Macovei Monica Nitrozamine

NITROZAMINE
Compuii N- nitrozo Compuii N- nitrozo au devenit tot mai importani datorit proprietilor cancerigene a majoritii acestora. Se cunosc peste 100 de asemenea compui, dintre care majoritatea s-au dovedit a avea proprieti cancerigene la diferite specii de animale, printre care i la primate. Compuii N- nitrozo au fost evideniai n majoritatea produselor alimentare, n fumul de igar, aerul urban, produse chimice agricole, cosmetice i medicamente. Suntcompui care se pot forma ,,in vitro dar i ,,in vivo avnd ca precursori substane care se gsesc n mod natural n alimente, de aceea problematica abordrii acestor substane devine tot mai complex. n acest sens i domeniul sanitar- veterinar este interesat sub diferite aspecte de aceste probleme, domeniu vare poate lmuri intr-o faz primar mai multe din necunoscute. 1. Nitrozaminele Sunt substane obinute prin aciunea acidului nitros cu o amin secundar sau cu un acid aminat fiind prezent, de asemenea, i gruparea N- nitrozo. Radicalii nitrozaminelor pot fi reprezentai de grupri alchilice, arilalchilice sau de derivai heterociclici. n funcie de prezena acestor grupri, nitrozaminele pot fi clasificate astfel: A) Dialchilnitrozamine care pot fi: a) simetrice: Dimetilnitrozamina(DMN); Dietilnitrozamina(DEN); Dipropilnitrozamina(DPN); D-n-butilnitrozamina(DBN). b) asimetrice: Metiletilnitrozamina(MEN). B) Diarilnitrozamine: Difenilnitrozamina(DFN). C) Arilalchilnitrozamine: Etilfenilnitrozamina(EFN); Benzil n-nitrozo-fenilamina(BNN). D) Derivai heterociclici: Nitrozopirilidina; Nitrozoprolina; Nitrozopiperidina. 1.1. Formarea nitrozaminelor Formarea nitrozaminelor presupune prezena unor substane de nitrozare, cei mai cunoscui ageni fiind nitraii n prezena mediului acid care se convertesc n acid nitros instabil. Agenii nitrozani implicai intr-un mod activ, n realitate sunt reprezentai de anhidrida nitroas(N2O3), nitroziltiocianatul(SCN-N=O), halogenura de nitrozil(N=O). Viteza de nitrozare este proporional cu felul aminelor, dar i cu existena nitritului, condiiile reale de formare depind foarte mult de urmtorii factori principali: pH-ul mediului, natura aminei, temperatura i prezena agenilor catalizatori sau inhibitori.

Macovei Monica Nitrozamine

Fig. 1. Schema general a formrii nitrozaminelor i implicaiile acestora in organismul uman. Influena pH-ului Aminele secundare sunt nitrozate ntr-un mediu acid, iar procentul maxim de nitrozare al dimetilaminei descrete cu un factor de 10 pentru fiecareunitate de Ph cuprins ntre 5 i 9. Natura aminei Alturi de felul aminei i bazicitatea acesteia, natura aminei reprezint o nsuire fundamental n a influena viteza de nitrare. De exemplu, difenilamina, care este mai puin bazic, se nitrozeaz de 1000 de ori mai repede dect dialchilaminele, care au un caracter profund bazic. i coninutul alimentelor n amine influeneaz formarea nitrozaminelor, existnd un prag al dependenei n funcie de natura aminei, dincolo de care randamentul devine crescut. Acesta poate reprezenta aproximativ 1000 ppm n cazul prolidinei i 2000 ppm n cazul dimetilaminei. 1.2. Ageni catalizatori sau inhibitori Prezena taninurilor (n ceai, sucuri de fructe) n concentraii sporite fa de cele ale nitriilor duce la inhibarea formrii nitrozaminelor, dar fr o blocare total a procesului. Dac concentraiile sunt mai sczute fa de nitrii efectul inhibitor face loc unuia catalitic, cu un maxim la un pH=4, n cazul dimetilaminei. Acidul galic reduce, de asemenea, n mod egla formarea nitrozaminelor. Mirvish (1972), demonstreaz c ascorbaii pot bloca formarea dimetilnitrozaminei, NO-morfolinei, NOmetilaminei. Acest efect inhibitor se manifest puternic la un pH cuprins ntre 3 i 4, dac raportul molar escorbat/nitrit este superior sau egal cu 2. Adugarea acidului ascorbic n produsele alimentare face s se diminueze formarea nitrozaminelor. Att ,,in vivo ct i ,,in vitro, acidul ascorbic poate preveni formarea nitrozaminelor, fapt observat de Weisburger (1975) ntr-o populaie dintr-o anumit regiune a
2

Macovei Monica Nitrozamine

Japoniei, unde incidena cancerului gastric este crescut datorit consumului ridicat de pete tratat cu nitrii. Confirmarea epidemiologic a putut fi demonstrat fa de populaia care a consumat pete conservat cu nitrii, dar la care s-au adugat i ascorbai, ct i fa de regiunile unde populaia a consumat cu preponderen legume sau alte surse de vitamina C, cnd incidena cancerului a fost mult mai mic. Efectul inhibant al acidului ascorbic n formarea nitrozaminelor a putut fi demonstrat i pe oarecii hrnii cu raii bogate n nitrii, n concentraii care au favorizat apariia tumorilor, iar Walters (1976), demonstreaz acelai efect fa de unii antioxidani. Agenii de catalizare n formarea nitrozaminelor sunt reprezentai i de tiocianai, prezeni n saliv n cantiti medii de 129 ppm, n sucul gastric 34 ppm, fumtorii concentrnd de 3 ori mai mult tiocianaii. Cnd se admit cantiti sporite de nitrai i morfin, mpreun cu acidul ascorbic, mutagenitatea dispare, aprnd din nou activitatea antimutagenic a vitaminei C, care este cunoscut ca reductor a anhidridei nitroase n acid nitric, aceast reacie micornd cantitatea de anhidrid necesar formrii nitrozaminelor. Pentru o persoan de 60 kg o cantitate de 900 mg acid ascorbic este considerat un nivel sczut. Aciunea unor bacterii poate duce la derularea unor reacii de nitrozare, fapt confirmat de Sander (1969), Huynh Cong i Jaquet (1973). Autorii respectivi au prezentat posibilitatea formrii nitrozaminelor chiar n mediu neutru sau bazic prin aciunea unor sue de E. Coli. 1.3. Proprieti fizico-chimice Modalitatea n care sunt substituii radicalii R1 i R2 face s fie diferene ntre nitrozamine n ceea ce privete proprietile fizico-chimice. La temperatura obinuit, nitrozaminele se prezint sub form lichid, n cazul dimetilnitrozaminei sau sub form solid n cazul dipropilnitrozaminei. Dialchilnitrozaminele sunt miscibile n ap dar i n numeroi solveni organici (eter, alcool, cloroform, diclormetan i hexan), temperatura de fierbere este cuprins ntre 150-220oC, avnd o culoare galben sau verzuie - glbuie. Datorit faptului c prin reacia de condensare crete cantitatea de carbon, volatilizarea lor crete,fapt ce permite i o eventual clasificare, din acest punct de vedere existnd nitrozamine volatile i nevolatile. Majoritatea nitrozaminelor se descompun relativ uor la UV, rezultnd amine secundare i acidul nitros. Nitrozaminele, datorit structurii lor chimice, pot participa la reacii chimice cum ar fi: hidroliza, reducerea, absorbie n UV la 245 i 330 nm. De obicei, formarea i comportarea compuilor N-nitroi este urmrit la 310-350 nm. O alt caracteristic a acestor compui este proprietatea de a fi examinai prin chemiluminiscen folosind analizorul termal de energie pentru a evidenia oxidul de azot eliberat. Deci, compuii N-nitrozai pot fi analizai folosind spectrofotometria n UV i IR, iar totalul derivailor N-nitrozai sunt msurai prin chemiluminiscen. Totui, detectarea compuilor respectivi, precum i estimarea concentraiei lor se face dificil deoarece: concentraia n medie este de ordinul microgramelor/kg (1/109); prezena lor poate fi decelat intr-un numr complex de produse alimentare sau biologice; foarte muli constituieni conin azot i dau reacii asemntoare; compuii N-nitrozo cu masa molecular mic sunt relativ uor de extras din produse, fiind antrenabili n vapori, folosirea acestei metode este exclus pentru identificarea compuilor N-nitrozo nevolatili. Reacia de nitrozare crete cu lungimea legturilor peptidice sau cu greutatea molecular a peptidelor. Valorile de examinare UV i
3

Macovei Monica Nitrozamine

totalul compuilor N-nitrozo cresc n concordan cu acetia(poliaminoacizii). Pollock (1985) demonstreaz formarea acidului nitrozoiminodialleanoic n timpul nitrozrii dipeptidelor, chiar dac e folosete un mediu foarte acid i timpul de reacie este foarte lung (16 ore). Hidroliza. Este o proprietate folosit pentru extragerea nitrozaminelor dintr-un mediu acid diluat, datorit faptului c nitrozaminele rezist bine la hidroliz, stabilitatea lor ,,in vivo fiind demonstrat. Denitrozarea se poate face n acid acetic glacial n prezena acidului bromhidric sau n prezena altui acid ce rezist la fierbere. Reacia este invers celei de sintez cu eliberarea acidului nitros. nsuirea respectiv st la baza testului Libermann -nitrozo n care acidul nitros, eliberat n prezena unui fenol, d un compus colorat n rou( n mediu acid), care devine bleu- albastru n mediu alcalin diluat. Reducerea. Prin reaciile de reducere, nitrozaminele se transform n hidrazin sau n amine secundare. Reacia de reducere depinde de valoarea pH-ului, astfel c prin studiul DMN, N- nitrozomorfolinei, N- metilalanilinei i N- nitrozodifenilalaninei la un pH cuprins ntre 0,2- 12,5, se demonstreaz c n mediul c n mediul acid se obine 80% hidrazin, iar n mediul alcalin se formeaz amine secundare i oxid nitros. Agenii de reducere frecvent utilizai sunt: zincul, hidrura de aluminiu i de litiu i amalgamul de sodiu. Oxidarea. Reprezint o reacie chimic n care nitrozaminele sunt transformate n nitramine sub influena unor ageni oxidani de tipul acidului pertrifluoracetic sau acidului nitric. Sunt situaii cnd reacia de oxidare poate duce la transformarea nitrozaminelor n aldehide cu eliberarea de ioni NO+. 1.4. Clasificarea nitrozaminelor dup origine Aprecierea nivelului de expunere al consumatorului la diferitele nitrozamine presupune cunoaterea principalelor elemente de formare a acestora n funcie de proveniena lor. De aceea, dup origine, nitrozaminele se clasific n endogene i exogene. Nitrozaminele endogene Aceste tipuri de nitrozamine sunt analizate n special prin intermediul principalilor precursori, reprezentai de nitrii i nitrai, reinndu-se totui greutatea de evaluare precis a precursorilor respectivi. Fiecare produs alimentar are o gam foarte variat n ceea ce privete concentraiile n nitrai i nitrii. Aceast varietate face dificil stabilirea unei compoziii standard, mai mult, fiecare produs poate fi preparat i consumat n diferite modaliti cu diferite tehnici de preparare, consumatorii neurmrind n mod strict un anumit model alimentar, la care se mai adaug i imposibilitatea stabilirii unui consum individual de alimente cu tehnicile de prelucrare i gtire pentru fiecare produs. Evaluarea cantitilor nu corespunde ntotdeauna cu cele ingerate n realitate, cu toate c n studiile de control epidemiologic toate ntrebrile au fost puse n acelai mod, urmrind acelai protocol. De aceea, majoritatea autorilor au fost de acord c n lapte i n produsele lactate concentraiile pot fi sczute. Dimpotriv, s-ar crede c brnza ar conine cantiti mai mari. Exist mai puine informaii despre carnea proaspt, abundnd sursele de date despre carnea prelucrat, conservat, srat, uscat i afumat, cu toate c n unele ri acestea
4

Macovei Monica Nitrozamine

constituie o surs secundar pentru nitrai i surs principal pentru nitrii. Oricum, este foarte dificil de estimat concentraiile nitrailor i nitriilor pentru c acestea potvaria foarte mult n funcie de produs i metodele de prelucrare i preparare. Produsele vegetale au un aport sporit n nitrai i nitrii, cu toate c aceste concentraii pot varia n funcie de sezon, lumin, poriunea plantei, vrsta plantei, fertilitatea solului, intensitatea luminii, metoda de depozitare, prelucrare i gtire. Coninutul de nitri al apei potabile este un factor important pentru a determina expunerea omului la eventualele surse de contaminare. Concentraiile sunt extrem de variabile, iar valorile sunt diferite de la o ar la alta, de la o regiune la alta. n Frana, de exemplu, s -au gsit unele ape improprii pentru consum.(50-150 mg/l). Nitrozamine exogene Unele produse alimentare conin nitrozamine, pn n prezent fiind identificai mai mult d e 15 asemenea compui, frecvent mprii n nitrozamine volatile i nevolatile. Cea mai cunoscut este dimetilnitrozamina care poate fi identificat de multe ori dificil, proces influenat de tehnicile de analiz folosite i procedeele de preparare i gtire ale produselor alimentare. n general, autorii sunt de acord c oule, carnea proaspt, pinea, produsele cerealiere, uleiurile, untul, legumele crude, fructele proaspete, dulciurile i apa conine cantiti foarte mici de NDMA sau chiar deloc. Crnurile prelucrate, conservate, afumate, srate sau uscate reprezint o important surs de nitrozamine. Concentraiile n carnea conservat afumat pot fi uneori inferioare celor gsite n carnea conservat neafumat, fapt explicat n zilele noastre prin faptul c n realitate unele produse alimentare nu sunt afumate, dar prelucrarea lor s-a efectuat cu diferite produse chimice care imprim aceast nsuire. Privitor la dimetilnitrozamin se poate aprecia pe de o parte o mare discrepan ntre valorile artate, iar pe de alt parte o important reducere a acestor compui, datorit mbuntirii tehnicilor de prelucrare i pregtire a produselor alimentare. Aceast reducere nu poate pentru moment s fi extins sistematic n ri, cum ar fi China i Japonia, unde petele srat i uscat, legumele fermentate i murate care conin cantiti sporite de nitrozamine, sunt adesea consumate, reprezentnd obiceiuri alimentare. 1.5. Aprecierea riscurilor pentru sntate Se cunoate faptul c precursorii compuilor N-nitrozo (nitrii, amine, amide) sunt larg rspndite n mediul nconjurtor. Acetia sunt prezeni i n alimente, iar studiile efectuate pe animale demonstreaz c acetia se formeaz i n organism, ducnd mai departe la sinteza compuilor N-nitrozo. Aceste procese se pot produce n egal msur i la om. Compuii Nnitrozo sunt cancerigeni pentru toate speciile de animale, iar cea mai mare parte a lor sunt mutageni n sistemele experimentale diferite. Este foarte greu de evaluat riscul cantitativ al cancerigenitii pentru om ntruct expunerea la compuii N- nitrozo i la precursorii lor (nitrii, amine, amide) este uoar i posibil.

Macovei Monica Nitrozamine

Cei mai rspandii N-nitrozocompui ce se formeaz in produse alimentare sunt urmtorii:

1.6. Prezena nitrozaminelor n alimentele de origine animal 1.6.1. Prezena nitrozaminelor n produsele pe baz de carne

Principalele alimente incriminate n decelarea nitrozaminelor sunt reprezentate de pete i produse din pete, carne i produsele rezultate i mai puin laptele i derivatele obinute. Prezena n pete. Carnea de pete, mai cu seam de pete marin, poate conine o gam variat de nitrozamine. Compuii N- nitrozai provin datorit prelucrrii tehnologice. Somonii conin, de exemplu, aproximativ 4 ppb dietilnitrozamin, petele afumat 4-9 ppb, petele tratat cu nitrii sau nitrai 8-14 ppb, iar petele afumat i tratat cu nitrai 20-26 ppb. Procentul de nitrozare este favorizat de afumarea gazoas ce poate conine urme de NO2-. Cantiti sporite de nitrozamine au fost identificate la petele crud, srat i uscat, comercializat pe pieele Extremului Orient, astfel c dimetilnitrozamina a reprezentat 0,6-9,0 ppm. (Fong, 1971), Crosby i colab., Howe i colaboratorii (1986) gsesc concentraii de NDMA cuprinse ntre 0 i 35 g/kg.
6

Macovei Monica Nitrozamine

Actual se cunoate c factorul cldur, produs n special sub form de gaz, determin o cretere a concentraiilor de nitrozamine. Rezultate asemntoare au fost publicate de Hawery i Fazio (1977) n USA , de Iyengar si colab. n Canda i Suedia. n petele srat, uscat sau conservat concentraiile difer de la o ar la alta i n funcie de metodologia folosit. Petele chinezesc srat cu clorur de sodiu contaminat cu nitrai poate conine de la 6 la 20 g/kg NDMA. (Fong i Chan, 1976). Concentraii de la 0,5 la 5 g/kg NDMA s-au gsit n macroul srat crud, n scrumbiile din Oceanul Pacific, heringi (Preussmann i Eisenbrand, 1984) pe cnd Maki i col. (1980) raporteaz concentraii de 3-34 g/kg n probele de pete srat. n funcie de tehnica de prjire, concentraia de NDMA n petele srat poate ajunge la 300 g/kg (Ohishima i col. 1981). Walker (1990) a gsit concentraii de 1-9000 g/kg NDMA, depinznd de provenien (origine geografic) i de metodologia de prelucrare, iar dup Pignatelli (1983) pot atinge valori pn la 45 g/kg. Tricker i Preussmann (1988) afirm c i stridiile afumate pot conine unele nitrozamine. Adugarea nitrailor n srurile utilizate la srarea petelui, urmat de contaminarea cu bacterii bogate n nitrat-reductaz explic existena acestor valori. Fung i Chan (1973,1974) au izolat din acest pete sue de stafilococi cu echipamente enzimatice foarte reductoare, demonstrnd de altfel , i importana condiiilor igienice de stocare a produselor alimentare. Finurile de pete conin, de asemenea, nitrozamine, fiind observate i cazuri de intoxicaii alimentare la animalele domestice care au fost hrnite cu asemenea finuri (Sen, 1972). Bohler (1962) i Koppang (1964) au fost primii care au observat i demonstrat efectele nocive ale finurilor de pete conservate sub influena nitritului de sodiu. Tehnica respectiv fiind adoptat i de unele fabrici din Norvegia, face ca n 1964 s fie semnalate n aceast ar intoxicaii acute la diferite specii de animale domestice hrnite cu finuri tratate n acest mod. Un coninut de 0,12-4,5 ppm dimetilnitrozamin a fost evideniat i n fina de pete care a provocat accidente hepatice la vizonii canadieni. Referindu-se la carnea proaspt, Gouch i col.(1978) raporteaz o prob din 36 coninnd dialkilnitrozamina, n concentraie de 2 i 0,2 g/kg. Stephany i Schuller (1980) raporteaz valori aproximative de 0,1 g/kg pentru carnea de viel, cu 29% probe pozitive. n carnea crud nitrozaminele nu sunt prezente, apar ca urmare a prelucrrii tehnologice cu att mai mult dac se utilizeaz i nitriii. Concentraia lor crete sub aciunea unor factori cum ar fi fumul, unele condimente i modul de pregtire (Iyenegar, 1976; Schaffner, 1976; Hildrum, 1977). Cu privire la carnea conservat i depozitat, Pignately (1983) a estimat un coninut de 3-4 g/kg nitrozamine volatile la carnea afumat, conservat sau depozitat i crete la 48 g/kg pentru carnea condimentat. n 1988 Tricker i Preussmann, n urma unui studiu referitor la carnea de vit i produsele din carne conservate consumate n Germania de vest sau gsit nitrozamine volatile n 52% din probele analizate. n 50% din probe, concentraiile de NDMA au fost mai mici de 5 g/kg i n 2,1% au fost mai mari. ntr-un studiu efectuat de Panalakas (1973) pe un eantion de 195 de probe, 57 produse au coninut 2-12 ppb dimetilnitrozamin. n Canada, Sen (1969), analiznd 100 de produse carnate a gsit concentraii de 2-50 ppb n dimetilnitrozamin sau dietilnitrozamin, nitrozopiperidin, acestea din urm rezultnd prin nitrozarea piperidinei din condimente i a prolinei din carne.

Macovei Monica Nitrozamine

Produsele fr conservant (unca .a.) n mod normal nu conin NDMA, dar nitrozopirolidina se afl n concentraii crescute (NDMA fiind volatil se evapor pe durata nclzirii- Tricker i col. 1985; Sen i col. 1987). Knowles (1975) a cercetat n special nitrozarea ce se desfoar n bacon. Afumarea realizat tradiional, prin suspendarea jambonului deasupra focului de lemne, s-ar putea realiza i prin pulverizarea sau imersarea jambonului n lichid. Analizele efectuate n produsele obinute, n variantele respective au artat prezena numeroilor compui fenolici nitrozai. n ultimii ani, n unele ri au fost dezvoltate tehnicile de reducere a concentraiilor nitrozaminelor la aceste produse prin micorarea dozelor de aditivi i nitrai pe de o parte i prin adugarea de inhibitori ai nitrozrii, pe de alt parte, cum ar fi acidul ascorbic. Sen (1976) a observat c 10-30% din nitrozaminele coninute de baconul afumat provin datorit decarboxilrii acizilor nitrozaminai. Carnea de pasre poate conine 1-5 g/kg NDMA, cu deosebire puii gtii. Referitor la carnea de pasre crud se pare c valorile sunt peste ateptri. Pentru ou, Hotchis (1987) gsete 0,2 probe pozitive, iar Howe i col. (1986) raporteaz valoarea 0. i n conservele de carne, Dhont (1976) constat un coninut ridicat de nitrozoprolin (0,340-0,440 ppm) i nitrozosarcozin (10 ppb). La elementele precursoare din alimente se mai adaug i compui normali ai anumitor condimente (piper, ardei iute) care se transform n nitrozopirolidin i nitrozopiperidin sub influena i n prezena nitriilor. Primele studii referitoare la uleiul comestibil nu au fost apreciate ca fiind destul de semnificative. Hedler i col. (1979) au gsit concentraii de NDMA i NDEA de 23 i 28 g/kg, n 33% din cele 61 de probe analizate. 1.6.2. Prezena nitrozaminelor n lapte i produse lactate

Pignalelli (1983), referindu-se la Sen i col.(1980 i 1982) a raportat valori de la 0,05 la 4,5 g/kg cu o frecven de 66,7% probe pozitive. Pentru laptele pasteurizat Gray (1981) a gsit valori ntre 0,05 i 0,17 g/kg. n general, cercettorii consider c laptele conine un nivel sczut de nitrozamine, dar acestea pot fi gsite ocazional sub form de urme, n laptele praf se gsete aproximativ 0,6 g/kg. Referitor la iaurt i alte produse lactate acide Gough i Hotchkiss au gsit 0 probe pozitive din cele 16 testate, iar Klein a raportat doar urme de NDMA n iaurt i brnza proaspt.
8

Macovei Monica Nitrozamine

i brnza a constituit subiectul numeroaselor cercetri la care Howe i Gough, au gsit concentraii de 0,05 la 20 de g/kg NDMA, din care 55% fiind probe pozitive. Centrul Naional de Cercetare din SUA raporteaz concentraii de la 1 la 5 g/kg, iar Gough concentraii de la 0,01 la 10 g/kg. Din 209 probe analizate de Eisenbrand s-au gsit 0,5% probe pozitive coninnd NDMA cu 1 pn la 6 g/kg. n alte 30 de probe au fost gsite concentraii de 0,5 pn la 0,9 g/kg. Un studiu efectuat pe mai multe tipuri de brnz din Danemarca dar i din alte ri din Europa, s-au gsit numai 2% probe pozitive la NDMA ce conin concentraii cuprinse ntre 0,3 i 3,6 g/kg. 1.7. Alte condiii de formare a nitrozaminelor i prezena lor n diferite produse Marea diversitate a aspectelor demonstreaz formarea complex a nitrozaminelor, existnd o proporie ntre concentraia iniial a nitriilor sau nitrailor i coninutul de nitrozamine formate. Pot fi ns i anumite situaii nefavorabile legate de urmtoarele condiii: cnd se utilizeaz cantiti importante de nitrai sau nitrii, depind posibilitile de fixare natural (prezena nitriilor reziduali); anumite nitrozamine se produc n cantiti mai crescute dect altele, cum este cazul nitrozopirolidinei; N-nitrozo-3-hidroxipirolidina (NHPHR) a crei activitate biologic nu este bine cunoscut a fost decelat n produsele de carne (mezeluri). Au fost descrise dou moduri de formare a nitrozaminelor: prin interaciunea direct a aminelor i nitriilor; nitrozarea aminoacizilor. Temperatura poate influena apariia anumitor nitrozamine. De exemplu, prolina nitrozat la 175oC face s apar nitrozoprolina, iar prin nitrozare la 100-150oC se transform n pirolidin care mai departe d natere nitrozopirolidinei. Aceste aspecte demonstreaz c acizii nitrozaminai joac un rol important n formarea nitrozaminelor. Fa de cele cteva aspecte tratate, se consider c alimentaia omului este o surs variat de nitrozamine.Druckrey (1962) a pus n eviden pentru prima dat formarea nitrozaminelor pornind de la combustia tutunului.Compuii nitrozai se formeaz n timpul arderii i proporional cu coninutul iniial n nitrai i amine. igrile pot conine nitrai ntre 0,2 i 1% (putnd ajunge pn la 6% n anumite cazuri). Datorit arderii, aminele degajate sunt puse n contact cu nitraii producnd cantiti de pn la 84 nanograme de dimetilnitrozamin i 30 de nanograme de etil-metilnitrozamin pe igaret. Principalele amine identificate au fost: anabasina, cornicotina, dimetilamina, pirolidina, metiletilanina, dietilamina, piperidina,prolina

Macovei Monica Nitrozamine

i nicotina. Omul poate fi expus la nitrozamine datorit prezenei acestora n mai toate mediile, contaminarea ns poate mbrca o mare diversitate. ntr-un studiu efectuat de Mavelle T. i col.(1991), se demonstreaz prezena NDMA n bere, chiar n cursul primelor etape ale fluxului de obinere. Dimetilamina i cei doi alcaloizi, gramina i ordenina sunt principalii precursori ai dimetilnitrozaminei. n urma descompunerii pariale a alcaloidului ordenin rezult dimetilamina care se nitrozeaz n prezena oxidului de azot prezent n aerul cald cu care se realizeaz nclzirea malului. Mecanismul de nitrozare propus pentru gramin poate fi prezentat in felul urmtor:

Dup Cuzick i col. (1989) fumtorii care consum mai mult de 3,5 litri de bere pe sptmn sunt mult mai expui la cancerul pancreasului.

1.8. Toxicologia nitrozaminelor Interesul consacrat studiului toxicitii nitrozaminelor a fost provocat n urma celor 2 cazuri de intoxicaii profesionale cu dietilnitrozamina (solvent n industria automobilelor) studiate de ctre Barnea i Magea n 1954. Aceiai autori au semnalat i demonstrat aciunea puternic hepatocarcinogen, dnd o amploare crescut problemei nitrozaminelor.

10

Macovei Monica Nitrozamine

Toxicitatea acut a nitrozaminelor este variabil: DL50 per os la obolan variaz ntre 5 mg/kg pentru diciclohexil-nitrozamin i crete cnd scade lungimea lanului hidrocarbonat pentru dialchilnitrozamine, iar dietilnitrozamina are DL50 de 10 ori superioar fa de DMN. Nitrozaminele ciclice, cum ar fi N-nitrozohexametilen i N-nitrozomorfolina, au de regul o toxicitate acut crescut. Nitrozaminele manifest toxicitate moderat. Dialchilnitrozaminele, cu cteva excepii, produc la diferite specii de animale o necroz hepatic centrolobular; nitrozaminele ciclice (nitrozopiperidina, nitrozomorfolina) manifest efecte semntoare. n medicina veterinar intoxicaiile accidentale au fost mai rare, cazurile raportate referindu-se la o hepatit zis toxic provocat de fina de hering administrat bovinelor i ovinelor din Norvegia. Clinic, intoxicaia evolueaz pe o perioad mai mic de o sptmn, predominnd sindromul depresiv manifestat prin abatere, apatie i anorexie total. Tulburrile digestive (colici) i hipertermina sunt inconstante. A fost observat prezena unui miros particular, descris ca aromatic, fecal i usor acetonic n respiraie sau n laptele bovinelor. Studiul necropsic scoate n eviden leziunile hepatice ca cele mai importante: tipul acut sau cronic se manifest prin ficatul granulos, gri- brun, histologic caracterizandu-se printr-o necroz sau fibroz obliterant. Alte constatri inconstante se refer la prezena edemului subcutanat sau stomacal (submucus), existena unui exsudat clar, uneori sangvinolent n caviti i splenomegalie. n formele supraacute sunt observate diverse leziuni de tip hemoragic (peteii, echimoze) la nivelul tractusului digestiv sau al aparatului respirator. La nivelul anilor 1960, dup mai multe dificulti, cercettorii norvegieni au stabilir originea unor asemenea endemii: fabricanii de fin de pete au nlocuit clorura de sodiu cu nitritul de sodiu. Fina s-a dovedit toxic atunci cnd nitritul a fost introdus la nceput nu la sfritul procesului de fabricare, deducndu-se c substanele toxice se formeaz n fin pornind de la nitrii n timpul preparrii. n 1965, Sakshang reproduce cu DMN aceleai simptome i leziuni la ovine. Analiza eantioanelor de fin incriminat au relevat prezena a 30-100 ppm DMN. 1.8.1. Evaluarea toxicologic Este unanim acceptat prezena nitrozaminelor n mediul nconjurtor ca elemente preformate sau sintetizate in vivo. Sursele de contaminare sunt extrem de multiple, iar natura foarte variat a precursorilor nglobeaz numeroase substane naturale. Experienele folosite au demonstrat c nitrozaminele au efect puternic cancerigen; dozele active pot fi de ordinul a 0,1 mg/kg, carcinogenitatea, putndu-se observa dup o singur administrare, toate speciile testate fiind sensibile, iar efectele fiecrei doze fiin ireversibile i cumulative. Ali autori consider c leziunile induse de DMN ar fi ireversibile; mecanismele de revenire sunt cunoscute, fenomene ce pot sugera c efectul dozelor succesive nu este cumulativ. Dimman i Claus afirm c exist o doz fr efect (nivel fr efect) estimat la 104 molecule pe celul. Echivalentul molecular al acestor valori poate fi exprimat innd cont de urmtoarele aspecte: - dup compararea acestor valori un aliment cuprinde 3 ppb DMN i reprezint acelai risc ca i altul cu 50 ppb nitrozamine. - la scar celular, alimentele cu un coninut foarte mare de nitrozamine nu aduc dect 100 mol./celul, cifr mult inferioar celei de 104 din doza fr efect.
11

Macovei Monica Nitrozamine

Cercettorii anglo- saxoni evalueaz riscul reprezentat de baconul ingerat cotidian la micul dejun astfel: considernd baconul cu 15 ppb nitrozamine (media de ingerare n 2 trane, deci 7g 2), cantitatea cotidian absorbit de un individ de 50 kg este de : greutate corporal. Presupunnd c nitrozamina ingerat este dietilamina, la care cea mai redus doz cancerigen ( la obolan) este de 75 g/kg/zi, rezult raportul: ceea ce demonstreaz c aceast substan se dovedete experimental activ la o concentraie de 18000 de ori superioar celor din aliment. Aceste valori sunt conexate i n funcie de longevitatea individului. Cu ct individul triete maimult cu att riscul fenomenelor tumorale crete, omul trind de 20 de ori mai mult dect obolanul se ajunge la un raport de 1/900. De exemplu, pentru 75 g/kg frecvena cancerului n populaia roztoarelor este de 71%. n acste condiii, riscul maxim pentru om poate fi : 0,71 1/900 =0,008 sau 0,08% sau 8 la 10.000. Toate studiile cancerigene sunt de acord c produsele chimice i demonstreaz efectul cu att mai trziu cu ct doza este mai mic. Aceasta nu nseamn c acest punct de vedere este universal admis i c nu exist numeroase argumente care ndeamn la pruden.

1.9. Studii experimentale pe animale Koppang (1974) realizeaz intoxicaii experimentale la porci i bovine stabilind c doza hepatotoxic este de 12-26 mg DMN/kg la rumegtoare i 282 mg/kg (dup 105 zile) la porcine, acestea dovedindu-se a fi foarte rezistente. Pentru animalele de experien, cea mai important activitate biologic a acestor compui const n cancerogenitate i teratogenitate. De obicei, calea de administrare nu influeneaz organul int i tipul tumoral indus. S-a demonstrat cancerigenitatea compuilor N-nitrozo i pe cale transplacentar n cazul cnd acetia sunt administrai n a doua parte a gestaiei. Aciunea mutagen a nitrozaminelor observat n sistemul eprubetelor, difer de cea a nitrozaminelor, acestea manifestndu-se i sub influena unei activri metabolice. Nitrozaminele au un efect toxic, uneori letal, asupra emrionilor animalelor, iar nitrozamidele produc malformaii n numeroase organe, sisteme sau aparate. ntr-un studiu efectuat de A. Perez i col. (1990) n Cuba privind mutagenitatea N nitrozomorfolinei biosintetizat de ctre morfolin n prezena nitrailor i inhibarea acesteia de ctre acidul ascorbic, autorii arat c nitratul i morfolina nu pot induce activitatea mutagenic per os, cu toate c sunt situaii cnd apar aceste manifestri. Acestea se presupune c ar fi efectul biosintezei N- nitrozomorfolinei realizat prin reducerea nitrailor n nitrii i continuarea transformrii acestora n stomac pn la nitrai acizi, care n intestin formeaz anhidrida nitroas ce intr n reacie cu morfolina. La om pot apare intoxicaii asemntoare n urma inhalrii de nitrozamine. Barnes i magee (1954) au observat dou intoxicaii accidentale cu DMN n SUA, manifestndu -se cu
12

Macovei Monica Nitrozamine

leziuni hepatice mai mult sau mai puin grave, reversibile la unul i nsoite de ciroz la cel care a decedat. 1.10. Efectele carcinogene ale nitrozaminelor Dintre nitrozaminele studiate pn n prezent, aproximativ 75% s-au dovedit a avea efect carcinogen la toate speciile testate n doze foarte sczute. Aciunea mutagen este, de asemenea, cunoscut chiar la procariote i la Drosophila. Tumorile observate sunt cele hepatice, dar organele int pot varia n funcie de compus, mod de administrare, doz, durat. n condiii experimentale definite, noiunea este destul de selectiv i organotropismul caracteristic a fost pus n legtur cu metabolismul acestor substane. Actual, nitrozaminele sunt definite ca metabolismul acestor substane. Actual, nitrozaminele sunt definite ca substane carcinogene indirecte aa-numite toxice dup bioactivitate. n urma studiului a 56 de compui pe obolan, Montesano a rezumat frecvena relativ a principalelor localizri tumorale observate dup cum urmeaz: 31% din strile cancerigene s au dezvoltat n faringe sau esofag; 30% au fost cancere hepatice; 18% cu atingerea cavitilor nazale; 9% cancer al sistemului respirator; 8% au afectat rinichiul sau limba; 6% cancerul cardiac. Diversitatea efectelor produse este legat ca o relaie ntre structura nitrozaminelor i activitatea lor astfel: - alchilnitrozaminele simetrice provoac ndeosebi hepatoame, existnd i unele excepii: diamilnitrozamina provoac cancerul pulmonar, dibutilnitrozamina cancerul vezical, alchil, ciclohexil, fenil sau benzil nitrozaminele nu sunt cunoscute ca i cancerigene. - nitrozaminele asimetrice la care un substituent este reprezentat de un radical metil, au tropism esofagian sau stomacal. Cancerul esofagului este cu att mai periculos cu ct crete lungimea lanului lateral. Compuii substituii cu un radical pirolidin au, dimpotriv, o afinitate hepatic i testicular. N-morfolina are afinitate pentru ficat, N-piperidinapentru esofag, aparatul respirator, ficat sau stomac, N- piperazina pentru cavitile nazale. Nitrozamidele induc tumori pentru cile de administrare astfel: N- metilnitrozoureea aplicat pe piele induce dezvoltarea carcinoamelor cutanate, iar dup administrare per os a diverselor nitrozamine apar carcinoame scvamoase la stomac. Nitrozamidele, n anumite condiii, posed particularitatea de a putea atinge SNC sau periferic i rinichii. Metilnitrozoureea dup administrarea subcutanat produce o posibil stare cancerigen neurogenic; etil- butilnitrozoureea induce leucemie. Toxicitatea nitrozaminelor rezult n principal din proprietile alchilante ale metaboliilor lor. Mecanismul lor de aciune, n special cel carcinogen este strns corelat de metabolismul lor.

13

Macovei Monica Nitrozamine

1.11. Metabolismul nitrozaminelor Date cu privire la absorbia, metabolismul i excreia compuilor N-nitrozo sunt puine. Compuii N-nitrozo se absorb repede la nivelul tractusului intestinal, iar viaa biologic a lor este mai mic de 24 ore. Asemenea compui pot fi excretai fr modificri la nivelul rinichilor sau exhalai, dar o bun parte a lor sufer transformri metabolice. O alt parte a acestora, cum este de exemplu DMN, poate fi degradat total rezultnd dioxidul de carbon, gradul de descompunere variind foarte mult n funcie de structura compusului i specia animalelor de experien. n 1956, Dutton i Health au demonstrat, utiliznd 14C, c DMN la obolan este eliminat, n principal, prin aerul expirat sub form de 14CO2; acest rezultat demonstreaz c DMNeste demetilat in vivo, ulterior precizndu-se c demetilarea este catalizat de oxigenazele cu funciuni multiple microzomale. Dialchilaminele de acest tip sunt rapid metabolizate (degradare total n 24 ore de la ingestie, la diferite specii), dup o distribuie uniform n diferite esuturi, fr a se concentra n mod deosebit chiar n organele int. Corelaia ntre metabolism i hepatotoxicitate a fost pus n eviden pentru prima dat de Health (1962), dup diminuarea biotransformrii DMN prin inhibiie specific a oxigenazelor microzoamelor, cnd toxicitatea hepatic a produsului este diminuat. Cercetrile ulterioare au avut n vedere depistarea metaboliilor cancerigeni cu proprieti alchilante. ntr-o prim faz moleculele sunt hidrolizate n C alfa pentru dialchilaminele simple-DMN i DEN, n beta sau gamma pentru lanurile lungi i foarte lungi, apoi dezalchilate. Toate aceste reacii sunt dependente de enzimele microzomale. n faza a doua, care contrar precedentei, este spontan, monoalchilnitrozaminele sunt transformate n diveri cationi; ionul alchil- diazonium i un carbocation (cation alchil) final care i-a pierdut cei 2 atomi de azot iniiali. Sunt cercetri care sugereaz c aceti carbocationi reprezint moleculele cu efect cancerigen ultime. i alte posibiliti nu sunt excluse: transformarea n lactone sau hidrazine, de altfel, cu capaciti cancerigene cunoscute. innd cont de studiul relaiilor dintre metabolism i efectul toxic, numeroase experiene au demonstrat c nitrozaminele sunt cancerigene pentru esuturile n care biotransformarea lor este foarte intens. Acelai autor face o bun corelaie ntre metabolismul tisular al DMN sau DEM i organotropismul lor toxic. 1.12. Mecanismul de aciune al nitrozaminelor Nitrozaminele sunt capabile s formeze ageni alchilani (nu foarte numeroi), dar aproape toi cu proprieti mutagene i/sau cancerigene. Compuii celulari nucleofili majori, care pot fi alchilai sunt aminoacizii: metionina, histidina, cisteina i bazele nucleice: adenina, guanina i citozina. Transformarea primelor elemente poate fi rspunztoare de efectele duntoare provocate de nitrozamine, n special asupra ficatului, la doze subcancerigene. Alchilarea bazelor nucleice este implicat fa de efectele tumorale i mutagene ale compuilor N-nitrozai. Magee i Hultin (1962) au demonstrat c radioactivitatea rezidual dup administrarea de 14 C DMN este legat puternic de proteinele intracelulare. Aciunea nitrozaminelor se nscrie,
14

Macovei Monica Nitrozamine

deci, n teoria general a agenilor alchilani mutageni i cancerigeni. Numeroase cercetri fac i corelaia ntre proporia acizilor nucleici alchilai ntr-un organ i apariia tumorilor n esutul lezat. Observaiile biochimice enunate au sugerat aciunea vtmtoare prin acumulare (efectul fiecrei doze se adaug precedentei) i este ireversibil. 1.13. Riscul nitrozaminelor pentru om Distribuia geografic a anumitor tipuri de cancer conduce la incriminarea factorilor legai de mediu, obiceiuri alimentare (foarte variate n funcie de regiune), fiind n special relatate cancere ale tractului digestiv pentru care au fost suspectate nitrozaminele. Bogovki (1976) a decelat nitrozamine n rachiul de cidru, fapt ce poate explica frecvena mare a cancerului esofagian n Normandia. O observaie asemntoare a fost fcut i n Zambia cu alcoolul distilat local. n Transkeiau fostobservate cancere esofagiene la subiecii masculi, aspecte asociate cu prepararea unei buturi din lapte fermentat n combinaie cu o plant local bogat n nitrai ca urmare a unei carene de molibden n sol. n alte regiuni ca Japonia, Chile i Columbia, unde solul i apa conin cantiti sporite de nitrai, frecvena cancerului digestiv este superioar altor ri. Observaiile realizate la subiecii aclorhidrici sugereaz c dezvoltarea florei bacteriene stomacale faciliteaz sinteza nitrozaminelor, ceea ce denot o frecven mare a cancerului pulmonar la fumtori. Rolul respectiv al hidrocarburilor policiclice aromate i al nitrozaminelor nu a fost nc elucidat. Nitrozaminele, au fost de asemenea implicate n apariia cancerului persoanelor din mediul urban: epidemiologitii semnaleaz prezena simultan a unei concentraii ridicate de peroxid de azot i a cancerului n anumite zone, combinarea NO2 cu NO permind formarea nitrozaminelor. Importana nitrozrii in vivo a anumitor medicamente a demonstrat c tratarea ndelungat a bolilor cu compui aminai nu este suficient, n schimb, o nitrozoureebutilcloronitrozouree utilizat n medicina uman, n terapie, a determinat un procent anormal de crescut de leucemii la bolnavi.

15

Macovei Monica Nitrozamine

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1.BANU, C; VASU, C. Produsele alimentare i inocuitatea lor. Bucureti: Editura Tehnic, 1982. 2.GJIL, Iuliana. Chimie organic aplicat produselor agroalimentare. Bucureti: Editura Printech, 2008. 3.GORAN, Gheorghe Valentin. Toxicologia produselor alimentare. Bucureti: Editura Printech, 2009. 4.PAULING, Linus. Chimie general. Bucureti: Editura tiinific, 1972. 5.SAVU Constantin. Poluarea mediului i prezena substanelor toxice n alimente: Controlul calitii alimentelor. Bucureti: Editura Semne, 1999.

16