Microorganisme patogene transmisibile prin alimente

Bacterii din genul Staphylococcus

Morfologie
 Cuprinde bacterii cu formă de coci, Gram pozitive, cu
diametrul de 0,5 -1,5 microni, dispuşi ca celule izolate, în
perechi, tetrade, lanţuri scurte, sau mai des grupaţi în
grămezi sub formă de ciorchine, de unde şi denumirea. De
obicei sunt catalazo pozitive, facultativ anaerobe, imobile,
asporogene.

 În afara speciei Staphylococcus aureus cu implicaţiile cele

mai mari în patologia umană, inclusiv în igiena alimentară,
în ultimele două decenii s-a stabilit că şi alte specii de
Staphylococcus pot fi implicate în microbiologia alimentelor
mai ales speciile care sunt coagulazo pozitive, fiind
implicate adeseori singure sau în comun cu alte bacterii în
cazuri de toxiinfecţii alimentare la om
Microorganisme patogene transmisibile prin alimente
Bacterii din genul Staphylococcus
 Microorganisme patogene transmisibile prin alimente
Bacterii din genul Staphylococcus

Rezistenţa
 Principalul pericol al contaminării alimentelor - elaborarea de către unele tulpini
(coagulazo – pozitive) a unei enterotoxine - enterotoxina stafilococică este
termostabilă.

 Metodele de pasteurizare sunt ineficace pentru distrugerea acesteia. Abia după

o fierbere de 60 minute se constată o anume reducere a activităţii
enterotoxinei. În autoclav la 2 atm., enterotoxina stafilococică este inactivată.

 S.aureus se multiplică la>5-6°C şi elaborează enterotoxina la > 18°C; Pentru

inhibarea dezvoltării germenilor patogeni, carnea trebuie stocată la
temperatura < 5°C, de preferat în jurul a 0°C.
 Microorganisme patogene transmisibile prin alimente
Bacterii din genul Staphylococcus

Surse de contaminare
 Oamenii aparent sănatoşi (de regulă, pe mucoasa nazală). Frecvenţa
purtătorilor este mai mare printre oamenii care prezintă sau au prezentat
furunculi, panariţii sau diferite răni la nivelul pielii.

 Ugerul şi pielea animalelor. Leziunile mameloanelor şi pielii ugerului conţin

adesea stafilococi cu care se contaminează laptele, fie direct, fie prin mâinile
mulgătorilor (S.agalactiae, S.dysgalactiae şi S.uberis).

 Toxiinfecţia cu enterotoxina stafilococică poate apărea de cele mai multe ori

prin consumul de lapte pasteurizat, dacă înainte de pasteurizare a fost
contaminat şi ţinut în condiţii favorabile multiplicării stafilococilor.
 Microorganisme patogene transmisibile prin alimente
Bacterii din genul Staphylococcus

Alimente care pot fi contaminate

 Lapte - bacteriile din genul Staphylococcus acţionează în principal asupra
lipidelor din lapte - microorganisme lipolitice. Ele elaborează lipaze care
determină hidroliza grăsimii cu formare de acizi graşi şi glicerină. Consecinţa
este apariţia diferitelor modificări de miros şi gust – butiric, iute, înţepător,
picant, rânced.

 Laptele praf – tratamentele - pasteurizarea, concentrarea şi atomizarea nu

inactivează enterotoxina stafilococică.

 Brânzeturi - Staphylococcus aures rezistă şi uneori se multiplică şi produce

enterotoxină. S-a constatat că stafilococii coagulază pozitivi se înmulţesc pe
timpul procesului de fabricare în brânza Cheddar, telemea şi caşcaval.
 Microorganisme patogene transmisibile prin alimente
Bacterii din genul Staphylococcus

Alimente care pot fi contaminate

 Carnea şi produselor de carne deshidratate - carnea deshidratată, supele

deshidratate, gelatina, colagenul şi plasma sanguină. Deshidratarea este
considerată ca un mijloc de conservare.
 Carnea şi produselor de carne sarate - în produsele cu valoare aw scăzută se
poate înmulţi Staphilococcus aureus, deşi se pare că în aceste condiţii nu
produce enterotoxină.
 Preparatele de carne tratate termic (70 – 750C) - mai puţin din contaminări
primare cât mai ales din contaminare secundară.
 Carnea de pasăre - Contaminarea carcaselor poate avea loc în cursul oricărei
operațiuni de tăiere, împărțire, prelucrare, depozitare și distribuire a cărnii.
 Carnea de iepure – diferite specii din genul Staphylococcus, cum ar fi: S. sciuri,
S. xylosus, S. lentus.
 Microorganisme patogene transmisibile prin alimente
Bacterii din genul Staphylococcus

Alimente care pot fi contaminate

 Moluşte, crustacee întregi sau decochiliate/decojite refrigerate sau congelate,
fructe de mare refrigerate, congelate şi altele (mai ales când el provine din
locurile poluate cu apele de scurgere din aglomerările umane).

 Ouăle – se pot contamina în timpul depunerii sau după aceasta.

 Produsele din ouă – pe lângă microorganismele provenite de pe coajă,

produsele din ouă se pot contamina şi cu microorganisme prezente pe
suprafeţele şi instalaţiile cu care acestea vin in contact.

 Conservele alimentare – provenienţa bacteriilor este reprezentată de apa de

răcire. Prezenţa bacteriilor din genul Staphylococcus în conserve determină de
obicei acrirea conţinutului; deseori conţinutul are miros, aspect şi gust normale.
Recipientele nu se bombează.
 Metodologia de diagnostic

Termeni şi definiţii

 Stafilococ coagulază - pozitivi - bacterii care formează colonii tipice şi / sau

atipice pe suprafaţa mediului de cultură şi care prezintă o reacţie coagulază -
pozitiv;

 Numărarea stafilococilor coagulază - pozitivi - determinarea numărului de

stafilococi coagulază - pozitivi găsiţi pe mililitru sau pe gram de probă
 Metodologia de diagnostic

Principiul metodei

 Inocularea suprafeței unui mediu selectiv de cultură solid, folosind plăci în

dublu, cu o cantitate precizată din suspensia inițială în cazul produselor solide.

 Incubarea aerobă a plăcilor la 37° C și examinată atât după 24 de ore cât și

după 48 de ore.

 Calcularea numărului de stafilococi coagulază- pozitiv pe mililitru sau pe gram

de probă din numărul coloniilor tipice și/sau atipice obținute pe plăci la nivelele
de diluție alese în așa fel încât să dea un rezultat semnificativ și confirmat prin
rezultatul unui test coagulază-pozitiv.
 Metodologia de diagnostic

Medii de cultură utilizate

 Mediu agar Baird – Parker

 Pentru preparare se dizolvă componentele sau baza

completă deshidratată în apă la fierbere. Dacă este
necesar se ajustează pH-ul astfel încât dup sterilizare să
fie 7,2 ±0,2 la 25 ºC. Se transferă mediul în cantităţi de
100 ml în flacoane de sticlă de capacitate adecvată.
Seterilizează mediul timp de 15 min. la 121 ºC
 Metodologia de diagnostic

Pregătire

 Se topeşte mediul de bază, apoi se răceşte la

aproximativ 47°C prin intermediul băii de apă. Se
adaugă în condiţii aseptice suplimentele selective:
soluţia telurit de potasiu - K2TeO3 soluţie de
sulfametazină (dacă nu sunt conţinute de mediu de
bază) fiecare soluţie fiind încălzită înainte de baie de
apă la 47°C, amestecând bine după fiecare adăugare.

 Pregătirea plăcilor cu agar - se pun cantităţi adecvate

de mediu complet în cutii Petri sterile pentru a se
obţine o grosime a agarului de 4 mm şi se lasă să se
solidifice. Plăcile pot fi păstrate până la 24h la
temperatura de +3 ºC±2°C.
 Metodologia de diagnostic

Echipamente de încercare utilizate

 Termostat 35o +-0,5oC şi 37o +-0,5oC - aparat electric pentru dezvoltarea

microbiană;
 Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea Cu căldură uscată a obiectelor de sticlă,
porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-
60 minute;
 Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru:
medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de
121oC timp de 20-30 minute;
 Lampă U.V - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor
şi a suprafeţelor de lucru;
 Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de
temperatura camerei;
 Omogenizator Stomacher 400-Circulator –omogenizare eşantion;
 Autoclav Tuttnauer pentru instrumentar;
 Metodologia de diagnostic

Echipamente de încercare utilizate

 Baie de apă reglabilă la temperatură mai mare de 100oC sau reglabilă la 45oC;
 Cutii Petri sterile din sticlă cu diametrul de 90-100 mm;
 Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml, gradate în
diviziuni de 0,5 şi respectiv 0,1 cu orificiu de 2-3 mm;
 Lupă cu putere de mărire de 3x;
 pH metru;
 Eprubete de 16 x 160 mm sterile;
 Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml;
 Mojar cu pistil, sterile;
 Pentru a obţine o cultură pură de drojdii şi mucegaiuri este necesar ca materialul
de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria
întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute, iar mediile
sterilizate la 121oC timp de 30 minute.
Metodologia de diagnostic
 Metodologia de diagnostic

9ml 9ml 9ml 9ml

X g produs +
1 ml 1 ml 1ml

Diluţia 10-1 10-2 10-3 10-4

 Metodologia de diagnostic

Prin operaţia de diluţie reiese că între două diluţii consecutive,

diferenţa de concentraţie este de 10 ori (diluţii decimale):

Nr. tub 1 2 3 4
Diluţia 1/10x) 1/100 1/1000 1/10000
Cantitate (g) 0,1 0,01 0,001 0,0001
sau volum
(ml)
sau sau sau sau
Din proba 10-1 10-2 10-3 10-4
iniţială pe ml
diluţie xx)
 Metodologia de diagnostic

Procedura de lucru
 Însămânţare şi incubare

 Se toarnă circa 15 ml mediu Baird – Parker (topit în

prealabil şi menţinut la 450 ±10 C într-o baie de apă),
în fiecare cutie Petri. Timpul scurs între finalul
preparării suspensiei iniţiale (sau diluţiei 10-1 dacă
produsul este lichid) şi momentul în care mediul este
turnat în cutiile Petrii, nu trebuie să depăşească 15
min;

 Inoculul se amestecă cu mediul şi amestecul rezultat

este lăsat să se solidifice, după ce cutiile Petri au
fost aşezate pe o suprafaţă orizontală, rece;
 Metodologia de diagnostic

Procedura de lucru
 Însămânţare şi incubare

 Se prepară o cutie martor, cu 15 ml mediu, pentru

verificarea sterilităţii.

 Se efectuează incubarea aerobă a cutiilor la 35°C şi la

37°C timp de 4 sau 5 zile;
Metodologia de diagnostic
Metodologia de diagnostic
Metodologia de diagnostic
 Metodologia de diagnostic

Confirmare ( testul coagulazei)

 De pe suprafața fiecărei colonii selectate, se ia inocul
cu ansă sterilă şi se transferă într-o eprubetă sau
sticlă cu infuzie de creier-inimă. Se incubează la 35°
C și la 37° C timp de 24±2 ore.
 Se adaugă aseptic 0,01ml din fiecare cultură la 0,3
ml plasmă de iepure în eprubetă sau sticlă de
hemoliză sterile și se incubează la 35 ° C și la 37 ° C.
 Prin înclinarea eprubetei se examinează coagularea
plasmei după incubare de 4 ore până la 6 ore şi,
dacă testul este negativ, se reexaminează la 24 ore
incubare sau se examinează la timpii de incubare
precizați de producători.
 Se consideră testul coagulazei pozitiv dacă volumul
de cheag ocupă mai mult de jumătate din volumul
iniţial al lichidului.
 Metodologia de diagnostic

Exprimare rezultate
 Se calculează, pentru fiecare placă, numărul a de stafilococi coagulază
pozitivi, conform formulei.

bc bnc
A= ------ x Cc + ------ x Cnc
Ac Anc
 Unde :
Ac - număr de colonii tipice supuse testului coagulazei
Anc - număr de colonii atipice supuse testului coagulazei
bc - număr de colonii tipice care s-au dovedit a fi coagulză-pozitive;
bnc - număr de colonii atipice care s-au dovedit a fi coagulză-pozitive;
cc – număr total de colonii tipice văzute pe placă;
cnc - număr total de colonii atipice văzute pe placă.
 Metodologia de diagnostic

Exemplu

O numărare după inoculare cu 0,1 ml produs dă următoarele rezultate:

 Pentru prima diluţie (10-2): 65 colonii tipice şi 85 colonii tipice şi lipsa coloniilor atipice;

 Din 65 colonii, 5 colonii au fost selectate şi toate 5 s-au dovedit a fi coagulază - pozitive, dând
a =65;
65 0
A = ------ x 5 + ------ = 65
5 0
 Din 85 colonii, 5 colonii au fost selectate din care 3 s-au dovedit a fi coagulază - pozitive, dând
a =51;

85 0
A= ------ x 3 + ------ = 51
5 0
 Metodologia de diagnostic

 Pentru a doua diluţie selectată (10-3): 3 colonii tipice şi 7 colonii tipice şi lipsa coloniilor atipice;

 Din 3 colonii, toate au fost selectate şi s-au dovedit a fi coagulază - pozitive, dând a =3;

3 0
A= ------ x 3 + ------ = 3
3 0

 Din 7 colonii, 5 au fost selectate şi toate 5 s-au dovedit a fi coagulază - pozitive, dând a =7;

7 0
A= ------ x 5 + ------ = 7
5 0
 Metodologia de diagnostic

Σa
N = --------------------------------
V (n1 + 0,1 n2) d
Unde:
Σa - suma coloniilor de stafilococ coagulează pozitiv identificate pe toate plăcile selectate
V – volumul de inocul aplicat pe fiecare placă în ml
n1- numărul de plăci selectate la prima diluție
n2- numărul de plăci selectate la a doua diluție
d- gradul de diluare care corespunde la prima diluție selectată

65+ 51+3+7 126 126

N = ------------------------- = ------------------------ = ---------------- = 57.272
0,1( 2 + 0,1x2) 10-2 0,1 x 2,2 x0,01 0,0022

Rezultatul după rotunjire este 5,7 x 104