ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A

MICROORGANISMELOR PATOGENE DIN

PRODUSELE ALIMENTARE
2. DETERMINAREA MICROORGANISMELOR PATOGENE – agenți ai toxiinfecțiilor și
intoxicațiilor prin alimente contaminate
- Îmbolnăvirea este cauzată prin consum de alimente în/pe care s-au dezvoltat microorganisme
care elaborează metaboliţi cu efect toxic. Perioada de incubaţie şi simptomele evidenţiate prin
investigaţii pot fi corelate cu alimentul ingerat (în special pentru bacterii).

- microorganismele patogene pot ajunge in alimente de la oamenii bolnavi care manipuleaza

alimentele, de la animalele bolnave sau din mediu datorita managementului defectuos al
ingrasamintelor organice.

- Recomandări pentru manipulatorii de alimente

- OMS oferă următoarele îndrumări pentru persoanele care manipulează alimente:

- Atât operatorii de produse alimentare profesioniști, cât și cei domestici ar trebui să fie vigilenți în
timp ce pregătesc mâncarea și ar trebui să respecte regulile igienice de pregătire a alimentelor.
- Manipulatorii profesioniști de alimente care suferă de febră, diaree, vărsături sau leziuni vizibile
ale pielii infectate trebuie să raporteze imediat angajatorului lor.
- Cele cinci chei ale OMS pentru o hrană mai sigură servesc drept bază pentru programele
educaționale de instruire a persoanelor care manipulează alimentele și de educare a
consumatorilor. Sunt deosebit de importante în prevenirea intoxicațiilor alimentare.

Cele cinci chei ale alimentației mai sigure sunt:

- păstrarea conditiilor stricte de igiena pe tot traseul alimentelor: recoltare, procesare, ambalare,
depozitare, vanzare, gatire etc.;
- separarea foarte buna a alimentelor crude de cele gătite;
- gatirea corespunzatoare a alimentelor;
- păstrarea alimentele la temperaturi sigure;
- folosirea in procesul de fabricare a apei și materiilor prime sigure din punct de vedere
microbiologic.

- Recomandări pentru producătorii de fructe, legume, pește și produse animale

- Cele cinci chei ale OMS pentru creșterea fructelor, legumelor, peștelui și a altor produse
animale in siguranță au drept scop promovarea sănătății prin practici cheie pentru prevenirea
contaminării microbiene.
Cele cinci chei pentru creșterea mai sigură a fructelor și legumelor sunt:

- Practicarea unei igiene personale corespunzătoare;

- Protejarea câmpurilor de contaminarea fecală a animalelor;
- Utilizarea deșeurilor fecale tratate;
- Evaluarea și gestionarea riscurilor din apa de irigații;
- Păstrarea echipamentelor de recoltare și depozitare curate și uscate.

Cele cinci chei pentru produse de acvacultură și de origine animală mai sigure pentru a proteja
sănătatea publică sunt:

- Practicarea unei igiene personale corespunzătoare;

- Curățarea temeinică a adăposturilor de animale, lacurilor și iazurilor de piscicultură;
- Gestionarea calității apei;
- Păstrarea animalelor/peștelui din ferme sănătos;
- Utilizarea echipamentelor și containerelor de recoltare curate.
2.1. Genul Salmonella
- Genul Salmonella cuprinde bacili Gram-negativi,
mobili cu cili peritrichi (exceptie S. gallinariuum),
facultativ anaerobe sau anaerobe, capabile sa produca
endotoxine.

- fac parte din familia Enterobacteriaceae, sunt

ubicuitari, prezenți în intestinul mamiferelor (om,
animale domestice și peridomestice), precum și al
păsărilor, reptilelor, batracienilor și insectelor.

- au fost identificate aproximativ 2600 serotipuri de Salmonella. Salmonella enterica subspecia

enterica a fost izolată în peste 90% din cazuri la om, celelalte subspecii generând îmbolnăviri
întâmplătoare. Salmoneloza este a doua infecție gastrointestinală ca frecvență de raportare după
campilobacterioză și una din principalele cauze ale focarelor alimentare în UE.
- Salmoneloza este o boală acută bacteriană, principala formă clinică fiind manifestată în mod
obișnuit ca gastroenterită acută autolimitată, cu debut brusc, diaree, febră, durere abdominală,
mialgie (durere musculara), cefalee, greață, vărsături și/sau alte simptome și uneori poate lua
caracter sistemic.

- Boala durează între 4 și 7 zile, majoritatea persoanelor vindecându-se fără tratament. În special
în rândul sugarilor și vârstnicilor, deshidratarea poate fi severă chiar mortala. Pot să apară cazuri
asimptomatice sau care evoluează către septicemie sau infecție localizată (meningită,
osteomielită).

- Rezervorul natural de infecție este reprezentat de animalele sălbatice și domestice, precum:

păsări (în special rațe), porci, bovine, rozătoare, câini, pisici, diverse specii de broaște țestoase,
alte reptile.

- Omul poate fi izvor de infecție ca bolnav, convalescent, rar purtător, dar mai ales ca infectat
inaparent. Salmonella se transmite pe cale digestivă: prin ingerare de apă/alimente contaminate
sau fecal-oral. Mai mult de 95 % din infecțiile cu Salmonella sunt transmise pe cale alimentară.
- Sursele alimentare cel mai des incriminate sunt:
- ouă și produse din ou, crude sau insuficient preparate termic;
- lapte și produse din lapte, nepasteurizate;
- carne și produse din carne, insuficient preparate termic;
- legume și fructe contaminate, ce nu necesită preparare termică.
Transmiterea fecal-orală,de la persoană la persoană, este posibilă în faza simptomatică a bolii,
atunci când nu se respectă regulile de igienă.

- Perioada de incubație: între 6 și 72 ore, de obicei 12-36 ore.

- Perioada de contagiozitate: poate varia pe parcursul infecției, de la câteva zile până la câteva
săptămâni. Starea de purtător temporar poate continua luni de zile, mai ales la sugari. În funcție
de serotip, aproximativ 1% dintre adulții infectați și 5% dintre copiii sub 5 ani pot rămâne purtători
timp de 1 an.

- Detectarea prezenței Salmonella se face în conformitate cu Regulamentul (CE) nr 2073/2005

(criterii microbiologice pentru produsele alimentare), cu modificările ulterioare, în conformitate cu
Directiva Standardul ISO 6579 - Microbiologia alimentelor și hranei pentru animale - Metoda
orizontală pentru detectarea Salmonella spp. (ISO, 2002).
- Principiul de determinare: - In mod normal, bacteriile apartinand genului Salmonella in produse
alimentare sunt absente sau numarul lor este foarte redus, acestea fiind asociate cu o microflora
mult mai numeroasa in care de obicei predomina alte eterobacteriaceae.

- Există mai multe metode de determinare a Salmonella sp. în produsele alimentare printre care
se pot aminti metodele clasice culturale, metoda PCR (o alternativă frecvent aplicată
la ora actuala) și metoda FISH (care încă nu este populară, deși se lucrează la optimizarea ei).

Metoda clasica culturala

- In scopul creerii unor conditii favorizante pentru salmonele, pentru determinarea lor in produse
alimentare, in analiza microbiologica se parcurg mai multe etape:
1. Etapa de preambogatire prin inocularea in medii nutritive lichide lipsite de selectivitate;
2. Etapa de imbogatire, prin inocularea in medii selective cu grade diferite de selectivitate, care
sa favorizeze inmultirea salmonelelor;
3. Inocularea pe medii selective si medii de diferentiere pentru izolarea coloniilor caracteristice
genului Salmonella;
4. Etapa de confirmare prin teste biochimice si serologice
Tehnica de lucru:
1. Etapa de preambogatire - La analiza produselor alimentare care au suferit tratamente
termice,refrigerare, congelare, uscare, se recomandă ca după efectuarea probei omogene ( 25g
în 225 ml ser fiziologic steril) să se transfere integral în mediul de preîmbogățire (500 ml) și să se
facă incubarea la 370C timp de 16-20 ore. Mediile de preîmbogățire sunt bulionul lactozat, bulion
cu manitol sau apă peptonată tamponată. Pentru produse precum cacao sau produse din
ciocolată, apa peptonată va conține un adaus de cazeină sau lapte degresat și verde briliant
pentru a inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram-pozitive. În cazul produselor alimentare acide, apa
peptonată trebuie utilizată cu concentrație dublă de componente, în timp ce pentru carne și
alimente cu un conținut ridicat de grăsimi, pre-îmbogățirea trebuie efectuată în bulion de lactoză
cu adăugarea de Triton X-100.

- Etapa de preîmbogățire favorizează multiplicarea atât a salmonelelor cât și a microflorei

asociate, astfel încât prin acidifierea mediului în limite de pH 6,5 – 5,8 se crează condiții
favorabile pentru salmonele și nefavorabile pentru enterobacterii inhibate la valori sub 5,8.

2. Etapa de imbogatire – Din vas, după termostatare se recoltează 10 ml probă și se inoculează

în 2 vase ce conțin 100 ml din mediile de îmbogățire: a. mediul cu selenit cisteină – inhibă într-un
grad mai avansat microbiota asociată, cisteina favorizând dezvoltarea salmonelelor;
- b. Mediu cu tetrationat (Müller – Kauffman) – un mediu mai puțin selectiv. Sărurile biliare din
componența mediului inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive, iar thiosulfatul de sodiu este
mai puțin toxic pentru salmonele decât pentru alte bacterii Gam negative.

- mediile de îmbogățire se termostatează în prealabil la 42°C. Incubarea se face apoi tot la 42°C
timp de 48 ore.

3. Etapa de diferențiere - Din vasele cu mediile de îmbogățire, după 24 ore se pot face recoltări
cu ansa si se fac trasări la suprafața mediilor culturale de diferenţiere, în scopul obţinerii de
colonii distincte, iar plăcile se incubeaza la 37°C timp de 20 – 24 ore. Mediile de diferențiere
folosite sunt: a. mediul cu sulfit de bismut – agar (mediul Wilson și Blair) – este un mediu selectiv
și permite diferențierea pe baza caracterelor morfo-coloniale; b. Mediul verde – briliant – agar; c.
Mediul ADLC (Leifson); d. Mediul cu bilă Istrati- Meitort.

- După 48 ore se repetă trasările și se izolează sub formă de culturi pure minimum 5 colonii din
fiecare placă, colonii care se crede că aparțin genului Salmonella;

- Pe mediul cu sulfit de bismut, coloniile tipice de Salmonella sunt de culoare brun spre negru,
turtite, aderente la mediu cu luciu metalic. Mediul din jurul coloniilor este brun la început și cu
trecerea timpului de incubare se închid la culoare.
- pe mediul verde briliant, coloniile tipice sunt incolore, roz sau roșiatice pe mediu de culoare
roșiatică. Bacteriile lactozo pozitive formează pe acest mediu colonii galben-verzui.

4. Etapa de confirmare – pentru testele de confirmare din coloniile izolate se fac trasări pe medii
de identificare şt incubare la 37°C – 20 - 24 ore. Mediile de identificare folosite sunt: 1. Mediul
TSI; b. Mediul cu uree-agar; c. Mediul de evidențiere a galactozidazei.

- pe mediul TSI se poate folosi şi tehnica înţepării mediului cu o ansa dreapta, iar prin urmărirea
modificărilor ce intervin după termoetatare se pot trage următoarele concluzii:

- dacă tubul are culoarea galbenă însemnă că a fost fermentată glucoza, iar dacă culoarea este
roşie sau nemodificată fermen­tația nu a avut loc. Apariţia culorii negre presupune formarea de
H2S, iar prezența bulelor care au produs rupturi în gel denotă formarea de gaz prin fermentarea
glucozei.

- prin cultivarea pe mediu cu uree reacția este pozitivă daca mediul va avea culoare roșie după
incubare.