UNIVERSITATEA POLITEHNICA TIMIȘOARA

Facultatea de Chimie Industrială și Ingineria Mediului

Metode cromatografice
de analiză a alimentelor
Note de curs - numai pentru uzul studenților
Curs 10

2023
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

7. Cromatografia de lichide

7.1. Factorii care influențează separarea în cromatografia de lichide

Pentru a putea utiliza cromatografia de lichide ca metodă de analiză în condiții

satisfăcătoare, nu este necesară cunoașterea în amănunt a teoriei cromatografiei de
lichide, dar este indispensabilă stăpânirea noțiunilor de bază, mai ales pentru a se putea
face selecția fazelor cromatografice într-o manieră corectă.
În ciuda complexității aparente a instrumentului, partea esențială a analizei
cromatografice este procesul de separare care are loc în coloană, restul aparaturii având
doar rolul auxiliar de a asigura depozitarea fazei mobile, asigurarea compoziției sale
stabilite și a presiunii de intrare în coloană, introducerea probei, detectarea
componentelor separate și procesarea datelor. Ca urmare a modului în care este conceput
designul aparatelor moderne, această esență se pierde însă de multe ori în spatele
complexității electronice sau inginerești a întregului sistem. Rezultatul este că rolul
important al funcțiunii coloanei este înțeles doar superficial și tehnica cromatografică nu
este utilizată într-o manieră adecvată.
În timpul separării cromatografice se pot deosebi două procese care au loc
simultan, continuu și aparent independent una de alta. Prima este deplasarea fiecărui solut
printr-o succesiune de echilibre de distribuție între faza mobilă și cea staționară, în
conformitate cu coeficientul său de distribuție. Al doilea proces este specific coloanei,
care trebuie să limiteze dispersia naturală a soluților astfel încât la ieșirea din coloană
fiecare solut să se regăsească sub forma unei benzi de eluție cât mai înguste și distincte de
celelalte. Primul proces, cel al retenției componentelor, este de natură termodinamică și
poate fi controlat prin alegerea corespunzătoare a naturii fazelor cromatografice. Cel
de-al doilea proces este, în esență, de natură cinetică și depinde de caracteristicile fizice
ale componentelor sistemului cromatografic, ca: viteza de deplasare a fazei mobile,
diametrul și uniformitatea particulelor de umplutură din coloană, coeficientul de
difuziune al solutului în faza mobilă și faza staționară, etc. Pentru a putea realiza o
separare optimă, pentru fiecare probă va trebui găsită perechea de faze cea mai potrivită
și selectată coloana corespunzătoare.
În cromatografia de lichide, ecuația esențială care permite înțelegerea procesului
de retenție și identificarea parametrilor cu ajutorul cărora va fi posibilă optimizarea
analizei este ecuația volumului de retenție.

VR =VM +KVS
unde
VM - volumul mort al coloanei,
K - coeficientul de distribuție al solutului,
VS - volumul fazei staționare.

Această relație este dedusă pe baza teorei talerelor a lui Martin și Synge,
perfecționată apoi de alți autori. În cromatografia de lichide, spre deosebire de
cromatografia de gaze, volumul fazei staționare din coloană nu mai poate fi definit așa de
net. În majoritatea cazurilor, în separare nu intervine întregul acest volum ci numai
volumul fazei staționare disponibil solutului.

1
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Separarea a doi compuși va fi posibilă dacă volumele lor de retenție vor fi diferite, adică
în cazul în care fie coeficienții de distribuție ai celor doi soluți vor fi diferiți, fie volumul
de fază staționară disponibil fiecărui component al amestecului analizat va fi diferit.
Așadar pentru a realiza separarea dorită trebuie studiați factorii care influențează acești
doi parametri, coeficientul de distribuție și volumul fazei staționare disponibile.

7.1.1. Interacțiuni moleculare care influențează coeficientul de distribuție

Coeficientul de distribuție este raportul dintre concentrația solutului în faza

staționară și concentrația în faza mobilă, fiind o măsură a interacțiunilor moleculare
dintre solut și cele două faze. Așadar cunoașterea interacțiunilor respective, care sunt
consecințele forțelor ce se manifestă între moleculele celor două faze cromatografice și
cele ale solutului, va permite evaluarea posibilităților de a realiza separarea
cromatografică. Aceste forțe pot fi de patru tipuri: forțe chimice, forțe ionice, forțe polare
și forțe de dispersie. Există și alte forțe, de exemplu cele bazate pe legături de hidrogen,
însă pentru simplificare acestea sunt considerate ca fiind o categorie de forțe polare foarte
puternice. Prin alegerea corespunzătoare a fazelor, toate aceste interacțiuni pot fi astfel
dirijate încât să se realizeze retenția și separarea dorită. Realizarea de interacțiuni
moleculare diferite în cele două faze reprezintă modalitatea pentru a obține selectivitate
în separările cromatografice. Pentru a realiza selectivitatea necesară și a realiza
separarea, trebuie ca un anumit tip de interacțiuni specifice să fie dominante în faza
staționară, iar interacțiunile din faza mobilă să fie diferite.
Interacțiunile chimice pot fi considerate practic ireversibile, cel puțin în
cromatografie și drept consecință coeficientul de distribuție al solutului legat prin
asemenea forțe de faza staționară este apropiat de infinit. Un exemplu de cromatografie
de lichide bazat pe asemenea interacțiuni este cea de afinitate, în care una dintre
componentele probei analizate interacționează chimic cu gruparea de afinitate a fazei
staționare și substanța respectivă este extrasă selectiv dintre compușii prezenți în sistem.
Acest tip de cromatografie reprezintă așadar mai mult o extracție decât o separare
cromatografică, iar în celelalte tipuri de cromatografie forțele chimice nu au un rol
semnificativ.
Interacțiunile ionice se bazează pe sarcinile electrice care rezultă în urma
ionizării moleculelor în soluție. Aceste interacțiuni sunt folosite în cromatografia ionică.
Dacă solutul se prezintă sub formă de anioni, ca de exemplu în cazul acizilor organici,
faza staționară va trebui să conțină cationi cu sarcină pozitivă drept contraioni pentru a
interacționa cu anionii respectivi și a încetini deplasarea lor prin coloană. În mod
corespunzător, pentru separarea compușilor cu caracter cationic prezenți în proba
analizată, faza staționară va trebui să conțină contraioni de tip anionic. Fazele staționare
ionice sunt constituite în mod obișnuit din polimeri reticulați care au fost modificați
chimic pentru a li se grefa grupările schimbătoare de ioni dorite. O altă alternativă este
utilizarea unor faze chimic legate cu grupări schimbătoare de ioni, în acest caz grupările
respective fiind legate chimic de un suport de silicagel, asemănător ca în cazul altor faze
staționare chimic legate. A treia posibilitate este de a adsorbi compusul schimbător de
ioni pe suprafața fazei staționare, acest tip de cromatografie fiind denumit cromatografie
prin perechi de ioni. Compusul respectiv este introdus în faza mobilă în concentrație
redusă (în jur de 1%), de unde se adsoarbe pe faza staționară chimic legată.

2
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Interacțiunile polare au la bază de asemenea sarcinile electrice ale moleculelor,

însă în acest caz este vorba de dipoli permanenți sau induși. Trebuie menționat că o
moleculă polară nu posedă sarcini nete, exceptând situația în care molecula respectivă
este în același timp și ionizată. Exemple de substanțe cu dipoli permanenți sunt alcoolii,
esterii, aldehidele, etc. Molecule polarizabile sunt, printre altele, hidrocarburile aromatice
ca benzenul, toluenul sau xilenii. Există compuși cu dipoli permanenți care în același
timp sunt și polarizabili, ca de exemplu 2-feniletanolul. Pentru a separa compușii polari
sau polarizabili, va trebui utilizată o fază staționară polară în combinație cu o fază mobilă
relativ nepolară. De exemplu pentru a separa niște hidrocarburi aromatice, care sunt
compuși polarizabili, se va folosi o fază staționară puternic polară, cum este silicagelul și
a fază mobilă nepolară, cum este hexanul.
Interacțiunile de dispersie sunt mult mai dificile de caracterizat. Sunt interacțiuni
foarte slabe, de tip London, Van der Waals, etc. care se produc între molecule nepolare.
Ele sunt în esență tot electrice prin natura lor, însă rezultă mai mult din fluctuațiile de
sarcină decât din sarcinile electrice propriu-zise ale moleculelor. Exemple de interacțiuni
de dispersie sunt forțele care se manifestă între moleculele hidrocarburilor saturate.
Acești compuși nu au caracter ionic, nu sunt polarizabile și nu au momente dipol, totuși
cele superioare nu sunt gaze ci lichide sau solide întrucât moleculele lor sunt ținute
laolaltă de forțele de dispersie. Pentru ca fenomenul de retenție să fie bazat pe interacțiuni
de dispersie trebuie ca faza staționară să nu conțină grupări ionice sau polare ci numai
grupări hidrofobe, așa cum este cazul fazelor staționare inverse din cromatografia HPLC.
În plus, faza mobilă trebuie să fie puternic polară pentru ca interacțiunile de dispersie în
această fază să fie minime. Asemenea faze sunt cele de tipul amestecurilor metanol-apă
sau acetonitril-apă.
În sistemele reale, situația în care retenția cromatografică este determinată doar de
un singur tip de interacțiuni este întâlnită doar în puține cazuri. Dacă totuși se întâmplă
acest lucru, poate fi vorba numai despre interacțiuni de dispersie. Interacțiunile polare
sunt însoțite întotdeauna de interacțiuni ionice și de dispersie, iar cele ionice de
interacțiuni polare și de dispersie.

7.1.2. Factorii care influențează disponibilitatea fazei staționare

Așa cum rezultă din ecuația volumului de retenție, nu numai tăria interacțiunii
dintre solut și faza staționară va fi cea care determină retenția solutului ci și volumul fazei
staționare prezente în sistem și accesibile solutului. Volumul fazei staționare cu care
componentele amestecului de analizat pot interacționa depinde de starea fizică a fazei
staționare și a suportului. Astfel, dacă faza staționară este un solid poros și dimensiunile
porilor sunt comparabile cu diametrele moleculare ale componentelor de separat, atunci
faza staționară va fi selectivă pentru mărimea moleculelor acestora. Moleculele anumitor
soluți vor putea pătrunde în interiorul porilor și vor interacționa cu mai multă fază
staționară decât alte molecule mai mari care vor fi parțial excluse de la aceste
interacțiuni. Așadar, separarea va fi controlată de fenomenul de excluziune bazat pe
mărimea moleculelor și de aceea se numește cromatografie de excluziune. Dacă faza
staționară va fi chirală, cantitatea de fază staționară disponibilă pentru a interacționa cu
solutul va fi doar aceea care din punct de vedere steric se potrivește cu orientarea spațială
a moleculei de solut. Acest tip de cromatografie se numește cromatografie de lichide

3
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

chirală. Trebuie menționat că în funcție de natura fazei staționare ambele aceste tipuri,
cromatografia de excluziune sau cromatografia chirală, pot să se încadreze fie în
categoria cromatografiei lichid-lichid fie în a celei de tip lichid-solid.

7.2. Cromatografia de lichide de înaltă performanță: faze staționare chimic

legate, sisteme de alimentare cu fază mobilă, detectoare

Cromatografia lichid-lichid (LLC) se bazează pe distribuția moleculelor solutului

între două faze lichide nemiscibile, în conformitate cu solubilitatea acestora în cele două
faze. Mediul care realizează separarea constă dintr-un suport inert (silicagel, kieselguhr)
pe care este depus un strat de fază staționară lichidă, iar separarea se realizează prin
trecerea unui flux de fază mobilă ce conține proba analizată peste faza staționară. Faza
staționară se poate găsi împachetată într-o coloană sau dispusă în strat subțire pe o placă
de sticlă sau folie de aluminiu.

7.2.1. Faze staționare legate chimic

Cromatografia lichid-lichid se clasifică în funcție de polaritatea relativă a fazei

staționare și fazei mobile în două categorii:
- Cromatografie lichid-lichid pe faze normale, în care faza staționară este
polară, iar faza mobilă nepolară;
- Cromatografie lichid-lichid pe faze inverse, în care faza staționară este
nepolară, iar faza mobilă polară.
În cazul cromatografiei pe faze normale, ordinea de eluție este bazată pe
principiul că componenții nepolari vor avea o preferință pentru faza mobilă și vor elua
mai repede, în timp ce componenții mai polari vor avea o afinitate mai mare față de faza
staționară și vor elua mai târziu.
În cazul cromatografiei pe faze inverse, ordinea de eluție va fi inversată, în sensul
că primii vor elua componenții mai polari. Utilizarea pe scară foarte largă a
cromatografiei pe faze inverse (RPC) la ora actuală se bazează pe faptul că majoritatea
compușilor organici au în structura lor regiuni hidrofobe și în consecință vor putea
interacționa cu fazele staționare nepolare. Întrucât faza mobilă în cazul RPC conține în
mod uzual apă, această metodă este foarte bună pentru și pentru separarea substanțelor
polare care sunt fie insolubile în solvenți organici, fie se leagă prea puternic de
adsorbenții polari pentru a putea fi separate prin cromatografie lichid-solid. Un alt avantaj
important al cromatografie pe faze inverse este că solvenții utilizați nu trebuie
anhidrificați.
Deși faza staționară și cea mobilă sunt astfel alese încât miscibilitatea lor să fie
minimă, chiar și o solubilitate foarte mică a fazei staționare în faza mobilă duce la
antrenarea ei în timpul curgerii fazei mobile prin coloană. Evitarea acestei probleme a
fost posibilă prin amplasarea unei precoloane (coloane de protecție) înaintea coloanei
cromatografice, care să conțină o umplutură cu granulație mare pe care să fie depusă o
concentrație ridicată (30-40%) din aceeași fază staționară care se găsește și în coloana de
analiză, astfel ca faza mobilă să fie saturată cu faza staționară respectivă înainte de a intra
în coloană. La ora aceasta, prin utilizarea fazelor staționare chimic legate nu mai există
pericolul desprinderii fazei staționare de pe suport.

4
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Suportul fazei staționare este constituit dintr-un material relativ inert, ca de

exemplu: alumină, polimeri sintetici (polimetacrilat, copolimer stiren-divinilbenzen),
sticlă și mai ales silicagel, care are avantajul că poate fi ușor modificat chimic. Este
important ca suportul să nu interacționeze cu solutul, astfel ca mecanismul retenției să nu
fie unul mixt, de repartiție și adsorbție ci numai de repartiție. Din acest motiv, atunci când
se folosesc adsorbenți poroși drept suport este necesar să se realizeze o încărcare avansată
a suportului cu fază staționară, pentru a acoperi toți centrii activi. Suporturile pot să fie de
două tipuri: poroase sau superficial poroase. Cele poroase pot fi încărcate cu o cantitate
mai mare de fază staționară (între 10-30%), dar eficiența lor de separare este considerată
a fi mai scăzută. Suporturile superficial poroase se pot încărca numai cu 0,5-1,5% fază
staționară, însă au o eficiență de separare mai mare. Eficiența de separare depinde foarte
mult de dimensiunile particulelor de suport, fiind cu atât mai mare cu cât aceste
dimensiuni sunt mai mici. La ora actuală în cromatografia de lichide de înaltă
performanță se utilizează suporturi de silicagel total poros cu dimensiuni uniforme, între
3 și 10 μm, de formă neregulată sau sferică. Cele mai eficiente sunt cele sferice.
Pentru a elimina problemele legate de pierderea fazei staționare de pe suport în
timpul eluției, se utilizează legarea chimică a fazei staționare de materialul suportului.
Acest tip de cromatografie de lichide se numește cromatografie cu faze chimic legate
(BPC). Reacțiile cele mai mult utilizate pentru obținerea acestui tip de faze staționare
sunt cele de sililare. Ele constau în reacția grupărilor silanolice de la suprafața
silicagelului cu clorsilani substituiți. Un exemplu în acest sens este reacția cu un alchil-
dimetilclorsilan, în urma căreia ia naștere o fază chimic legată monomerică, întrucât
fiecare moleculă de agent de sililare poate reacționa doar cu o singură grupă silanolică.

Si OH CH 3 Si OH CH 3

Si OH + Cl Si R Si O Si R + HCl

Si OH CH 3 Si OH CH 3

Dacă se utilizează di- sau triclorsilani în prezență de umiditate se va forma un

strat polimeric pe suprafața silicagelului, adică o fază chimic legată polimerică.

Cl Si O Cl Cl
Si OH
Si
Si OH + Cl Si R Si O R + Cl Si R
-2 HCl
Si OH Cl Si OH Cl

5
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Si O O R Cl
H2 O Si Si 4 H 2O
Si O R Cl Cl + Cl Si R
- HCl - 5 HCl
Si OH Cl

Si O O R HO R
Si Si Si
Si O R HO O OH

Si OH

Grupările silanolice Si-OH vor fi capabile să adsoarbă compușii polari și deci vor
afecta proprietățile fazei chimic legate, în general în mod nedorit. Aceste deficiențe pot fi
eliminate prin inactivarea grupărilor silanolice reziduale prin reacție (endcapping) cu
trimetilclorsilan sau hexametildisilazan.
Modul de interacțiune al fazei staționare chimic legate cu soluții va depinde de
natura grupării funcționale R, cele mai utilizate faze staționare fiind cele nepolare, la care
gruparea R este octadecil C-18. Acestea vor fi așadar faze staționare inverse. Alte grupări
R de tip nepolar care se folosesc în cazul suporturilor chimic legate sunt cele de tip octil
sau ciclohexil. Se utilizează și faze staționare chimic legate care au grupări polarizabile,
de tip fenil, sau polare, de tip aminopropil, cianopropil sau dihidroxi. Cele cu grupări
polare vor fi faze staționare normale, utilizate pentru separarea compușilor polari.

7.2.2. Aparatura utilizată în cromatografia lichid-lichid de înaltă

performanță (HPLC)

Cromatografia de lichide de înaltă performanță s-a dezvoltat după ce teoria

separărilor cromatografice a demonstrat că pentru obținerea unei eficiențe de separare
ridicate, comparabilă cu cea realizată în cromatografia de gaze, este nevoie de utilizarea
unor umpluturi cu granulație fină, de ordinul a 2-5 μm. Pentru a avea însă viteze de eluție
corespunzătoare, în aceste situații se impune folosirea unor presiuni ridicate la intrarea
eluentului în coloană. Pe de altă parte, folosirea unor coloane scurte a dus la scăderea
importantă a capacității de încărcare cu probă, ceea ce a necesitat construirea unor
detectoare de mare sensibilitate.
Schema de principiu a unui cromatograf de lichide de înaltă performanță este dată în
Figura 7.1:

6
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Figura 7.1. Schema unui cromatograf de lichide de înaltă performanță (HPLC)

Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt:

- sistemul de alimentare cu fază mobilă
- dispozitivul pentru introducerea probei
- una sau două pompe
- coloana
- detectorul
- sistemul de prelucrare a datelor

7.2.2.1. Sistemul de alimentare cu fază mobilă

Cuprinde următoarele dispozitive, care pot fi asamblate în diferite configurații:

- rezervoarele de solvenți;
- dispozitivul pentru degazarea solvenților;
- dispozitivul pentru realizarea gradientului de solvenți.
Dispozitivul pentru degazare este necesar pentru îndepărtarea din solvenți a
gazelor dizolvate, mai ales a oxigenului, care în timpul trecerii prin coloană ar putea
reacționa cu faza staționară, sau ar putea forma bule de gaz cu influență nefavorabilă atât
asupra separării cât mai ales a detecției, ținând cont de volumul foarte mic al celulelor
detectoarelor moderne. Degazarea se realizează în două moduri:
- prin barbotare de heliu în rezervorul de solvent;
- prin trecerea solventului printr-o unitate de degazare cu vid, unitate
prevăzută cu o tubulatură de teflon care permite difuzarea prin pereți a gazelor
prezente în solvent, dar nu și a moleculelor solventului.

Dispozitivul pentru alimentarea cu solvenți poate fi foarte diferit ca și

complexitate, de la un simplu rezervor de solvenți în cazul eluției izocratice până la un
programator de eluent pentru doi sau trei solvenți.

7
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Prin eluția cu gradient de solvent se poate realiza separarea componentelor care nu se

separă prin eluție izocratică. Este foarte eficientă mai ales dacă polaritatea componentelor
analizate diferă foarte mult.
Există două tipuri de sisteme de eluție cu gradient de solvent:
1. Sistemul cu gradient de joasă presiune, în care solvenții se preiau din
rezervoare diferite într-o cameră de amestecare, apoi amestecul de solvenți este pompat
prin coloană (Figura 4.13). Cromatografele moderne posedă electrovalve de
proporționare pentru solvenți, comandate de un microprocesor. În acest mod crește
rezoluția, se reduce timpul de analiză și crește și sensibilitatea analizei.

Figura 7.2. Formarea gradientului de solvenți cu ajutorul sistemului cu valvă de

proporționare

Multe cromatografe de lichide moderne posedă sisteme pentru vehicularea

solvenților care pot amesteca doi sau mai mulți solvenți, progresiv, într-un raport cuprins
între 0 și 100% pentru oricare solvent. Se obține o diagramă de compoziție în funcție de
timp care poate avea formă liniară, convexă sau concavă. Programarea compoziției
eluentului îndeplinește același rol in cromatografia de lichide ca programarea de
temperatură în cromatografia de gaze, permițând separarea peakurilor neseparate
corespunzător, fără a afecta rezoluția celorlalte peakuri. Găsirea programului optim
necesită timp și eluția cu gradient poate avea și anumite inconveniente. De exemplu, este
nevoie de un timp la sfârșitul fiecărei analize pentru a reveni la compoziția inițială a
eluentului, iar dacă unul din solvenți are un semnal mai puternic în detector decât ceilalți,
se va înregistra o derivă a liniei de bază (drift). Din acest motiv, pentru separarea unor
amestecuri mai simple, se preferă eluția izocratică deși timpul de analiză este mai mare,
însă nu se mai consumă timp pentru găsirea programului ideal pentru eluția cu gradient.
Avantajul acestui sistem de gradient este că se folosește o singură pompă, chiar
dacă până la urmă sistemul de programare cu ventile de proporționare este aproape tot așa
de complicat și de scump ca și utilizarea unei a doua pompe.
2. Sistemul cu gradient de înaltă presiune, care operează cu câte o pompă
pentru fiecare solvent. În general, aceste pompe sunt deservite de motoare pas cu pas, iar
debitul pompei este controlat de frecvența de alimentare a motorului respectiv. Acest
sistem este mai scump decât celălalt, însă reproductibilitatea rezultatelor este mai bună.

8
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

7.2.2.2. Dispozitive pentru introducerea probei

Introducerea probelor poate fi realizată în două moduri: prin injecție cu ajutorul

unei seringi sau prin folosirea unei valve (robinet) de injecție cu mai multe canale.
Injecția cu seringi se aplică mult mai puțin decât în cromatografia de gaze pentru că ea
necesită seringi rezistente la presiune ridicată și un septum construit dintr-un material
care să nu permită extragerea unor compuși de către faza mobilă, care să dea naștere unor
peakuri-fantomă.
Valvele de injecție permit introducerea reproductibilă a probelor în coloanele
cromatografice aflate sub presiune, fără întreruperea curgerii fazei mobile. Proba este
încărcată la presiune atmosferică într-o buclă exterioară a valvei de injecție și este apoi
introdusă în faza mobilă printr-o simplă rotire a valvei. Volumul de probă introdusă
variază între 2μl și mai mult de 100 μl (în mod uzual este 2μl)și poate fi modificat prin
schimbarea buclei de injecție sau folosind valve speciale cu volum variabil de probă.
Pentru analize în serie se recomandă folosirea unor dispozitive de introducere automată a
probelor (autosampler).

7.2.2.3. Coloana cromatografică

În mod obișnuit, coloanele cromatografice utilizate în analizele HPLC sunt

confecționate din oțel inoxidabil, au lungimea cuprinsă între 7,5-30 cm (aceste lungimi
sunt standardizate) și diametrul interior între 4 și 5 mm (uzual 4,6 mm). Pentru reținerea
fazei staționare în coloană, la capetele acesteia se găsesc două frite din oțel inoxidabil cu
ochiuri de 2 μm sau mai mici.
Dezvoltarea fazelor staționare chimic legate a avut o mare importanță pentru
cromatografia lichid-lichid pe coloane de silicagel. Diametrul standard al umpluturilor
folosite în HPLC este de 5 μm, dar în ultima vreme o răspândire tot mai mare au
umpluturile cu diametrul de 3 μm sau chiar mai puțin. Umpluturile mai fine sunt mai
eficiente (reducerea la jumătate a diametrului particulelor determină dublarea eficienței
de separare), însă mai scumpe. În ce privește tipul umpluturii, se utilizează atât umpluturi
formate din particule total poroase cât și umpluturi constituite din particule superficial
poroase.
Se fabrică o gamă largă de coloane analitice, având diametrele interioare cuprinse
în intervalul de la 4,6 mm (considerate de dimensiuni normale) la mai puțin de 0,1 mm
dar și coloane preparative care au diametrul mai mare de 50 mm. În principiu, cu cât
diametrul coloanei este mai mare, încărcarea cu probă va fi mai mare, deci se va putea
injecta o cantitate mai mare de probă. Pe de altă parte, există o serie de elemente care fac
coloanele mai înguste mai atractive pentru separările analitice. Astfel, coloanele mai
înguste vor necesita un consum mai mic de solvent, determinând economii importante.
Un alt avantaj important este că peakul solutului va elua întrun volum mai mic și întrucât
răspunsul majorității detectoarelor depinde de concentrație rezultă că înălțimea peakului
va fi mai mare iar limita de detecție va fi redusă. Aceste avantaje au dus la dezvoltarea
unor coloane capilare cu diametrul interior redus până la 0,1 mm, însă folosirea acestora
creează o serie de alte probleme, cum ar fi cele generate de necesitatea de a lucra cu
debite foarte mici de fază mobilă sau de a reduce foarte mult volumele moarte, de
exemplu cele care apar la conexiunea dintre diferitele componente ale aparatului.

9
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

În general, pentru coloanele înguste cu diametre între 2 și 0,5 mm se folosește

termenul de microcolane sau “microbore”, în timp ce coloanele cu diametre mai mici
decât 0,5 mm sunt denumite nanocoloane. Nanocolanele, la rândul lor, se subîmpart în
coloane capilare umplute sau "nanobore" (diametre între 0,04-0,3 mm) și coloane
capilare deschise, cu diametre mai mici de 0,1 mm. Acestea din urmă sunt construite din
sticlă specială și din punct de vedere constructiv sunt similare cu coloanele capilare
folosite în cromatografia de gaze. Deși folosirea lor necesită o aparatură specială în ce
privește construcția pompei și a detectorului, care să opereze la debite de fază mobilă
foarte mici, de până la 1μl/min, ele permit realizarea unor separări cu o eficiență mai
mare de 100.000 talere teoretice într-un timp de analiză mai mic de 30 de minute, cu un
consum foarte scăzut de fază mobilă.
Pentru creșterea duratei de utilizare a unei coloane de analiză HPLC se recomandă
introducerea unei coloane de protecție (precoloană, guard column). Aceasta este o
coloană mică ce conține un cartuș ce se poate înlocui la nevoie și care se amplasează între
injector și coloana analitică și previne pierderea eficienței coloanei analitice datorită
prezenței anumitor impurități prezente în probă sau solvent, de exemplu a celor care se
adsorb foarte puternic. Coloanele de protecție sunt umplute cu fază staționară
microporoasă sau peliculară. Cele peliculare sunt mai ușoare de manipulat la umplere
însă trebuie schimbate mai frecvent deoarece capacitatea lor de reținere este mai scăzută.

7.2.2.4. Pompe utilizate în cromatografia de lichide

La ora actuală există un mare număr de pompe care pot fi utilizate în

cromatografia de lichide, dintre care unele sunt destinate numai unor aplicații specifice.
Aceste pompe sunt de două tipuri:
- pompe pneumatice, care sunt pompe cu presiune constantă;
- pompe mecanice, care sunt pompe cu debit constant.
Pompele pneumatice sunt pompe de tip seringă care sunt acționate sub influența
presiunii aerului. Avantajele lor sunt construcția simplă, costul redus și posibilitatea
realizării unor presiuni foarte mari. Pe ansamblu însă ele sunt inferioare pompelor
mecanice, dezavantajul major fiind acela că debitul și viteza de curgere se modifică la
schimbarea vâscozității eluentului, ceea ce le face neoperabile în cazul sistemelor de
eluție cu gradient. De asemenea, ele necesită oprirea fluxului de lichid în timpul
realimentării pompei. Pompele pneumatice se folosesc la ora actuală, în anumite cazuri,
pentru realizarea debitelor mari necesare pentru cromatografia preparativă.
Pompele mecanice sunt utilizate în majoritatea aplicațiilor. Ele sunt pompe cu
piston, care eliberează solventul în mod constant, fără a necesita oprire mai îndelungată
pentru reîncărcare, ca pompele pneumatice. Debitul lor rămâne constant chiar în
condițiile modificării unor caracteristici ale eluentului ca vâscozitatea sau temperatura și
de aceea pot fi folosite în combinație cu detectoarele de mare sensibilitate, întrucât nu
duc la modificări ale zgomotului de fond al acestora. Dezavantajul lor principal este că
orice defecțiune care afectează curgerea eluentului duce la creșterea bruscă a presiunii în
sistem. Pentru evitarea accidentelor, aceste pompe sunt prevăzute cu limitatoare de
presiune, care opresc pompa dacă se atinge o presiune maximă stabilită.
Cel mai simplu, mai ieftin și drept urmare mai folosit tip de pompă este pompa cu
un singur piston (cu mișcare alternativă – “reciprocating”). Aceasta a fost prima pompă

10
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

de presiune înaltă folosită pentru coloane cu particule de dimensiuni mici. Schema acestei
pompe este prezentată în Figura 7.3.

Figura 7.3. Pompa de înaltă presiune cu un singur piston

Această pompă are un piston confecționat în mod tradițional din safir, în mod
uzual cu diametru de 3-4 mm și lungime de aproximativ 4 cm, care se găsește într-un
cilindru din oțel inoxidabil. Mișcarea pistonului este comandată de un rotor excentric care
are un profil special ce permite ca mișcarea de refulare să fie liniară și uniformă iar cea
de aspirație neliniară și rapidă. Există însă și alte modalități pentru a comanda mișcarea
pistonului. Întoarcerea pistonului pentru cursa de aspirație este determinată de un arc de
întoarcere. Intrarea și ieșirea solventului din pompă sunt reglate cu ajutorul a două
robinete cu o singură cale, care nu permit deplasarea sa decât întro singură direcție.
Volumul de solvent pompat la o cursă a pistonului este în mod uzual în jur de 250 μl, dar
poate fi redus până la 2-5 μl dacă se utilizează coloane înguste.
Acest tip de pompă este de uz general și potrivită pentru majoritatea aplicațiilor
LC. Din cauza faptului că în timpul realimentării cilindrului fluxul de lichid este oprit
pentru o scurtă perioadă, se creează niște pulsații ale debitului de fază mobilă. Aceste
pulsații nu influențează negativ separarea în majoritatea cazurilor, deoarece coloana
conține suficientă fază mobilă pentru a atenua pulsațiile. Se poate folosi și un atenuator
de pulsații. Pulsațiile de debit pot determina creșterea zgomotului de fond pentru anumite
detectoare, care nu mai pot fi în aceste condiții folosite la sensibilitatea lor maximă.
Totuși, în majoritatea cazurilor ele nu reprezintă o problemă reală.
Există mai multe variante de pompe lipsite de pulsații. Prima este pompa cu două
capete și dublu efect, care a fost realizată prima oară de firma Waters și constă în
utilizarea a două pompe cuplate astfel încât atunci când una este în fază de umplere
cealaltă să fie în fază de refulare. Acest lucru este posibil prin proiectarea
corespunzătoare a rotorului excentric, care comandă mișcarea ambelor pistoane.
Cea de-a doua variantă de pompă fără pulsații este pompa cu realimentare rapidă.
Aceasta folosește de asemenea doi cilindri și un singur piston comun. Diferența este că
cea de-a doua pompă este folosită numai pentru realimentarea rapidă a primei pompe,
care realizează pomparea fazei mobile in coloană. Această realimentare are loc de
aproximativ 100 de ori mai repede decât refularea, motiv pentru care pulsațiile pompei
sunt reduse la minim.

11
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Utilizarea pompelor trebuie făcută cu multă atenție, nefiind voie ca ele să

funcționeze în gol, fără solvent. Utilizarea ca solvenți a acizilor clorhidric și bromhidric
trebuie evitată deoarece aceștia corodează chiar și oțelurile inoxidabile. De asemenea,
dacă se folosesc ca faze mobile soluții tampon, în special cele care conțin cloruri, acestea
nu trebuie să rămână în pompă după terminarea analizei, deoarece pot cauza coroziune.

7.2.2.5. Detectoare utilizate în cromatografia de lichide HPLC

Funcția detectorului este de a monitoriza faza mobilă pe măsură ce ea iese din

coloană. Detecția prezintă mai multe probleme în cromatografia de lichide decât în cea de
gaze, neexistând detectoare universale de tipul detectorului cu ionizare în flacără.
Clasificarea detectoarelor se poate face în două categorii:
- Detectoare care măsoară modificarea unei proprietăți fizice a efluentului
coloanei.
Asemenea detectoare înregistrează modificarea unei proprietăți fizice a fazei
lichide constituite din eluent și componenta separată în coloană comparativ cu eluentul,
de exemplu detectoarele de indice de refracție sau de conductivitate. Deși ele au o
aplicabilitate destul de largă, au sensibilitate scăzută și sunt afectate de schimbarea
compoziției fazei mobile, deci nu pot fi folosite dacă eluția se face cu gradient.
- Detectoare care măsoară modificarea unei proprietăți a solutului.
Din această categorie fac parte detectoarele spectrofotometrice, cu fluorescență și
electrochimice. Ele răspund la o proprietate fizică caracteristică numai solutului și în
principiu sunt independente de eluent. Au sensibilitate ridicată și un domeniu larg de
răspuns liniar, dar datorită specificității lor în general este nevoie de mai mult decât un
detector pentru a realiza o analiză mai complexă. Există asemenea unități care conțin mai
multe detectoare situate în serie, de exemplu de UV, fluorescență și conductivitate.
La ora actuală există peste 30 de tipuri de detectoare folosite în cromatografia de
lichide, cele mai numeroase fiind cele spectrofotometrice, urmate de cele electrochimice
și de detectoarele pentru anumite aplicații specifice. Un aspect important la alegerea
detectoarelor este compatibilitatea lor cu colanele înguste sau cele capilare, deoarece
acestea impun anumite condiții speciale. Există și posibilitatea cuplării cromatografului
de lichide cu un spectrometru de masă, la fel ca în cazul cromatografiei de gaze, în acest
caz spectrometrul funcționând ca un detector extrem de specific.

Detectorul spectrofotometric în UV-Vis

Se bazează pe măsurarea transmitanței celulei de măsură atunci când aceasta este

străbătută de eluentul care conține componentele separate în coloana cromatografică.
Condiția necesară este ca aceste componente să aibă absorbție suficient de mare în
domeniul spectral în care funcționează detectorul, iar eluentul să fie transparent în
domeniul respectiv. Detectoarele spectrofotometrice în UV-VIS se pot utiliza pentru
analiza compușilor aromatici și a celor care posedă legături conjugate: olefine,
compuși carbonilici, derivați azoici, nitroderivați, dar și a proteinelor, enzimelor, acizilor
nucleici și steroizilor. Ele se pot folosi în eluția cu gradient și sunt aproape insensibile la
variațiile de flux date de pulsațiile provocate de pompe. Dezavantajul lor major, alături de
acela că substanțele analizate trebuie să absoarbă în UV sau vizibil, este că solvenții

12
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

utilizați trebuie să fie de puritate deosebită, pentru ca absorbția lor în UV să fie nulă.
Lipsa de absorbție a solventului este o condiție esențială mai ales în cazul eluției cu
gradient, deoarece nerespectarea acestei condiții ar duce la o deviere continuă a liniei de
bază. În aceste circumstanțe, detectorul spectrofotometric poate fi considerat un detector
cu răspuns la modificarea proprietăților solutului. Mărimea absorbției unei componente
este dată de cunoscuta lege Lambert-Beer:

log I0/ I = A = ε·l·c

unde
I0 - intensitatea luminii incidente,
I - intensitatea luminii transmise,
A - absorbanța,
ε - coeficientul molar de extincție (în l/mol·cm),
l - lungimea parcursă de raza luminoasă în soluție (în cm),
c - concentrația componentei în soluție (în mol/l).

Detectorul spectrofotometric în UV-Vis este caracterizat de sensibilitate ridicată,

limita detecție fiind 1·10-9 g/ml pentru compușii cu absorbție puternică și este relativ
puțin sensibil la variațiile de temperatură și debit ale fazei mobile.
Trebuie menționat faptul că aceste detectoare se pot utiliza și în cazul substanțelor care
nu prezintă absorbție sau au absorbție slabă în domeniul de lungimi de undă al
detectorului, dacă ele se pot transforma în derivați care să aibă o asemenea absorbție.
Acest lucru se face prin procedeul numit derivatizare postcoloană, în care efluentului
coloanei i se adaugă un reactiv corespunzător și reacția de derivatizare are loc înainte ca
efluentul să ajungă în detector.
Există trei tipuri de detectoare în UV-VIS:
- Detectorul cu lungime de undă fixă
- Detectorul cu lungime de undă variabilă
- Detectorul cu șir de diode.
Detectorul cu lungime de undă fixă poate fi realizat în varianta cu un singur
fascicul sau cu două fascicule. Detectorul cu două fascicule este prezentat schematic în
Figura 7.4.
Lumina provenită de la o sursă de radiații (în general o lampă de mercur) este
focalizată cu ajutorul unui sistem de lentile pe cele două celule, celula de măsură și celule
de referință, apoi ajunge pe două celule fotoelectrice. Semnalul acestor fotocelule este
modificat electronic și apoi reprezintă semnalul de intrare pentru sistemul de achiziții de
date al unui calculator sau integrator. Volumul celulei trebuie să fie cât mai mic cu
putință pentru a reduce dispersia peakurilor și a asigura o separare corespunzătoare.
Coloanele moderne sunt capabile să reducă volumul în care eluează un peak la câțiva μl
și dacă volumul celulei este prea mare în celulă va intra mai mult decât un peak, ceea ce
va face imposibilă rezoluția peakurilor respective. Volumul celulei de măsură la un
detector modern nu are voie să fie mai mare decât 5 μl și este recomandat să fie mai puțin
de 2 μl. Deoarece absorbanța este proporțională cu lungimea celulei, rezultă că pentru a
avea o celulă cu sensibilitate mare ar fi indicată mărirea lungimii acesteia. Creșterea
lungimii celulei este însă limitată de necesitatea ca volumul celulei să fie cât mai mic.

13
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Pentru a avea o lungime cât mai mare corespunzătoare unui volum cât mai mic, rezultă că
ar trebui redus diametrul celulei, însă și această reducere este limitată pentru că se reduce
concomitent și energia luminoasă care ajunge pe fotocelulă și crește zgomotul de fond al
detectorului. Celulele detectoarelor moderne au lungimi cuprinse între 1 și 10 mm și
diametre interioare de 1 mm sau mai puțin.

Figura 7.4. Schema detectorului UV-Vis cu dublu fascicul

Detectorul cu lungime de undă variabilă utilizează drept sursă o lampă care emite
o radiație pe un spectru larg de lungimi de undă (de exemplu o lampă de deuteriu) și prin
utilizarea unui monocromator se poate selecta o radiație cu o anumită lungime de undă
dorită, în intervalul 190350 nm. La unele dintre aceste detectoare, există și posibilitatea
de a opri fluxul de fază mobilă, de a reține componenta respectivă în celulă și de a-i face
spectrul complet în ultraviolet. Uneori aceste spectre pot fi utilizate pentru identificarea
calitativă a componentelor respective, deși utilizarea spectrelor în UV în acest scop este
limitată. Un alt avantaj al acestui tip de detector este că pentru fiecare componentă se
poate selecta lungimea de undă la care aceasta are absorbanța maximă și astfel de a crește
sensibilitatea analizei.
Detectorul cu șir de diode utilizează o lampă de deuteriu sau de xenon care emite
pe tot domeniul spectrului de UV. Lumina acestei lămpi este focalizată cu ajutorul unui
sistem de lentile prin celula de măsură și apoi ajunge pe o rețea de difracție (Figura 7.5).
Lumina dispersată de această rețea cade pe un șir de diode. Fiecare diodă măsoară câte o
bandă îngustă a spectrului (aproximativ 2 nm), iar măsurătoarea are loc într-un timp
extrem de scurt (mai puțin de 10 milisecunde). Astfel, practic la interval de milisecunde
se obține câte un spectru UV. Utilizarea acestui detector are următoarele avantaje
importante:
- Se obțin spectrele tuturor componentelor separate, care pot fi utilizate
pentru identificarea calitativă a acestora;
- Prin alegerea unei anumite lungimi de undă se obține o cromatogramă în
care apar doar compușii care absorb la lungimea de undă respectivă.
Rezultatele unei asemenea analize pot fi prezentate sub forma unor grafice
tridimensionale absorbanță-timp-lungime de undă. Sensibilitatea detectoarelor cu șir de
diode ajunge la 1,5·10-7 g/ml.

14
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Figura 7.5. Schema detectorului UV-Vis cu șir de diode

Detectorul cu fluorescență

Este probabil cel mai sensibil detector folosit in cromatografia de lichide,

cantitatea minimă detectabilă fiind de până la 100 de ori mai mică decât în cazul
detectoarelor UV-Vis. El poate detecta compușii care prezintă fluorescență sau pe aceia
care pot fi transformați în compuși fluorescenți.
Prin fluorescență se înțelege proprietatea unor molecule de a emite o radiație în
momentul în care au atins o stare electronică excitată în urma absorbției unei radiații. Un
proces de fluorescență cuprinde două etape. În prima etapă, absorbția unui foton
determină trecerea moleculei respective într-o stare electronică excitată. Revenirea într-o
stare energetică stabilă are loc de asemenea prin emisia unui foton, adică prin ceea ce este
numit fluorescență. Energiile fotonilor absorbiți, respectiv emiși pot varia în funcție de
nivelele energetice între care are loc tranziția. În general, emisia se face la lungimi de
undă mai mari (adică energii mai mici) decât excitația. Intensitatea fluorescenței este
proporțională cu concentrația compusului respectiv.
Numărul compușilor care manifestă proprietatea de fluorescență naturală este
destul de redus, în această categorie întrând compușii aromatici, mai ales cei polinucleari
condensați. O serie de compuși care nu manifestă fluorescență naturală pot fi însă
transformați în derivați fluorescenți (de exemplu prin reacție cu clorură de dansil).
Această transformare se poate face înaintea separării cromatografice, numindu-se
derivatizare precoloană, sau după separarea cromatografică, adică prin derivatizare
postcoloană. Derivatizarea precoloană prezintă avantajele că se pot alege condițiile de
reacție pentru derivatizare fără a se ține cont de sistemul de eluent, se poate elimina fără
probleme excesul de reactiv de derivatizare, iar în unele cazuri selectivitatea separării
cromatografice pentru compusul derivatizat este mai mare decât pentru cel nederivatizat.
Avantajul principal al derivatizării postcoloană este că se poate realiza automat, prin
dozarea reactivului de derivatizare în efluentul coloanei, fără a fi necesară efectuarea
acestei reacții în afara sistemului cromatografic.
Un model de detector cu fluorescență este prezentat în Figura 7.6.

15
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Lampa de UV care emite radiația de excitație este în general o lampă de mercur

de presiune redusă care emite la 253,4 nm. O serie de substanțe fluorescente sunt excitate
de lumina emisă la această lungime de undă. Radiația este dirijată cu ajutorul unor lentile
prin celula de măsură, iar radiația fluorescentă emisă este focalizată cu ajutorul altor
lentile pe o fotocelulă.
Există detectoare de construcție mai complexă, care permit detectarea selectivă a
radiației fluorescente de o anumită lungime de undă, sau chiar obținerea unui spectru de
fluorescență al substanței respective.

Figura 7.6. Detectorul cu fluorescență

Detectorul refractometric diferențial

Este un detector universal, cu bună stabilitate dar mai puțin sensibil, care măsoară
variația indicelui de refracție în prezența componentelor separate în coloana
cromatografică. Are și dezavantajul că este foarte sensibil la schimbările de temperatură,
deci trebuie termostatat cu mare precizie (± 0,001ºC pentru a putea fi utilizat la
sensibilitatea maximă). De asemenea, nu poate fi utilizat în cazul în care eluția se face cu
gradient și nu se pot folosi decât solvenți care au indice de refracție mult diferit de cel al
compușilor analizați. Cu toate aceste limitări, detectorul de indice de refracție este extrem
de util pentru analiza compușilor neionici, care nu absorb în UV și nu prezintă
fluorescență.
Există două tipuri de detectoare refractometrice: cu deflecție și cu reflexie sub
unghi limită (de tip Fresnel). Schema de principiu a unui refractometru cu deflecție este
prezentată în Figura 7.7.

16
Metode cromatografice de analiză a alimentelor Curs 10

Figura 7.7. Detectorul refractometric diferențial

Raza de lumină incidentă, provenită de la un bec cu incandescență, în general o

lampă cu filament de wolfram, trece printr-o lentilă de focalizare și este dirijată pe celula
detectorului. La trecerea din celula de referință în cea de măsură, raza va fi deviată cu un
unghi proporțional cu diferența dintre indicii de refracție ai lichidelor care se găsesc în
cele două celule. Raza reflectată de oglindă trece din nou prin cele două celule, după care
este focalizată de o altă lentilă pe o celulă fotoelectrică. Când raza de lumină își schimbă
poziția pe celulă, semnalul pe care acesta îl emite se va modifica, iar diferența față de
semnalul de bază este amplificată și constituie de fapt răspunsul detectorului, fiind
proporțională cu concentrația componentei în celula refractometrului. Sensibilitatea
acestui detector ajunge până la 10-6 g/ml (deci de ordinul ppm), considerabil mai slabă
decât a altor detectoare. Este utilizat cu rezultate bune pentru analiza hidraților de carbon
și a unor polimeri.

17