternic cancerigene. Un efect similar asupra descompunerii NNA exercit mrirea pH-ului i
mrirea temperaturii.
n baza datelor cinetice au fost calculate mrimile energiei de activare a proceselor
chimice de descompunere (Ea = 59,8 kJ/mol) i fotochimice (Ea = 47,61 kJ/mol).
Datele cinetice obinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicitii mediului
apos i a produselor alimentare, cauzat de prezena N-nitrozoaminelor.

33